(86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/US99/21081 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (21) Numer zgłoszenia: (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (22) Data zgłoszenia: (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/US99/21081 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego: , WO00/15853 PCT Gazette nr 12/00 (51) Int.Cl. C12Q 1/68 ( ) C12P 21/06 ( ) A61K 39/12 ( ) A61K 39/21 ( ) C07H 21/04 ( ) (54) Cząsteczka rekombinowanego RNA, komórka rekombinowana, chimeryczny wirus, sposób wytwarzania chimerycznego wirusa i preparat szczepionki (30) Pierwszeństwo: ,US,09/152,845 (73) Uprawniony z patentu: MOUNT SINAI SCHOOL OF MEDICINE OF NEW YORK UNIVERSITY,New York,US (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 11/04 (72) Twórca(y) wynalazku: Adolfo Garcia-Sastre,New York,US Peter Palese,Leonia,US (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 05/09 (74) Pełnomocnik: Urszula Bartnik, POLSERVICE, Kancelaria Rzeczników Patentowych Sp. z o.o. PL B1 (57) 1. Cząsteczka rekombinowanego RNA, znamienna tym, że obejmuje miejsce wiązania swoiste względem polimerazy RNA wirusa choroby Newcastle (NDV) oraz sygnały potrzebne do replikacji i transkrypcji NDV, w których pośredniczy NDV, operatywnie związane z sekwencją heterologicznego RNA, przy czym miejsce wiązania specyficzne dla polimerazy RNA wirusa choroby Newcastle i sygnałów wymaganych do replikacji w której pośredniczy NDV i transkrypcji jest zawarte w 3' i 5'-niekodującym regionie flankującym RNA wirusowego genomu NDV. 12. Sposób wytwarzania chimerycznego wirusa o nici RNA "minus", znamienny tym, że transfekuje się komórkę gospodarza sekwencjami nukleotydów kodującymi rekombinowaną cząsteczkę RNA zawierającą miejsce wiązania swoiste względem polimerazy RNA wirusa choroby Newcastle (NDV) oraz sygnały potrzebne do replikacji i transkrypcji NDV, w których pośredniczy NDV, operatywnie związane z sekwencją genomem wirusa choroby Newcastle, przy czym cząsteczka RNA zawiera mutacje, insercje lub delecje, przy czym miejsce wiązania specyficzne dla polimerazy RNA wirusa choroby Newcastle i sygnałów wymaganych do replikacji w której pośredniczy NDV i transkrypcji jest zawarte w 3' i 5'-niekodującym regionie flankującym RNA wirusowego genomu NDV. 13. Preparat szczepionki, znamienny tym, że zawiera wytworzonego metodami inżynierii genetycznej wirusa choroby Newcastle, zawierającego cząsteczkę rekombinowanego RNA zawierającą miejsce wiązania swoiste względem polimerazy RNA wirusa choroby Newcastle (NDV) oraz sygnały potrzebne do replikacji i transkrypcji NDV, w których pośredniczy NDV, operatywnie związane z sekwencją genomu wirusa choroby Newcastle, przy czym cząsteczka RNA zawiera mutacje, insercje lub delecje, przy czym miejsce wiązania specyficzne dla polimerazy RNA wirusa choroby Newcastle i sygnałów wymaganych do replikacji w której pośredniczy NDV i transkrypcji jest zawarte w 3' i 5'-niekodującym regionie flankującym RNA wirusowego genomu NDV, i przy czym ta cząsteczka RNA zawiera mutacje, insercje lub delecje, prowadzące do atenuowanego fenotypu, lub zwiększonej immunogeniczności, oraz fizjologicznie dozwoloną zaróbkę.

2 2 PL B1 Opis wynalazku 1. Dziedzina techniki Przedmiotem wynalazku jest cząsteczka rekombinowanego RNA, komórka rekombinowana, chimeryczny wirus, sposób wytwarzania chimerycznego wirusa i preparat szczepionki. Szczegółowo zaś, niniejszy wynalazek zajmuje się dziedziną rekombinowanych matryc wirusa RNA choroby Newcastle, które mogą zostać użyte celem ekspresji produktów genów heterologicznych w odpowiednich systemach komórek gospodarza i/lub celem skonstruowania rekombinowanych wirusów, które produkują, pakują i/lub prezentują produkt genu heterologicznego. Produkty ekspresji oraz chimeryczne wirusy mogą zostać korzystnie zastosowane w szczepionkach. Wyprodukowane metodami inżynierii genetycznej rekombinowane wirusy choroby Newcastle, zawierające modyfikacje i/lub mutacje umożliwiają zastosowanie tego wirusa w szczepionkach. Modyfikacje te, to atenuowany fenotyp i zwiększona immunogeniczność. Rekombinowane wirusy choroby Newcastle, indukują interferon oraz szlaki pokrewne. Niniejszy wynalazek służy do zastosowania rekombinowanych wirusów choroby Newcastle oraz wektorów wirusowych przeciwko szerokiemu zakresowi patogenów i/lub antygenów, w tym nowotworowo-specyficznych antygenów. Wynalazek został zaprezentowany na drodze przykładów, w których skonstruowano matryce RNA rekombinowanego wirusa choroby Newcastle zawierające sekwencje kodujące heterologiczny gen o ujemnej polarności. W dalszej kolejności wynalazek pozwala na konstruowanie matryc RNA rekombinowanego wirusa choroby Newcastle, które zawierają sekwencje kodujące heterologiczny gen o pozytywnej polarności. Sekwencje genu heterologicznego dotyczą sekwencji otrzymanych z ludzkiego wirusa niedoboru immunologicznego. 2.Tło wynalazku Celem bezpośredniej ekspresji heterologicznych białek w systemach komórek gospodarza poddano genetycznej modyfikacji szereg wirusów DNA (np. wirus wakcinii, bakulowirus, itd.). Ostatnio poczyniono postępy w zakresie pozytywno-niciowych wirusów (np. poliowirus). Uważa się, że produkty genów heterologicznych lub chimeryczne wirusy dające produkt genu heterologicznego są potencjalnie korzystne jako szczepionki (zarówno jako podjednostki lub całościowe szczepionki wirusowe). Jedyną wadą użycia wirusów takich jak wakcinia celem skonstruowania rekombinowanych lub chimerycznych wirusów jest brak zróżnicowania głównych epitopów wakcinii. Brak zróżnicowania wśród szczepów wirusowych nakłada znaczne ograniczenia na ciągłe stosowanie chimer wakcinii, ponieważ wielokrotne szczepienia doprowadzą do wytworzenia odporności gospodarza na dany szczep, uniemożliwiającej zakażenie gospodarza inokulowanym wirusem. Inokulacja chimeryczną wakcinią jednostki odpornej nie doprowadzi tym samym do indukcji odpowiedzi immunologicznej. Dla kontrastu, ujemnoniciowe wirusy RNA mogą być atrakcyjnymi kandydatami do konstrukcji chierycznych wirusów stosowanych jako szczepionki. Przykładowo, szczególnie pożądanym wirusem jest ujemnoniciowy wirus RNA grypy, ponieważ jego znaczna zmienność genetyczna pozwala na skonstruowanie rozległego repertuaru szczepionek stymulujących odporność bez ryzyka rozwinięcia się tolerancji. Ostatnio udało się skonstruować przy użyciu wirusa grypy zakaźne rekombinowane lub chimeryczne ujemnoniciowe cząsteczki RNA (U.S Patent nr 5,166,057 do Palesc i wsp., włączony tutaj w całości poprzez odniesienie) Wirus choroby Newcastle Rodziny wirusów, zawierających jednoniciowe RNA jako antysensowny genom, zostały zaklasyfikowane do grup mających genomy niepodzielne (Paramyxoviridae, Rhabdoviridae) lub podzielne genomy (Orthomyxoviridae, Bunyaviridae oraz Arenaviridae). Szczegółowo opisana poniżej oraz zastosowana w niniejszych przykładach rodzina Paramyxoviridae zawiera wirus choroby Newcastle (NDV), wirus paragrypy, wirus Sendai, szympans wirus 5 oraz wirus świnki. Wirus choroby Newcastle jest wirusem otoczkowym zawierającym liniowy, jednoniciowy genom zbudowany z ujemnoniciowego RNA. Genomowe RNA zawiera opisane szczegółowo geny w kolejności 3'- -NP-P-M-F-HN-L. Genomowe RNA zawiera również sekwencję liderową na 3' końcu. Strukturalne elementy wirionu dotyczą otoczki wirusowej stanowiącej dwuwarstwową błonę pochodzącą z błony komórkowej. Glikoproteina, hemaglutynimo-neuramidaza (HN) wystaje z otoczki umożliwiając posiadanie przez wirusa zarówno aktywności hemaglutyniny jak i neuramidazy. Fuzyjna glikoproteina (F), która oddziałuje również z błoną wirusa jest w pierwszej kolejności produkowana jako nieaktywny prekursor, a następnie cięta post-translacyjnie celem wytworzenia dwóch polipepty-

3 PL B1 3 dów połączonych mostkiem siarczkowym. Aktywne białko F bierze udział w penetracji NDV do komórek gospodarza poprzez ułatwianie fuzji otoczki wirusowej z błoną komórkową gospodarza. Białko matriks (M) bierze udział w składaniu wirusa oraz oddziałuje zarówno z otoczką wirusa jak i białkami nukleokapsydu. Główną podjednostkę białkową nukleokapsydu stanowi białko nukleokapsydu (NP), które nadaje kapsydowi symetrię helikalną. Białka P i L występują w połączeniu z nukleokapsydem. Uważa się, że podlegające fosforylacji fosfobiałko (P) odgrywa rolę w regulacji transkrypcji oraz może również brać udział w metylacji, fosforylacji i poliadenylacji. Gen L, kodujący zależną od RNA polimerazę RNA, jest wraz z białkiem P niezbędny do syntezy wirusowego RNA. Białko L, zabierające niemal połowę genomu wirusa, jest największym białkiem wirusowym oraz odgrywa istotną rolę zarówno w transkrypcji jak i replikacji. Replikacja wszystkich ujemnoniciowych wirusów RNA, w tym NDV, jest utrudniona ze względu na brak komórkowej maszynerii wymaganej do replikacji RNA. Dodatkowo, ujemnoniciowy genom nie może bezpośrednio ulegać translacji do białek, ale musi najpierw ulec transkrypcji do pozytywnoniciowej kopii (mrna). A zatem, po wejściu do komórki gospodarza, genomowe RNA nie może samodzielnie przeprowadzić syntezy potrzebnej polimerazy RNA zależnej od RNA. Białka L, P i NP. muszą wnikać do komórki w trakcie infekcji razem z genomem. Uważa się, że większość lub wszystkie białka wirusowe, które przeprowadzają transkrypcje mrna NDV, przeprowadzają również jego replikację. Nie zidentyfikowano dotychczas w sposób jasny mechanizmu regulującego alternatywne zastosowania (tj. trakskrypcję lub replikację) tych samych komplementarnych białek ale wydaje się, że biorą w tym udział trzy formy jednego lub więcej białek nukleokapsydu, w szczególności NP. Bezpośrednio po penetracji wirusa, transkrypcja ulega inicjacji przez białko L korzystające z ujemnoniciowego RNA jako matrycy. Synteza wirusowego RNA jest regulowana w taki sposób, że prowadzi to do powstania podczas transkrypcji monocistronicznego mrna. Po zajściu transkrypcji, replikacja genomu wirusowego jest drugim zasadniczym wydarzeniem podczas infekcji przez ujemnoniciowe wirusy RNA. Jak w przypadku innych ujemnoniciowych wirusów RNA, replikacja genomu wirusa choroby Newcastle (NDV) jest przeprowadzana przez białka. Pierwszymi produktami replikatywnej syntezy RNA są komplementarne kopie (tj. o dodatniej polarności) genomu RNA wirusa NDV (crna). Te dodatnioniciowe kopie (antygenomy) różnią się od dodatnioniciowych transkryptów mrna strukturą ich zakończeń. W przeciwieństwie do transkryptów mrna, anty-genomowe crna nie mają czapeczki, ani nie są metylowane na 5' końcu oraz nie ulegają skróceniu ani poliadenylacji na 3' końcu. crna są koterminalne z ich ujemnoniciowymi matrycami oraz zawierają wszystkie informacje genetyczne w każdym segmencie genomowego RNA w postaci komplementarnej. crna służą jako matryce do syntezy ujemnoniciowych genomów wirusa NDV (vrna). Zarówno ujemnoniciowe genomy NDV (vrna) jak i antygenomy (crna) ulegają enkapsydacji poprzez białka nukleokapsydu; jedynymi rodzajami RNA nie ulegającego enkapsydacji są wirusowe mrna. Dla NDV miejscem replikacji dla wirusowego RNA jest cytoplazma, podobnie jak miejscem do transkrypcji. Składanie elementów wirusa zachodzi przy błonie komórkowej gospodarza, zaś dojrzały wirus jest uwalniany przez wypączkowywanie Konstruowanie ujemnoniciowych wirusów RNA. Sterowane przez RNA polimerazy RNA z wirusów były intensywnie badane w odniesieniu do wielu aspektów struktury białek i warunków reakcji. Jednakże, elementy matrycy RNA, które kierują optymalną ekspresją polimerazy mogą zostać zbadane jedynie poprzez oddziaływania z wykorzystaniem istniejących sekwencji wirusowego RNA. Analiza promotora jest szczególnie interesująca ze względu na brak wiedzy w zakresie sposobu na jaki polimeraza wirusowa rozpoznaje specyficzne wirusowe RNA spośród wielu kodowanych przez gospodarza RNA, odnajdywanych na terenie zakażonej komórki. Wirusy zwierzęce zawierające pozytywnoniciowe genomy RNA mogą ulegać replikacji jedynie po wprowadzeniu otrzymanego z plazmidu RNA do komórki na drodze transfekcji (przykładowo, Racaniello i wsp., 1981, 25 Science 214: ; Levis. i wsp., 1986, Cell 44: ). W przypadku poliowirusa, oczyszczona polimeraza będzie replikować genomowe RNA w reakcjach in vitro, a po wprowadzeniu droga traksfekcji do komórek to pozytywnoniciowe RNA jest zakaźne (Kaplan, i wsp., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: ). Jednakże, nieznane są elementy matrycy służące jako promotor transkrypcji dla kodowanej przez poliowirusa polimerazy,

4 4 PL B1 ponieważ nawet homopolimery RNA mogą ulec skopiowaniu (Ward, i wsp., 1988, J. Virol. 62: ). Transkrypty SP6 również były stosowane do produkcji modelu defektywnie interferujących cząsteczek RNA dla genomu wirusa Sindbis. Po wprowadzeniu do zakażanej komórki, RNA ulega replikacji i zapakowaniu. Sekwencje RNA, odpowiedzialne za zarówno rozpoznanie polimerazy wirusa Sindbis oraz pakowanie genomu do cząsteczek wirusa, okazały się znajdować wewnątrz 162 nukleotydów (nt) na 5' końcu oraz 19 nt na 3' końcu genomu (Levis, i wsp., 1986, Cell 44: ). W przypadku wirusa mozaiki rodzaju Bromus (BMV), pozytywnoniciowego RNA wirusa roślin, zastosowano transkrypty SP6 celem zidentyfikowania promotora jako 134 nt 3' końca przypominającego trna (Dreher, and Hall, 1988, J. Mol. Biol. 201: 31-40). Rozpoznawanie przez polimerazę oraz synteza okazała się być niezależna zarówno od cech sekwencji jak i struktury dwurzędowej (Dreher, i wsp., 1984, Nature 311: ). Ujemnoniciowe wirusy RNA okazały się odporne na badania wymagań strukturalnych replikazy. Oczyszczona polimeraza wirusa pęcherzykowego zapalenia żołądka jest aktywna jedynie jeśli jako matryce załączone są otrzymane z wirusa kompleksy rybonukleoproteinowe (RNP) (De i Banerjee, 1985, Biochem, Biophys. Res- Commun. 126:40-49; Emerson i Yu, 1975, J. Virol. 15: ; Naito i Ishihama, 1976, J. Biol. Chem. 251: ). W odniesieniu do wirusa grypy, wykazano, że gołe oczyszczone RNA z wirusa może zostać użyte do rekonstytucji RNP. Wirusowy nukleokapsyd oraz białka polimerazy były oczyszczane na żelu i renaturowane na wirusowym RNA przy użyciu tioredoksyny (Szewczyk, i wsp., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: ). Jednakże, autorzy ci nie wykazali, czy aktywność preparatu była specyficzna dla RNA wirusa grypy oraz nie zanalizowali sygnałów kierujących transkrypcją. Dopiero ostatnio możliwym stało się odzyskanie ujemnoniciowych wirusów RNA przy użyciu odwróconego podejścia rekombinowanej genetyki (U.S. Patent nr 5,166,057 do Palese i wsp.). Chociaż metoda ta została oryginalnie zastosowana do modyfikacji genomu wirusa grypy (Luytjes i wsp Cell 59: ; Enami i wsp. 1990, Proc. Natl. Acad Sci. USA 92: ), została również z powodzeniem użyta dla różnorodnych ujemnoniciowych wirusów RNA, segmentowanych i niesegmentowanych), w tym wścieklizny (Schnell i wsp. 1994, EMBO J. 13: ); wirusa syncytialnego dróg oddechowych (Collins i wsp. 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: ); oraz wirusa Sendai (Park i wsp. 1991, Proc. Nail. Acad. Sci. USA 88: ; Kato i wsp., 1996, Genes Cells 1: ). Jednakże, nie zastosowano do tej pory tego sposobu w odniesieniu do genomów RNA wirusa choroby Newcastle. 3. Podsumowanie wynalazku Przedmiotem wynalazku jest cząsteczka rekombinowanego RNA, która obejmuje miejsce wiązania swoiste względem polimerazy RNA wirusa choroby Newcastle (NDV) oraz sygnały potrzebne do replikacji i transkrypcji NDV, w których pośredniczy NDV, operatywnie związane z sekwencją heterologicznego RNA, przy czym miejsce wiązania specyficzne dla polimerazy RNA wirusa choroby Newcastle i sygnałów wymaganych do replikacji w której pośredniczy NDV i transkrypcji jest zawarte w 3' i 5'-niekodującym regionie flankującym RNA wirusowego genomu NDV. Przedmiotem wynalazku jest również cząsteczka rekombinowanego RNA, która obejmuje miejsce wiązania swoiste względem polimerazy RNA wirusa choroby Newcastle (NDV) oraz sygnały potrzebne do replikacji i transkrypcji NDV, w których pośredniczy NDV, operatywnie związane z sekwencją genomu wirusa choroby Newcastle, przy czym cząsteczka RNA zawiera mutacje, insercje lub delecje, przy czym miejsce wiązania specyficzne dla polimerazy RNA wirusa choroby Newcastle i sygnałów wymaganych do replikacji w której pośredniczy NDV i transkrypcji jest zawarte w 3' i 5'- -niekodującym regionie flankującym RNA wirusowego genomu NDV. W cząsteczce rekombinowanego RNA według wynalazku regiony takie jak, 3' i 5'-niekodujący region flankujący ma sensowną sekwencję wirusa, pokazaną na fig. 3. Cząsteczka rekombinowanego RNA charakteryzuje się ponadto tym, że heterologiczny RNA koduje wirusowy antygen. W bardziej korzystnym rozwiązaniu, cząsteczka rekombinowanego według wynalazku charakteryzuje się tym, że wspomniany wirusowy antygen pochodzi z wirusa ludzkiego niedoboru odporności, wirusa choroby Newcastle, grypy, wirusa oddechowego, wirusa choroby Marek'a, wirusa zakaźnej choroby kaletki, wirusa ptasiego zapalenia oskrzeli, wirusa zakaźnego zapalenia kaletki, wirusa niedokrwistości kurcząt, wirusa ptasiego zapalenia krtani i tchawicy, wirusa białaczki ptasiej, wirusa siatkowicy, wirusa grypy ptasiej, wirusa wścieklizny, wirusa panleukopenii kociej, wirusa pryszczycy, wirusa księgosuszu lub wirusa ospy świń.

5 PL B1 5 Przedmiotem wynalazku jest również komórka rekombinowana, która zawiera sekwencje nukleotydów kodujące cząsteczkę rekombinowanego NDV jak zdefiniowano poprzednio oraz białka P i L polimerazy RNA NDV. Przedmiotem wynalazku jest również chimeryczny wirus, który stanowi wirus o nici RNA "minus", zawierający cząsteczkę rekombinowanego RNA jak zdefiniowano powyżej. Korzystnie, w chimerycznym wirusie według wynalazku heterologiczny RNA pochodzi z wirusowego antygenu, a bardziej korzystnie pochodzi z wirusa ludzkiego niedoboru odporności, wirusa choroby Newcastle, grypy, wirusa oddechowego, wirusa choroby Marek'a, wirusa zakaźnej choroby kaletki, wirusa ptasiego zapalenia oskrzeli, wirusa zakaźnego zapalenia kaletki, wirusa niedokrwistości kurcząt, wirusa ptasiego zapalenia krtani i tchawicy, wirusa białaczki ptasiej, wirusa retikuloendoteliozy, wirusa grypy ptasiej, wirusa wścieklizny, wirusa panleukopenii kociej, wirusa pryszczycy, wirusa księgosuszu lub wirusa ospy świń. W innym także korzystnym wykonaniu chimeryczny wirus według wynalazku charakteryzuje się tym, że heterologiczny RNA zawarty jest w genie HN wirusa choroby Newcastle. Kolejno, przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania chimerycznego wirusa o nici RNA "minus", polegający na tym, że transfekuje się komórkę gospodarza sekwencjami nukleotydów kodującymi rekombinowaną cząsteczkę RNA zawierającą wiązania swoiste względem polimerazy RNA wirusa choroby Newcastle (NDV) oraz sygnały potrzebne do replikacji i transkrypcji NDV, w których pośredniczy NDV, operatywnie związane z sekwencją heterologicznego RNA, przy czym miejsce wiązania specyficzne dla polimerazy RNA wirusa choroby Newcastle i sygnałów wymaganych do replikacji w której pośredniczy NDV i transkrypcji jest zawarte w 3' i 5'-niekodującym regionie flankującym RNA wirusowego genomu NDV, oraz wyodrębnia się chimerycznego wirusa z hodowli. Przedmiotem wynalazku jest także sposób wytwarzania chimerycznego wirusa o nici RNA "minus", polegający na tym, że transfekuje się komórkę gospodarza sekwencjami nukleotydów kodującymi rekombinowaną cząsteczkę RNA zawierającą miejsce wiązania swoiste względem polimerazy RNA wirusa choroby Newcastle (NDV) oraz sygnały potrzebne do replikacji i transkrypcji NDV, w których pośredniczy NDV, operatywnie związane z sekwencją genomu wirusa choroby Newcastle, przy czym cząsteczka RNA zawiera mutacje, insercje lub delecje, przy czym miejsce wiązania specyficzne dla polimerazy RNA wirusa choroby Newcastle i sygnałów wymaganych do replikacji w której pośredniczy NDV i transkrypcji jest zawarte w 3' i 5'-niekodującycm regionie flankującym RNA wirusowego genomu NDV. Następnym przedmiotem wynalazku jest preparat szczepionki, zawierający wytworzonego metodami inżynierii genetycznej wirusa choroby Newcastle, zawierającego cząsteczkę rekombinowanego RNA zawierającą miejsce wiązania swoiste względem polimerazy RNA wirusa choroby Newcastle (NDV) oraz sygnały potrzebne do replikacji i transkrypcji NDV, w których pośredniczy NDV, operatywnie związane z sekwencją genomu wirusa choroby Newcastle, przy czym cząsteczka RNA zawiera mutacje, insercje lub delecje, przy czym miejsce wiązania specyficzne dla polimerazy RNA wirusa choroby Newcastle i sygnałów wymaganych do replikacji w której pośredniczy NDV i transkrypcji jest zawarte w 3' i 5'-niekodującycm regionie flankującym RNA wirusowego genomu NDV, i przy czym ta cząsteczka RNA zawiera mutacje, insercje lub delecje, prowadzące do atenuowanego fenotypu, lub zwiększonej immunogeniczności, oraz fizjologicznie dozwoloną zaróbkę. Przedmiotem wynalazku jest również preparat szczepionki, który zawiera wytworzonego metodami inżynierii genetycznej chimerycznego wirusa choroby Newcastle, zawierającego cząsteczkę rekombinowanego RNA zawierającą miejsce wiązania swoiste względem polimerazy RNA wirusa choroby Newcastle (NDV) oraz sygnały potrzebne do replikacji i transkrypcji NDV, w których pośredniczy NDV, operatywnie związane z sekwencją heterologicznego RNA, przy czym miejsce wiązania specyficzne dla polimerazy RNA wirusa choroby Newcastle i sygnałów wymaganych do replikacji w której pośredniczy NDV i transkrypcji jest zawarte w 3' i 5'-niekodującym regionie flankującym RNA wirusowego genomu NDV, którego genom koduje epitop heterologiczny, oraz farmaceutycznie dozwoloną zaróbkę. W korzystnym rozwiązaniu preparatu szczepionki, epitopem heterologicznym jest antygen wirusowy, a w jeszcze bardzie korzystnym rozwiązaniu preparat szczepionki zawiera wirusowy antygen, który pochodzi z wirusa ludzkiego niedoboru odporności, wirusa choroby Newcastle, grypy, wirusa oddechowego, wirusa choroby Marek'a, wirusa zakaźnej choroby kaletki, wirusa ptasiego zapalenia oskrzeli, wirusa zakaźnego zapalenia kaletki, wirusa niedokrwistości kurcząt, wirusa ptasiego zapale-

6 6 PL B1 nia krtani i tchawicy, wirusa białaczki ptasiej, wirusa retikuloendoteliozy, wirusa grypy ptasiej, wirusa wścieklizny, wirusa panleukopenii kociej, wirusa pryszczycy, wirusa księgosuszu lub wirusa ospy świń. W innym korzystnym rozwiązaniu, preparat szczepionki charakteryzuje się tym, że epitopem heterologicznym jest białko wzmagające reaktywność immunologiczną wybrane z grupy obejmującej cytokiny, interferon, czynnik tworzący kolonie i interleukiny, lub także korzystnie, epitopem heterologicznym jest antygen nowotworowy. Niniejszy wynalazek odnosi się do szczepionek, które mogą być podawane ludziom, jak również w celach weterynaryjnych. Szczepionki niniejszego wynalazku mogą być zaprojektowane do podawania zwierzętom domowym, w tym psom, kotom i dzikim zwierzętom, w tym lisom i skunksom, zwierzętom gospodarskim i ptactwu, w tym koniom, bydłu, owcom, indykom i kurom. Wynalazek dotyczy rekombinowanych wektorów wirusa choroby Newcastle oraz wirusów zmodyfikowanych tak, aby kodować zmutowane geny wirusa choroby Newcastle, bądź kodować kombinacje genów z różnych szczepów wirusa choroby Newcastle. Matryce RNA wytwarzane w niniejszym wynalazku zostały przygotowane poprzez transkrypcje odpowiednich sekwencji DNA za pomocą kierowanej przez DNA polimerazy RNA. Powstające matryce RNA mają ujemną polarność oraz zawierają odpowiednie sekwencje końcowe umożliwiające rozpoznanie matrycy przez aparat syntetyzujący RNA wirusa. Alternatywnie, zastosowane mogą zostać również matryce RNA o pozytywnej polarności, które zawierają odpowiednie sekwencje końcowe umożliwiające aparatowi syntetyzującemu RNA rozpoznanie matrycy. Ekspresja z matryc RNA o pozytywnej polarności może zostać uzyskana poprzez transfekcję plazmidami posiadającymi promotory rozpoznawane przez zależną od DNA polimerazę RNA. Przykładowo, plazmidowe DNA kodujące matryce pozytywnego RNA pod kontrolą promotora T7 mogą zostać zastosowane w połączeniu z systemem T7 wirusa wakcinii. Bicistroniczne RNA mogą zostać skonstruowane celem umożliwienia wewnętrznej inicjacji translacji sekwencji wirusowych oraz celem umożliwienia ekspresji sekwencji kodujących obce białka z regularnego miejsca inicjacji transkrypcji lub vice versa. Alternatywnie, obce białko może ulegać ekspresji z wewnętrznej jednostki transkrypcyjnej, w której to jednostka transkrypcji ma miejsce inicjacji oraz poliadenylacji. W kolejnym wykonaniu, obcy gen jest wstawiony do genu NDV, w taki sposób, że powstające białko jest białkiem fuzyjnym. Matryce wirusowego RNA rekombinowanych mutantów wirusa choroby Newcastle z niniejszego wynalazku mogą zostać zastosowane do transfekcji stransformowanej linii komórkowej, produkującej zależną od RNA polimerazę RNA oraz umożliwiającej komplementację. Alternatywnie, plazmid ulegający ekspresji pod odpowiednim promotorem może zostać zastosowany do wirusowo specyficznej (chimerycznej) transfekcji RNA. Komplementacja może zostać osiągnięta również poprzez zastosowanie wirusa pomocniczego dostarczającego zależną od RNA polimerazę RNA. Dodatkowo, opisany został również niezależny od wirusa system replikacji dla wirusa choroby Newcastle. Minimalna liczba białek wirusa choroby Newcastle wymaganych do specyficznej replikacji i ekspresji wirusa to trzy białka L, P i NP, które mogą ulegać ekspresji z plazmidów poprzez system T7 wakcinii. W kolejnym wykonaniu, jeśli do uzupełnienia wirusowego genomu zastosowane zostaną plazmidy kodujące antygenomową kopię genomu NDV, minimalnym zestawem wymaganym do specyficznej replikacji i ekspresji wirusa są białka L i P. Kiedy antygenomowa kopia genomu NDV ulega transkrypcji, białko polimerazy np. jest pierwszym białkiem ulegającym transkrypcji, a zatem nie jest koniecznym dostarczanie dodatkowej polimerazy NP w pozycji trans. Ekspresja produktów ekspresji oraz/i chimerycznych wirionów otrzymanych może w sposób korzystny zostać zastosowana w szczepionkach. Produkty ekspresji i chimeryczne wiriony niniejszego wynalazku mogą zostać zmodyfikowane, tak aby stworzyć szczepionki przeciwko szerokiemu zakresowi patogenów, w tym antygenów wirusowych, nowotworowych oraz autoantygenów biorących udział w chorobach autoimmunologicznych. W szczególności, chimeryczne wiriony niniejszego wynalazku mogą zostać zmodyfikowane tak aby stworzyć szczepionki przeciwko HIV, gdzie immunogenny poliopeptyd z gp 160, oraz/lub z wewnętrznych białek HIV jest wprowadzony do białka glikoproteiny HN celem stworzenia szczepionki zdolnej do wzbudzania odpowiedzi immunologicznej zarówno typu humoralnego jak i komórkowego. Zastosowanie wirusa choroby Newcastle do tego celu jest szczególnie atrakcyjne, ponieważ wirus choroby Newcastle nie jest patogenny dla człowieka. Zastosowanie rekombinowanego wirusa choroby Newcastle, celem podawania antygenów nowotworowych, jest szczególnie atrakcyjne wziąwszy pod uwagę znane właściwości antyneoplastyczne oraz immunostymulujące tego wirusa.

7 PL B Definicje Jak zastosowano tutaj, następujące terminy mają wskazane znaczenie: crna = anty-genomowe RNA HIV = ludzki wirus niedoboru immunologicznego L = duże białko M = białko matriks (znajduje się wewnątrz otoczki) MDCK = komórki końskiej nerki Madin Darby MDBK = komórki nerki bydlęcej Madin Darby moi = wielokrotność infekcji NA = neuraminidaza (glikoproteina otoczkowa) NDV = wirus choroby Newcastle NP = nukleobiałko (związane z RNA i wymagane do aktywności polimerazy RNA) NS = białko niestrukturalne (o nieznanej funkcji) nt = nukleotyd PA, PB1, PB2 = kierowane przez RNA komponenty polimerazy RNA RNP = rybonukleoproteina rrnp = rekombinowana RNP vrna = genomowe RNA wirusa WSN = wirus grypy A/WSN/33 wirus WSN-HK: ponownie złożony wirus zawierający siedem genów z wirusa WSN oraz gen NA z wirusa grypy A/HK/8/ Opis rycin Fig. 1. Schemat minigenomu NDV. Górna ilustracja przedstawia plazmid PNDVCAT zawierający promotor T7; sekwencję końcową 5' (5' koniec genomowego RNA, 191nt); wstawione nukleotydy (CTTAA) ; 667nt z CAT ORF; 3' końcowa sekwencja (3' koniec genomowego RNA, 121 nt) miejsca dla Bbsl i nukleaz. Niższa ilustracja przedstawia chimericzne NDV-CAT RNA powstające z transkrypcji in vitro. W wyniku opartej na NDV-amplifikacji oraz transkrypcji chimerycznego NDV-CAT minigenomu, aktywność CAT jest wykrywana w stransfekowanych komórkach. Fig. 2A-C. Schemat wektorów ekspresyjnych PTM1. PTM1-NP koduje białko NP z NDV. PTM1-P koduje białko P z NDV P. PTM1-L koduje białko L z NDV. Fig. 3. Sekwencja RNA z 5' i 3' niekodujących regionów NDV (+ sens) Sekwencje 5' do genu CAT stanowią 121 nt z 5' niekodującego regionu końcowego z pozytywnego genomu NDV zawierającej 65 nt sekwencji liderowej (wytłuszczone) oraz 56 nt z UTR genu Np. Sekwencje 3' do genu CAT stanowią wstawione nukleotydy cuuaa (poniżej) oraz 191 nt z niekodującego regionu pozytywnego genomu NDV zawierające 127 nt z UTR genu dla L, po których następuje 64 nt regionu zapowiadającego (wytłuszczony). Fig. 4A-B Schemat struktury rekombinowanych klonów NDV. RYC 4B, stanowi zakaźny NDV produkujący Env i Gag z HIV. Górny panel, Env I Gag z HIV znajdują się pomiędzy genami M i L. Niższy panel, Env i Gag z HIV są 3' do genu NP. Fig. 5 Schemat 3' i 5' końców z NDV porównanych z sekwencją Kurilla i wsp Virology 145: (3 ' koniec) oraz Yusoff i wsp Nucleic Acids Research 15: (5' koniec) Fig. 6 Oparta na plazmidzie technika odwrócenia dla opartej na NDV ekspresji obcego genu. Komórki są infekowane rekombinowanym wirusem wakcinii produkującym polimerazę T7. Dodatkowo, komórki są transfekowane 1) DNA plazmidowym kodującym białka L, NP i P z NDV pod kontrolą transkrypcyjną promotora T7 (ptm1-l, ptm1-np i ptm1-p, odpowiednio) oraz 2) plazmid DNA kodujący chimeryczny minigenom NDV-CAT pod kontrolą transkrypcyjną promotora T7 (pt7-ndv-cat-rb). Właściwy koniec 3' z minigenomie NDV-CAT został osiągnięty w oparciu o cięcie ułatwione sekwencją rybozymu (KB). Amplifikacja i transkrypcja chimerycznego genomu NDV-CAT prowadzi do aktywności CAT wykrywalnej w stransfekowanych komórkach. Nie kodujące regiony na 3' i 5' końcach minigenomu NDV-CAT są przedstawione jako czarne kwadraty. Fig. 7 Uwalnianie NDV z syntetycznego DNA. Komórki są infekowane rekombinowanym wirusem wakcinii produkującym polimerazę T7. Dodatkowo, komórki są transfekowane 1) DNA plazmidowym kodującym białka L, NP I P z NDV pod kontrolą transkrypcyjną promotora T7 (ptm1-l, ptm1-np i ptm1-p, odpowiednio) oraz 2) plazmid DNA kodujący chimeryczny minigenom NDV-CAT pod kontrolą transkrypcyjną promotora T7 (pt7-ndv+-rb). Właściwy koniec 3' z antygenomie NDV został osiągnięty w oparciu o cięcie ułatwione sekwencją rybozymu (RB). Amplifikacja i transkrypcja antygenomu

8 8 PL B1 NDV prowadzi do uwolnienia zakaźnych wirusów NDV. Niekodujące regiony na 3' i 5' końcach antygenomu NDV są przedstawione jako czarne kwadraty. 5. Opis wynalazku Niniejszy wynalazek dotyczy genetycznie zmodyfikowanych wirusów choroby Newcastle oraz wektorów wirusowych, które mają ekspresję dla heterologicznych genów lub zmutowanych genów wirusa choroby Newcastle lub dla kombinacji genów wirusowych otrzymanych z różnych szczepów wirusa choroby Newcastle. Wynalazek dotyczy konstrukcji i zastosowania rekombinowanych ujemnoniciowych matryc wirusowego RNA dla NDV, które mogą być użyte wraz z zależną od wirusowego RNA polimerazą RNA, celem ekspresji produktów genów heterologicznych w odpowiednich komórkach gospodarza i/lub celem uwolnienia heterologicznego genu w cząsteczkach wirusa. Produkt genu heterologicznego jest peptydem lub białkiem otrzymanym z genomu ludzkiego wirusa niedoboru immunologicznego. Matryce RNA niniejszego wynalazku mogą zostać przygotowane zarówno in vitro jak i in vivo poprzez transkrypcje odpowiednich sekwencji DNA przy użyciu zależnej od DNA polimerazy RNA, takiej jak ta z bakteriofaga T7, T3, polimerazy SP6 lub polimerazy eukariotycznej takiej jak polimeraza I. Rekombinowane matryce RNA mogą być zastosowane do transfekcji stabilnych/stransfekowanych linii komórkowych, które produkują białka zależnej od RNA polimerazy RNA umożliwiającej komplemetację, jak pokazano na drodze praktycznych przykładów. Transkrypty RNA ze sklonowanego DNA zawierającego region kodujący - w orientacji antysensownej - z genu acetylotransferazy chloramfenikolu (CAT) oflankowanej 3' i 5' końcowymi nukleotydami z NDV-CL RNA (California szczep/i 1914/1944- szczep) (Meindl i wsp., 1974 Virology 58: ) były transfekowane do komórek produkujących białka polimerazy NDV. W korzystnym wykonaniu, zastosowany jest nie-wirusowy system replikacji celem odzyskania chimerycznego NDV, w którym palzmidowe DNA kodujące genom lub antygenom NDV ulega koekspresji z DNA plazmidowym kodującym minimalny zestaw białek wirusa choroby Newcastle wymaganych do specyficznej replikacji i ekspresji wirusa, jak pokazano na drodze praktycznych przykładów opisanych infra. Zdolność do rekonstytucji NDV in vivo pozwala na zaprojektowanie nowych chimerycznych wirusów NDV, w których dochodzi do ekspresji obcych genów lub które mają ekspresję zmutowanych genów NDV. Zdolność do rekonstytucji NDV in vivo pozwala również na zaprojektowanie nowych chimerycznych NDV, w których dochodzi do ekspresji genów z różnych szczepów NDV. Jednym ze sposobów tego celu jest modyfikacja istniejących genów NDV. Przykładowo, gen HN może zostać zmodyfikowany celem, zawarcia obcych sekwencji w domenach zewnętrznych. Tam gdzie sekwencje heterologiczne są epitopami lub antygenami patogenów, tego rodzaju chimeryczne wirusy mogą być stosowane do indukcji ochronnej odpowiedzi immunologicznej przeciwko czynnikowi chorobowemu, z którego otrzymano dane determinanty. Zgodnie z niniejszym wynalazkiem, chimeryczne RNA jest konstruowane w taki sposób, że sekwencja kodująca otrzymana z regionu kodującego gp 160 z ludzkiego wirusa niedoboru immunologicznego jest wstawiona do sekwencji kodującej HN a NDV, zaś chimeryczny wirus jest produkowany poprzez transfekcję tego chimerycznego segmentu RNA do komórki gospodarza zainfekowanej dzikim typem NDV. W dalszej kolejności, takie chimeryczne wirusy powinny być zdolne do wzbudzania zarówno odpowiedzi humoralnej jak i komórkowej. Niniejszy wynalazek dotyczy również indukcji inteferonu i szlaków pokrewnych poprzez rekombinowane lub chimeryczne wirusy NDV. Niniejszy wynalazek pozwala na zastosowanie wektorów wirusowych oraz chimerycznych wirusów, celem stworzenia szczepionek przeciwko szerokiemu zakresowi wirusów i/lub antygenów, w tym antygenów nowotworowych. Wektory wirusowe i chimeryczne wirusy niniejszego wynalazku mogą być zastosowane celem modulacji układu immunologicznego podmiotu poprzez stymulacje odpowiedzi humoralnej, komórkowej lub poprzez stymulacje tolerancji na antygen. Jak użyto tutaj, podmioty oznaczają: ludzi, naczelne, konie, krowy, owce, świnie, kozy, psy, koty, ptactwo i gryzonie. Przy dostarczaniu antygenów nowotworowych wynalazek może być zastosowany do leczenia podmiotów mających chorobę poddającą się odrzuceniu immunologicznemu, taką jak guzy rozlane lub małe guzy lite. Uważa się, że dostarczanie antygenów nowotworowych poprzez wektory wirusowe i opisane tu wirusy chimeryczne może być korzystnym środkiem leczenia stosowanym po usunięciu dużych guzów litych. Wynalazek może być również zastosowany do leczenia podmiotów u których podejrzewa się chorobę nowotworową.

9 PL B1 9 Wynalazek w praktycznych przykładach jest zilustrowany przy użyciu NDV-CL (California szczep/1914/1944-szczep), jednakże, może zostać zastosowany jakikolwiek szczep NDV Konstrukcja rekombinowanych matryc RNA. Zidentyfikowano prawidłową sekwencję nukleotydową 5' i 3' końca antysensownych genomów RNA z NDV. Sekwencja nukleotydowa 5' i 3' końców antysensownego genomu RNA znacząco różni się od sekwencji 3' końca NDV poprzednio opisanej jak pokazano na Ryc 5. Identyfikacja właściwej sekwencji nukleotydowej 5' i 3' końców pozwala po raz pierwszy na modyfikacje rekombinowanych matryc RNA dla NDV, ekspresję rekombinowanych matryc RNA oraz uwalnianie rekombinowanych cząsteczek NDV. Niniejszy wynalazek obejmuje nie tylko końce 3' i 5' mające sekwencję nukleotydową pokazaną na Fig. 5, ale również jakiekolwiek modyfikacje lub mutacje dotyczące tych końców lub jakichkolwiek ich fragmentów, które wciąż zachowują funkcje końców dzikiego typu, tj. sygnały wymagane przez aparat syntetyzujący wirusowy RNA do rozpoznania matrycy. Sekwencje kodujące heterologiczny gen oflankowane przez komplementarne wirusowe miejsce wiązania polimerazy/promotor, tj. komplementarny wirusowy 3'-NDV koniec lub komplementarne końce wirusowe 3' i 5' mogą zostać skonstruowane stosując techniki znane fachowcom. Powstające matryce mogą być negatywnie polarne i zawierać odpowiednie sekwencje terminalne, umożliwiające rozpoznanie matrycy przez aparat syntetyzujący wirusowy RNA. Alternatywnie, zastosowane mogą zostać pozytywnie-polarne matryce RNA, które zawierają odpowiednie sekwencje końcowe umożliwiające rozpoznanie przez aparat syntetyzujący RNA rozpoznanie matrycy. Cząsteczki rekombinowanego DNA zawierające te sekwencje hybrydowe mogą być wklonowane i ulegać transkrypcji przez zależną od DNA polimerazę RNA, taką jak polimerazy bakteriofaga T7, T3, polimerazy SP6 lub polimerazy eukariotycznej takiej jak polimeraza I i tym podobnych, celem produkcji in vitro lub in vivo rekombinowanych matryc RNA, które posiadają odpowiednie sekwencje wirusowe pozwalające na rozpoznanie przez polimerazę i aktywność. W wynalazku, jakakolwiek sekwencja heterologiczna może zostać wbudowana do chimerycznych wirusów niniejszego wynalazku, w tym nie ograniczając się do antygenów takich jak 1) antygeny charakterystyczne dla patogenu; 2) antygeny charakterystyczne dla choroby autoimmunizacyjnej; 3) antygenów charakterystycznych dla alergenów oraz 4) antygenów charakteryzujących nowotwory. Przykładowo, sekwencje genów heterologicznych, które mogą zostać zmodyfikowane do chimerycznych wirusów wynalazku dotyczą, ale nie ograniczają się do epitopów ludzkiego wirusa niedoboru immunologicznego (HIV) takich jak gp 160; antygenu powierzchniowego wirusa hepatitis B (HBsAg); glikoprotein herpes wirusa (np. gd, ge); VP1 z poliowirusa oraz determinanty antygenowe takich patogenów niewirusowych jak bakterie i pasożyty, aby wspomnieć chociaż kilka. Antygeny charakterystyczne dla chorób autoimmunologicznych będą zazwyczaj tymi otrzymanymi z powierzchni komórki, cytoplazmy, jądra komórkowego, mitochondriów i tym podobnych tkanek ssaczych, w tym antygeny charakterystyczne dla cukrzycy, stwardnienia rozsianego, tocznia układowego rumieniowatego, reumatycznego zapalenia stawów, anemii złośliwej, choroby Addisona, sklerodermy, cukrzycy młodzieńczej, atroficznego zapalenia przewodu pokarmowego. Antygeny, które są alergenami są zazwyczaj białkami lub glikoproteinami, w tym antygenami otrzymanymi z pyłków, kurzu, pleśni, spór, insektów i żywności. Antygeny, charakterystyczne dla nowotworów zazwyczaj będą otrzymywane z powierzchni komórki, cytoplazmy, jądra komórkowego, organelii i tym podobnych z komórek tkanki nowotworowej. Przykłady dotyczą antygenów charakterystycznych dla białek nowotworowych, w tym białek kodowanych przez mutowane onkogeny; białek wirusowych związanych z nowotworami, oraz glikoprotein. Nowotwory dotyczą ale nie są ograniczone do tych otrzymanych z nowotworów warg, nosogardzieli, krtani oraz jamy ustnej, przełyku, żołądka, odbytnicy, odbytu, okrężnicy, wątroby, pęcherza moczowego, trzustki, tchawicy, płuc oraz oskrzeli, malanomy skóry, raka piersi, macicy, jajowodów, jajników, nerek, mózgu i innych części układu nerwowego, tarczycy, prostaty, jąder, choroby Hodgkina, chłoniaków nie -Hodgkina, mielomy oraz białaczki. W jednym specyficznym wykonaniu wynalazku, sekwencje heterologiczne są otrzymane z genomu ludzkiego wirusa niedoboru immunologicznego (HIV), korzystnie ludzkiego wirusa niedoboru immunologicznego 1 lub ludzkiego wirusa niedoboru immunologicznego 2. W kolejnym wykonaniu wynalazku, heterologiczne sekwencje kodujące mogą zostać wstawione do sekwencji kodujących gen NDV w taki sposób, że produkt genu chimerycznego jest produkowany wraz z heterologiczną sekwencją peptydową wewnątrz białka wirusowego NDV. W takim wykonaniu wynalazku sekwencje heterologiczne mogą być również otrzymane z genomu ludzkiego wirusa niedoboru immunologiczne-

10 10 PL B1 go, korzystnie ludzkiego wirusa niedoboru immunologicznego -1 lub ludzkiego wirusa niedoboru immunologicznego -2. W przypadku kiedy heterologiczne sekwencje pochodzą z HIV, takie sekwencje mogą dotyczyć, ale nie są ograniczone do sekwencji otrzymanych z genu env (tj. sekwencje kodujące całość lub część gp160, gp120, i/lub gp41), genu po1 (tj sekwencje kodujące całość lub część odwrotnej transkryptazy, enzodnukleazy, proteazy i/lub integrazy), gen gag, (tj. sekwencje kodujące całość lub część sekwencji kodujących p7. p6. p55, p17/18, p24/25) tat, rev, nef, vif; vpu, vpr, i/lub vpx. W jeszcze innym wykonaniu sekwencje genu heterologicznego, które mogą zostać zmodyfikowane do chimerycznego wirusa dotyczą tych kodujących białka z aktywnościami immunowzmacniającymi. Przykładami immunomodulatorowych białek są cytokiny, interferon typu 1, gamma interferon, czynniki stymulujące wzrost kolonii, interleukina -1, -2, -4, -5, -6, -12. Jednym ze sposobów konstrukcji tych molekuł hybrydowych jest wstawienie heterologicznej sekwencji kodującej do DNA komplementarnego genowi NDV, w taki sposób, że sekwencja heterologiczna jest oflankowana przez sekwencje wirusowe wymagane do aktywności polimerazy wirusowej., tj. miejsce wiązania polimerazy wirusowej/promotor, oznaczane tutaj jako miejsce wiązania polimerazy wirusowej, tj. miejsce wiązania polimerazy wirusowej/promotor, oznaczane tutaj jako miejsce wiązania polimerazy wirusowej oraz miejsce poliadenylacji. W preferowanym wykonaniu, heterologiczna sekwencja kodująca jest oflankowna przez sekwencje wirusowe, zawierające promotory replikacji z końca 5' i 3', sekwencje początku i końca genu oraz sygnały pakowania, które znajdują się na 5' i/lub 3' końcach. W alternatywnym podejściu, oligonukleotydy kodujące miejsce wiązania polimerazy, tj. komplementarne do 3' końca lub obu końców segmentów genomowych wirusa mogą być wligowane do heterologicznej sekwencji kodującej celem skonstruowania cząsteczki hybrydowej. Umieszczenie obcego genu lub segmentu obcego genu wewnątrz sekwencji docelowej było wcześniej podyktowane przez obecności odpowiednich miejsc dla enzymów restrykcyjnych. Jednakże, ostatnie postępy w biologii molekularnej zmniejszyły ten problem w znacznym stopniu. Miejsca dla enzymów restrykcyjnych mogą być łatwo wprowadzone gdziekolwiek w sekwencji docelowej dzięki zastosowaniu ukierunkowanej mutagenezy np. patrz na przykład, techniki opisywane przez Klunkel, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82,488). Zmiany w reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR), opisane tam, również umożliwiają specyficzne insercje sekwencji (tj. miejsc dla enzymów restrykcyjnych) oraz ułatwiają konstrukcję cząsteczek hybrydowych. Alternatywnie, reakcje PCR mogą być zastosowane celem przygotowania dwuniciowych cząsteczek DNA zawierających promotor kierowanej przez DNA polimerazy RNA. (np. bakteriofagów T3, T7 lub SP6) oraz sekwencję hybrydową zawierającą gen heterologiczny oraz miejsce wiązania polimerazy z NDV. Matryce RNA powinny następnie ulec transkrypcji bezpośrednio z tego rekombinowanego DNA. W jeszcze innym wykonaniu, rekombinowane matryce mogą być przygotowane poprzez zligowanie RNA pochodzących z genu heterologicznego o negatywnej polarności oraz wirusowego miejsca wiązania polimerazy przy użyciu ligazy RNA. Wymagania sekwencji dla aktywności wirusowej polimerazy oraz konstruktów stosowanych w wynalazku są opisane w podrozdziałach poniżej Wprowadzenie sekwencji genu heterologicznego do genów HP, P, NP, M, F oraz L. Segmenty genu kodującego białka HP, P, NP, M, F oraz L mogą zostać zastosowane do wstawienia produktów genów heterologicznych. Wstawienie sekwencji obcego genu do któregokolwiek z tych segmentów może być uzyskane albo poprzez komplementarne zastąpienie wirusowego regionu kodującego genem obcym, bądź poprzez częściowe zastąpienie. Komplementarne zastąpienie najlepiej jest osiągane poprzez zastosowanie ukierunkowanej mutagenezy PCR-em. Krótko, starter A powinien zawierać, od 5' do 3' końca: unikalne miejsce restrykcyjne takie jak miejsce restrykcyjne klasy IIS (tj. enzym przenoszący", rozpoznający specyficzną sekwencję, ale tnący DNA - powyżej lub poniżej sekwencji), odcinek nukleotydów komplementarny do regionu genu NDV oraz odcinek nukleotydów komplementarny do C-końca kodującego odcinek produktu obcego genu. Starter B powinien zawierać od 5' do 3' końca: unikalne miejsce restrykcyjne, odcinek nukleotydów komplementarny do genu NDV oraz odcinek nukleotydów odpowiadający %' kodującej części obcego genu. Po reakcji PCR korzystającej z tych starterów oraz sklonowanej kopii obcego genu, produkt może zostać wycięty i sklonowany przy użyciu unikalnych miejsc restrykcyjnych. Trawienie enzymem klasy IIS oraz transkrypcja oczyszczona polimeraza fagowa powinno doprowadzić do cząsteczki RNA zawierającej dokładnie nie ulegające translacji końce genu NDV ze wstawką obcego genu. W alternatywnym wykonaniu, reakcje PCR powinny zostać zastosowane celem przygotowania dwuniciowego DNA zawiera-

11 PL B1 11 jącego sekwencje promotora bakteriofaga oraz sekwencje genu hybrydowego, tak aby matryce RNA mogły być transkrybowane bezpośrednio bez klonowania Wstawienie sekwencji genu heterologicznego do genu HN. Aktywności hemaglutyniny i neuramidazy z NDV są kodowane przez pojedynczy gen. Białko HN jest główną powierzchniową glikoproteiną wirusa. Dla wielu wirusów, takich jak wirus grypy, hemaglutynina i neuramidaza zawierają szereg miejsc antygenowych. W konsekwencji białko to jest potencjalnym celem odpowiedzi humoralnej po zakażeniu. A zatem, substytucja miejsc antygenowych wewnątrz HN częścią obcego białka może dostarczyć intensywnej odpowiedzi immunologicznej przeciwko obcemu peptydowi. Jeśli sekwencja jest wstawiona wewnątrz cząsteczki HN i ulega ekspresji na zewnątrz HN stanie się immunogenna. Przykładowo, peptyd otrzymany z gp 160 HIV może zastąpić miejsce antygenowe białka HN prowadząc do wzbudzenia odpowiedzi humoralnej. W innym podejściu, sekwencja obcego peptydu może zostać wstawiona wewnątrz miejsca antygenowego bez usuwania jakichkolwiek sekwencji wirusowych. Produkty ekspresji takich konstruktów mogą być użyteczne w szczepionkach przeciwko obcym antygenom, i mogą naprawdę pokonać dyskutowany wcześniej problem o propagacji rekombinowanego wirusa w szczepionym organizmie. Nienaruszona cząsteczka HN z substytucją jedynie w miejscach antygenowych może umożliwiać funkcjonowanie HN, a zatem umożliwiać konstrukcje żywego wirusa. Tym samym wirus może być hodowany bez potrzeby dodatkowych funkcji pomocniczych. Wirus może również ulec atenuacji na inne sposoby celem uniknięcia jakiegokolwiek niebezpieczeństwa przypadkowej ucieczki. Inne konstrukty hybrydowe mogą zostać wykonane celem uzyskania na powierzchni komórek i białek uwalnianych z komórki. Jako glikoproteina powierzchniowa HN ma sekwencję sygnałową cięcia niezbędną dla transportu do powierzchni komórek oraz sekwencje na C-końcu umożliwiając zakotwiczenie. Celem uzyskania pełnego białka na powierzchni komórki koniecznym może okazać się zastosowanie tych sygnałów HN celem stworzenia białka hybrydowego. W tym przypadku, białko fuzyjne może ulegać ekspresji jako oddzielne białko fuzyjne z dodatkowego promotora wewnętrznego. Alternatywnie, jeśli tylko obecne są sygnały transportowe i nieobecna jest domena kotwicząca, białko może być wydzielane poza komórkę Konstrukcja bicistronicznego RNA i ekspresja białka heterologicznego. Bicistroniczne mrma może zostać skonstruowane celem umożliwienia wewnętrznej inicjacji translacji sekwencji wirusowych i umożliwienia ekspresji obcych białek kodujących sekwencje z regularnego końcowego miejsca inicjacji. Alternatywnie, sekwencja bicistronicznego mrna może zostać skonstruowana tam gdzie dochodzi do translacji sekwencji wirusowej z regularnej końcowej otwartej ramki odczytu, podczas gdy sekwencja obca jest inicjowana z miejsca wewnętrznego. Zastosowane mogą zostać pewne wewnętrzne sekwencje wejścia rybosomu (IRES). Wybrane sekwencje IRES powinny być krótkie, tak aby nie wpływać na ograniczenia pakowania wirusa choroby Newcastle. A zatem, korzystnym jest jeśli IRES wybrany do takie bicistronicznego podejścia nie powinien mieć więcej niż 500 nukleotydów długości, z mniej niż 250 preferowanymi nukleotydami. Korzystne jest, aby zastosowane IRES nie miały wspólnych elementów lub homologii strukturalnej z elementami z pikornawirusów. Korzystne elementy IRES dotyczą, ale nie są ograniczone do ssaczych BiP IRES oraz IRES z wirusa zapalenia wątroby typu C. Alternatywnie, obce białko może ulegać ekspresji z nowej wewnętrznej jednostki transkrypcyjnej, w której jednostka transkrypcji ma miejsce inicjacji i poliadenylacji. W kolejnym wykonaniu, obcy gen jest wstawiony do genu NDV w taki sposób, że powstające białko jest białkiem fuzyjnym. 5.2 Ekspresja produktów genu heterologicznego przy użyciu rekombinowanej matrycy RNA. Przygotowane rekombinowane matryce jak opisano powyżej, mogą być użyte na wiele sposobów celem ekspresji odpowiednich produktów genu heterologicznego. W jednym z wykonań rekombinowana matryca może być zastosowana do transfekcji odpowiednich komórek gospodarza, może kierować ekspresją produktu genu heterologicznego na wysokim poziomie. Systemy komórek gospodarza, które dostarczają wysokich poziomów ekspresji dotyczą ciągłych linii komórkowych, które uzupełniają funkcje wirusowe, takie jak np. linie superinfekowane NDV, liniie komórkowe zmodyfikowane tak aby pokrywać funkcje NDV, itp. W alternatywnym wykonaniu wynalazku rekombinowane matryce mogą zostać zastosowane do transfekcji linii komórkowych, które produkują białko polimerazy wirusowej celem osiągnięcia ekspresji heterologicznego produktu genu. Do chwili obecnej, stransformowane linie komórkowe produkujące białko polimerazy takie jak białko L mogą być zastosowane jako odpowiednie komórki gospodarza.