PL B1. POLITECHNIKA WROCŁAWSKA, Wrocław, PL

Transkrypt

1 PL B1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (13) B1 (21) Numer zgłoszenia: (51) Int.Cl. A61K 31/662 ( ) A61P 35/00 ( ) Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (22) Data zgłoszenia: (54) Zastosowanie związków bis- -aminoalkanofosfinowych (73) Uprawniony z patentu: POLITECHNIKA WROCŁAWSKA, Wrocław, PL (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 06/06 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 12/12 (72) Twórca(y) wynalazku: MARCIN DRĄG, Wrocław, PL MAŁGORZATA DRĄG-ZALESIŃSKA, Wrocław, PL ANNA MARCINKOWSKA, Radwanice, PL MACIEJ ZABEL, Poznań, PL JÓZEF OLEKSYSZYN, Siechnice, PL (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Halina Winohradnik

2 2 PL B1 Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie związków bis-α-aminoalkanofosfinowych do wytwarzania leków stosowanych w leczeniu chorób nowotworowych oraz w zapobieganiu tym chorobom. Choroby nowotworowe, a szczególnie nowotworowe guzy lite są ciągle wiodącą przyczyną śmierci na świecie. Konwencjonalne metody leczenia chorób nowotworowych obejmują metody chirurgiczne, podawanie pacjentowi związków chemioterapeutycznych i ostatnio wprowadzone metody immunologiczne, które polegają na podawaniu przeciwciał lub ich fragmentów połączonych z molekułami leku np. radioizotopami. Wszystkie te metody dają jednak niepełne powodzenie w leczeniu. Metody chirurgiczne są stosowane z powodzeniem, jeśli nowotwór jest wykryty we wczesnym stadium rozwoju, a na pewno przed etapem przerzutowania do innych organów organizmu. Chemioterapia ma również ograniczony zasięg stosowania, ponieważ leki chemioterapeutyczne są nieselektywne i toksyczne dla większości zdrowych komórek organizmu. Co gorsze, wiele komórek nowotworowych uodparnia się na stosowane leki chemioterapeutyczne i terapia staje się nieskuteczna. Dla przykładu u pacjentów z nowotworem, leczonych cis-platyną często pojawiają się komórki nowotworowe odporne na cis-platynę. Nowe, oparte na metodach immunologicznych terapie stwarzają szereg problemów, jak na przykład kłopoty z efektywnym dostarczeniem immunokompleksu do miejsca nowotworowego oraz poważne problemy z odpowiedzią układu odpornościowego i co za tym idzie neutralizacją kompleksu. W organizmie ludzkim, każdej doby powstaje nowych komórek. Taka sama ilość musi umrzeć. W kodzie genetycznym każdej z takich komórek jest zaprogramowana umiejętność do popełnienia samobójstwa. Proces taki nazywany jest apoptozą inaczej zaprogramowaną śmiercią komórki. Komórki nowotworowe na wskutek mutacji genetycznych (carcinogenesis) utraciły zdolność do apoptozy. Dlatego rosną bez ograniczeń prowadząc do śmierci organizmu. Z japońskiego opisu patentowego, zgłoszonego w trybie międzynarodowym nr PCT/JP98/04118, znane jest monoklonalne przeciwciało specyficznie rozpoznające ludzką proteinę związaną z integryną oraz antygeny, które wywołują apoptozę jądrzastych komórek krwi posiadających proteinę związaną z integryną. Większość leków przeciwnowotworowych w różny sposób i z różną skutecznością indukuje apoptozę komórek nowotworowych i tym samym eliminuje je z organizmu. Mechanizmy tych procesów w większości przypadków są słabo poznane albo wręcz nieznane. Z polskiego zgłoszenia patentowego PL znany jest sposób indukcji apoptozy w komórkach nowotworowych, w którym inicjatorem indukcji apoptozy jest lektyna. otrzymywana z Chelidonium maius, którą dodaje się do komórek nowotworowych linii CHO lub R2C w ilości od 5 do 30 μg/ml hodowli komórek nowotworowych zawierających 1 milion tych komórek, zawieszonych korzystnie w płynie infuzyjnym. W zgłoszeniu PCT/US99/-00637, do leczniczej indukcji apoptozy aktywowanych komórek w miejscu stanu zapalnego, stosuje się chimero we kwasy nukleinowe. Wobec przedstawionych faktów zrozumiałym jest, iż każdy związek zdolny do indukowania apoptozy jest potencjalnym i cennym lekiem przeciwnowotworowym. Kwasy bis-α-aminoalkanofosfinowe i ich pochodne są związkami znanymi w literaturze naukowej i patentowej (Maier L. i inni w J.Organometal. Chem., 1979, 178, 157; DE A1 oraz DE A1). Znane, biologiczne własności kwasów bis-α-aminoalkanofosfinowych i ich pochodnych dotyczą głównie ich aktywności przeciwko proteazie HIV (Peyman A. i inni w Tetrahedron Letters, ). Brak jest w literaturze naukowej i patentowej jakichkolwiek wzmianek o ich zdolnościach do indukcji apoptozy komórek nowotworowych. Według wynalazku do wytwarzania leków przeciwnowotworowych do leczenia nowotworów płuc. stosuje się związki bis-α-aminoalkanofosfinowe o wzorze ogólnym 1, w którym R 1 i R 2 są takie same lub różne i oznaczają grupę alkilową zawierającą od 1 do 2 atomów węgla lub fenylową, a X 1 oznacza H, jako czynniki aktywne indukujące apoptozę komórek nowotworowych. Korzystnie do wytwarzania leków, nadających się do leczenia drobnokomórkowego jak też niedrobnokomórkowego nowotworu płuc, stosuje się chlorowodorek bis[amino(fenylo)metano]fosfinowy lub chlorowodorek amino(fenylo)-metanofosfmowy(p-α-aminoetylo). Zawartość związków bis-α-aminoalkanofosfinowych w postaci leku, stanowiąca efektywną dawkę wystarczającą do indukcji apoptozy komórek nowotworowych, wynosi od 0,01 mg/kg do 200 mg/kg masy ciała pacjenta. Leki wywołujące apoptozę komórek rakowych, zawierające związki będące przedmiotem wynalazku mogą być również używane w leczeniu nowotworów pęcherza, mózgu, karku i głowy, nerek, czerniaka złośliwego, raka jajnika, trzustki, prostaty, macicy, skóry, wątroby, jelita grubego, piersi

3 PL B1 3 i różnych form białaczki. Zdolność do indukcji apoptozy czyni związki będące przedmiotem wynalazku szczególnie przydatnymi w leczeniu guzów litych i zaawansowanych form raka, które nie mogą być leczone na drodze konwencjonalnych metod. W leczeniu chorób nowotworowych kwasy bis-α-aminoalkanofosfinowe lub ich pochodne, których zastosowanie jest przedmiotem wynalazku, mogą być podawane pacjentowi poprzez każdą farmaceutycznie akceptowalną drogę np. doustnie lub dożylnie, podskórnie lub miejscowo. Dawki są uzależnione od stanu pacjenta, rodzaju związku a także od towarzyszącej terapii innymi lekami. Związki bis-α-aminoalkanofosfinowe mogą być skutecznymi inhibitorami aminopeptydazy N, enzymu, którego inhibicja, według ostatnich doniesień, indukuje proces apoptozy komórek nowotworowych (Sekine K., i inni w Leukemia, 1999, 13, ; Scornik O.A. i inni w Curr. Drug Metab. 2001, 2, 67-85). Zdolność wybranych kwasów bis-α-aminoalkanofosfinowych do inhibicji aminopeptydazy N (E.C ) przetestowano przy użyciu enzymu wyizolowanego ze świńskiej nerki i zakupionego w firmie Sigma-Aldrich. Aminopeptydaza N jest enzymem proteolitycznym występujących w' błonach komórkowych (z ang. membrane protease) i posiadającym w centrum aktywnym jeden atom cynku. Jej największe stężenie u ssaków notuje się w nerkach. Katalizuje ona hydrolizę N-końcowego aminokwasu w polipeptydach i białkach. Preferencje substratowe enzymu oscylują przede wszystkim wokół takich aminokwasów jak leucyna, alanina, metionina, nor-leucyna i fenyloalanina. Zdolność związków według wynalazku do wywoływania apoptozy komórek nowotworowych przetestowano na komórkach nowotworowych ludzkiego, epitelialnego raka płuc (Lung carcinoma) - A549 i przylegających w hodowli do podłoża, a zdeponowanych w pracowni hodowli komórkowych Zakładu Biochemii Lekarskiej Akademii Medycznej we Wrocławiu. Linia A549 jest scharakteryzowana w literaturze następująco: Ludzka linia komórkowa typu A549, kaukaska, rak płuc, ECACC Pochodzenie komórek - 58 letni mężczyzna rasy kaukaskiej. Komórki mogą syntezować lecytynę używając cytydynową difosfocholinową ścieżkę metaboliczną. Czasami komórki mogą zawierać ciała inkluzyjne, jednakże nie posiadające żadnych ludzkich patogenów. Morfologia: Epiteliczny, ludzki, kaukaski rak płuc Deponent: ATCC, USA Szczególne właściwości i zawartość: Lecytyna, Duże stężenia nienasyconych kwasów tłuszczowych (ECACC. Salisbury, Wiltshire) Subkulturowa optymalne tempo podziału wynosi 1:3 do 1:6 przy posiewie w ilości 2-4x10,000 komórek/cm 2 używając 0,25% trypsyny lub trypsyny/edta; 5% CO 2 ; 37C. Kariotyp: Hypotryploidalny Medium hodowlane: Dla linii Jurkat używano medium RPMI-1640 (R8758) firmy Sigma z dodatkiem 10% FBS (Fetal Bovine Serum) firmy Cambrax., dla linii A549 stosowano medium MEM (Minimum Essential Medium Eagle M2279) firmy Sigma z suplementacją 0,292 g/l L-glutaminą i 10% FBS firmy Cambrax. Warunki hodowli: Hodowle komórkowe prowadzono w temp. 37 C w atmosferze 5% CO 2. W celu odklejenia komórek linii A549 od podłoża stosowano trypsynizację używając 0,25% Trypsin-EDTA solution (T4049) firmy Sigma. Przedmiot wynalazku jest objaśniony w przykładach wykonania, które w żadnej mierze nie ograniczają jego zakresu. P r z y k ł a d I Aktywność inhibitorowa związków bis-α-aminoalkanofosfinowych w postaci chlorowodorku bis[amino- -(fenylo)metano]fosfinowego wobec aminopeptydazy N. Pomiary kinetyczne wykonano w 50 mm buforze fosforanowym o ph=7,2 i temp. 23 C. Jako substratu użyto L-leucylo-p-nitroanilidu z firmy Sigma rozpuszczonego w DMSO i o stężeniu końcowym 0,05 mm. Stężenia końcowe inhibitora rozpuszczonego w DMSO wynosiły 500 μμ, 100 μμ, 10 μμ, 1 μμ, 0,75 μμ oraz 0,5 μμ, natomiast stężenie końcowe aminopeptydazy N wynosiło 2 μg/ml. Wyniki mierzono jako zmianę absorbancji przy długości fali 410 nm w czasie 10 minut i porównywano z wynikami kontroli polegającej na identycznym pomiarze, bez dodatku czynnika aktywnego. Końcowy skład objętościowy mieszaniny w czasie pomiaru był następujący: roztwór enzymu w buforze - 20 μl, roztwór czynnika aktywnego - 50 μl, roztwór substratu μι i bufor uzupełniający μl. Otrzymana wartość inhibicji dla chlorowodorku bis[amino(fenylo)- metano]fosfinowego wobec aminopeptydazy N (IC 50 ) wynosiła 600 ± 100 nm. P r z y k ł a d II Aktywność inhibitorowa związków bis-α-aminoalkanofosfinowych w postaci chlorowodorku amino(fenylo)metanofosfinowego(p-α-aminoetylo) wobec aminopeptydazy N. Pomiary kinetyczne wykonano

4 4 PL B1 w 50 mm buforze fosforanowym o ph=7,2 i temp. 23 C. Jako substratu użyto L-Ieucylo-p-nitroanilidu z firmy Sigma rozpuszczonego w DMSO i o stężeniu końcowym 0,05 mm. Stężenia końcowe inhibitora rozpuszczonego w DMSO wynosiły 2 mm, 1 mm, 500 μμ, 100 μμ oraz 10 μμ, natomiast stężenie końcowe aminopeptydazy N wynosiło 2 μg/ml. Wyniki mierzono jako zmianę absorbancji przy długości fali 410 nm w czasie 10 minut i porównywano z wynikami kontroli polegającej na identycznym pomiarze, lecz bez dodatku czynnika aktywnego. Końcowy skład objętościowy mieszaniny w czasie pomiaru był następujący: roztwór enzymu w buforze - 20 μl, roztwór czynnika aktywnego - 50 μl, roztwór substratu μι i bufor uzupełniający μl. Otrzymana wartość inhibicji dla chlorowodorku amino(fenylo)- metanofosfinowego(p-α-aminoetylo) wobec aminopeptydazy N (IC 50 ) wynosiła 900 ± 100 μμ. P r z y k ł a d III bis[amino(fenylo)metano]fosfinowego przetestowano w hodowlach komórek A549 w fazie wzrostu stacjonarnego po 72 godzinach przy użyciu testu kometkowego. Przygotowano hodowle komórkowe linii A549 tej samej liczebności wyjściowej zawieszonych w toni, w objętości 0,9 ml. w dołkach (obraz w mikroskopie - pojedyncze, średnio liczne w polu widzenia). Hodowle pozostawiono do zrównoważenia w medium. Po 24 godzinach obraz w polu widzenia mikroskopu taki sam we wszystkich dołkach hodowlanych - tylko komórki żywe, równomiernie rozmieszczone, niezbyt liczne (liczebność nie ogranicza proliferacji). Preparat, w postaci roztworu o stężeniu wyjściowym - 10 mm, rozcieńczono używając medium hodowlanego dla linii A549 do stężenie 0,5mM i przefiltrowano przez filtry bakteriologiczne. Dodano odpowiednio do hodowli uzyskując stężenia efektywne 10 µm, 50 μμ i 125 μn. Po 72 godzinach wykonano test kometkowy polegający na identyfikacji rodzaju uszkodzenia DNA poszczególnych komórek identycznie jak opisano we wcześniejszych publikacjach (Drąg-Zalesińska, M., Wysocka. T., Dumańska. M., Jagoda, E., Zabel, M., Folia Histochemica et Cytobiologica, 40, 125 (2002); Drąg- Zalesińska, M., Wysocka, T., Gębarowska, E., Zabel, M., Folia Histochemica et Cytobiologica, 37, 133 (1999)). Otrzymane wyniki przedstawiono w Tabeli I. uszkodzenie DNA w komórkach 10 μμ 24,1% 8,6% 67,3% 50 μμ 38,7% 29,6% 31,7% 125 μμ 9,2% 31,6% 59,2% Tabela I. Wyniki testu kometkowego w warunkach neutralnych (ph=7) wykonanego dla lini A549 w fazie wzrostu stacjonarnego po 72 godzinach od inkubacji z chlorowodorkiem kwasu bis[amino- (fenylo)metano]fosfinowego. P r z y k ł a d IV amino(fenylo)metanofosfinowego(p-α-aminoetano) po 72 godzinach od inkubacji z linią komórkową A549 w fazie wzrostu stacjonarnego wykonano metodą opisaną w przykładzie III przy stężeniach 50 μμ, 125 μμ i 250 μμ. Dane eksperymentalne przedstawiono w Tabeli II. uszkodzenie DNA w komórkach 50 μμ 30,0% 8,9% 61,1% 120 μμ 85,0% 15,0% 0,0% 250 μμ 98,0% 0,0% 2,0% Tabela II. Wyniki testu kometkowego w warunkach neutralnych (ph=7) wykonanego dla linii A549 w fazie wzrostu stacjonarnego po 72 godzinach od inkubacji z chlorowodorkiem kwasu amino(fenylo)metanofosfinowego(p-α-aminoetylo).

5 PL B1 5 P r z y k ł a d V amino(fenylo)metanofosfinowego(p-α-aminoetylo) przetestowano w hodowlach komórek A549 w fazie wzrostu stacjonarnego po 48 godzinach przy użyciu testu kometkowego. Przygotowano hodowle komórkowe linii A549 tej samej liczebności wyjściowej zawieszonych w toni. W objętości 0,9 ml. w dołkach (obraz iv mikroskopie - pojedyncze, średnio liczne w polu widzenia). Hodowle pozostawiono do zrównoważenia w medium. Po 24 godzinach obraz w polu widzenia mikroskopu taki sam we wszystkich dołkach hodowlanych - tylko komórki żywe, równomiernie rozmieszczone, niezbyt liczne (liczebność nie ogranicza proliferacji). Preparat, w postaci roztworu o stężeniu wyjściowym - 10 mm, rozcieńczono używając medium hodowlanego dla linii A549 do stężenie 0,5 mm i przefiltrowano przez filtry bakteriologiczne. Dodano odpowiednio do hodowli uzyskując stężenia efektywne 50 µm. 125 μμ i 250 μm. Po 48 godzinach wykonano test kometkowy polegający na identyfikacji rodzaju uszkodzenia DNA poszczególnych komórek identycznie jak opisano we wcześniejszych publikacjach (Drąg-Zalesińska, M.. Wysocka, T., Dumańska, M., Jagoda. E.. Zabel, M., Folia Histochemica et Cytobiologica, 40, 125 (2002); Drąg- -Zalesińska, M., Wysocka, T., Gębarowska, E.. Zabel, M., Folia Histoehemiea et Cytobiologiea, 37, 133 (1999)). Otrzymane wyniki przedstawiono w Tabeli III. uszkodzenie DNA w komórkach 50 μμ 55,2% 5,3% 39,5% 125 μμ 73,5% 2,0% 24,5% 250 μμ 65,1% 0,0% 34,9% Tabela III. Wyniki testu kometkowego w warunkach neutralnych (ph=7) wykonanego dla lini A549 w fazie wzrostu stacjonarnego po 48 godzinach od inkubacji z chlorowodorkiem kwasu amino(fenylo)metanofosfinowego(p-α-aminoetylo). P r z y k ł a d VI bis[amino(fenylo)metano]fosfinowego przetestowano w hodowlach komórek A549 we wstępnej fazie wzrostu po 48 godzinach przy użyciu testu kometkowego. Przygotowano hodowle komórkowe linii A549 tej samej liczebności wyjściowej zawieszonych w toni, w objętości 0,9 ml, w dołkach (obraz w mikroskopie - pojedyncze, średnio liczne w polu widzenia). Hodowle pozostawiono do zrównoważenia w medium. Po 24 godzinach obraz w polu widzenia mikroskopu taki sam we wszystkich dołkach hodowlanych - tylko komórki żywe, równomiernie rozmieszczone, niezbyt liczne (liczebność nie ogranicza proliferacji). Preparat, w postaci roztworu o stężeniu wyjściowym - 10 mm, rozcieńczono używając medium hodowlanego dla linii A549 do stężenie 0.5mM i przefiltrowano przez filtry bakteriologiczne. Dodano odpowiednio do hodowli uzyskując stężenia efektywne 10 µm, 50 μμ i 125 μm. Po 48 godzinach wykonano test kometkowy polegający na identyfikacji rodzaju uszkodzenia DNA poszczególnych komórek identycznie jak opisano we wcześniejszych publikacjach (Drąg-Zalesińska, M., Wysocka, T., Dumańska, M.. Jagoda, E., Zabel, M., Folia Histochemica et Cytobiologiea, 40, 125 (2002); Drąg- Zalesińska. M., Wysocka, T., Gębarowska, E.. Zabel. M.. Folia Histoehemica et Cytobiologiea, 37, 133 (1999)). Otrzymane wyniki przedstawiono w Tabeli IV. uszkodzenie DNA w komórkach 50 μμ 55,2% 5,3% 39,5% 125 μμ 73,5% 2,0% 24,5% 250 μμ 65,1% 0,0% 34,9%

6 6 PL B1 Tabela IV. Wyniki testu kometkowego w warunkach neutralnych (ph=7) wykonanego dla linii A549 we wstępnej fazie wzrostu po 48 godzinach od inkubacji z chlorowodorkiem kwasu bis[amino- (fenylo)metano]fosfinowego. Zastrzeżenia patentowe 1. Zastosowanie związków bis-α-aminoalkanofosfinowych, o wzorze ogólnym 1, w którym R 1 i R 2 są takie same lub różne i oznaczają grupę alkilową zawierającą od 1 do 2 atomów węgla lub fenylową, a X 1 oznacza H, do wytwarzania leków przeciwnowotworowych do leczenia nowotworów płuc, jako czynników indukujących apoptozę komórek rakowych. 2. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że do wytwarzania leków nadających się do leczenia drobnokomórkowego oraz niedrobnokomórkowego nowotworu płuc. stosuje się chlorowodorek bis[amino(fenylo)metano]fosfinowy lub chlorowodorek amino(fenylo)metanofosfinowy(p-α-aminoetylo). 3. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że zawartość związków bis-α-aminoalkanofosfinowych w postaci leku, stanowiąca efektywną dawkę wystarczającą do indukcji apoptozy komórek nowotworowych, wynosi od 0,01 mg do 200 mg na kilogram masy ciała pacjenta. Rysunek Departament Wydawnictw UP RP Cena 2,46 zł (w tym 23% VAT)