Metody badania aktywności leków in vitro

Transkrypt

1 Artur Wnorowski Zakład Biofarmacji Uniwersytet Medyczny w Lublinie Wersja: 1.2 Rok: 2016 Metody badania aktywności leków in vitro Cytotoksyczność związków i żywotność komórek

2 Oznaczanie żywotności komórek Czytnik płytek (ang. plate-reader) Cytometria przepływowa (ang. flow cytometry) Mikroskopia HCI (ang. high content imaging)

3 Oznaczanie żywotności komórek Zasada Pośredni pomiar liczebności żywych komórek Oznaczenie aktywności znacznikowej, która jest związana z żywotnością komórek measurement of a marker activity associated with viable cell number Zastosowanie Do pomiaru proliferacji komórek Do oznaczania cytotoksyczności związków Jako wewnętrzna kontrola podczas innych testów komórkowych (ang. multiplexing as an internal control)

4 Oznaczanie żywotności komórek Testy oparte o redukcję soli tetrazolowej different classes of colorimetric tetrazolium reagents Redukcja resazuryny do rezorufiny resazurin reduction Pomiar aktywności proteolitycznej protease substrates generating a fluorescent signal Pomiar stężenia ATP w komórkach luminogenic ATP assay

5 Testy kolorymetryczne i oparte o pomiar fluorescencji Dodanie odczynnika właściwego dla danego testu Inkubacja komórek z odczynnikiem; żywe komórki metabolizują odczynnik do Barwnego produktu Produktu o innej barwie Produktu o właściwościach fluorescencyjnych Detekcja produktu przy użyciu czytnika

6 Testy redukcji soli tetrazolowej Tetrazolium Reduction Assays 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)- 2,5-diphenyltetrazolium bromide Jak się nazywam?

7 Testy redukcji soli tetrazolowej Tetrazolium Reduction Assays Ilość powstającego formazanu ma odpowiadać liczbie żywych (aktywnych metabolicznie) komórek Komórki umierając tracą zdolność to przekształcania MTT w formazan Dokładny mechanizm przemiany MTT w formazan nie jest znany NADH (dinukleotyd nikotynoamidoadeninowy) lub inny związek redukujący jako źródło elektronów Udział mitochondriów w reakcji

8 Testy redukcji soli tetrazolowej Tetrazolium Reduction Assays MTT (3-(4,5-dimethylthiazol- 2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) Pierwszy test zoptymalizowany do oznaczania żywotności na płytkach 96-dołkowych Stężenie: mg/ml; Inkubacja: 1 4 h Absorbancja: 570 nm; Długość kontrolna: 630 nm Uwaga na interferencję z czynnikami redukującymi Effects of the ph dependence of 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide-formazan absorption on chemosensitivity determined by a novel tetrazolium-based assay. Cancer Res Aug 15;49(16):

9 Testy redukcji soli tetrazolowej Tetrazolium Reduction Assays Produkt reakcji jest nierozpuszczalny; w wyniki reakcji powstają kryształy formazanu; konieczność rozpuszczenia przed pomiarem! Komórki U937 inkubowane przez 3 h z odczynnikiem MTT. Widać kryształy formazanu o rozmiarze większym niż same komórki. Rozpuszczalniki: DMSO, zakwaszony izopropanol (wpływa na barwnik w pożywce!), SDS, inne rozpuszczalniki organiczne i detergenty

10 Testy redukcji soli tetrazolowej Tetrazolium Reduction Assays MTT jako alternatywa dla inkorporacji trytowanej tymidyny Porównanie pomiaru żywotności techniką redukcji soli tetrazolowej (na przykładzie odczynnika MTS CellTiter) z testem inkorporacji radioaktywnie znakowanej tymidyny ([ 3 H]tymidyny) w komórkach TF-1 traktowanych czynnikiem wzrostu. Uwaga! MTT nie mierzy bezpośrednio proliferacji, lecz tylko aktywność metaboliczną

11 Testy redukcji soli tetrazolowej Tetrazolium Reduction Assays komórki NIH3t3 0.5 mg/ml MTT Bezpośrednio po dodaniu MTT 4 h po dodaniu MTT Zmiana w morfologii komórek pod wpływem MTT Konieczność optymalizacji stężenia odczynnika MTT Testy MTT jako testy typu endpoint (odczyt kończy eksperyment i uniemożliwia prowadzenia dalszych oznaczeń)

12 Testy redukcji soli tetrazolowej Tetrazolium Reduction Assays MTT Produkt wytrąca się w postaci kryształów Ładunek dodatni; łatwo wnika do żywych komórek (is positively charged and readily penetrates viable eukaryotic cells) MTS, XTT i WST Produkt rozpuszczalny w pożywce Ładunek ujemny; trudno wnikają do komórek (are negatively charged and do not readily penetrate cells) Są używane w połączeniu z akceptorem elektronów, który pośredniczy w transferze elektronów z komórki do cząsteczki soli tetrazolowej (are typically used with an intermediate electron acceptor that can transfer electrons from the cytoplasm or plasma membrane)

13 Testy redukcji soli tetrazolowej Tetrazolium Reduction Assays PES przenosi elektrony z komórkowego NADH na znajdujące się medium cząsteczki MTS, prowadząc do powstania rozpuszczalnego w fazie wodnej formazanu. Pośrednie akceptory elektronów: PMS (phenazine methyl sulfate) PES (phenazine ethyl sulfate, na schemacie) Mechanizm działania: Wnikają do komórki Ulegają redukcji w cytoplazmie Po wydostaniu się z komórki redukują sole tetrazolium do rozpuszczalnego formazanu

14 Testy redukcji soli tetrazolowej Tetrazolium Reduction Assays Testy z wykorzystaniem odczynników: MTS: 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium XTT: 2,3-bis-(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide WST-8: 2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium Prostszy protokół i mniejsze odchylenia pomiędzy powtórzeniami (brak konieczności rozpuszczania kryształów formazanu) w porównaniu z MTT Możliwość odczytywania absorbancji w różnych przedziałach czasowych

15 Redukcja resazuryny do rezorufiny reduction of resazurin to resorufin resazuryna: wskaźnik red-ox redukujące środowisko żywych komórek niebieski

16 Redukcja resazuryny do rezorufiny reduction of resazurin to resorufin Resazuryna rozpuszczalna w wodzie nie wymaga pośrednich akceptorów elektronów (ale ich dodatek przyśpiesza generowanie sygnału) odczyt fluorescencji przy E x = 560 nm i E m = 590 nm

17 Redukcja resazuryny do rezorufiny reduction of resazurin to resorufin sekwencyjne łączenie testów (sequential multiplex) pomiar cytotoksyczności w oparciu o resazurynę oraz pomiar aktywności caspazy-3

18 Redukcja resazuryny do rezorufiny reduction of resazurin to resorufin Bezpośrednio po dodaniu resazuryny 4 h po dodaniu resazuryny Cytotoksyczność resazuryny mierzona jako spadek zawartości ATP w komórkach HepG2 cytotoksyczność resazuryny per se zmiana morfologii komórek oraz uszczuplenie komórkowych zapasów ATP

19 Aktywność proteolityczna protease viability marker assay Substrat: GF-aminofluorocoumarin (glycylphenylalanyl-aminofluorocoumarin; Gly- Phe-AFC; GF-AFC) Krótsza inkubacja niż w przypadku testów z wykorzystaniem MTT/resazuryny (0.5 1 h) Odczyt: E x = nm E m = 505 nm

20 Aktywność proteolityczna protease viability marker assay AFC Assay chemistry. The cell-permeant substrate enters the cell, where it is cleaved by the live-cell protease activity to produce the fluorescent AFC. The live-cell protease is labile in membrane-compromised cells and cannot cleave the substrate.

21 Aktywność proteolityczna protease viability marker assay Assay Multiplexing. The CellTiter-Fluor Reagent was added to wells and viability measured after incubation for 30 minutes at 37 C. Caspase-Glo 3/7 Reagent was added and luminescence measured after a 30-minute incubation (10,000 cells/well).

22 Aktywność proteolityczna protease viability marker assay Bezpośrednio po dodaniu GF-AFC 4 h po dodaniu GF-AFC brak wyraźnych zmian w morfologii komórek traktowanych odczynnikiem GF-AFC brak cytotoksyczność pochodzącej od odczynnika GF-AFC mierzonej jako zmiana wewnątrzkomórkowego stężenia ATP dobry test na żywotność do sprzęgania z innymi oznaczeniami (np. z fluorescencyjnym testem na aktywność kaspaz)

23 Pomiar stężenia ATP w komórkach luminogenic ATP assay Żywe komórki produkują ATP, martwe nie produkują ATP. Ilość ATP zależy od liczby komórek. Im więcej ATP tym więcej utlenionej lucyferyny, a w konsekwencji większa intensywność luminescencji.

24 Pomiar stężenia ATP w komórkach luminogenic ATP assay Skład odczynnika: detergent do lizy komórek inhibitory ATPaz (stabilizacja ATP uwolnionego z komórek) lucyferyna (substrat) lucyferaza (enzym katalizujący reakcję świetlną)

25 Pomiar stężenia ATP w komórkach luminogenic ATP assay Szybki odczyt (maksimum sygnału po 10 min) Brak etapu inkubacji (możliwość automatyzacji) Bardzo duża czułość detekcja nawet poniżej 10 komórek/dołek (możliwość miniaturyzacji, płytki 1536-dołkowe) Drogi (rekombinowany enzym), wymaga luminometru

26 Pomiar stężenia ATP w komórkach luminogenic ATP assay (antagonista receptorów estrogenowych)

27 Oznaczanie żywotności komórek

28 Oznaczanie żywotności komórek Lektura dodatkowa: Is Your MTT Assay Really the Best Choice? Multiplexing Cell-Based Assays: Get More Biologically Relevant Data Cell Viability Assays Viability and Cytotoxicity Assay Reagents