BIOLOGIA KOMÓRKI. Mikroskopia fluorescencyjna -2 Przyżyciowe barwienia organelli wewnątrzkomórkowych

Transkrypt

1 BIOLOGIA KOMÓRKI Mikroskopia fluorescencyjna -2 Przyżyciowe barwienia organelli

2 Wstęp Komórki eukariotyczne, w odróżnieniu od komórek prokariotycznych (bakterie, archeony) posiadają wysoce skomplikowaną strukturę wewnętrzną. Eukarionty mają bowiem jądro komórkowe ograniczone otoczką jądrową, zawierające DNA z histonami upakowane w chromosomy, skomplikowany system organelli błonowych: siateczkę śródplazmatyczną gładką (SER) i szorstką (RER), aparat Golgiego, endosomy oraz lizosomy, które razem tworzą szlak wydzielniczy komórki, oraz mitochondria, plastydy (komórka roślinna) i peroksysomy. Dzięki obecności systemu błon biologicznych, który warunkuje istnienie odrębnych przedziałów (tzw. kompartmentację) komórka eukariotyczna posiada zdolność przeprowadzenia bardzo dużej liczby odmiennych (często przeciwstawnych) procesów biochemicznych, w tym samym czasie i w bliskim siebie sąsiedztwie. Zastosowanie klasycznego mikroskopu świetlnego ze względu na jego małą zdolność rozdzielczą (0,2μm) ogranicza możliwość dokładnej obserwacji struktur, dlatego też w tego typu badaniach bardzo często wykorzystuje się mikroskopię elektronową, której zdolność rozdzielcza na poziomie 0,2 nm niesie ze sobą znacznie większe możliwości poznania ultrastruktury organelli komórkowych. Alternatywą dla tej złożonej techniki pozostają reakcje immunocytochemiczne, bazujące na swoistej reakcji antygen-przeciwciało, których cechą charakterystyczną jest wysoka czułość umożliwiająca detekcję sygnału poniżej zdolności rozdzielczej klasycznego mikroskopu świetlnego. Wykorzystanie różnorakich fluorochromów sprzężonych z przeciwciałami umożliwia zastosowanie w tego typu badaniach mikroskopii fluorescencyjnej, jednakże takie analizy możliwe są zazwyczaj po utrwaleniu badanych komórek i ich dość złożonej obróbce. W ostatnich latach uzyskano szereg fluorochromów, które z jednej strony wiążą się specyficznie do błon określonych organelli komórkowych, co pozwala na określenie ich ewentualnego położenia w komórce, z drugiej zaś nadają się do barwień przyżyciowych. Wśród nich wyróżnić można barwniki wiążące się do błon aparatu Golgiego (Bodipy- Ceramide), mitochondriów (Miyo-Tracker, Rodamina 123), gładkiej siateczki śródplazmatycznej (ER-Tracker) oraz lizosomów (Lyso-Tracker). Barwnik DiOC 6 (3,3 -heksylokarbocyjanian jodowy) jest używany do barwienia wewnętrznych błon w komórce np. do wizualizacji siateczki śródplazmatycznej. Natomiast barwnik DiIC 18 (1,1 -dioctadecyl-3,3,3 3 -tetrametylindokarbocyjanian perchloru) wiąże się z błoną komórkową, co umożliwia po krótkiej inkubacji komórek z tym barwnikiem (np. pięciominutowej) wizualizację wyłącznie błon komórkowych, a po wydłużonej inkubacji komórek z barwnikiem (kilkugodzinnej) również przedziałów endosomów. Rodamina 123 jako silnie kationowy barwnik posiada zdolność przyłączania się do ujemnie naładowanych przedziałów komórki takich jak wewnętrzna błona mitochondriów, dzięki czemu pozwala na lokalizację tych organelli w komórce, oraz śledzenie zmian w ich właściwościach, w tym potencjale transmembranowym. Do wizualizacji DNA w komórkach stosuje się barwniki zdolne do penetracji błon komórkowych i wiążące się bezpośrednio z DNA: Hoechst bisbenzymid, a także DAPI (4,6-diamidinodihydrochloran-2-fenylindonu). Natomiast jodek propydyny barwi kwasy nukleinowe, a barwienie jedynie struktur bogatych w DNA lub RNA można uzyskać stosując trawienie RNazą lub DNazą.

3 Cel ćwiczenia: Ćwiczenie ma na celu praktyczne zapoznanie się z budową i funkcjonowaniem mikroskopu fluorescencyjnego oraz wykorzystaniem barwników fluorescencyjnych do wizualizacji organelli w żywych komórkach. Materiały: Hodowle ludzkich fibroblastów skóry (HSF); komórki wysiane na szkiełkach w szalkach Petriego Pożywka do hodowli ludzkich fibroblastów: Modified Eagle Medium (MEM) z dodatkiem antybiotyków (100 i.u./ml peniciliny, 10 μg/ml neomycyny, 10 μg/ml streptomycyny) Zbuforowany roztwór soli fizjologicznej (PBS) z jonami wapnia i magnezu Barwniki przyżyciowe: DiIC 18 (0,9 mm) DiOC 6 (0,25 mg/ml) Lyso-Tracer 99 (0,75 μm) Rodamina 123 (0,1 mg/ml) Hoechst (0,1 mg/ml) Wykonanie ćwiczenia: 1. Grupę podzielić na trzy czteroosobowe zespoły, każda osoba z zespołu wykorzystuje barwnik Hoechst oraz inny barwnik przyżyciowy 2. Przygotować mikroskop do pracy w jasnym polu oraz kontraście faz 3. Wybrać do doświadczenia po jednej szalce z komórkami wysianymi na szkiełkach, komórki oglądnąć w mikroskopie odwróconym Barwienie przyżyciowe błony komórkowej barwnikiem DiIC 18 oraz jąder komórkowych barwnikiem Hoechst Przygotować 1ml roztworu barwnika DiIC 18 o stężeniu 9μM w pożywce hodowlanej Zlać płyn hodowlany z szalki, komórki przepłukać 1 ml ciepłego PBS a następnie zalać 1 ml przygotowanego roztworu barwnika Szalki inkubować przez 20 min w cieplarce w 37 o C Po zadanym czasie do roztworu barwnika w szalce z komórkami dodać barwnik Hoechst w takiej objętości, aby jego stężenie w płynie hodowlanym wyniosło 1 μg/ml, dokładnie rozpipetować i szalkę ponownie umieścić w cieplarce na 10 min Po zakończonej inkubacji szkiełka z komórkami 3x delikatnie przepłukać ciepłym PBS Wyczyścić szkiełko podstawowe i nakropić na nie 20 μl PBS, na kroplę nałożyć szkiełko (komórkami do dołu) Preparaty oglądać w mikroskopie kontrastowo-fazowym, a następnie przełączyć mikroskop do pracy w epi-fluorescencji ( zmienić obiektywy, włączyć lampę rtęciową Oglądnąć preparat przy wzbudzeniu UV oraz światłem zielonym. Porównać obrazy komórek w kontraście-faz i w epi-fluorescencji. Barwienie przyżyciowe siateczki śródplazmatycznej barwnikiem DiOC 6 oraz jąder komórkowych barwnikiem Hoechst 33342

4 1. Przygotować 1 ml roztworu barwników DiOC 6 w stężeniu 2,5 μg/ml oraz Hoechst w stężeniu 1 μg/ml w ciepłej pożywce hodowlanej 2. Usunąć pożywkę hodowlaną z szalki, komórki przepłukać 1 ml ciepłego PBS, po czym natychmiast zalać 1ml ciepłego roztworu barwników 3. Szalki z komórkami inkubować przez 10 min w cieplarce w 37 o C 4. Po zakończonej inkubacji szkiełko z komórkami przepłukać delikatnie 3x ciepłym PBS 5. Wyczyścić szkiełko podstawowe i nakropić na nie 20 μl PBS, na kroplę nałożyć szkiełko (komórkami do dołu) 6. Preparaty oglądać w mikroskopie kontrastowo-fazowym, a następnie przełączyć mikroskop do pracy w epi-fluorescencji (zmienić obiektywy, włączyć lampę rtęciową Oglądnąć preparat przy wzbudzeniu UV oraz światłem niebieskim. Porównać obrazy komórek w kontraście-faz i w epi-fluorescencji. Barwienie przyżyciowe lizosomów barwnikiem Lyso-Tracer Red 99 oraz jąder komórkowych barwnikiem Hoechst Przygotować 1ml roztworu barwnika Lyso-Tracer 99 o stężeniu 75nM w medium hodowlanym 2. Z szalki hodowlanej usunąć pożywkę, komórki przepłukać 1 ml ciepłego PBS a następnie zalać 1ml roztworu barwnika Lyso-Tracer Szlakę z komórkami inkubować przez 20 min w cieplarce w 37 o C 4. Po zadanym czasie do roztworu barwnika w szalce z komórkami dodać barwnik Hoechst w takiej ilości, aby jego stężenie w medium wyniosło 1μg/ml, dokładnie rozpipetować i szalkę ponownie umieścić w cieplarce na 10 min 5. Po zakończonej inkubacji komórki delikatnie przepłukać 3x PBS Wyczyścić szkiełko podstawowe i nakropić na nie 20 μl PBS, na kroplę nałożyć szkiełko (komórkami do dołu). 6. Preparaty oglądać w mikroskopie kontrastowo-fazowym, a następnie przełączyć mikroskop do pracy w epi-fluorescencji (zmienić obiektywy, włączyć lampę rtęciową Oglądnąć preparat przy wzbudzeniu UV oraz światłem zielonym. Porównać obrazy komórek w kontraście-faz i w epi-fluorescencji. Barwienie przyżyciowe mitochondriów Rodaminą 123 oraz jąder komórkowych barwnikiem Hoechst Przygotować 1 ml roztworu Rodaminy 123 o stężeniu 1μg/ml w pożywce hodowlanej 2. Zlać płyn hodowlany z szalki, następnie komórki na szkiełkach przepłukać 1 ml ciepłego PBS, po czym zalać 1 ml przygotowanego roztworu Rodaminy Szalkę inkubować przez 50 min w cieplarce w 37 o C 4. Po zadanym czasie do roztworu barwnika w szalce z komórkami dodać barwnika Hoechst w takiej ilości, aby jego stężenie w medium wyniosło 1 μg/ml, dokładnie rozpipetować i szalkę ponownie umieścić w cieplarce na 10 min 5. Po zakończonej inkubacji komórki na szkiełkach przepłukać 3x ciepłym PBS

5 6. Wyczyścić szkiełko podstawowe i nakropić na nie 20 μl PBS, na kroplę nałożyć szkiełko (komórkami do dołu) 7. Preparaty oglądać w mikroskopie kontrastowo-fazowym, a następnie przełączyć mikroskop do pracy w epi-fluorescencji (zmienić obiektywy, włączyć lampę rtęciową Oglądnąć preparat przy wzbudzeniu UV oraz światłem zielonym. Porównać obrazy komórek w kontraście-faz i w epi-fluorescencji. 8. Oglądnąć preparaty przygotowane przez kolegów z zespołu i porównać je między sobą. Referat: Mikroskopia fluorescencyjna w badaniach struktury i funkcji komórek Zakres materiału, jaki należy przygotować do ćwiczeń: Budowa i zasada działania mikroskopu fluorescencyjnego Barwniki fluorescencyjne stosowane w biologii komórki Zastosowanie fluorescencji w biologii komórki i diagnostyce klinicznej Budowa i funkcje podstawowych organelli Metody wizualizacji w komórce poszczególnych organelli Zalecana literatura: B. Alberts i in.: Podstawy biologii komórki, PWN 2005, część druga, rozdział 15 Red. J. Kawiak, M. Zabel: Seminaria z cytofizjologii, Wrocław 2002, rozdział 8 M. Pluta: Mikroskopia optyczna. Mikroskopia fluorescencyjna, rozdział 9 str

6