PL B1. Sposób oceny toksyczności substancji chemicznych względem komórek nowotworowych

Transkrypt

1 PL B1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (21) Numer zgłoszenia: (22) Data zgłoszenia: (51) Int.Cl. G01N 33/15 ( ) G01N 33/50 ( ) C12Q 1/02 ( ) B82B 1/00 ( ) (54) Sposób oceny toksyczności substancji chemicznych względem komórek nowotworowych (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 18/12 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 12/16 (73) Uprawniony z patentu: UNIWERSYTET MEDYCZNY IM. KAROLA MARCINKOWSKIEGO W POZNANIU, Poznań, PL UNIWERSYTET IM. ADAMA MICKIEWICZA W POZNANIU, Poznań, PL (72) Twórca(y) wynalazku: MARIA WOŁUŃ-CHOLEWA, Poznań, PL JERZY LANGER, Błażejewko, PL KRZYSZTOF LANGER, Poznań, PL WOJCIECH WARCHOŁ, Luboń, PL (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Wojciech Lisiecki

2 2 PL B1 Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku jest nowy sposób oceny toksyczności substancji chemicznych względem komórek nowotworowych z wykorzystaniem hodowli komórek na nanoustrukturyzowanych strukturach przestrzennych. Wrażliwość poszczególnych nowotworów na substancje chemiczne w szczególności cytostatyczne oraz chemioterapeutyczne jest ustalana empirycznie na podstawie danych pochodzących z badań in vitro oraz testów klinicznych. Schematy chemioterapii z reguły zawierają skojarzenie kilku leków, których skuteczność działania jest określana w badaniach cytotoksycznych na komórkach linii nowotworowych oraz izolowanych z materiału biologicznego. Taką ocenę wrażliwości komórek na substancje chemiczne przeprowadza się na podstawie określenia ich proliferacji lub żywotności w środowisku, w którym znajdują się te substancje. Aktywność biologiczną badanych komórek określa się przy pomocy szeregu testów żywotności, przykładowo testu MTT, XTT czy ATP-TCA, których podstawą jest analiza powstawania metabolitów komórkowych lub ATP [1]. Znane sposoby badania wrażliwości nowotworów na substancje chemiczne opierają się na hodowlach komórek w naczyniach płaskich, ograniczających wzrost komórek w dwóch wymiarach. Sposoby te mają ograniczone zastosowanie, ponieważ pozwalają na ocenę efektów substancji leczniczej tylko względem jednej warstwy komórek. Komórki hodowane na płaskich powierzchniach mają zmieniony metabolizm, proliferację oraz ekspresję genów względem tych samych komórek w formie przestrzennej i dlatego ocena wrażliwości komórek w tych warunkach w znacznym stopniu odbiega od warunków panujących w żywym organizmie. W organizmie żywym (w warunkach in vivo) komórki tworzą struktury przestrzenne. Mogą być przyczepione do różnych powierzchni a ich proliferacja jest wspomagana przez inne komórki, struktury biologiczne czy białka. Całość stanowi bardzo skomplikowane trójwymiarowe środowisko, charakteryzujące się różną dostępnością zarówno substancji odżywczych jak i substancji chemicznych w szczególności leczniczych. Znane są również sposoby hodowli komórek na strukturach przestrzennych, (trójwymiarowych, 3D) o silnie rozbudowanej powierzchni. Umożliwiają one komórkom między innymi lepszy wzrost oraz tworzenie struktur wielowarstwowych, które w porównaniu z hodowlami płaskimi są bliższe warunkom panującym w organizmie żywym. Sposoby te są również stosowane przy ocenie wrażliwości komórek nowotworowych na substancje lecznicze. Przykładami mogą być sferoidy oraz skafoldy. Znany jest sposób hodowli komórek w sferoidach [2]. Sferoidy są to niewielkich rozmiarów pęcherzyki, wewnątrz, których są zamykane hodowane komórki. Sposób ten polega na skomplikowanym oraz wielostopniowym procesie opłaszczania komórek błoną utworzoną przykładowo na bazie glikolu polipropylenowego, a następnie procesu polimeryzacji. Jest to przyczyna ograniczonego zastosowania tej metody w hodowli komórkowej. Sposób ten w znacznym stopniu odzwierciedla warunki in vivo lecz skomplikowana technologia ogranicza jego stosowanie. Innym znanym sposobem jest hodowla na tzw. skafoldach (3D) czyli rusztowaniach przestrzennych [3]. Są to struktury przestrzenne o silnie rozbudowanej powierzchni umożliwiające między innymi lepszy wzrost komórek w trzech wymiarach. Znane są skafoldy wykonane z różnych materiałów porowatych o różnej wielkości por lub materiały włókniste tworzące przestrzenne rusztowanie, na powierzchni których następuje wzrost komórek. W celu prowadzenia wydajnych hodowli komórkowych i tkankowych na znanych skafoldach konieczne jest zapewnienie warunków sterylnych. W trakcie zakładania hodowli niekorzystnym zjawiskiem jest ich potencjalne zakażenie drobnoustrojami. Hodowla komórkowa zanieczyszczona bakteriami nie nadaje się do oceny toksyczności substancji chemicznych względem komórek nowotworowych. Dotychczas stosowane w tym celu podłoża 3D nie posiadały właściwości bakteriostatycznych, bakteriobójczych i przeciw grzybiczych i z tego względu w celu zapewnienia sterylnych warunków stosuje się dodatek substancji bakteriobójczych i grzybobójczych co może mieć wpływ na wynik hodowli, a zatem również na wynik badania. Bezpośrednio przed wykorzystaniem do hodowli komórkowej skafoldy nasącza się płynem hodowlanym, a następnie sterylizuje co najmniej trzy godziny promieniowaniem UV. Procedury przygotowawcze mogą zmieniać własności fizykochemiczne skafoldów, a tym samym wpływać na hodowane na nich komórki nowotworowe. Wadą tychże rusztowań jest nieprzepuszczalność dla światła widzialnego co skutkuje brakiem możliwości oceny morfologicznej komórek, w trakcie badań, pod transmisyjnym mikroskopem świetlnym.

3 PL B1 3 Celem wynalazku było opracowanie sposobu oceny toksyczności substancji chemicznych względem komórek nowotworowych w trakcie hodowli komórek in vitro. Sposób według wynalazku polega na dwuetapowej hodowli komórek nowotworowych na strukturach przestrzennych utworzonych z nanostrukturalnych nano- i mikrokapilar wykonanych metodą elektroprzędzenia z nanokompozytu, w którego skład wchodzą co najmniej dwa polimery klasyczne oraz przewodzący polimer polianilina. W pierwszym etapie hodowlę komórek nowotworowych prowadzi się w płynie hodowlanym, a następnie kontynuuje hodowlę w płynie hodowlanym zawierającym dodatek testowanej substancji chemicznej, po czym przeprowadza się test żywotności. Do hodowli stosuje się nanostrukturalne nano- i mikrokapilary uformowane w dowolne struktury przestrzenne począwszy od spłaszczonych nieregularnych siateczek, poprzez siatki o uporządkowanym układzie, aż po struktury rozbudowane przestrzennie uformowane w pożądane kształty. Korzystne jest stosowanie struktur przestrzennych w formie spłaszczonych nieregularnych siateczek. Korzystne jest stosowanie nano- i mikrokapilar wykonanych z nanokompozytu zawierającego polistyren oraz od 15 do 45% politlenku etylenu oraz od 0,5 do 4% polianiliny względem mieszaniny polistyrenu i politlenku etylenu. Szczególnie korzystne jest stosowanie nanokompozytu zawierającego od 20 do 30% politlenku etylenu i od 0,5 do 1,5% polianiliny względem mieszaniny polistyrenu i politlenku etylenu. W pierwszym etapie zawiesinę komórek nowotworowych przeznaczonych do hodowli nanosi się bezpośrednio na siatki z nanokompozytu, a następnie prowadzi się hodowlę w znany sposób w odpowiednim dla danego typu komórek medium hodowlanym przez okres od 15 do 72 godzin, w zależności od rodzaju hodowanej komórki, najczęściej są to 24 godziny, po czym rozpoczyna się drugi etap polegający na przeniesieniu hodowli komórek do płynu hodowlanego zawierającego testowaną substancję chemiczną a następnie kontynuuje się hodowle przez od 6 do 48 godzin, w zależności od rodzaju hodowanej komórki, po czym określa się żywotność komórek jednym ze znanych testów do analizy cytotoksyczności, w szczególności MTT, XTT czy ATP-TCA. Korzystne jest stosowanie kolorymetrycznego testu MTT lub XTT, w którym sole tetrazolowe MTT lub XTT, wskutek działania mitochondrialnej dehydrogenazy bursztynianowej, enzymu aktywnego tylko w komórkach o nienaruszonym metabolizmie, redukowane są do formazanu. Ilość formazanu oznacza się fotometrycznie i koreluje z liczbą żywych komórek. Jako testowaną substancje chemiczną stosuje się dowolny związek chemiczny wykazujący działanie toksyczne, przykładowo względem komórek nowotworowych, a w szczególności substancje stosowane jako leki cytostatyczne lub chemioterapeutyczne. W celu przygotowania komórek do hodowli pobrany od pacjenta wycinek tkanki nowotworowej poddaje się procesowi izolacji znanymi metodami i sporządza się zawiesinę komórek we właściwym medium hodowlanym. W sposobie według wynalazku zawiesinę komórek nowotworowych, we właściwym dla ich hodowli medium hodowlanym, nanosi się na siatki utworzone z przypadkowo rozmieszczonych lub uporządkowanych w różnym stopniu nano- i mikrokapilar a następnie siatki z naniesionymi komórkami umieszcza się w płynie hodowlanym właściwym dla danego typu komórek. Siatka z naniesionymi komórkami stanowi integralną całość, dlatego można w jednym płynie hodowlanym umieścić kilka równoległych prób, co umożliwia hodowlę w ściśle identycznych warunkach. Eliminuje to wpływ nawet niewielkich różnic w warunkach hodowli kilku równoległych próbek. Hodowlę w znanych warunkach prowadzi się przez okres od 15 do 72 godzin, w zależności od rodzaju hodowanej komórki, najczęściej są to 24 godziny. Następnie nanostrukturalne nano- i mikrokapilary wraz z wyhodowanymi w pierwszym etapie komórkami przenosi się do nowych naczyń hodowlanych zawierających świeże, właściwe dla danego typu komórek, medium hodowlane zawierające dodatek testowanej substancji chemicznej i kontynuuje się hodowlę przez kolejne od 6 do 48 godzin w zależności od rodzaju hodowanej komórki. Po tym czasie określa się żywotność komórek standardowym testem do analizy cytotoksyczności. W pierwszym etapie możliwe jest równoległe hodowanie w tym samym naczyniu zawierającym medium hodowlanym kilku równoległych próbek, które w drugim etapie mogą być hodowane albo w kilku naczyniach zawierających medium hodowlane z dodatkiem tej samej testowanej substancji ale o różnych stężeniach albo każde naczynie hodowlane zawiera medium hodowlane z dodatkiem różnych testowanych substancji. Pierwszy wariant umożliwia, w jednym cyklu hodowlanym, określenie

4 4 PL B1 korzystnego dla terapii stężenia testowanej substancji, a w drugim wariancie wybór substancji wywierającej najkorzystniejszy cytostatyczny wpływ na badane komórki nowotworowe. Sposób według wynalazku jest znacznie prostszy od znanych gdyż: siatki oraz komórki nie wymagają uprzedniego przygotowania jak w przypadku skafoldu czy sferoidów, do badania wystarczają niewielkie ilości materiału komórkowego oraz testowanej substancji chemicznej. W wynalazku podłoże nie wymaga uprzedniej modyfikacji, tak jak ma to miejsce w przypadku stosowania skafoldów. Ponadto, komórki w sposobie według wynalazku nie wymagają procesu opłaszczania jak to ma miejsce w przypadku tworzenia sferoidów. W sposobie według wynalazku komórki osadzone na siatkach można obserwować pod transmisyjnym mikroskopem optycznym co nie jest możliwe w przypadku skafoldów. Jest to bardzo cenna właściwość, ze względu na możliwość prowadzenia oceny morfologicznej komórek hodowanych na siatkach. Dzięki zastosowaniu siatek według wynalazku, które charakteryzują się właściwościami bakteriostatycznymi, wyeliminowano niebezpieczeństwo zakażeń bakteryjnych, które mogą wpływać na wyniki testów cytotoksycznych. Ocena toksyczności substancji chemicznych względem komórek nowotworowych sposobem według wynalazku jest szybka gdyż może być przeprowadzona w czasie od 24 do 48 godzin, a ponadto może być wykonana w każdej pracowni prowadzącej rutynowo hodowle in vitro. Dodatkową zaletą jest możliwość wykonania w pierwszym etapie równoległej inkubacji w tym samym naczyniu dla kilku siatek co eliminuje różnice wynikające nawet z niewielkich różnic w warunkach hodowli. Hodowle na nano-ustrukturyzowanych siatkach mogą być obserwowane pod mikroskopem optycznym transmisyjnym, bez przerywania hodowli jak również nie wymagają barwienia lub destrukcji siatki lub hodowli. Bezpośrednia obserwacja tej samej próbki hodowanych komórek w różnych fazach hodowli zarówno w pierwszym jak i drugim etapie umożliwia ocenę wpływu środowiska na morfologie oraz zdolności proliferacyjnej komórek. Sposób według wynalazku przedstawiono w przykładach, które obrazują, ale nie wyczerpują zakresu stosowania wynalazku. P r z y k ł a d 1 Do badania wykorzystano linie komórkową komórki HeLa wywodzącą się z raka szyjki macicy. Hodowle prowadzono według następującej procedury: 1. Przygotowanie środowiska hodowli komórek. Podłożem do hodowli były siatki z nanoustrukturalnych nano- i mikrokapilar otrzymanych w następujący sposób. 150 mg polistyrenu rozpuszczono w 2 ml chloroformu, następnie powoli dodawano 50 mg politlenku etylenu porcjami po około 10 mg stale mieszając mieszadłem magnetycznym. Następnie roztwór polistyrenu i politlenku etylenu mieszano do całkowitego rozpuszczenia, co trwało ok. 1 godziny, po czym dodano 8 ml zawiesiny polianiliny (17,6 mg PANI) ciągle mieszając do uzyskania jednorodnego rozproszenia polianiliny w roztworze polimerów, co trwało ok. 0,5 godziny. Następnie przeprowadzono proces elektroprzędzenia w niejednorodnym polu elektrycznym z metalowymi elektrodami pod napięciem 4,5 kv przy odległości elektrod 15 cm i prędkości wypływu roztworu polimerów 0,2 ml/min. Otrzymane nano- i mikrokapilary przeniesiono na plastikowe ramki nośne. Podłoże hodowlane w postaci siatek do trójwymiarowego wzrostu komórek umieszczono w naczyniach hodowlanych (płytki Petriego). 2. Proces osadzania komórek na nanostrukturalnych nano- i mikrokapilar w postaci siatek. Komórki linii HeLa, w ilości 7860(±100) komórek na siatkę, nanoszono na podłoże hodowlane w postaci zawiesiny komórkowej medium hodowlanym, którym było podstawowe RPMI wzbogacone 10% surowicą cielęcą FBS, 2 mmol/l L-glutaminą oraz mieszaniną antybiotyków: 100 g/ml streptomycyny i 100 U/ml penicyliny. Podłoże hodowlane z naniesionymi komórkami przenoszono na ok. 30 minut do inkubatora w celu umożliwienia trwałego przyczepienia się komórek do podłoża. Po tym czasie naczynia hodowlane z tak przygotowanymi siatkami z komórkami napełniano medium hodowlanym i inkubowano dalsze 24 godziny. Następnie nanostrukturalne nano- i mikrokapilary wraz z hodowlą przenoszono do nowych naczyń hodowlanych zawierających świeże medium hodowlane z dodatkiem 5-fluorouracylu (5-FU) jako testowanej substancji chemicznej. Wykonano trzy serie hodowli po trzy powtórzenia przy czym w każdej serii użyto innego stężenia 5-fluorouracylu, a mianowicie 2,5, 5,0 oraz 10,0 M. Hodowlę kontynu-

5 PL B1 5 owano przez kolejne 48 godzin. Po tym czasie określono żywotność komórek testem XTT. Uzyskane wyniki przedstawiono w tabeli 1. P r z y k ł a d 2 Postępując jak w przykładzie 1 przeprowadzono hodowlę z użyciem linii komórkowej komórki CHO wywodzące się z raka jajnika. Komórki naniesiono w ilości 13120(±200) na siatkę. Jako medium hodowlane stosowano medium podstawowe RPMI wzbogacone 5% surowicą cielęcą FBS, 2 mmol/l L-glutaminą oraz mieszaniną antybiotyków: 100 g/ml streptomycyny i 100 U/ml penicyliny. Wyniki przedstawiono w tabeli 1. P r z y k ł a d 3 Postępując jak w przykładzie 1 przeprowadzono hodowlę z użyciem linii komórkowej komórki 3T3 stanowiące mysie fibroblasty. Komórki naniesiono w ilości 4620(±100) na siatkę. Jako medium hodowlane stosowano medium podstawowe DMEM wzbogacone 10% surowicą cielęcą FBS, 2 mmol/l L-glutaminą oraz mieszaniną antybiotyków: 100 g/ml streptomycyny i 100 U/ml penicyliny. Wyniki przedstawiono w tabeli 1. Zahamowanie aktywności komórek linii HeLa, CHO oraz 3T3 poddanych działaniu 5-fluorouracylu o stężeniach: 2,5, 5,0 oraz 10,0 M względem komórek kontrolnych niepoddanych działaniu 5-fluorouracylu przedstawiono w tabeli 1, opisują one zahamowanie aktywności mitochondrialnej w zależności od dawki substancji chemicznej względem danego typu komórek. Wyniki podano w procentach jako średnie arytmetyczne wraz z odchyleniami standardowymi (SD). W przypadku stosowanych linii komórkowych otrzymane wyniki wskazują na efekt działania stosowanej substancji leczniczej. We wszystkich typach komórek stwierdzono zmniejszoną żywotność wyrażającą się zmniejszoną redukcją barwnika XTT. T a b e l a 1. 5-FU % HeLa % CHO % 3T3 [ M] średnia SD średnia SD średnia SD 2,5 58,3 1,3 62,1 3,2 29,7 8,7 5,0 60,8 2,8 70,6 9,9 44,6 8,6 10,0 62,8 0,62 63,9 4,3 55,6 3,0 Literatura: 1. Gottfried Konecny et al.: Correlation of Drug Response with the ATP Tumorchemosensitivity Assay in Primary FIGO Stage III Ovarian Cancer. Gynecologic Oncology 77 (2000) Daniela Loessner et al.: Bioengineered 3D platform to explore ccll/ecm interactions and drug resistance of epithelial ovarian cancer cells. Biomaterials 31 (2010) Young-Jin Kima et al.: Three-dimensional gastric cancer cell culture using nanofiber scaffold for chemosensitivity test. International Journal of Biological Macromolecules 45 (2009) Zastrzeżenia patentowe 1. Sposób oceny toksyczności substancji chemicznych względem komórek nowotworowych polegający na hodowli in vitro komórek w środowisku zawierającym toksyczne względem komórek nowotworowych substancje chemiczne oraz na teście żywotności komórek, znamienny tym, że hodowle prowadzi się na nano- ustrukturyzowanych strukturach przestrzennych. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że strukturami przestrzennymi są siatki z nanostrukturalnych nano- i mikrokapilar. 3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że nanostrukturalne nano- i mikrokapilary są wykonane metodą elektroprzędzenia z nanokompozytu, w którego skład wchodzą co najmniej dwa polimery klasyczne oraz przewodzący polimer polianilina.

6 6 PL B1 4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że nano- i mikrokapilary wykonane są z nanokompozytu zawierającego polistyren oraz od 15 do 45% politlenku etylenu oraz od 0,5 do 4% polianiliny względem mieszaniny polistyrenu i politlenku etylenu. 5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że nanokompozyt zawiera od 20 do 30% politlenku etylenu i od 0,5 do 1,5% polianiliny. 6. Sposób według zastrz. 1 albo 2 albo 3 albo 4 albo 5, znamienny tym, że hodowlę prowadzi się w dwóch etapach przy czym w pierwszym etapie hodowle prowadzi się w środowisku pozbawionym toksycznej względem komórek nowotworowych substancji chemicznej a w drugim etapie w obecności substancji toksycznej. Departament Wydawnictw UPRP Cena 2,46 zł (w tym 23% VAT)