PL B BUP 20/05. Andrzej Niewiadomy,Lublin,PL Joanna Matysiak,Lublin,PL Wojciech Rzeski,Lublin,PL Adam Opolski,Wrocław,PL

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (21) Numer zgłoszenia: (22) Data zgłoszenia: (51) Int.Cl. C07D 285/125 ( ) A61P 35/00 ( ) (54) Pochodna 1,3,4-tiadiazolu, zastosowanie pochodnej 1,3,4-tiadiazolu jako czynnika antynowotworowego oraz sposób otrzymywania pochodnej 1,3,4-tiadiazolu (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 20/05 (73) Uprawniony z patentu: Uniwersytet Przyrodniczy w Lublinie,Lublin,PL Uniwersytet Marii Curie Skłodowskiej, Lublin,PL Instytut Immunologii i Terapii Doświadczalnej, Wrocław,PL Niewiadomy Andrzej,Lublin,PL Matysiak Joanna,Lublin,PL (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 03/10 (72) Twórca(y) wynalazku: Andrzej Niewiadomy,Lublin,PL Joanna Matysiak,Lublin,PL Wojciech Rzeski,Lublin,PL Adam Opolski,Wrocław,PL (74) Pełnomocnik: Hładyniuk Józef W., Biuro Rzecznika Patentowego PL B1

2 2 PL B1 Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku jest nowy związek, jego zastosowanie jako czynnika antynowotworowego oraz sposób otrzymywania nowego związku. 2-Aminotiadiazol i jego pochodne wykazują wielokierunkowe działanie biologiczne, przy czym dość istotne wydają się być właściwości przeciwnowotworowe. Umiarkowaną aktywność układu wyjściowego stwierdzono w stosunku do linii nowotworowych S91 melanoma (czerniak), 8110 glioblastoma 6C3HED lymphosarcoma. Metylo- i acetylo- aminopochodne mają obniżoną czynności antyproliferacyjną. Potwierdzono ich właściwości przeciwnowotworowe w stosunku raka gruczołowego piersi, sarcoma 180 i białaczki P 1534 u myszy. Związki te były dodatkowo aktywne przeciwko białaczce L1210 i 8174 myszy (M.M. Ciotti, S.R. Humphreys, J.M. Venditti, NO. Kaplan, A. Goldin, Cancer. Res. 20, 1195, 1960). Natomiast w przypadku fenylopochodnej nie wykazano czynności w stosunku do wymienionych linii (D.L. Hill, Cancer. Chemother. Pharmacol. 4, , 1980). Znaczną aktywność 2,2'-(metylenodiamino)bis-1,3,4-tiadiazolu stwierdzono w stosunku do białaczki L1210, 6C3HED lymphosarcoma, C1498 białaczki meloblastycznej, sarcoma 180, B16 melanoma (czerniak) i dość słabą w stosunku do wątrobiaków (T. Matsumoto, K. Ootsu, Y. Okada, Cancer Chemother. Rep. 58, 331, 1974). Podstawienie w pozycji C-5 pierścienia heterocyklicznego prowadzi z reguły do osłabienia właściwości przeciwnowotworowych. Dla 5-hydroksy-2-aminotiadiazolu stwierdzono aktywność w stosunku do czerniaka i glioblastoma, natomiast 5-tiolo- i 5-chloropochodne był nieaktywne (D.L. Hill, Cancer. Chemother. Pharmacol. 4, , 1980). Kliniczne zastosowanie 2-aminotiadiazolu komplikuje hiperurikemia i boleści żołądkowe, co wymusza jednoczesne działania zapobiegające tym efektom, jakkolwiek substancja ta została objęta II etapem badań klinicznych. Badania obejmowały między innymi chorych na raka płuc (J.A. Stewart, CC. Ackerly, C.F. Myers, R.A. Newman, I.H. Krakoff, Cancer. Chemother. Pharmacol. 16, , 1986), raka nerki (PI. Elson, L.K. Kvols, SE. Vogl, D.I. Glover, r.g. Hahn, D.L. Trump, P.P. Carbone, ID. Earle, T.E. Davis Invest. New Drugs 6, , 1988), zaawansowanego nowotwora okrężnicy (R.F. Asbury, A. Kramar, D.G. Haller, Am. J. Klin. Oncol. 10, , 1987), zaawansowanego nowotwora jajników (R.F. Asbury, I. Wilson, I. A. Blessing, H.I. Buchsbaum, P.I. DiSaia, Am. J. Klin. Oncol. 9, , 1986), guza mezodermalnego trzonu macicy (R.F. Asbury, I.A. Blessing, D. Moore, Am. J. Klin. Oncol. 19, , 1996) czy zaawansowanego nowotwora jelita grubego (G.Y. Locker, L. Kilton, I.D. Khandeker, T.E. Lad, R.H. Knop, K. Albain, R. Blough, S. French, A.B. Benson, Invest. New Drugs, 12, , 1994). Otrzymane wyniki testów klinicznych z reguły nie dawały podstaw do kontynuowania badań w tym zakresie ze względu na brak dostatecznie pozytywnej reakcji czy pojawianie się różnego rodzaju objawów ubocznych. Ostatnio, szerokie spektrum aktywności w warunkach in vitro wykazano dla N-podstawionego 5-amino-1,3,4-tiadiazolo-2-sulfonamidu testując związki na komórkach kilkudziesięciu linii różnorakich nowotworów ludzkich. Stwierdzono przy tym wyraźny wpływ rodzaju N-podstawienia, zarówno jakościowy jak i ilościowy, na efekt antyproliferacyjny (C.T. Supuran, A. Scozzafava, Eur. J. Med. Chem. 35, , 2000). Również kompleksowe połączenia kationów metali z aminotiadiazolem charakteryzują właściwości przeciwnowotworowe. Dla jonów żelaza(ii) i III z 5-podstawionym-1,3,4-tiadiazolem stwierdzono właściwości antyproliferacyjne w stosunku do linii komórkowej P388 (białaczka limfatyczna myszy). (L. Mishra, M. K. Said, H. Itokawa, K. Takeya, Bioorg. Med. Chem. 3, , 1995). Zgodnie z wynalazkiem opracowano nowy związek 2-(4-fluorofenyloamino)-5-(2,4-dihydroksybenzeno)-1,3,4-tiadiazol (zwany dalej FABT) o wzorze 1, otrzymywany według schematu, przedstawionego na rysunku. 2-(4-fluorofenyloamino)-5-(2,4-dihydroksybenzeno)-1,3,4-tiadiazol (FABT) o wzorze 1 otrzymuje się w reakcji sulfinylo-bis(2,4-dihydroksybenzkarbotioilu), znanego z opisu zgłoszeniowego wynalazku nr P o wzorze 3 z 4-fluorofenylo-3-tiosemikarbazydem o wzorze 2. Reakcję prowadzi się w rozpuszczalniku organicznym, korzystnie alkoholu metylowym, w podwyższonej temperaturze, korzystnie w temperaturze wrzenia rozpuszczalnika organicznego. Wykorzystanie odczynnika sulfinylo-bis(2,4- -dihydroksybenzkarbotioilu) (SBKT) zapewnia przebieg reakcji z zasadami organicznymi i selektywną endocyklizację tioacylopochodnych. Po reakcji S E tego związku z 4-fluorofenylo-3-tiosemikarbazydem dalszy

3 PL B1 3 przebieg procesu warunkuje zdolność stabilizacji struktur liniowych przez przejście tiolowe i oksydacyjne wiązanie H 2 S przez nadmiar elektrofilowego reagenta. W syntezie układu tiadiazolu przebieg cyklizacji z reguły umożliwia zastosowanie FeCl 3 lub Cu(ClO 4 ) 2. Wielkości obliczonych minimalnych energii dla obu izomerów wskazują na ograniczone prawdopodobieństwo tworzenia struktur anularnych Y związku o wzorze 1. Specyficznie podstawiony 2-(4-fluorofenyloamino)-5-(2,4-dihydroksybenzeno)-1,3,4-tiadiazol stanowi nowy związek heterocykliczny o interesującym spektrum aktywności biologicznej nadający się do zastosowania jako czynnik antynowotworowy. FABT już przy stężeniu 100 μm wykazuje silne działanie antyproliferacyjne w stosunku do wszystkich badanych rodzajów komórek nowotworowych. Jednocześnie przy tym stężeniu nie wykazuje aktywności cytotoksycznej. Na podkreślenie zasługuje fakt bardzo silnej aktywności tej substancji w stosunku do komórek białaczkowych (Jurkat). FABT ma szczególne, nieopisywane w piśmiennictwie medycznym właściwości, co można wykorzystać w leczeniu nowotworów. P r z y k ł a d I. 0,02 mola sulfinylo-bis(2,4-dihydroksybenzkarbotioilu) i 0,01 mola 4-fluorofenylo-3- -tiosemikarbazydu przeniesiono do 50 ml metanolu i ogrzewano do wrzenia (3h). Mieszaninę poreakcyjną przesączono na gorąco a przesącz zadano 100 ml wody. Wydzielony związek odsączono, przemywano wodą i wysuszono. Krystalizowano z metanolu (70 ml), t.t C Charakterystyka analityczna Analiza elementarna dla wzoru: C 14 H 10 FN 3 O 2 S (303,34) %N obliczony: 13,84; znaleziony: 13,76 EI-MS: M m/z (pik główny), fragmentacje (m/z): 168, 141, 136, 109, 94, 83, 66, 52. [ 1 H]NMR (DMSO-d 6,TMS), δ (ppm): 10,85; 10,27; 9,92 IR (cm -1 ): 3400, 3259, 3218, 3166, 1629, 1590, 1510, 1476, 1449, 1411, 1325, 1252, 1231, 1183, 1134, 1113, 1052, 1013, 987, 967, 875, 825. P r z y k ł a d II. Wyniki badań aktywności cytostatycznej FABT Badania wykonano w Laboratorium Immunologii Nowotworów Instytutu Immunologii i Terapii Doświadczalnej PAN we Wrocławiu. W teście przesiewowym zastosowano linię komórkową HCV29T (rak pęcherza moczowego) a ponadto linie A549 (rak płuc), SW707 (rak odbytnicy) i T47D (rak piersi). Aktywność cytostatyczna FABT badano pod względem przydatności do hamowania podziału komórek. Wymienione linie były hodowane w medium opti-mem z dodatkiem 5% FCS, 50 μg/ml streptomycyny, 50 U/ml penicyliny i 2 mm glutaminy. Komórki utrzymywano w 37 C w wilgotnej atmosferze 5% CO 2. Test hamowania proliferacji Do 24-godzinnej hodowli komórek dodawano badany FABT, przygotowując roztwory wyjściowe o stężeniu 1 mg/ml ex tempore do każdego doświadczenia przez rozpuszczenie 1 mg związku w 100 μl DMSO μl medium hodowlanego. Rozpuszczalnikiem dla dalszych rozcieńczeń było medium hodowlane. Związek testowano w stężeniach końcowych 100, 10, 1, 0.1 μg/ml. Po 72-godzinnej inkubacji z testowanym związkiem badano zahamowanie proliferacji komórek. Badania wykonano przy użyciu testu SRB mierzącego zahamowanie proliferacji komórek docelowych (Skehan et al., J. Natl. Cancer Inst., 82: , 1990) w hodowli in vitro. Próby wykonano w trzech powtórzeniach. Równolegle prowadzono badania w stosunku do kompleksów Pt(II), jako układów porównawczych. Wyniki w postaci ID 50 (dawka powodująca zahamowanie proliferacji 50% populacji komórek nowotworowych) wyznaczone na poszczególnych liniach nowotworowych zebrano w tabeli. Wartości ID wyznaczano dla każdego doświadczenia, a następnie obliczono średnie i odchylenie standardowe (SD). Przyjętym kryterium selekcji w zastosowanych badaniach przesiewowych in vitro jest poziom ID 50 nie wyższy niż 4 μg/ml (Geran RI i wsp. Cancer Chemotherapy Reports, 3, 2(part3): 59-61, 1972).

4 4 PL B1 T a b e l a. Aktywność cytotoksyczna FABT oraz chemioterapeutyków przeciwnowotworowych: cis-platyna, karboplatyna, wobec komórek ludzkich linii nowotworowych, wyrażona jako ID 50 w μg/ml Związek linia komórkowa / ID 50 [μg/ml] HCV29T A549 SW707 T47D FABT 6,2 ± 1,4 Neg 3,6 ± 1,1 4,2 ± 1,2 Cisplatyna nie badano 3,6 ± 1,4 nie badano 6,2 ± 1,5 Karboplatyna nie badano 40 ± 1,0 nie badano Neg. Przedstawione chemioterapeutyki należą do kompleksów Pt(II). Cisplatyna (cisdichlorodiaminoplaty-nall) stosowana jest w monoterapii, jak i łącznie z innymi statykami, m. in. w raku jajnika, jądra, pęcherza moczowego. Jest lekiem skutecznym, ale ze względu na działania uboczne: nefrotoksyczne, ototoksyczne, neurotoksyczne jest też lekiem niebezpiecznym. Karboplatyna (cyklobutanodikarboksylodiaminoplatynall) zaliczana jest do leków drugiej generacji. Wykazuje mniej objawów niepożądanych i jest lepiej tolerowana przez chorych. P r z y k ł a d III. Przeciwnowotworowa aktywność FABT Wyniki badań realizowanych w Katedrze Immunologii i Wirusologii UMCS w Lublinie. Materiały i metody. Stosowano wyjściowe 10mM i 100mM w DMSO. Roztwory robocze przygotowywano poprzez odpowiednie rozcieńczenie roztworów wyjściowych w podłożu hodowlanym. Wykorzystano następujące hodowle komórkowe. 1. Jurkat E6.1 - ludzkie komórki nowotworowe białaczki T-limfocytarnej; 2. TE ludzkie komórki nowotworowe rhabdosarcoma/medulloblastoma; 3. SK-N-AS - ludzkie komórki nowotworowe neuroblastoma; 4. A549 - ludzkie komórki nowotworowe raka płuc; 5. HT-29 - ludzkie komórki nowotworowe raka jelita grubego; 6. FTC ludzkie komórki raka tarczycy; 7. FAO - linia hepatocytów szczura jako linia porównawcza. Linie 1, 4 i 5 otrzymano z Instytutu Immunologii i Terapii Doświadczalnej PAN we Wrocławiu. Hodowle 2, 3, 6 i 7 uzyskano z European Collection of Cell Cultures, Salisbury, UK. Podłoża hodowlane Komórki Jurkat E6.1 hodowano w podłożu RPMI-1640, komórki linii TE 671, SK-N-AS i FTC 238 hodowano w podłożu DMEM:F-12 HAM (1:1), komórki linii A549 hodowano w podłożu DMEM:F- -12 HAM (2:1), komórki HT-29 w podłożu DMEM a komórki linii FAO w podłożu HAM's F12K. Do podłoża hodowlanego dodawano 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 100 j/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny. Podłoża hodowlane RPMI-1640, DMEM:F-12 HAM, DMEM pochodziły z firmy Sigma (Sigma, St. Louis, MO, USA), podłoże HAM's F-12K pochodziło z firmy ICN (ICN Pharmaceuticals, Costa Mesa, CA, USA). Bydlęca surowica płodowa (FBS) pochodziła z firmy Life Technologies (Life Technologies, Karlsruhe, Germany). Pozostałe odczynniki pochodziły z firmy Sigma. Przygotowanie hodowli komórkowych. Komórki przechowywane w banku tkanek w ciekłym azocie, rozmrażano w temp. 37 C, następnie przelewano do butelek plastykowych zawierających odpowiednie podłoże hodowlane. Komórki hodowano w temperaturze 37 C w inkubatorze z 5% przepływem CO 2. Po namnożeniu komórek, płyn zlewano, komórki przepłukiwano PBS (bez jonów wapnia i magnezu) i poddawano działaniu 0.25% roztworu trypsyny + EDTA, w celu otrzymania zawiesiny komórek potrzebnej do założenia doświadczenia. Hodowla astrogleju Hodowle zakładano z mózgów 18-dniowych płodów szczurzych. Tkankę mózgową poddano dysocjacji na pojedyncze komórki roztworem 0.25% trypsyny-edta. Komórki zawieszano w podłożu hodowlanym (DMEM:F-12 HAM (1:1) + 10% FBS) i wylewano na plastykową butelkę hodowlaną o powierzchni 75 cm 2. Komórki hodowano w temperaturze 37 C w inkubatorze z 5% przepływem CO 2. Selekcję w kierunku astrocytów przeprowadzono w momencie całkowitego pokrycia przez rosnące komórki powierzchni butelki hodowlanej. W tym celu butelkę poddano intensywnemu wytrząsaniu tak aby usunąć komórki słabiej przyklejone do podłoża. Identyfikację astrocytów potwierdzono immunocytochemicznie barwiąc komórki w kierunku charakterystycznego markera GFAP (glial fibryllary acidic protein).

5 PL B1 5 Oznaczanie aktywności antyproliferacyjnej badanych substancji w hodowli komórkowej. Do mikropłytki 96-dołkowej z płaskim dnem (firmy NUNC, Roskilde, Denmark) rozlewano przygotowaną wcześniej zawiesinę komórek w podłożu hodowlanym, o gęstości: kom/ml (Jurkat, TE 671, A549), kom/ml (FTC 238) oraz kom/ml dla HT-29 i SK-N-AS w objętości 100 μl na dołek. Po przyklejeniu komórek (24 godz.) ostrożnie ściągano płyn i następnie dodawano różne stężenia badanej substancji w płynie z dodatkiem 10% FBS (100 μl na dołek). Hodowle na płytkach poddawano 96-godzinnej inkubacji w temp. 37 C, w atmosferze 95% powietrza i 5% CO 2. Aktywność antyproliferacyjną badanego związku określano metodą MTT. Oznaczanie aktywności cytotoksycznej. Do mikropłytki 96-dołkowej z płaskim dnem rozlewano przygotowana wcześniej zawiesinę komórek linii FAO oraz astrogleju o gęstości kom/ml w objętości 100 μl na dołek. Następnego dnia po przyklejeniu się komórek, ostrożnie ściągano płyn i następnie dodawano różne stężenia badanej substancji w podłożu hodowlanym, w którym stężenie surowicy zostało obniżone do 2%. Płytki inkubowano przez 48 godzin w temperaturze 37 C, w inkubatorze z przepływem 5% CO 2. Żywotność komórek określano metodą MTT. Metoda MTT (wg kitu Cell proliferation kit III, Boehringer Manheim) Metoda ta została opracowana w celu oznaczania proliferacji i żywotności komórek w badaniach substancji o działaniu cytotoksycznym i antyproliferacyjnym. W komórkach metabolicznie czynnych żółta sól tatrazoliowa MTT, redukowana jest do niebieskiego formazanu, przy udziale dehydrogenaz mitochondrialnych. Nierozpuszczalne w wodzie kryształki formazanu gromadzą się w komórkach i do ich rozpuszczenia konieczne jest użycie organicznego detergentu rozbijającego błony i jednocześnie rozpuszczającego barwnik. W tym celu używany jest bufor SDS-HCl o ph 7,4. Stężenie uwolnionego barwnika mierzy się ilościowo w czytniku do płytek 96-dołkowych przy długości fali 570 nm. Intensywność zabarwienia jest wprost proporcjonalna do ilości żywych komórek. Roztwór MTT w PBS o stężeniu 5 mg/ml, dodawano w ilości 15 μl do każdego dołka na plastykowej płytce. Płytki inkubowano przez 3 godz. w temp. 37 C, po tym czasie dodawano do każdego dołka 100 μl buforu SDS-HCl i pozostawiano na noc w temp. 37 C. Wynik odczytywano następnego dnia przy użyciu czytnika E-max Reader (Molecular Devices Corporation, Menlo Park, CA, USA). Ocena morfologii komórek. Komórki linii TE671 wylewano na komorę typu Lab-Tek Chamber Slide (NUNC) w ilości 5 x Następnego dnia zmieniono podłoże hodowlane i dodawano świeże podłoże z dodatkiem FABT w stężeniach 50 i 100 μm. Po 48 godzinach komórki barwiono metodą May-Grünwalda-Giemsy. Oceny morfologii komórek dokonano przy pomocy mikroskopu świetlnego Olympus B-51 (Olympus Optical Co, LTD, Tokyo, Japan). Zdjęcia wykonano przy użyciu programu analysis (Soft Imaging Sysytem GmGH, Münster, Germany). Wyniki Ocena aktywności antyproliferacyjnej Aktywność antyproliferacyjną FABT określano w hodowlach różnego rodzaju ludzkich komórek nowotworowych: białaczkowych (Jurkat), rhabdosarcoma/medulloblastoma (TE671), neuroblastoma (SK-N-AS), raka płuc (A549), raka jelita grubego (HT-29), raka tarczycy (FTC 238). Komórki poddano działaniu substancji w stężeniach 10, 25, 50 i 100 μm przez okres 96 godzin. FABT charakteryzował się silną aktywnością antyproliferacyjną w stosunku do komórek białaczkowych - Jurkat. Już przy stężeniu 10 μm następowało 80% zahamowanie wzrostu komórek a dawka 50 μm hamowała wzrost w 99%. W przypadku komórek linii A549, TE671, HT-29 znaczące zahamowanie wzrostu następowało przy stężeniu 25 μm i wynosiło odpowiednio 52%, 48% i 40%. Komórki neuroblastoma (SK-N-AS) były mniej wrażliwe. Zahamowanie wzrostu o 35% następowało przy stężeniu 50 μm. Komórki raka tarczycy (FTC 238) charakteryzowały się największą opornością na działanie FABT. W tym przypadku stężenie 50 μm powodowało nieznaczne 11% zahamowanie wzrostu. Dopiero dawka 100 μm powodowała silny, 76% efekt (Wykres 1). Ocena morfologii komórek FABT powodował znaczące zmiany w morfologii komórek TE671. W porównaniu z hodowlą kontrolną następowało wyraźne obkurczenie cytoplazmy i wydłużenie komórek. Efekt ten nasilał się ze wzrostem dawki. Fotografia 1 przedstawia hodowlę kontrolną, fotografia 2 przedstawia hodowlę poddaną działaniu dawki 50 μm zaś fotografia 3 przedstawia hodowlę poddaną działaniu dawki 100 μm. Ocena aktywności cytotoksycznej

6 6 PL B1 Ocenę cytotoksyczności FABT przeprowadzono w hodowli hepatocytów szczurzych (linia FAO) i astrogleju. Komórki poddano działaniu związku w dawce 10, 50, 100, 250 i 500 μm przez okres 48 godzin. Badany związek charakteryzował się niską cytotoksycznością w stosunku do komórek FAO (wykres 2) i astrogleju (wykres 3). Znaczący spadek żywotności komórek o 25% (hepatocyty) i 97,5% (astroglej) pojawiał się dopiero przy stężeniu 250 μm. Zastrzeżenia patentowe 1. 2-(4-fluorofenyloamino)-5-(2,4-dihydroksybenzeno)-1,3,4-tiadiazol o wzorze (4-fluorofenyloamino)-5-(2,4-dihydroksybenzeno)-1,3,4-tiadiazol o wzorze 1 dla zastosowania jako czynnik antynowotworowy. 3. Sposób otrzymywania 2-(4-fluorofenyloamino)-5-(2,4-dihydroksybenzeno)-1,3,4-tiadiazolu o wzorze 1, znamienny tym, że poddaje się reakcji sulfinylo-bis(2,4-dihydroksybenzkarbotioil o wzorze 3 z 4-fluorofenylo-3-tiosemikarbazydem o wzorze 2 a reakcję prowadzi się w rozpuszczalniku organicznym w podwyższonej temperaturze. 4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że jako rozpuszczalnik organiczny stosuje się alkohol metylowy. 5. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że reakcję prowadzi się w temperaturze wrzenia rozpuszczalnika organicznego.

7 PL B1 7 Rysunki

8 8 PL B1

9 PL B1 9

10 10 PL B1 Departament Wydawnictw UP RP Cena 2,00 zł.