Badanie aktywności przeciwnowotworowej nowej pochodnej 5-phenylo-2-amino-1,3,4- tiadiazoli FABT w komórkach ludzkiego raka płuca. Małgorzata Juszczak

Transkrypt

1 Badanie aktywności przeciwnowotworowej nowej pochodnej 5-phenylo-2-amino-1,3,4- tiadiazoli FABT w komórkach ludzkiego raka płuca Małgorzata Juszczak Zakład Biologii Medycznej, Instytut Medycyny Wsi, Lublin goskazyla@poczta.onet.pl tel Streszczenie Pochodne 2-amino-1,3,4-tiadiazoli stanowią szereg związków o szerokim spektrum właściwości biologicznych, w tym przeciwnowotworowych. Pochodne 5-phenylo-2-amino-1,3,4-tiadiazoli, które są obiektem zainteresowania naszej grupy badawczej zostały zsyntetyzowane i wyselekcjonowane na podstawie analizy QSAR jako związki o potencjalnych właściwościach przeciwnowotworowych. Zbadano wpływ FABT na proliferację komórek nowotworowych raka płuca, raka jelita grubego, glioma oraz rhabdosarcoma-medulloblastoma. Sprawdzony został także ewentualny toksyczny wpływ pochodnej na komórki prawidłowe (fibroblasty skóry, astrocyty i neurony). Analizowano także mechanizmy komórkowe, które potencjalnie mogą być zaangażowane w działanie FABT na poziomie molekularnym. Na podstawie otrzymanych wyników badań stwierdzono, że FABT hamował proliferację komórek nowotworowych w sposób zależny od stężenia, nie będąc przy tym toksycznym dla komórek prawidłowych. Ponadto, zaobserwowano zdolność FABT do obniżania poziomu fosforylacji kinazy ERK1/2 oraz podwyższania poziomu fosforylacji kinazy Akt w komórkach raka płuca linii A549. Wykazano również, że badana substancja hamowała cykl komórkowy w fazie G0/G1 oraz wzrost ekspresji białka p27/kip1. Nie stwierdzono natomiast indukcji apoptozy w komórkach traktowanych FABT. Słowa kluczowe hodowle komórek in vitro, 2-amino-1,3,4-tiadiazole, aktywność przeciwnowotworowa, cytotoksyczność, kinaza ERK1/2, kinaza Akt, cykl komórkowy, p27/kip1, apoptoza

2 Wstęp Mimo znacznego postępu, jaki dokonał się w ostatnich latach w chemioterapii, radioterapii i immunoterapii, opracowanie skutecznej terapii przeciwnowotworowej stanowi poważne wyzwanie dla współczesnej medycyny. Stosowane obecnie leki cytostatyczne wywołują liczne efekty uboczne, które ograniczają skuteczność ich działania oraz obniżają jakość życia pacjentów. Badania kliniczne dowodzą, że chemioterapia jest toksyczna dla układu nerwowego. Poszukiwanie nowych strategii terapeutycznych, a także opracowanie nowych leków działających specyficznie na komórki nowotworowe i nie uszkadzających komórek prawidłowych, w tym komórek nerwowych, stanowi szczególnie pilne zadanie dla badaczy, lekarzy oraz przemysłu farmaceutycznego. Badania in vitro stanowią pierwszy etap oceny przydatności nowych substancji jako potencjalnych leków przeciwnowotworowych. Tematyką niniejszej pracy jest ocena aktywności przeciwnowotworowej nowej pochodnej 2- amino-1,3,4-tiadiazoli 2-(4-fluorophenyloamino)-5-(2,4-dihydroxyphenyl)-1,3,4-thiadiazole (FABT) w modelu badawczym in vitro oraz zbadanie molekularnych mechanizmów zaangażowanych w jej działanie w komórkach nowotworowych. Pochodna ta została zsyntetyzowana w Katedrze Chemii, Uniwersytetu Przyrodniczego w Lublinie. Struktura FABT opiera się na pierścieniu tetrazoliowym. Pierścień tiadiazoliowy został wykorzystany jako szkielet do syntezy wielu pochodnych, które wykazują szereg aktywności farmakologicznych [1]. Pochodne tiadiazoli posiadają aktywność przeciwbakteryjną [2,3], przeciwgruźliczą [4], przeciwgrzybiczą [5] i przeciwwirusową [6]; znalazły zastosowanie w leczeniu leiszmanioz [7] i malarii [8]. W szeregu publikacji zaprezentowano również właściwości przeciwdrgawkowe, przeciwdepresyjne, przeciwbólowe, którymi obdarzone są głównie pochodne indolowe tiadiazoli [9, 10]. Szeroko opisywaną właściwością pochodnych aminotiadiazoli jest ich aktywność przeciwnowotworowa. Zdolność hamowania proliferacji nowotworów testowano zarówno w układach badawczych in vitro [11-16], jak i in vivo [17-23]. Z tego względu nowozsyntetyzowane pochodne 5-phenylo-2-amino-1,3,4-tiadiazoli poddano analizie QSAR (ilościowa zależność pomiędzy strukturą a reaktywnością), która wykazała ich potencjalne właściwości przeciwnowotworowe. Następnie przeprowadzono badania z wykorzystaniem hodowli komórek in vitro. Testy te wykazały zdolność pochodnych chlorowej (4ClABT), fluorowych (FABT, 3FABT) oraz bromowej (BrABT) do hamowania proliferacji komórek nowotworowych pochodzących z guzów układu nerwowego, między innymi glioma, neuroblastoma, astrocytoma, rhabdosarcoma-medulloblastoma, jak i nowotworów narządów obwodowych raka płuc, jelita grubego, piersi, krtani, tchawicy, białaczki T-limfocytarnej czy szpiczaka mnogiego [24-28]. Co ważne, w stężeniach działających antyproliferacyjnie, nie były one toksyczne dla komórek prawidłowych, w tym fibroblastów skóry, hepatocytów, neuronów, astrocytów oraz oligodendrocytów. Zaobserwowano ponadto troficzne działanie FABT w hodowli neuronów poddanych działaniu czynników neurotoksycznych, co może świadczyć o jej działaniu neuroprotekcyjnym. Działanie przeciwnowotworowe pochodnych 5-phenylo-2-amino-1,3,4- tiadiazoli ujawniało się w hamowaniu podziału komórek nowotworowych, obniżaniu poziomu syntezy DNA, zmianie morfologii tych komórek oraz zdolności zmniejszania ruchliwości komórek nowotworowych. Wyniki badań dotyczących przeciwnowotworowej i neuroprotekcyjnej aktywności 5-phenylo-2-amino-1,3,4-tiadiazoli stały się podstawą do opracowania dwóch zgłoszeń patentowych [29, 30].

3 Niniejsza praca jest syntetyczną analizą opisanych dotychczas wyników badań dokumentujących przeciwnowotworowe działanie FABT, ze szczególnym uwzględnieniem komórek raka płuca linii A549. Powstała w oparciu o publikacje: Rzeski W, Matysiak J, Kandefer-Szerszeń M. Anticancer, neuroprotective activities and computational studies of 2-amino-1,3,4-thiadiazole based compound. Bioorganic & Medicinal Chemistry 2007;15: Juszczak M, Matysiak J, Szeliga M, Pozarowski P, Niewiadomy A, Albrecht J, Rzeski W. 2-Amino- 1,3,4-thiadiazole derivative (FABT) inhibits the extracellular signal-regulated kinase pathway and induces cell cycle arrest in human non-small lung carcinoma cells. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 2012, 22, oraz badań w zakresie Projektu badawczego Ministerstwa Nauki i Szkolnictwa Wyższego nr N N Materiały i metody Struktura chemiczna FABT FABT (2-(4-fluorophenyloamino)-5-(2,4-dihydroxyphenyl)-1,3,4-thiadiazole) otrzymano z 4-(4- fluorophenyl)-3-thiosemicarbazide (Lancaster, Germany) i sulfinylbis-(2,4-dihydroxythiobenzoyl) w procesie endocyklizacji. Strukturę chemiczną FABT przedstawia Ryc.1 F N H N N S HO OH Ryc. 1 Struktura 2-(4-fluorophenyloamino)-5-(2,4-dihydroxyphenyl)-1,3,4-thiadiazole (FABT). Hodowle komórkowe. Doświadczenia przeprowadzono z wykorzystaniem komórek nowotworowych linii A549 - ludzki niedrobnokomórkowy rak płuca, HT-29 ludzki rak jelita grubego, TE671 ludzka rhabdomyosarcoma/medulloblastoma (uzyskane z ECACC, European Collection of Cell Cultures) oraz C6 glioma szczurza (uzyskana z Department of Neonatology, Charite-Virchow Clinics, Humboldt University, Berlin, Germany). Cytotoksyczność związku badano wobec: pierwotnej hodowli fibroblastów skóry ludzkiej (HSF- human skin fibroblasts), wprowadzonej z fragmentu skóry izolowanej od zdrowych ochotników; neuronów mysich (hodowla wprowadzona z komórek linii P19 indukowanej do różnicowania kwasem retinowym) oraz szczurzego astrogleju (hodowla izolowana z mózgów osesków szczurzych).

4 Komórki hodowano w podłożach hodowlanych: A549 DMEM+Nutrient Mixture F-12 Ham w stosunku 3:1; C6, HSF DMEM; TE671, HT-29, astroglej - DMEM+Nutrient Mixture F-12 Ham w stosunku 1:1 (Sigma) oraz neurony podłoże Neurobasal +2% B27 Suplement + 2mM L- glutaminy i P19 podłoże Alpha MEM (Gibco). Do płynów hodowlanych, oprócz podłoża Neurobasal, dodano 10% bydlęcej surowicy płodowej (FBS Sigma) oraz antybiotyki: penicylinę ( j/ml) i streptomycynę ( mg/ml). Komórki inkubowano w temperaturze 37 o C w wilgotnej atmosferze 95% powietrza i 5% CO 2. Pierwotna hodowla szczurzego astrogleju Hodowlę astrogleju zakładano z mózgów 3-dniowych szczurów. Tkankę mózgową rozdysocjacjowywano na pojedyncze komórki roztworem 0,25% trypsyny-edta. Komórki zawieszano w podłożu hodowlanym DMEM+Nutrient Mixture F-12 Ham (1:1) z dodatkiem 10% FBS, po czym wylewano na butelki hodowlane o powierzchni 75cm 2. Komórki hodowano w temperaturze 37 o C w wilgotnej atmosferze 95% powietrza i 5% CO 2. Selekcję w kierunku astrocytów przeprowadzano w momencie gdy hodowla uzyskała monolayer, wykorzystując siłę adhezji komórek do podłoża. Butelkę poddano intensywnemu wytrząsaniu tak, aby usunąć komórki słabiej przyklejone do podłoża, w wyniku czego na powierzchni butelki pozostawały najbardziej adherentne astrocyty. Identyfikację astrocytów wykonano poprzez immunocytochemiczne potwierdzenie ekspresji GFAP (glial fibryllary acidic protein). Hodowla neuronów mysich Hodowlę neuronów uzyskano z komórek mysiego potworniaka linii P19 w wyniku indukcji kwasem retinowym. Zawiesinę komórek P19 poddano indukcji różnicowania w kierunku neuronów kwasem retinowym (0,5 M) w podłożu AlphaMEM zawierającym 5% FBS (po 48 godz. od założenia doświadczenia wymieniono płyn hodowlany z kwasem retinowym na świeży). Powstałe neutrosfery (po 5 dniach od indukcji) zebrano i zwirowano dwukrotnie (4 rpm, 5 minut), przepłukując podłożem AlphaMEM bez surowicy. Następnie rozdysocjowywano na pojedyncze komórki za pomocą 0,01% trypsyny w EDTA w temp. 37 o C, po czym zawiesinę neuronów oczyszczono z uwolnionego DNA poprzez trawienie DN-azą. Otrzymaną zawiesinę neuronów wylewano na opłaszczone poli-l-lizyną mikropłytki 96-dolkowe (Nunc) w gęstości 4 x 10 5 kom/ml. Komórki nerwowe hodowano w temperaturze 37 o C w wilgotnej atmosferze 95% powietrza i 5% CO 2, zmieniając podłoże hodowlane co drugi dzień. Do wykonania doświadczeń wykorzystywano neurony dniowe (licząc od dnia założenia hodowli). Oznaczanie stopnia proliferacji komórek metodą MTT Metoda ta została opracowana w celu badania proliferacji i żywotności komórek w obecności substancji cytostatycznych i cytotoksycznych. Komórki aktywne metabolicznie przy udziale dehydrogenaz mitochondrialnych redukują żółtą sól tetrazoliową MTT do niebieskiego formazanu. Nierozpuszczalne w wodzie kryształki formazanu gromadzą się w komórkach i do ich rozpuszczenia konieczne jest użycie detergentu rozbijającego błonę komórkową i jednocześnie rozpuszczającego

5 barwnik. W tym celu używany jest bufor SDS-HCl o ph 7,4. Stężenie uwolnionego barwnika mierzy się ilościowo w czytniku do płytek 96-dołkowych przy długości fali 570 nm. Intensywność barwy jest wprost proporcjonalna do ilości żywych komórek. Na płytce 96-dołkowej z płaskim dnem (Nunc) przygotowano hodowlę komórek linii A549, TE671 o gęstości kom/ml, linii C6-0, kom/ml oraz HT kom/ml. Następnego dnia płyn hodowlany zebrano i komórki poddano działaniu FABT w zakresie stężeń 1 M. Po 96 godz. okresie inkubacji określono żywotność komórek przy pomocy testu MTT. Natężenie wytworzonej w reakcji barwy mierzono w czytniku spektrofotometrycznym Elx800 (BIO-TEK, Highland Park, Winooski, Vermont, USA). Badanie aktywności cytotoksycznej komórkach prawidłowych Na płytce 96-dołkowej przygotowano hodowle komórek prawidłowych: HSF i astrogleju o gęstości kom/ml oraz neuronów 4 x 10 5 kom/ml. Następnego dnia komórki poddano działaniu szeregu stężeń badanych substancji. Po 24 godzinach inkubacji określono żywotność komórek metodą LDH (In Vitro Toxicology Assay Kit, Lactic Dehydrogenase based, Sigma). Test LDH opiera się na określaniu stężenia dehydrogenazy mleczanowej (LDH) w płynie hodowlanym. Substancje działające toksycznie na komórki powodują uszkodzenie błony komórkowej. W wyniku tego do środowiska pozakomórkowego uwalniane są składniki cytoplazmy komórek, między innymi dehydrogenaza mleczanowa. Ilość LDH uwolnionego do podłoża hodowlanego jest proporcjonalna do stopnia uszkodzenia komórek. Metoda opiera się na redukcji NAD do NADH przez komórkową LDH. NADH następnie reaguje z barwnikiem tetrazoliowym, który zmienia kolor. Natężenie wytworzonej w tej reakcji barwy mierzy się spektrofotometrycznie przy długości fali 490nm. Oznaczanie poziomu syntezy DNA w komórce - metoda BrdU (Cell proliferation ELISA, BrdU, Roche Diagnostics) Test wiązania bromodezoksyurydyny (BrdU) opiera się na określeniu wpływu badanych substancji na syntezę DNA w komórkach nowotworowych. Komórki linii A549 wylewano na dołki mikropłytki 96-dołkowej (2 x 10 4 kom/ml). Następnego dnia płyn hodowlany zebrano a komórki poddano działaniu badanych substancji (1- M) zawieszonych w świeżym podłożu hodowlanym. Po 48 godz. wykonano test BrdU według procedury kitu. W trakcie replikacji BrdU jest wbudowywana do DNA. Ilość wbudowanego substratu mierzona natężeniem barwy jest wprost proporcjonalna do aktywności replikacyjnej komórek. Natężenie wytworzonej w reakcji barwy mierzono w czytniku Elx800 przy długości fali 4nm. Określanie zdolności indukcji apoptozy (Cell Death ELISA PLUS, Roche Diagnostics) Test opiera się na wykrywaniu w hodowli poddanej działaniu badanych substancji, monoi oligo-nukleosomów, charakterystycznych markerów fragmentacji DNA i śmierci apoptotycznej komórek. Komórki A549 wylewano na mikropłytki 96-dołkowe. Następnego dnia usuwano podłoże hodowlane i dodawano FABT rozpuszczoną w świeżym płynie hodowlanym. Po 24 godzinach określano poziom apoptozy w komórkach testem Cell Death ELISA, według procedury kitu. Do

6 zlizowanych komórek dodawano przeciwciała wiążące się specyficznie do pofragmentowanego DNA o określonej długości oraz do histonów. Następnie przeciwciała te wiązane były przez przeciwciała II-rzędowe połączone z peroksydazą chrzanową, która w oddziaływaniu z substratem dawała reakcję barwną. Natężenie wytworzonej w reakcji barwy mierzono w czytniku spektrofotometrycznym przy długości fali 405nm. Western Blotting Western Blotting jest metodą immunodetekcji białek. W pierwszym etapie białka zawarte w lizacie komórkowym są poddawane rozdziałowi elektroforetycznemu, kolejnym etapem zaś jest elektrotransfer białek na membranę. Obecność badanych białek na membranie potwierdzana jest przy użyciu specyficznych przeciwciał. Wizualizacja prążków na membranie przeprowadzana jest w reakcji chemiluminescencji będącej efektem działania peroksydazy chrzanowej sprzężonej z przeciwciałami II-rzędowymi. W celu przygotowania próbek do Western Blotting hodowle komórek nowotworowych zostały poddane działaniu FABT przez okres 24 godz. W próbkach zlizowanych buforem RIPA, oznaczano ilość białka metodą BCA (BCA Protein Assay Kit, Pierce), po czym próbki były zawieszane w buforze próbkowym i denaturowane w temp. C przez 5 min. Rozdział elektroforetyczny białek przeprowadzano na żelach poliakrylamidowych 10%. Następnie białka były przenoszone na membranę PVDF na drodze elektrotransferu półsuchego. W kolejnym etapie miejsca niespecyficznego wiązania białek na membranie zostały zablokowane 5% odtłuszczonym mlekiem w TBS / 0,1% Tween przez 1 godz. w temperaturze pokojowej a następnie membrany inkubowano z odpowiednimi przeciwciałami I-rzędowymi (Cell Signalling, Sigma) przez noc w temperaturze 4 C. Stosowano rozcieńczenie przeciwciał zgodnie do zaleceń producenta. Po tym czasie membrany inkubowano z przeciwciałami II-rzędowymi sprzężonymi z peroksydazą chrzanową (Cell Signaling) o odpowiedniej specyfice gatunkowej w standardowym rozcieńczeniu 1:2000 przez 1 godz. w temperaturze pokojowej. Białka na membranie uwidoczniano na drodze reakcji przeprowadzonej przez peroksydazę chrzanową. Na membranę nanoszono substrat dla peroksydazy (ECL Pierce), który był przekształcany w luminol. Reakcje wizualizowano na kliszy fotograficznej (Kodak). Cytometria przepływowa - metoda z oranżem akrydyny Cytometria jest prostą metoda umożliwiającą ocenę ilości komórek znajdujących się w poszczególnych fazach cyklu komórkowego, jak i poziomu apoptozy. Różnicowanie komórek opiera się na pomiarze zawartości DNA i RNA w komórkach w wiązce lasera z wykorzystaniem metachromatycznego fluorochromu oranż akrydyny (AO). Komórki poddane działaniu FABT zawieszano w PBS, po czym dodawano do nich odczynnik zawierający niejonowy detergent TritonX-, który tworzył pory w błonie komórkowej, zwiększając jej przepuszczalność. Następnie dodawano oranż akrydyny barwnik fluorescencyjny wiążący się specyficznie do DNA i RNA komórek. Analizę fluorescencji przeprowadzano w cytometrze FACSCalibur (Becton Dickinson).

7 Wyniki i dyskusja Antyproliferacyjne działanie FABT badane było w szeregu linii nowotworowych. Wykorzystane w doświadczeniach komórki pochodziły zarówno z nowotworów układu nerwowego (neuroblastoma SK-N-AS, glioma C6), jak i guzów narządów obwodowych (rak płuca A549, rak jelita grubego HT-29). Komórki poddano działaniu FABT w zakresie stężeń 1- µm (1; 2,5; 5; 10; 25; i µm) przez okres 96 godz., po czym wykonano test MTT. Następnie obliczono wartości IC (wartość stężenia powodującego zahamowanie proliferacji % komórek) dla każdej linii nowotworowej, które przedstawiono w Tabeli 1. Na postawie wyników powyższego doświadczenia stwierdzono, że FABT hamował proliferację komórek nowotworowych w sposób zależny od stężenia, przy czym nasilenie tego efektu zależało od rodzaju komórek nowotworowych. Najbardziej wrażliwe na działanie badanej pochodnej okazały się komórki raka płuca A549, najbardziej oporne zaś komórki raka jelita grubego HT-29. Linia Typ histologiczny IC (μm) A549 ludzki niedrobnokomórkowy rak płuca 22,8 TE671 ludzka rhabdomyosarcoma medulloblastoma 26 C6 glioma szczurza 27,3 HT-29 ludzki rak jelita grubego 33,1 Tab. 1 Wartości IC obliczone metodą regresji liniowej wg Litchfielda and Wilcoxona [35] na podstawie wyników analizy proliferacji metodą MTT. Powyższe wyniki korelują z aktywnością badanych poprzednio pochodnych z szeregu 5-phenylo-2- amino-1,3,4-tiadiazoli: 3FABT, 4ClABT, 4BrABT [25, 26]. Pochodne te, podobnie jak FABT hamowały proliferację komórek nowotworowych w sposób zależny od stężenia, jednak różniły się one pomiędzy sobą nasileniem efektu antyproliferacyjnego. Pochodne bromowa (4BrABT) i chlorowa (4ClABT) wykazały silniejsze właściwości hamowania podziałów komórek nowotworowych niż FABT. Ponieważ niezwykle istotnym problemem w chemioterapii jest toksyczność leków przeciwnowotworowych wobec prawidłowych tkanek, zbadano wpływ FABT na komórki prawidłowe. W tym celu działaniu FABT poddano pierwotną hodowlę fibroblastów skóry ludzkiej (HSF), pierwotną hodowlę astrogleju szczurzego oraz oligodendrocyty szczurze OLN-93 przez okres 24 godz. Następnie zmierzono poziom toksyczności w hodowlach, w porównaniu z kontrolą przy wykorzystaniu testu LDH. Na podstawie wyników powyższych doświadczeń (Ryc. 2) stwierdzono, że FABT nie był toksyczny dla fibroblastów, astrocytów oraz oligodendrocytów (wzrost poziomu dehyrdogenazy mleczanowej zaobserwowano jedynie przy najwyższym użytym stężeniu FABT - μm w hodowli astrogleju oraz oligodendrocytów). Co więcej, zaobserwowano istotne statystycznie obniżenie poziomu LDH w hodowlach fibroblastów (w zakresie 25- µm) oraz astrogleju (w zakresie 2,5- µm) w porównaniu z kontrolą, co może świadczyć o protekcyjnym

8 % kontroli % kontroli % kontroli działaniu FABT wobec komórek prawidłowych. Podobne wyniki uzyskano dla innych, badanych uprzednio pochodnych z szeregu 5-phenylo-2-amino-1,3,4-tiadiazoli [25, 26]. HSF Astroglej OLN ** ** , FABT [ M] 1 2, FABT [ M] 1 2, FABT [ M] Ryc. 2 Wpływ FABT na żywotność fibroblastów, astrocytów oraz oligodendrocytów po 24 godzinach inkubacji badany metodą LDH. Kolumny przedstawiają poziom LDH w hodowli poddanej działaniu FABT w porównaniu z kontrolą. Różnice istotne statystycznie w odniesieniu do kontroli przy **p< 0,01, p< 0,001, test One-way ANOVA z testem następowym post test Tukey. Kolejnym etapem badań było określenie molekularnych mechanizmów zaangażowanych w działanie FABT w komórkach nowotworowych. Doświadczenia zostały przeprowadzone w komórkach raka płuca linii A549, jako najbardziej wrażliwych na działanie badanej substancji. W celu analizy tego problemu sprawdzono wpływ FABT na poziom syntezy DNA w komórkach, szlaki przekazywania sygnału, progresję cyklu komórkowego oraz zdolność indukcji apoptozy. W pierwszej kolejności zbadano wpływ FABT na poziom syntezy DNA w komórkach A549. Doświadczenie zostało przeprowadzone z wykorzystaniem testu Cell proliferation ELISA, BrdU. Na postawie wyników przedstawionych na Ryc. 3, stwierdzono istotny statystycznie spadek poziomu bromodezoksyurydyny wbudowanej do DNA komórek w stężeniu 10 µm FABT i wyższych. Świadczy to o spadku potencjału replikacyjnego komórek raka płuca poddanych działaniu pochodnej.

9 poziom syntezy DNA (% kontroli) , FABT [ M] Ryc. 3 Wpływ FABT na syntezę DNA w komórkach raka płuca A549 po 48 godz. inkubacji. Kolumny przedstawiają poziom bromodezoksyurydyny wbudowanej do DNA podczas replikacji w hodowli poddanej działaniu FABT w porównaniu z kontrolą. Różnice istotne statystycznie w odniesieniu do kontroli przy p< 0,001, test One-way ANOVA z testem następowym post test Tukey. Następnie oceniano wpływ FABT na główne szlaki przekazywania sygnału zaangażowane w proliferację i przeżycie komórek nowotworowych, jakimi są szlak kinazy ERK1/2 (extracellularsignal regulated kinase) oraz kinazy Akt. W komórkach traktowanych FABT przez 24 godz. metodą Western Blotting badano poziom fosforylacji kinaz, będący miarą ich aktywacji. Stwierdzono, zależny od stężenia FABT, spadek poziomu fosforylacji kinazy perk1/2 oraz wzrost fosforylacji kinazy pakt. Zmiany te nie były efektem różnic w ilości białka w poszczególnych próbkach, o czym świadczy stały poziom β-aktyny. Wyniki zostały przedstawione na Ryc. 4. Obniżenie poziomu aktywacji kinazy ERK1/2, jak podaje piśmiennictwo, może być związane z hiperaktywacją kinazy Akt. Kinazy te regulują nawzajem swoją aktywność w procesach wzrostu komórek nowotworowych, indukcji apoptozy oraz oporności na cytostatyki [31]. Ryc. 4 Analiza poziomu fosforylacji kinaz perk1/2 i pakt metodą Western Blotting po 24 godz. inkubacji z FABT. Jednakową ilość białka w poszczególnym próbkach potwierdzono przeciwciałami skierowanymi przeciwko β-aktynie. Niezwykle istotnym mechanizmem, który może być celem leków przeciwnowotworowych w chemioterapii jest cykl komórkowy. Z tego względu w dalszej kolejności zbadano wpływ FABT na progresję cyklu komórkowego w komórkach A549. Komórki inkubowane z badaną pochodną

10 przez 24 godz. poddano analizie cytometrycznej. Wyniki analizy (Ryc. 5 A) jednoznacznie wskazują, że FABT powodował zablokowanie cyklu komórkowego w fazie G0/G1. Wraz ze wzrostem stężenia substancji rosła ilość komórek znajdujących się fazie G0/G1 cyklu komórkowego, zmniejszała się natomiast ilość komórek w fazach S i G2/M. Dodatkowo ekspresja białek regulujących cykl komórkowy została zbadana metodą Western Blotting. Analizowano poziom białek p21waf1/cip1, p27/kip1 i Cykliny D1 w komórkach poddanych działaniu FABT przez 24 godz. i porównano je z hodowlą kontrolną. Wyniki [Ryc. 5 B] wskazują, że FABT stymulował ekspresję białka p27/kip1, nie zmieniając jednocześnie ekspresji p21waf1/cip1 i Cykliny D1. Stymulacja p27 jest korzystna z punktu widzenia terapii raka płuca, gdyż badania kliniczne wykazały, że obniżenie poziomu ekspresji tego białka jest skorelowane z krótszym czasem przeżycia pacjentów [32]. Ryc. 5 (A) Wpływ FABT na progresję cyklu komórkowego badany metodą cytometrii przepływowej metodą barwienia oranżem akrydyny po 24 godz. inkubacji. Kolumny przedstawiają ilość komórek żywych w porównaniu z kontrolą. Różnice istotne statystycznie w odniesieniu do kontroli przy *p< 0,05, **p< 0,01, p< 0,001, test One-way ANOVA z testem następowym post test Tukey. (B) Analiza ekspresji białka p27 metodą Western Blotting po 24 godz. inkubacji z FABT. Jednakową ilość białka w poszczególnym próbkach sprawdzono przeciwciałami skierowanymi przeciwko β- aktynie. Stwierdzona w badaniach zdolność FABT do modulacji aktywności kinaz oraz blokowania cyklu komórkowego pozostają w zgodności z doniesieniami literaturowymi. Szeroko dyskutowany jest związek pomiędzy zmianami w nasileniu sygnału w komórce przekazywanego w szlaku kinazy ERK1/2 a istnieniem blokady progresji cyklu komórkowego z fazy G1 do fazy S, szczególnie z udziałem białka p27/kip1 [33, 34].

11 Sprawdzono również zdolność FABT do indukowania apoptozy. Test przeprowadzony metodą ELISA wykazał, że badana pochodna nie indukowała śmierci komórek na drodze apoptozy w komórkach A549. Nie stwierdzono istotnych statystycznie różnic w poziomie apoptozy w komórkach poddanych działaniu FABT w porównaniu z kontrolą po 24 godz. inkubacji (dane nie przedstawione). Przedstawione w pracy wyniki świadczą o tym, że FABT wykazuje działanie antyproliferacyjne, nie będąc toksycznym dla komórek prawidłowych. W komórkach raka płuca badana substancja hamowała proces syntezy DNA oraz zmieniała poziom fosforylacji kinaz ERK i Akt. Ponadto, indukowała blokadę cyklu komórkowego w fazie G0/G1, nie powodując apoptozy. Powyższe wyniki są odmienne od rezultatów badania aktywności (E,E)-2,5-bis[4-(3-dimethylaminopropoxy)styryl]-1,3,4-thiadiazole, uzyskanych przez Chou i współpracowników. Stwierdzili oni, że pochodna ta indukowała apoptozę w mechanizmie zależnym od kinazy Akt [15]. Może to świadczyć o tym, że mechanizm działania pochodnych aminotiadiazoli zależy od struktury łańcuchów bocznych przyłączonych do tiadiazolowego rdzenia. FABT, ze względu na swoje właściwości antyproliferacyjne oraz niską toksyczność w stosunku do komórek prawidłowych wydaje się być atrakcyjnym kandydatem na nowy lek przeciwnowotworowy. Osiągnięcie tego celu wymaga potwierdzenia aktywności badanej substancji w badaniach in vivo oraz w próbach klinicznych. Podziękowania Większość badań, których wyniki zawarte są w niniejszej pracy zostało sfinansowane ze środków finansowych Projektu badawczego Ministerstwa Nauki i Szkolnictwa Wyższego nr N N Piśmiennictwo 1. Glossman M. D. Application of density functional theory concepts to the study of the chemical reactivity of thiadiazoles. Journal of Molecular Structure (Theochem) 1995, 330: Chochan Z. H., Rau A., Supuran C. T. Antibacterial Co(II) and Ni(II) complexes of N- 2- (2furanylmethylene)-2-aminothiadiazole and role of SO 4, NO , C 2 O 4 and CH 3 CO 2 on biological properties. Metal-Based Drugs 2002, 8, Tumkevicius S., Labanauskas L., Bucinskaite V., Brukstus A., Urbelis G. Synthesis and structure of benzimidazo[1,2-c][1,2,3]thiadiazoles: first examples of a novel ring system. Tetraedron Letters 2003, 44, Foroumadi A., Asadipour A., Mirzaei M., Karimi J., Emami S. Antituberculosis agents. V. Synthesis, evaluation of in vitro antituberculosis activity and cytotoxicity of some 2-(5-nitro-2- furyl)-1,3,4-thiadiazole derivatives. Il Farmaco 2002, 57, Kumita I., Noda K. Synthesis of antifungal 2-anilino-4-phenylthiazoles and their inhibitory activities on sterol biosynthesis. Journal of Pesticide Science 2001, 26 (2), Ijichi K., Fujiwara M., Nagano H., Matsumoto Y., Hanasaki Y., Ide T., Katsuura K., Takayama H., Shirakawa S., Aimi N., Shigeta S., Konno K., Matsushima M., Yokota T., Baba M. Anti-

12 HIV-1 activity of thiadiazole derivatives: structure-activity relationship, reverse transcriptase inhibition, and lipophilicity. Antiviral Research 1996, 31, Ram V. J., Goel A., Kandpal M., Mittal N., Goyal N., Tekwani B. L., Guru P. Y., Rastogi A. K. Tetraazaacenaphthene, tetraazaphenalene and 1,3,4-thiadiazole derivatives as potential leischmanicides. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 1997, 7 (6), Invidiata F. P., Grimaudo S., Giammanco P., Giammanco L. Synthesis and pharmacological properties of 6-substituted 3-(pyridine-4-yl)-1,2,4-triazole [3,4-b][1,3,4]thiadiazoles. Farmaco 1991, 46 (12), Dogan H. N., Duran A., Rollas S., Sener G., Uysal M. K., Gülen D. Synthesis of new 2,5- disubstituted-1,3,4-thiadiazoles and preliminary evaluation of anticonvulsant and antimicrobial activities. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 2002, 10, Varvaresou A., Siatra-Papastaikoudi T., Tsotinis A., Tsantili-Kakoulidou A., Vamvakides A. Synthesis. Lipophilicity and biological evaluation of indole-containing derivatives of 1,3,4- thiadiazole and 1,2,4-triazole. Il Farmaco 1998, 53, Oettgen HF, Purple JR, Coley VC, Krakoff IH, Burchenal JH. Potentiation of the anti-leucemic effects of 2-aminothiadiazole by isonicotinamide and derivatives. Cancer Research 1964, 24: Nelson JA, Rose LM, Bennett LL Jr. Effect of 2-amino-1,3,4-thiadiazole on ribonucleotide pools of leukemia L1210 cells. Cancer Research 1976, 36, Nelson JA, Rose LM, Bennett LL Jr. Mechanism of action 2-amino-1,3,4-thiadiazole (NSC4728). Cancer Research 1977, 37, Hill DL. Aminothiadiazoles. Cancer Chemother Pharmacol. 1980;4: Chou JY, Lai SY, Pan SL, Jow GM, Chern JW, Guh JH. Investigation of anticancer mechanism of thiadiazole-based compound in human non-small cell lung cancer A549 cells. Biochemical Pharmacology 2003;66: Alam MS, Liu L, Lee DU. Cytotoxicity of New 5-Phenyl-4,5-dihydro-1,3,4-thiadiazole Analogues. Chemical and Pharmaceutical Bulletin 2011, 59, Lu K, Loo TL. The pharmacologic fate of the antitumor agent 2-amino-1,3,4-thiadiazole in the dog. Cancer Chemotherapy and Pharmacology 1980, 4, Steward JA, Ackerly CC, Myers CF, Newman RA, Krakoff IH. Clinical and clinical pharmacologic studies of 2-amino-1,3,4-thiadiazole (A-TDA:NSC 4728). Cancer Chemotherapy and Pharmacology 1986, 16, Asbury RF, Wilson J, Blessing JA, Buchsbaum HJ, DiSaia PJ. Aminothiadiazole (NSC4728) in patient with advanced ovarian carcinoma. A phase II study of the Gynecologic Oncology Group. American Journal of Clinical Oncology1986, 9, Asbury RF, Blessing JA, Mortel R, Homesley HD, Malfetano J. Aminothiadiazole (NSC #4728) in patients with advanced cervical carcinoma. A phase II study of the Gynecologic Oncology Group. American Journal of Clinical Oncology 1987, 10, Locker GY, Khandekar J, Krauss S et al. Phase II trial of aminothiadiazole in previously treated and untreated patients with advanced colorectal carcinoma: an Illinois Cancer Council Trial. Cancer Treatment Reports 1987; 71, Asbury RF, Kramar A, Haller DG. Aminothiadiazole (NSC#4728) in patient with advanced colon cancer. A phase II study of the Eastern Cooperative Oncology Group. American Journal of Clinical Oncology 1987, 10,

13 23. Asbury R, Blessing JA, Smith DM, Carson LF. Aminothiadiazole in the treatment of advanced leiomyosarcoma of the uterine corpus. A Gynecologic Oncology Group study. American Journal of Clinical Oncology 1995, 18, Rzeski W, Matysiak J, Kandefer-Szerszeń M. Anticancer, neuroprotective activities and computational studies of 2-amino-1,3,4-thiadiazole based compound. Bioorganic and Medicinal Chemistry 2007, 15, Juszczak M., Matysiak J., Brzana W., Niewiadomy A., Rzeski W. Evaluation of the antiproliferative activity of 2-(monohalogenophenyl-amino)-5-(2,4-dihydroxyphenyl)-1,3,4- thiadiazoles Arzneimittel-Forschung (Drug Research) 2008, 58, Juszczak M., Matysiak J., Niewiadomy A., Rzeski W. The activity of a new 2-amino-1,3,4- thiadiazole derivative 4ClABT in cancer and normal cells. In vitro study. Folia Histochemica et Cytobiologica, 2011, 49(3), Juszczak M, Matysiak J, Szeliga M, Pozarowski P, Niewiadomy A, Albrecht J, Rzeski W. 2- Amino-1,3,4-thiadiazole derivative (FABT) inhibits the extracellular signal-regulated kinase pathway and induces cell cycle arrest in human non-small lung carcinoma cells. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 2012, 22, J. Matysiak, A. Opolski, Synthesis and antiproliferative activity of N-substituted 2-amino-5-(2,4- dihydroxyphenyl)-1,3,4-thiadiazoles. Bioorganic & Medicinal Chemistry 2006, 14, Niewiadomy A., Matysiak J, Rzeski W., Opolski A. (2004): Nowy związek, zastosowanie nowego związku jako czynnika antynowotworowego oraz sposób otrzymywania nowego związku. Urząd Patentowy RP, zgłoszenie w sprawie uzyskania patentu nr P Niewiadomy A., Matysiak J, Rzeski W. (2004): Nowy związek, zastosowanie nowego związku w leczeniu chorób neurologicznych oraz sposób otrzymywania nowego związku. Urząd Patentowy RP, zgłoszenie w sprawie uzyskania patentu nr P McCubrey JA, Steelman LS, Chappell WH, Abrams SL, Wong EWT, Chang F, Lehmann B, Terrian DM, Milella M, Tafusi A, Stivala F, Libra M, Basecke J, Evangelisti C, Martelli AM, Franklin RA. Roles of the Raf/MEK/ERK pathway in cell growth, malignant transformation and drug resistance Biochimica et Biophysica Acta 2007, 1773, Tsukamoto, S.; Sugio, K.; Sakada, T.; Ushijima, C.; Yamazaki, K.; Sugimachi, K. Reduced expression of cell-cycle regulator p27(kip1) correlates with a shortened survival in non-small cell lung cancer. Lung Cancer 2001, 34, Meloche, S.; Pouyssegur, J. The ERK1/2 mitogen-activated protein kinase pathway as a master regulator of the G1- to S-phase transition. Oncogene 2007, 26, Roovers, K.; Assoian, R. K. Integrating the MAP kinase signal into the G1 phase cell cycle machinery. BioEssays 2000, 22, Litchfield LT, Wilcoxon F: A simpliefied method of evaluation dose-effect experiments. Journal of Pharmacology and Experimantal Therapeutics 1949, 96,