(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (13) (1) T3 Int.Cl. C07K 14/81 (06.01) Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 11/ EP B1 (4) Tytuł wynalazku: Cięcie prekursorów insuliny przez wariant trypsyny () Pierwszeństwo: EP (43) Zgłoszenie ogłoszono: w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 08/23 (4) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: Wiadomości Urzędu Patentowego 11/12 (73) Uprawniony z patentu: Sanofi-Aventis Deutschland GmbH, Frankfurt am Main, DE F.HOFFMANN-LA ROCHE AG, Basel, CH (72) Twórca(y) wynalazku: PL/EP T3 FRANK GEIPEL, Penzberg, DE STEPHAN GLASER, Seeshaupt, DE CHRISTOPH HOH, Frankfurt am Main, DE ERHARD KOPETZKI, Penzberg, DE RAINER MUELLER, Penzberg, DE FRANK ZOCHER, Frankfurt am Main, DE (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Magdalena Tagowska PRZEDSIĘBIORSTWO RZECZNIKÓW PATENTOWYCH PATPOL SP.Z O.O. SKR. POCZT WARSZAWA Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

2 Opis [0001] Niniejszy wynalazek dotyczy wytwarzania wariantu zrekombinowanej trypsyny ze zwiększoną swoistością substratową wobec argininy w stosunku do lizyny w organizmach gospodarza nie będących zwierzętami. Ponadto, wynalazek ten dotyczy wariantów zrekombinowanej trypsyny i ich wytwarzania. Także dostarczone jest zastosowanie zrekombinowanych wariantów trypsyny z trzustki świni do cięcia prekursorów insuliny i zestawy zawierające wariant trypsyny. [0002] Trypsyna jest proteazą serynową, która katalizuje hydrolityczne cięcie peptydów przy grupie karboksylowej zasadowych aminokwasów argininy i lizyny (Keil B., (1971). The Enzyme Vol. II, wyd. 3, red. Boyer, Acad. Press NY. str ). Zrekombinowana trypsyna z trzustki świni ma masę cząsteczkową około 200 daltonów i optimum enzymatycznej aktywności w ph 8,0. [0003] Trypsyna jest stosowana w procesach przemysłowej produkcji insuliny i analogów insuliny. Produkcja tych biocząsteczek jest opisana w literaturze i kilka podejść zostało wybrane. Z ekonomicznego punktu widzenia, chemiczna synteza insuliny ludzkiej i analogów insuliny nie jest możliwa. Tak wiec obecnie istnieją głównie dwa procesy produkcji insuliny i analogów insuliny, a mianowicie podejście semisyntetyczne stosujące insulinę świni jako materiał wyjściowy oraz zastosowanie genetycznie modyfikowanych mikroorganizmów do ekspresji zrekombinowanej insuliny. [0004] Insulina jest polipeptydem o długości 1 aminokwasów, które są podzielone na 2 łańcuchy aminokwasowe: łańcuch A o 21 aminokwasach i łańcuch B o aminokwasach. Łańcuchy są połączone ze sobą za pomocą 2 mostków disiarczkowych. Preparaty insuliny są stosowane do terapii cukrzycy od wielu lat. Zastosowanie znajdują nie tylko naturalnie występujące insuliny, ale od niedawna także pochodne i analogi insuliny. [000] Analogi insuliny są analogami naturalnie występujących insulin, a mianowicie insuliny ludzkiej lub insulin zwierzęcych, które różnią się podstawieniami przynajmniej jednej naturalnie występującej reszty aminokwasowej innymi resztami aminokwasowymi i/lub dodaniem/usunięciem przynajmniej jednej reszty aminokwasowej z odpowiadającej, a poza tym identycznej, naturalnie występującej insuliny. Dodane i/lub zastąpione reszty aminokwasów mogą także być takimi, które nie występują naturalnie. [0006] Pochodne insuliny są pochodnymi naturalnie występującej insuliny lub analogu insuliny, które są uzyskiwane za pomocą modyfikacji chemicznej. Modyfikacja chemiczna może polegać, na przykład, na dodaniu jednej lub więcej specyficznej grupy chemicznej do jednego lub więcej aminokwasów. [0007] Przykładami pochodnych insuliny są B29-N-mirystoilo-des(B) insulina ludzka, B29-N-palmitoilodes(B) insulina ludzka, B29-N-mirystoilo insulina ludzka, B29-N-palmitoilo insulina ludzka, B28-Nmirystoilo Lys B28 Pro B29 insulina ludzka, B28-N-palmitoilo-Lys B28 Pro B29 insulina ludzka, B-N-mirystoilo- Thr B29 Lys B insulina ludzka, B-N-palmitoilo-Thr B29 Lys B insulina ludzka, B29-N-(N-palmitoilo-Yglutamylo)-des(B) insulina ludzka, B29-N-(N-litocholilo-Y-glutamylo)-des(B) insulina ludzka, B29-N-(ωkarboksyheptadekanoilo)-des(B) insulina ludzka i B29-N-(ω-karboksyheptadekanoilo) insulina ludzka. [0008] Analogi insuliny są opisane w EP , EP i EP EP dotyczy między innymi podstawień B27 i B28. EP opisuje analogi insuliny, w których występują różne aminokwasy, korzystnie prolina w pozycji B29, ale nie kwas glutaminowy. [0009] Inne analogi insuliny to Lys B28 Pro B29 insulina ludzka, B28 Asp insulina ludzka, insulina ludzka, w której prolina w pozycji B28 została podstawiona przez Asp, Lys, Leu, Val lub Ala i gdzie Lys w pozycji B29 może 1

3 1 2 3 być podstawiona przez Pro; AlaB26 insulina ludzka; des(b28-b) insulina ludzka; des(b27) insulina ludzka lub des(b) insulina ludzka. [00] EP obejmuje analogi insuliny z lizyną lub argininą w B28, które mogą być dodatkowo modyfikowane w B3 i/lub A21. [0011] W EP ujawnione są analogi insuliny chronione przed modyfikacjami chemicznymi, w których asparagina w B3 i przynajmniej jeszcze jeden aminokwas w pozycjach A, A1, A18 lub A21 są modyfikowane. W WO 92/00321 są opisane analogi insuliny, w których przynajmniej jeden aminokwas w pozycjach B1-B6 jest zastąpiony przez lizynę lub argininę. [0012] Ważne analogi insuliny omówione niniejszym to insulina glarginowa (insulina ludzka z Gly A(21), Arg B (31), Arg B (32)) i insulina glulizynowa (insulina ludzka z Lys B(3), Glu B(29)). [0013] Procesy rekombinacji DNA pozwalają na przygotowanie w mikroorganizmach prekursorów insuliny lub analogów insuliny, w szczególności ludzkiej proinsuliny lub proinsuliny, która ma sekwencję aminokwasową i/lub łańcuch aminokwasów różniący się od insuliny ludzkiej. Proinsuliny przygotowane z komórek genetycznie modyfikowanej Escherichia coli nie mają żadnych prawidłowo połączonych mostków cystynowych. Sposób uzyskiwania insuliny ludzkiej z zastosowaniem E. coli (EP ) jest oparty na następujących etapach procesu: [0014] Fermentacja mikroorganizmu, rozdział komórek, rozbicie komórek, izolacja prekursora insuliny lub analogu insuliny, ponowne fałdowanie do pożądanej (natywnej) struktury trójwymiarowej przez tworzenie odpowiednich mostków disiarczkowych, aby uzyskać pre-pro-insulin(y) ( PPI ), cięcie trypsyną odpowiedniej pre-pro-insuliny (ewentualnie w obecności karboksypeptydazy B), zasadowe oczyszczenie, pierwszy etap chromatograficzny, końcowe cięcie enzymatyczne by uzyskać insulinę ludzką lub odpowiedni analog insuliny, drugi etap chromatograficzny i ostateczne oczyszczenie przez HPLC, krystalizację i suszenie. [001] Cięcie trypsyną pre-pro-insuliny jest złożoną reakcją enzymatyczną: presekwencja i peptyd C są odcinane na tym etapie, aby uzyskać odpowiednie produkty. Na przykład, w przypadku produkcji insuliny ludzkiej, pożądane cenne produkty to Arg(B31),Arg(B32)-insulina i Arg(B31)-insulina (DE ). [0016] Jednak cięcie trypsyną prowadzi do tworzenia wielu produktów ubocznych w wyniku zachodzenia niepożądanych reakcji ubocznych. Trypsyna jest endoproteazą (typ serynowy), która tnie wiązania peptydowe przy C-końcowych resztach argininy (Arg) lub lizyny (Lys). Cięcie trypsyną cząsteczek pre-proinsuliny może zachodzić w różnych miejscach równocześnie. Ze względu na liczne miejsca cięcia w obrębie specyficznej cząsteczki pre-pro-insuliny, w czasie reakcji cięcia trypsyną może powstać wiele niepożądanych produktów ubocznych. Jak widać na Fig. 1, wiele produktów ubocznych wygenerowanych w czasie reakcji cięcia jest konsekwencją cięcia wiązania peptydowego przy C-końcu reszt Lys zamiast Arg. [0017] Dla wszystkich pre-pro-insulin, miejsce cięcia między presekwencją i łańcuchem B insuliny jest jednozasadowe. Na tym miejscu złączenia może zajść tylko jedna reakcja cięcia. [0018] Na dwóch pozostałych miejscach złączenia łańcuch-b/peptyd C i peptyd C/łańcuch A są obecne inne miejsca ciecia. Dla ludzkiej insuliny i insuliny glarginowej miejsca cięcia pomiędzy łańcuchem B/peptydem C i peptydem C/łańcuchem A są oba dwuzasadowe (Arg-Arg i Lys-Arg, odpowiednio). Dodatkowo cięcie po B29-Lys prowadzi do tworzenia B-des-Thr ( des-thr ). [0019] Dla insuliny ludzkiej tylko cięcie trypsyna po resztach B31-Arg i B32-Arg daje wartościowe produkty dla miejsca złączenia łańcuch B/peptyd C, a mianowicie insulinę B31-Arg ( mono-arg ) i insulinę B31-Arg,B32-Arg ( di-arg ). Produkty te mogą być podsumowane jako Arg-insuliny. Cięcie po B32-Arg jest kluczowe w procesie wytwarzania insuliny glarginowej, jako że może być stosowana tylko Di-Arg-insulina. 2

4 1 2 3 Dla ludzkiej insuliny i insuliny glarginowej, cięcie po B29-Lys prowadzi do tworzenia des-thr. Dla insuliny glulizynowej, to miejsce ciecia jest jednozasadowe i możliwymi produktami są formy zawierające Arg. [00] W odniesieniu do miejsca złączenia peptyd C/łańcuch A, cięcie trypsyną po reszcie Arg, a nie Lys jest kluczowe, aby uzyskać wartościowe produkty. Fałszywe cięcie po Lys prowadzi do tworzenia produktów ubocznych A0. [0021] Aby przezwyciężyć wady stanu techniki jest pożądane stosowanie w procesie cięcia pre-proinsuliny enzymu trypsyny ze zwiększoną specyficznością wobec Arg dla różnych miejsc cięcia, jak przykładowo przedstawiono na Fig. 1. Przez zwiększenie specyficzności enzymu trypsynowego wobec Arg i w efekcie zmniejszenie specyficzności wobec Lys można oczekiwać tworzenia produktów ubocznych, szczególnie składników des-thr i A0. Sichler i wsp., FEBS Lett. (02) :2-224, badali wpływ zmiany aminokwasu w pozycji 190 (numeracja chymotrypsynogenu według Huber, R. & Bode, W., Acc. Chem. Res. (1978) 11: ) w ludzkiej trypsynie. Stwierdzono, że w tej pozycji wymiana seryny typu dzikiego na alaninę u mutanta powodowała zwiększenie selektywności cięcia dla argininy i obniżenie względem lizyny przy stosowaniu sztucznych substratów. W tym samym czasie stwierdzono, że aktywność enzymatyczna mutanta jest obniżona o czynnik około 2 w porównaniu z typem dzikim. Testowanie zrekombinowanej ludzkiej trypsyny typu dzikiego i ludzkiego mutanta trypsyny (zmiana aminokwasu w pozycji 190 z seryny na alaninę) dla obróbki pre-pro-insuliny doprowadziła do tworzenia wysokich ilości produktów ubocznych dla obu enzymów, wykazując, że zwiększenie selektywności Arg nie może być stosowane do cięcia pre-pro-insuliny (patrz poniżej, Przykład 1). [0022] W świetle stanu techniki problemem do rozwiązania jest dostarczenie wariantu trypsyny, który wykazuje zwiększoną selektywność dla argininy bez znacznej utraty aktywności proteolitycznej. Innym szczególnym problemem do rozwiązania jest dostarczenie wariantu trypsyny, który ma zwiększoną selektywność dla argininy w obrębie miejsc cięcia dla obróbki pre-pro-insuliny, jak przykładowo pokazano na Fig. 1. [0023] Tak więc problem jest rozwiązany przez dostarczenie wariantu trypsyny świni z wymianą aminokwasu w pozycji 172 z seryny na alaninę. W korzystnym wykonaniu wariant Ser172Ala trypsyny świni jest dostarczony za pomocą sposobów rekombinacji. Zadziwiająco, stwierdzono, że aktywność enzymatyczna wariantu Ser172Ala trypsyny świni jest dla reakcji cięcia pre-pro-insuliny nieomal równa w porównaniu z enzymem typu dzikiego. [0024] Pozycja aminokwasu seryny 190 badana w ludzkiej trypsynie Sichler i wsp. (FEBS Lett. (02) :2-224) odpowiada serynie w pozycji 172 trypsyny świni, jak przedstawiono w SEK NR ID: 1. Obie pozycje są częścią tak zwanego miejsca S1 proteaz serynowych podobnych do trypysyny. [002] W jednym wykonaniu wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania insuliny, analogu insuliny lub pochodnej insuliny, w którym (a) pre-pro-insulina, analog pre-pro-insuliny lub pochodna pre-pro-insuliny jest cięta trypsyną świni Ser172Ala określoną przez sekwencję SEK NR ID.3 (b) rozdzielane są powstałe produkty cięcia, oraz (aa) jeśli jeden z powstałych produktów cięcia jest analogiem insuliny lub pochodną insuliny, ten analog insuliny lub ta pochodna insuliny jest otrzymywana, lub (bb) produkty cięcia będące prekursorami insuliny, analogu insuliny lub pochodnej insuliny są dalej poddawane obróbce, a insulina, analog insuliny lub pochodna insuliny powstałe w wyniku takiej dalszej obróbki jest oddzielana i otrzymywana; 3

5 1 2 3 przy czym insulina korzystnie jest insuliną ludzką; i analog insuliny jest wybrany z grupy obejmującej Lys B28 Pro B29 insulinę ludzką, B28 Asp insulinę ludzką, insulinę ludzką, w której prolina w pozycji B28 została podstawiona Asp, Lys, Leu, Val lub Ala i gdzie w pozycji B29 Lys może być podstawiona przez Pro; AlaB26 insulinę ludzką; des(b28-b) insulinę ludzką; des(b27) insulinę ludzką i des(b) insulinę ludzką, i pochodna insuliny jest wybrana z grupy obejmującej B29-N-mirystoilo-des(B) insulinę ludzką, B29-Npalmitoilo-des(B) insulinę ludzką, B29-N-mirystoilo insulinę ludzką, B29-N-palmitoilo insulinę ludzką, B28- N-mirystoilo Lys B28 Pro B29 insulinę ludzką, B28-N-palmitoilo-Lys B28 Pro B29 insulinę ludzką, B-N-mirystoilo- Thr B29 Lys B insulinę ludzką, 8-N-palmitoilo- Thr B29 Lys B insulinę ludzką, B29-N-(N-palmitoilo-Yglutamylo)-des(B) insulinę ludzką, B29-N-(N-litocholilo-Y-glutamyl)-des(B) insulinę ludzką, B29-N-(ωkarboksyheptadekanoilo)des(B) insulinę ludzką i B29-N-(ω-karboksyheptadekanoilo) insulinę ludzką. [0026] W korzystnym wykonaniu wynalazku analog insuliny jest insuliną glulizynową lub insuliną glarginową. [0027] W dalszym wykonaniu wynalazku, wymieniona dalsza obróbka produktów cięcia będących prekursorami insuliny, analogu insuliny lub pochodnej insuliny obejmuje cięcie tych produktów karboksypeptydazą B, z wyjątkiem insuliny glarginowej. [0028] W innym wykonaniu wynalazku, cięcie trypsyną świni Ser172Ala jest przeprowadzane w wartości ph w zakresie 7, do 9,, korzystnie 8,3; w temperaturze pomiędzy 1 C i C, bardziej korzystnie pomiędzy 8 i 1 C, najkorzystniej w 8 C; i reakcja enzymatyczna jest hamowana przez zakwaszenie próbki, korzystnie przez dodanie 1 N lub 2N roztworu HCl. [0029] W innym wykonaniu wynalazek dotyczy trypsyny świni Ser172Ala określonej przez sekwencję SEK NR ID: 3, DNA kodującego trypsynę świni Ser172Ala, korzystnie określonego przez sekwencję SEK NR ID.: 4. [00] W innym wykonaniu wynalazek dotyczy DNA kodującego trypsynogen świni Ser196Ala określony przez SEK NR ID:6. Peptyd sygnałowy tego pre-trypsynogenu pochodzi z czynnika alfa Saccharomyces cerevisiae. [0031] W innym wykonaniu wynalazek dotyczy wektora zawierającego sekwencję DNA jak opisano powyżej. [0032] W innym wykonaniu wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania trypsyny świni Ser172Ala określonej przez przez sekwencję SEK NR ID.3 obejmującego etapy (a) dostarczenia wektora według zastrz. 16, (b) transformowania szczepu mikroorganizmu gospodarza wektorem, (c) hodowania transformowanego szczepu mikroorganizmu gospodarza w podłożu hodowlanym, które zawiera składniki odżywcze, przy czym szczep mikroorganizmu gospodarza wyraża trypsynę świni Ser172Ala lub trypsynogen świni Ser196Ala, (d) przekształcania w dojrzałą trypsyny świni Ser172Ala, jeśli produkt ekspresji (c) jest trypsynogenem świni Ser196Ala, oraz (e) oczyszczania trypsyny świni Ser172Ala ze szczepu mikroorganizmu gospodarza i/lub podłoża hodowlanego. przy czym w szczególności szczep mikroorganizmu gospodarza jest metylotroficznym szczepem drożdży wybranym z grupy obejmującej gatunki Hansenula, Pichia, Candida i Torulopsis; a korzystnie szczep gospodarza mikroorganizmu jest wybrany z grupy obejmującej Pichia pastoris, Hansenula polymorpha, Candida boidiniii, Torulopsis glabrata. 4

6 1 2 3 [0033] W niniejszym dokumencie, określenie wariant trypsyny świni i wariant trypsyny świńskiej oznaczają białko, które jest wariantem, tzn. postacią alleliczną dojrzałej izoformy białka trypsyny I, wygenerowanego za pomocą podstawienia aminokwasu w pozycji 172 zgodnie z SEK NR ID: 1. [0034] W celu skróconego określenia wariantu trypsyny świni tu opisanego, należy stwierdzić, że liczba dotyczy reszty/pozycji aminokwasu w sekwencji aminokwasowej dojrzałej trypsyny z trzustki świni przedstawionej w SEK NR ID: 1. Określenie aminokwasu wykorzystuje trzyliterowe skróty jak i jednoliterowy alfabet aminokwasów, tzn., Asp D kwas asparaginowy, Ile I izoleucyna, Thr T treonina, Leu L leucyna, Ser S seryna, Tyr Y tyrozyna, Glu E kwas glutaminowy, Phe F fenyloalanina, Pro P prolina, His H histydyna, Gly G glicyna, Lys K lizyna, Ala A alanina, Arg R arginina, Cys C cysteina, Trp W tryptofan, Val V walina, Gln Q glutamina, Met M metionina, Asn N asparagina. Aminokwas w danej pozycji sekwencji aminokwasowej jest podany przez jego trójliterowy skrót i liczbę. Tak więc Ser172 oznacza resztę seryny w pozycji aminokwasu 172 z SEK NR ID: 1. Podstawienie przez inny aminokwas jest podane jako trójliterowy skrót dodany po liczbie wskazującej pozycję. Np. Ser172Ala oznacza podstawienie Ser w pozycji 172 w SEK NR ID: 3 przez Ala. [003] Określenie zwiększona selektywność miejsca cięcia wariantu trypsyny oznacza przesunięcie specyficzności dla cięcia hydrolitycznego, przez co dla wariantu przesunięcie prowadzi do preferowanego cięcia przy grupie karboksylowej argininy raczej niż lizyny. [0036] Gdy aktywność trypsyny jest oznaczana ilościowo, obecny dokument odnosi się do jednostek (U). Aktywność proteolityczna trypsyny i jej wariantów jest oznaczana ilościowo z zastosowaniem oznaczenia fotometrycznego wykorzystującego jako substraty Chromozym TRY, Chromozym TH i Chromozym PL (Roche Diagnostics GmbH). Proteolityczna aktywność właściwa lub aktywność właściwa danego preparatu jest definiowana jako liczba jednostek na mg białka w preparacie, oznaczona za pomocą metody opisanej w Przykładzie 9. [0037] Metylotroficzne drożdże są definiowane jako drożdże, które są zdolne do wykorzystywania metanolu jako źródła węgla. Określenie także obejmuje ich szczepy laboratoryjne. Jeśli szczep metylotroficznych drożdży jest auksotrofem i ze względu na to wymaga uzupełniania dodatkową substancja zawierającą węgiel, taką jak np. histydyna w przypadku szczepu metylotroficznych drożdży niezdolnego do syntezy tego aminokwasu w dostatecznych ilościach, ta dodatkowa substancja jest traktowana jako składnik odżywczy, ale nie jako źródło węgla. [0038] Wektor jest definiowany jako DNA, który może zawierać, tzn. nieść i utrzymywać fragment DNA według wynalazku, obejmujący, na przykład, fagi i plazmidy. Te określenia są rozumiane przez specjalistów w dziedzinie inżynierii genetycznej. Określenie kaseta ekspresyjna oznacza sekwencję nukleotydową kodującą pre-białko, funkcjonalnie połączoną z promotorem i terminatorem. Dla wektorów zawierających kasetę ekspresyjną określenia wektor i wektor ekspresyjny są stosowane jako synonimy. [0039] Określenie oligonukleotyd jest stosowane do cząsteczki kwasu nukleinowego, DNA (lub RNA), o długości mniejszej od 0 nukleotydów. [00] Transformacja oznacza wprowadzenie DNA do organizmu, tzn. organizmu gospodarza, tak, że DNA może ulegać replikacji, jako element pozachromosomowy lub przez integrację do chromosomu. [0041] Określenie ekspresja i czasownik eksprymować/wyrażać oznaczają transkrypcję sekwencji DNA i/lub translację transkrybowanego mrna w organizmie gospodarza prowadzące do otrzymania pre-białka, tzn. nie obejmuje procesów potranslacyjnych.

7 1 2 3 [0042] Sekwencja nukleotydowa koduje peptyd lub białko, kiedy przynajmniej część kwasu nukleinowego, lub jego dopełnienia, może bezpośrednio ulec translacji dostarczając sekwencję aminokwasową peptydu lub białka, lub gdy wyizolowany kwas nukleinowy może być stosowany, sam lub jako część wektora ekspresyjnego, do ekspresji peptydu lub białka in vitro, w komórce prokariotycznego gospodarza lub w komórce eukariotycznego gospodarza. [0043] Promotor jest regulacyjną sekwencją nukleotydową, która stymuluje transkrypcję. Te określenia są rozumiane przez specjalistę w dziedzinie inżynierii genetycznej. Tak jak promotor, element promotorowy stymuluje transkrypcję, ale stanowi podfragment większej sekwencji promotora. [0044] Określenie funkcjonalnie połączone dotyczy połączenia dwóch lub więcej fragmentów kwasu nukleinowego na pojedynczym wektorze, tak że jeden wpływa na funkcję drugiego. Na przykład, promotor jest funkcjonalnie połączony z sekwencją kodującą, tzn. sekwencją nukleotydową kodującą białko lub prebiałko, gdy jest zdolny do wpływania na ekspresję tej sekwencji kodującej, tzn. że sekwencja kodująca jest pod kontrolą transkrypcyjną promotora. [004] Określenie polipeptyd lub białko oznacza polimer złożony z ponad 90 monomerów aminokwasów połączonych przez wiązania peptydowe. Określenie peptyd" oznacza oligomer złożony z 90 lub mniej monomerów aminokwasów połączonych przez wiązanie peptydowe. Wiązanie peptydowe jest kowalencyjnym wiązaniem pomiędzy dwoma aminokwasami, w których grupa α-aminowa jednego aminokwasu jest połączona z grupą α-karboksylową drugiego aminokwasu. [0046] Określenie pro-białko", forma pro-białka", zymogen", trypsynogen", pre-białko" lub pre-pro-białko" oznacza pierwotny produkt translacji, który jest prekursorem dojrzałego białka, tzn. jeśli białko jest wynikiem obróbki potranslacyjnej pre-białka. [0047] Określenie obróbka potranslacyjna" oznacza etapy modyfikacji, którym poddane jest pre-białko lub pre-pro białko, aby powstało dojrzałe białko w przedziale komórkowym lub zewnątrzkomórkowym. [0048] Peptyd sygnałowy jest ulegającą odcięciu sekwencją sygnałową aminokwasów obecną w formie pre-białka lub pre-pro-białka wydzielanego białka. Białka transportowane przez błonę komórkową, tzn. ulegajace sekrecji typowo mają N-końcową sekwencję bogatą w aminokwasy hydrofobowe, zazwyczaj o długości około 1 do aminokwasów. W którymś momencie przechodzenia przez błonę sekwencja sygnałowa jest odcinana przez peptydazę sygnałową (Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., Walter, P. (red.), Molecular Biology of the Cell, czwarte wydanie, 02, Garland Science Publishing). Wiele źródeł peptydów sygnałowych jest dobrze znanych specjalistom w dziedzinie i może obejmować, na przykład, sekwencję aminokwasową peptydu sygnałowego czynnika α z Saccharomyces cerevisiae i tym podobne. Innym przykładem jest peptyd sygnałowy natywnego pre białka trypsynogenu z trzustki świni według SEK NR ID:, pozycja Na ogół, N-koniec pre-białka zasadniczo każdego wydzielanego białka jest potencjalnym źródłem peptydu sygnałowego odpowiedniego do stosowania w tym wynalazku. Peptyd sygnałowy może także być dwuczęściowy obejmując dwa peptydy sygnałowe kierujące pre-białko do pierwszego i drugiego przedziału komórki. Dwuczęściowe peptydy sygnałowe są odcinane w kolejnych etapach w czasie szlaku sekrecji. Specjalnym przykładem tego jest prepro peptyd czynnika α Saccharomyces cerevisiae (Wodys i wsp., J. Biol. Chem. 263 (1988) 69-14). [0049] Pre-białka z N-końcowym peptydem sygnałowym są kierowane, by wchodziły w szlak sekrecyjny. Szlak sekrecyjny obejmuje proces obróbki potranslacyjnej, który ostatecznie prowadzi do wydzielania białka. Glikozylacja i tworzenie wiązań disiarczkowych są procesami, która są częścią szlaku sekrecyjnego przed 6

8 wydzielaniem. Zgodnie z niniejszym dokumentem należy rozumieć, że białka wydzielane przez szczepy metylotroficznych drożdży przeszły przez szlak sekrecyjny Szczegółowy opis wynalazku [000] Wszystkie proteazy serynowe podobne do trypsyny mają wspólną preferencję substratową do zasadowej reszty, lizyny lub argininy. Podczas gdy wymiana aminokwasu w serynie odpowiadającej pozycji 190 ludzkiej trypsyny trzustkowej prowadzi do pożądanej zmiany specyficzności względem sztucznych substratów, konsekwencją jest obniżenie aktywności proteolitycznej. [001] Dodatkowo ocena mutanta ludzkiej trypsyny wykazała, że obserwowane przesunięcie specyficzności w kierunku reszt argininy przy stosowaniu sztucznych substratów nie mogło być stosowane do obróbki prepro insuliny. Przykład 1 ilustruje konwersję pre-pro-insuliny z ludzkim mutantem trypsyny seryna190alanina. W czasie reakcji są wytwarzane wysokie ilości produktów ubocznych, głównie składników B-des-Thr-i A0. [002] Nie wykazano w jakim stopniu efekt ten dotyczy wszystkich proteaz serynowych podobnych do trypsyny. Jednym sposobem wyjaśnienia tego zagadnienia jest wprowadzenie mutacji wymiany Ser-Ala do sekwencji aminokwasowej innych rodzajów trypsyny ssaków w miejscu w każdej odpowiedniej sekwencji polipeptydu odpowiadającej pozycji 190 izotypu I ludzkiej trypsyny z trzustki. Robiąc to twórcy zadziwiająco ujawnili, że taka mutacja wymiany w trypsynie trzustki świni zwiększa selektywność miejsca cięcia dla argininy w obróbce pre-pro insuliny, a jednocześnie utrzymuje wyższy poziom aktywności proteolitycznej. [003] Specjalista w dziedzinie jest świadomy metod podstawiania jednej lub więcej reszt aminokwasowych w białku. Przykład 2 ilustruje jak mutant z wymianą aminokwasu może być skonstruowany na poziomie kodującej sekwencji DNA. Jednak inne metody są możliwe. W tym wynalazku, syntetyczna sekwencja nukleotydowa kodująca mutanta Ser172Ala trypsyny z trzustki świni, jak przedstawiono w SEK NR ID: 4, była wyrażana w mikroorganizmach gospodarza. [004] Wariant trypsyny jest korzystnie produkowany jako heterologiczne białka w mikroorganizmach gospodarza takich jak bakterie i grzyby. Specjalista w dziedzinie dysponuje wiedzą na temat systemów ekspresji w bakteriach, które istnieją dla szeregu prokariotycznych gospodarzy, takich jak gatunki E. coli, Bacillus i Staphylococcus, by wymienić tylko kilka. Jeszcze bardziej korzystnymi mikroorganizmami gospodarza są grzyby. Przykładem korzystnego gatunku grzyba jest Aspergillus. Jednak jeszcze bardziej korzystne są gatunki drożdży, takie jak gatunki z rodzajów Saccharomyces lub Schizosaccharomyces. Jednak jeszcze bardziej korzystne są szczepy gatunków metylotroficznych drożdży. [00] Metylotroficzne drożdże mają szlaki biochemiczne potrzebne do wykorzystania metanolu i są klasyfikowane do czterech rodzajów, w oparciu o morfologię komórki i cechy wzrostowe: Hansenula, Pichia, Candida i Torulopsis. Najbardziej rozwinięte systemy gospodarza metylotroficznego wykorzystują Pichia pastoris (Komagataella pastoris) i Hansenula polymorpha (Pichia angusta). Ekspresja heterologicznych białek w drożdżach jest opisana w US , US , US i US [006] Organizmy drożdży wytwarzają szereg białek, które są syntetyzowane wewnątrz komórki, ale wykazują funkcje poza komórką. Te zewnątrzkomórkowe białka są określane jako białka wydzielane. Pierwotnie wydzielane białka są wyrażane we wnętrzu komórki w postaci prekursora, pre-białka lub pre-probiałka zawierającego N-końcowy peptyd sygnałowy zapewniający skuteczne kierowanie wyrażanego produktu do szlaku sekrecyjnego komórki, poprzez błonę reticulum endoplazmatycznego. Peptyd sygnałowy jest na ogół odcinany od pożądanego produktu w czasie translokacji. Cięcie jest przeprowadzane 7

9 1 2 3 proteolitycznie przez peptydazę sygnałową. Szczególna podsekwencja aminokwasowa w peptydzie sygnałowym jest rozpoznawana i cięta przez peptydazę sygnałową. Ta podsekwencja jest określana jako miejsce cięcia peptydazy sygnałowej. Po wejściu do szlaku sekrecyjnego białko jest transportowane do aparatu Golgiego. Z aparatu Golgiego białka są dystrybuowane do błony plazmatycznej, lizosomów i pęcherzyków sekrecyjnych. [007] Wydzielane białka napotykają na różne warunki środowiska w przeciwieństwie do białek wewnątrzkomórkowych. Częścią procesów szlaku sekrecyjnego jest stabilizacja dojrzewających zewnątrzkomórkowych białek. Tak więc pre-białka, które przechodzą przez szlak sekrecyjny drożdży przechodzą specyficzną obróbkę potranslacyjną. Na przykład, obróbka może obejmować generację wiązań dwusiarczkowych by wytworzyć połączenia międzycząsteczkowe. Co więcej, niektóre aminokwasy białka mogą być glikozylowane. [008] Sugerowano kilka podejść dla ekspresji i sekrecji w drożdżach białek heterologicznych dla drożdży. EP opisuje proces, za pomocą którego białka heterologiczne dla drożdży są transformowane za pomocą wektora ekspresyjnego niosącego DNA kodujący pożądane białko, peptyd sygnałowy i peptyd działający jako miejsce cięcia dla peptydazy sygnałowej. Przygotowuje się i hoduje hodowlę transformowanego organizmu, i odzyskuje się białko z podłoży hodowlanych. Do stosowania w komórkach drożdży stwierdzono, że odpowiednim peptydem sygnałowym jest peptyd sygnałowy czynnika α z Saccharomyces cerevisiae (US ). [009] W czasie sekrecji, enzym drożdży KEX-2 jest peptydazą sygnałową, która rozpoznaje sekwencję lizyna-arginina jako swoje miejsce cięcia w pre-białku. KEX-2 tnie w miejscu połączenia sekwencji pożądanego białka. W efekcie uwalniany jest pożądany produkt genu i jest wolny od części lidera, tzn. peptydu sygnałowego pre-białka. Endoproteaza KEX-2 została pierwotnie scharakteryzowana w drożdżach Saccharomyces, gdzie specyficznie obrabia prekursor czynnika koniugacyjnego α i czynnika killer (Julius, D., i wsp., Cell 37 (1984) 7-89). Gatunki drożdży metylotroficznych, takich jak Pichia pastoris mają proteazę typu KEX-2 (podobna rola i funkcja) jak Saccharomyces cerevisiae (Werten, M.W., i wsp., Yeast 1 (1999) 87-96). [0060] Dobrze ustalonym gatunkiem metylotroficznych drożdży przykładowo opisanym jako gospodarz do ekspresji zrekombinowanych białek na wysokim poziomie jest Pichia pastoris (US , US , US 4 812, US , US , US , US , US , US , US , US , US 4 929, US , US , US , US , US , US , WO 00/6903). W nieobecności glukozy, Pichia pastoris stosuje metanol jako źródło węgla, co równocześnie jest cechą charakterystyczną organizmu metylotroficznego. Promotor oksydazy alkoholowej (AOX1) przedstawiony w SEK NR ID: 7 kontroluje ekspresję oksydazy alkoholowej, która katalizuje pierwszy etap metabolizmu metanolu. Typowo, % całkowitego rozpuszczalnego białka w komórkach indukowanych metanolem jest oksydazą alkoholową. Kilka wektorów ekspresyjnych Pichia zawiera promotor AOX1 i stosuje się metanol do indukcji ekspresji na wysokim poziomie pożądanego heterologicznego białka. Konstrukty ekspresyjne także integrują do genomu Pichia pastoris, tworząc stransformowanego i genetycznie stabilnego gospodarza. [0061] Stosując wektor ekspresyjny kodujący heterologiczne pre-białko zawierające peptyd sygnałowy lub peptyd sygnałowy z miejscem cięcia dla peptydazy sygnałowej, i pożądane białko, można manipulować szczepy metylotroficznych drożdży, takich jak szczepy Pichia pastoris, aby wydzielały pożądany produkt do podłoża, z którego można oczyścić wydzielane białko. 8

10 1 2 3 [0062] Może być korzystne otrzymanie sekwencji nukleotydowej kodującej pre-białko posiadające zasadniczo odmienne wykorzystanie kodonów. Kodony mogą być wybrane by zwiększyć szybkość, z którą zachodzi ekspresja pre-białka w danym drożdżowym gospodarzu ekspresyjnym zgodnie z częstością, z która poszczególne kodony są wykorzystywane przez gospodarza. Inne powody dla znacznych zmian w sekwencji nukleotydowej kodującej pre-białko, bez zmiany zakodowanej sekwencji aminokwasowej, obejmują produkcję transkryptów RNA o bardziej pożądanych właściwościach, takich jak dłuższy czas półtrwania, niż transkrypty otrzymane z naturalnie występującej sekwencji. [0063] Przykład 3 ilustruje etapy klonowania majce na celu dostarczenie wektora ekspresyjnego kodującego wariant trypsyny. Stosując wektor zawierający sekwencję nukleotydową kodującą pre-białko, która jest zdolna ekspresji, np. funkcjonalnie połączona z promotorem lub elementem promotorowym i do terminatora lub elementu terminatora, jak i do sekwencji wymaganych do wydajnej translacji, organizm gospodarza jest transformowany wektorem i selekcjonowane są transformanty. [0064] Z jednej strony wydajność ekspresji zależy od odpowiedniego adresowania pożądanego produktu, np. do szlaku sekrecyjnego za pomocą peptydu sygnałowego, takiego jak peptyd sygnałowy czynnika α z Saccharomyces cerevisiae lub peptyd sygnałowy natywnego trypsynogenu z trzustki świni. Przykład 4 dostarcza transformowany mikroorganizm gospodarza i Przykład pokazuje jak można uzyskać ekspresję wariantu trypsyny. Tak więc pierwotny produkt translacji obejmuje peptyd sygnałowy, który kieruje polipeptyd do szlaku sekrecyjnego. Przykład 6 ilustruje pomiary aktywności trypsyny w supernatancie transformowanych drożdży metylotroficznych. [006] Z jednej strony wydajność ekspresji może być zwiększona przez zwiększenie dawki genu kodującego wybrany produkt. Tak więc liczba kopii konstruktu ekspresyjnego, to jest wektora ekspresyjnego lub kasety ekspresyjnej, w organizmie gospodarza jest amplifikowana. Jednym sposobem uzyskania tego jest przez wielokrotną transformację wektorem ekspresyjnym kodującym pożądany produkt. Innym sposobem jest wprowadzanie genu kodującego pożądany produkt do organizmu gospodarza stosując pierwszy i drugi wektor ekspresyjny, gdzie drugi wektor ekspresyjny jest oparty na markerze selekcyjnym, który różni się od markera selekcyjnego, stosowanego w pierwszym wektorze ekspresyjnym. Drugi wektor ekspresyjny kodujący ten sam pożądany produkt może nawet być wprowadzony, gdy organizm gospodarza już niesie wielokrotne kopie pierwszego wektora ekspresyjnego (US,324,639; Thill, G.P., i wsp., Positive and Negative Effects of Multi-Copy Integrated Expression in Pichia pastoris, International Symposium on the Genentics of Microorganisms 2 (1990), str ; Vedvick, T., i wsp., J. Ind. Microbiol. 7 (1991) 197-1; Werten, M.W., i wsp., Yeast 1 (1999) 87-96). Przykład 7 opisuje jak można zwiększyć wydajność ekspresji wariantu trypsyny, aby dostarczyć klon drożdży do produkcji na skalę przemysłową. [0066] Transformanty są wielokrotnie analizowane pod względem wydajności zrekombinowanego białka wydzielanego do podłoża wzrostowego. Wybiera się transformanty wydzielające największe ilości enzymatycznie aktywnego zrekombinowanego białka. [0067] Wydzielanie wariantu trypsyny świni do podłoża hodowlanego kieruje dojrzałe zrekombinowane białko do przestrzeni zewnątrzplazmatycznej, z której dyfunduje do podłoża hodowlanego. Transformowane metylotroficzne drożdże hodowane w hodowli płynnej wydzielają zrekombinowany wariant trypsyny z trzustki świni do płynnej pożywki wzrostowej, tzn. płynnej pożywki hodowlanej. To pozwala na bardzo wydajny rozdział biomasy drożdży od zrekombinowanego białka stosując np. techniki sączenia. W rezultacie wariant zrekombinowanej trypsyny świni oczyszczony z tego źródła jest bardzo wydajnie oddzielany od innych enzymów, takich jak rybonukleaza lub inne (nie-trypsynowe) proteazy. Tak więc pierwszym korzystnym 9

11 1 2 3 wykonaniem wynalazku jest wariant, otrzymany za pomocą podstawienia aminokwasu, izotypu I trypsyny z trzustki świni, w którym aminokwas seryna w pozycji 172 zastępuje resztę aminokwasu alaninę, numerowane od N-końca izotypu I trypsyny z trzustki świni według SEK NR ID: 1, z wytworzeniem wariantu trypsyny z trzustki świni z aktywnością trypsyny. [0068] Korzystnie, wariant trypsyny z trzustki świni ma zwiększoną selektywność miejsca cięcia do hydrolitycznego cięcia przy grupie karboksylowej aminokwasu argininy, raczej niż hydrolitycznego cięcia przy grupie karboksylowej aminokwasu lizyny. [0069] Bardziej korzystnie, wyizolowany wariant wykazuje zwiększoną selektywność gdy polipeptyd prekursora insuliny lub jego analog jest stosowany jako substrat. [0070] W jeszcze innym korzystnym wykonaniu wynalazku, specyficzna aktywność proteolityczna wariantu trypsyny świni wynosi 0% w porównaniu z trypsyną trzustki świni typu dzikiego. Tak więc gdy są produkowane i oczyszczane w równoważnych warunkach, aktywność specyficzna trypsyny wariantu zrekombinowanej trypsyny z trzustki świni jest 0% gdy jest porównywana z niezmienioną trypsyną trzustki świni, to znaczy formą typu dzikiego. [0071] W innym korzystnym wykonaniu wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania wariantu trypsyny z trzustki świni obejmującą etapy (a) dostarczenie wektora zawierającego sekwencję nukleotydową, który koduje wariant trypsyny z trzustki świni, (b) transformacja szczepu mikroorganizmu gospodarza wektorem, (c) hodowla transformowanego szczepu mikroorganizmu gospodarza w podłożu wzrostowym, które zawiera składniki odżywcze, przez co szczep mikroorganizmu gospodarza wyraża wariant zrekombinowanej trypsyny z trzustki świni, i (d) oczyszczenie wariantu zrekombinowanej trypsyny z trzustki świni ze szczepu mikroorganizmu gospodarza i/lub podłoża wzrostowego. [0072] Wydajność translacji heterologicznego białka może być poprawiona przez przystosowanie kodonów sekwencji nukleotydowej kodującej heterologiczne białko zgodnie z preferowanymi kodonami organizmu gospodarza. Tak więc w korzystnym wykonaniu wynalazku, sekwencja nukleotydowa, która koduje wariant zrekombinowanej trypsyny z trzustki świni stanowi SEK NR ID: 4. [0073] W jeszcze bardziej korzystnym wykonaniu wynalazku, (a) wektor zawiera sekwencję nukleotydową, która koduje pre-białko złożone ze zrekombinowanego trypsynogenu z trzustki świni i peptydu sygnałowego, jak przedstawiono w SEK NR ID: 6, (b) szczep mikroorganizmu gospodarza jest szczepem metylotroficznych drożdży, (c) podłoże wzrostowe zawiera metanol jako źródło węgla, (d) szczep metylotroficznych drożdży wyraża wariant zrekombinowanej trypsyny z trzustki świni, i (e) wariant trypsyny z trzustki świni jest oczyszczany z podłoża wzrostowego. [0074] Pochodzący z drożdży jak i niepochodzący z drożdży eukariotyczny peptyd sygnałowy, inny niż te w szczególności wymienione, mogą być stosowane w tym samym celu. Choć peptyd sygnałowy może nie być cięty przez peptydazę sygnałową, peptyd cięty przez peptydazę sygnałową może być wstawiony do sekwencji aminokwasowej pre-białka, to znaczy pomiędzy sekwencją aminokwasową peptydu sygnałowego i sekwencją aminokwasową polipeptydu wariantu zrekombinowanej trypsyny z trzustki świni. Tak więc w jeszcze innym bardzo korzystnym wykonaniu wynalazku, peptyd sygnałowy zawiera miejsce cięcia dla peptydazy sygnałowej, które jest umieszczone obok pierwszego (N-końcowego) aminokwasu zrekombinowanego trypsynogenu z trzustki świni. [007] W innym korzystnym wykonaniu wynalazku, sekwencja nukleotydowa kodująca pre-białko jest funkcjonalnie połączona z promotorem lub elementem promotorowym. Jest korzystne, że wektor jest plazmidem zdolnym do replikacji jako episom w szczepie metylotroficznych drożdży. Jest dalej korzystne, że

12 1 2 3 sztuczny chromosom zdolny do replikacji w szczepie metylotroficznych drożdży zawiera wektor. Jednak jest najbardziej korzystne, że chromosom szczepu metylotroficznych drożdży zawiera wektor w formie zintegrowanej. [0076] Tak więc w korzystnym sposobie stosującym szczep metylotroficznych drożdży, a w szczególności w szczepach Pichia pastoris, wektor koduje sekwencję aminokwasową dla wariantu pre-białka trypsynogenu z trzustki świni, który wnika do szlaku sekrecyjnego. [0077] W dalszym korzystnym wykonaniu wynalazku, szczep metylotroficznych drożdży jest gatunkiem Hansenula, Pichia, Candida lub Torulopsis. Jest bardzo korzystne, że szczep metylotroficznych drożdży jest wybrany z grupy złożonej z Pichia pastoris, Hansenula polymorpha, Candida boidinii i Torulopsis glabrata. Jest jeszcze bardziej korzystne, że szczep metylotroficznych drożdży jest szczepem Pichia pastoris z numerem dostępu American Type Culture Collection lub jego pochodną. [0078] Inne korzystne wykonanie wynalazku jest szczepem Pichia pastoris z chromosomem, który zawiera wektor obejmujący sekwencję nukleotydową, która koduje pre-białko złożone z wariantu zrekombinowanej trypsyny z trzustki świni i peptydu sygnałowego, funkcjonalnie połączonej z promotorem AOX Pichia pastoris według SEK NR ID: 7 lub jego elementem promotorowym. [0079] Specjalista w dziedzinie jest świadoma faktu, że wydajność wydzielanego heterologicznego białka, takiego jak wariant trypsyny z trzustki świni, możliwy do otrzymania z podłoża wzrostowego, takiego jak płynne podłoże wzrostowe, może być zwiększona gdy liczba kopii sekwencji nukleotydowych kodujących pre-białko, z którego heterologiczne białko jest wyrażane i wydzielane, jest zwiększona. Tak więc wydajność wydzielanego heterologicznego białka do uzyskania z podłoża wzrostowego może być zwiększona gdy liczba kopii wektora w genomie szczepu metylotroficznych drożdży jest zwiększona. Na przykład, liczba kopii wektora może być zwiększona przez poddanie szczepu metylotroficznych drożdży powtórzonym transformacjom wektorem i powtórzonym rundom selekcji stosując rosnące stężenia czynnika selekcyjnego, na który marker selekcyjny zawarty w wektorze nadaje oporność (US ; Thill, G.P., i wsp., Positive and Negative Effects of Multi-Copy Integrated Expression in Pichia pastoris, International Symposium on the Genetics of Microorganisms 2 (1990), str ; Vedvick, T., i wsp., J. Ind. Microbiol. 7 (1991) 197-1). [0080] Przykładem markera selekcyjnego jest gen Sh ble, który jest genem oporności na Zeocin (Drocourt, D., i wsp., Nucleic Acids Res. 18 (1990) 09; Carmels, T., i wsp., Curr. Genet. (1991) 9-314). Białko kodowane przez gen Sh ble wiąże Zeocin stechiometrycznie i z silnym powinowactwem. Wiązanie Zeocin hamuje jej toksyczną aktywność przez to selekcjonując transformanty zawierające gen Sh ble. Specjalista w dziedzinie wie, że zwiększenie stężenia Zeocin jako czynnika selekcyjnego w podłożu selekcjonuje zwiększenie liczby kopii wektora wyrażającego gen Sh ble. Jest więc korzystne stosowanie wektora z [0081] genem Sh ble jako markerem selekcyjnym, aby wygenerować przez powtórzoną transformację wiele transformantów szczepu metylotroficznych drożdży zawierających wielokrotne kopie wektora. Jest dalej korzystne, że transformacje są powtarzane i selekcja jeszcze bardziej opornych transformantów jest powtarzana aż już nie uzyskuje się dla transformowanego szczepu metylotroficznych drożdży zwiększenia poziomu oporności na Zeocin lub nie jest już możliwe zwiększenie stężenia Zeocin w podłożu selekcyjnym. [0082] Specjalista w dziedzinie zna sposoby oczyszczania rekombinowanej, wyrażanej i wydzielanej trypsyny z trzustki świni za pomocą chromatografii (Funakoshi, A., i wsp., J. Biochem. (Tokio) 88 (1980) ; Paudel, H.K.,i Liao, T.H., J. Biol Chem. 261 (1986) ; Nefsky, B., i Bretscher, A., 11

13 Eur. J. Biochem. 179 (1989) ). Korzystnie wariant trypsynogenu z trzustki świni w podłożu wzrostowym jest oczyszczany stosując chromatografię jonowymienną. Dalsze etapy obróbki prowadzące do oczyszczonego produktu są opisane w Przykładzie 8. Produkcję izoformy I trypsyny z trzustki świni typu I przeprowadzono podobnie poza tym, że sekwencja kodująca typu dzikiego była stosowana do skonstruowania wektora ekspresyjnego. [0083] Jeszcze inne korzystne wykonanie wynalazku jest wariantem izotypu I trypsyny z trzustki świni, za pomocą jednej z metod opisanych powyżej. Innym wykonaniem wynalazku jest zastosowanie wariantu trypsyny z trzustki świni do obróbki pre-pro-insuliny. Korzyści stosowania wariantu Ser172Ala trypsyny świni do cięcia enzymatycznego różnych pre-pro-insulin są opisane w Przykładach -12. Następujące przykłady, odnośniki, listy sekwencji i figury są dostarczone aby pomóc w zrozumieniu tego wynalazku, którego prawdziwy zakres jest przedstawiony w załączonych zastrzeżeniach. Jest zrozumiałe, że mogą być wprowadzone modyfikacje w przedstawionych procedurach bez oddalania się od ducha wynalazku. 1 Opis Figur [0084] Figura 1: Schemat głównych miejsc cięcia dla trypsyny dla pre-pro-insulin insuliny ludzkiej, insuliny glarginowej i insuliny glulizynowej. Czarne trójkąty oznaczają miejsca cięcia dające produkt(y), białe trójkąty oznaczają miejsca cięcia dające produkty uboczne. Wiązania dwusiarczkowe prepre insulin nie są przedstawione. Figura 2: Cięcie pre-pro-insuliny glarginowej zrekombinowaną ludzką trypsyną typu dzikiego (Przykład 1) Figura 3: Figura 4: Figura : Figura 6: Cięcie pre-pro-insuliny glarginowej zrekombinowanym wariantem seryna190alanina ludzkiej trypsyny (Przykład 1) Mapa plazmidu ptry-ser172ala, który jest pochodną handlowo dostępnego plazmidu ppiczαa (Invitrogen), który nadaje oporność na Zeocin. Wstawka określona jako TrySer172Ala jest syntetyczną sekwencją DNA kodującą wariant zrekombinowanego wydzielanego trypsynogenu świni, który niesie podstawienie aminokwasu Ser172Ala, i który jest w postaci fuzji do sekwencji nukleotydowej kodującej peptyd sygnałowy czynnika α Saccharomyces cerevisiae. AOX1-Prom oznacza promotor AOX1 Pichia pastoris, Term" oznacza terminator AOX1 Pichia pastoris. Przedstawiono cięcie pre-pro-insuliny (insulina ludzka) natywną, zrekombinowaną trypsyną świni (Przykład, Tabela 1). Przedstawiono cięcie pre-pro-insuliny (insulina ludzka) wariantem S172A trypsyny świni (Przykład, Tabela 1). [008] Ogólnie w następujących przykładach stosowano metody sugerowane i opisane w instrukcjach Invitrogen Pichia Expression Kit Version M , ppicz A, B,i C Version D , ppiczα A, B, i C" Version E , i ppic9k Version E Czyni się też odniesienie do dalszych wektorów, szczepów drożdży i podłoży tam wymienionych. Podstawowe metody biologii molekularnej stosowano jak opisano w Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3. wydanie, CSHL Press, 01. [0086] Metoda HPLC: Faza stacjonarna: Nucleosil 1- C18, Macherey & Nagel, x 4 mm; ruchoma faza A: 4 mm bufor fosforan sodu (ph 2,), 31 mm NaCl, 2 % (obj./obj.) acetonitril; 12

14 Ruchoma faza B: 4 mm bufor fosforan sodu (ph 2,), mm NaCl, 6 % (obj./obj.) acetonitril; Gradient: liniowy, od 6% fazy B do % fazy B w ciągu min. [0087] Celem następujących przykładów jest ilustracja tego wynalazku bez jego ograniczania. Przykład 1: Cięcie pre-pro-insuliny glarginowej stosując zrekombinowaną ludzką trypsynę typu dzikiego i wariant ludzkiej trypsyny Seryna190Alanina [0088] Te eksperymenty przeprowadzono w 8 C i wartości ph 8,3 (roztwór buforowany) i w skali do 0 ml. [0089] Roztworem PPI napełniono odpowiednie termostatyzowane naczynie reakcyjne i reakcję rozpoczynano przez dodatek preparatu enzymu. Pobierano próbki po określonych przedziałach czasowych; reakcję enzymatyczną stopowano natychmiast przez zakwaszenie roztworu próbki 1N lub 2 N roztworem HCl. Stężenie odpowiednich produktów określano za pomocą HPLC Przykład 2: Mutageneza syntetycznej sekwencji nukleotydowej, która koduje trypsynogen z trzustki świni [0090] Ogólnie standardowe metody biologii molekularnej stosowano jak opisano w Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3. wydanie, CSHL Press, 01. Metoda wyjaśniona poniżej jest specyficznym zastosowaniem bardzo ogólnej metody, która jest także znana jako ukierunkowana mutageneza. [0091] Wygenerowano mutacje w sposób ukierunkowany stosując reakcję łańcuchową polimerazy (PCR). Aby zmutować pożądany kodon, tzn. trójkę zasad, zaprojektowano i zsyntetyzowano parę komplementarnych jednoniciowych oligonukleotydów DNA reprezentujących wariant części syntetycznej sekwencji nukleotydowej kodującej trypsynogen trzustki świni. Jednoniciowe oligonukleotydy DNA były identyczne lub komplementarne do sekwencji podanej w SEK NR ID: 2 poza sekwencją tripletu, który miał być zmutowany. Typowo oligonukleotyd DNA ma długość około do 4 nukleotydów; sekwencja tripletu, która miała być zmutowana lub jej dopełnienie było zlokalizowane w centralnej części oligonukleotydu DNA, który ją zawierał, i była oflankowana z obu stron przez około do 12 nukleotydów. Oligonukleotydy DNA zaprojektowano tak, że hybrydyzacja oligonukleotydów DNA do zrekombinowanego DNA trypsynogenu z trzustki świni typu dzikiego (według SEK NR ID: 2) dawała hybrydyzację z centralnym niesparowaniem, ale z nienaruszonym parowaniem zasad na flankach niesparowania, obejmującym końce ' i 3' każdego oligonukleotydu DNA. [0092] Dodatkowo, dostarczono dwa jednoniciowe oligonukleotydy DNA jako startery, z których pierwszy, określany jako ' trypsyna (SEK NR ID: 8) obejmował '-koniec 9 nukleotydów SEK NR ID: 2 i drugi określany jako 3' trypsyna (SEK NR ID: 9) obejmował sekwencję komplementarną do końca 3' 12 nukleotydów SEK NR ID: 2. Dwa startery zaprojektowano by zawierały miejsca cięcia dla endonukleaz restrykcyjnych. Tak więc pierwszy i drugi starter były wydłużone i obejmowały przylegające sekwencje, które flankowały syntetyczną sekwencję nukleotydową SEK NR ID: 2. ' trypsyna zawierała miejsca EcoRI i 3' Xba I. [0093] Sekwencja nukleotydowa, która kodowała wariant, na drodze podstawienia aminokwasu białka dojrzałej trypsyny z trzustki świni typu dzikiego, była syntetyzowana za pomocą kilku etapów opartych na PCR. [0094] Przeprowadzono pierwszy i drugi PCR stosując jako matrycę dwuniciowy DNA obejmujący sekwencję nukleotydową według SEK NR ID: 2, która była obecna jako wstawka w wektorze. Sekwencje wektora 13

15 1 2 flankujące wstawkę były takie, że w czasie PCR startery ' trypsyna i 3' trypsyna pasowały idealnie po hybrydyzacji. Pierwszy PCR przeprowadzono stosując parę starterów złożonych ze startera ' trypsyna i pierwszego jednoniciowego oligonukleotydu DNA obejmującego zmutowaną sekwencję, tzn. wariant tripletu, przez co dwa startery hybrydyzowały do przeciwnych nici matrycy DNA. Drugi PCR przeprowadzono odpowiednio stosując starter 3' trypsyna i drugi jednoniciowy oligonukleotyd DNA, który był komplementarny do pierwszego. W rezultacie pierwszy i drugi PCR dały dwa produkty pośrednie: część ' i część 3' sekwencji nukleotydowej kodującej wariant zrekombinowanej trypsyny z trzustki świni, przy czym część ' niosła zmutowaną sekwencję na swoim końcu 3' i vice versa, część 3' niosła zmutowaną sekwencję na swoim końcu '. [009] Powstałe dwa pośrednie produkty amplifikacji analizowano za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym, pożądane fragmenty wycięto i DNA wyizolowano z bloczków agarozowych stosując QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, nr katalogu 28704). [0096] Następnie przeprowadzono trzeci PCR, aby połączyć dwie części. W tym celu dwie części połączono w pojedynczym PCR i przeprowadzono pięć cykli PCR bez jakichkolwiek dodawanych starterów i 3. W czasie tych cykli powstało niewiele produktów pełnej długości. Stosowaną temperaturę hybrydyzacji wyliczono dla zachodzących na siebie sekwencji części ' i części 3'. Następnie dodano startery ' trypsyna i 3' trypsyna i przeprowadzono jeszcze 2 cykli PCR, gdzie stosowana tu temperatura hybrydyzacji odpowiadała dodanemu starterowi z niższą temperaturą topnienia. [0097] Zmutowany fragment DNA pełnej długości następnie wstawiono do wektora do klonowania stosując PCR cloning kit - blunt end (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim; nr katalogu ). Fragment DNA sprawdzono za pomocą analizy enzymami restrykcyjnymi i sekwencjonowania. Sprawdzony fragment DNA następnie wycięto za pomocą cięcia Xho I i Not I i wstawiono do wektora ekspresyjnego Pichia pastoris, który był cięty tymi samymi enzymami restrykcyjnymi (patrz Przykład 3 i Przykład ). [0098] Ser172Ala: Trójka zasad TCT obecna w SEK NR ID: 2 w pozycji została podstawiona GCT. W tym celu, w pierwszym PCR oligonukleotyd DNA '-Try-Ser172Ala (SEK NR ID: ) zastosowano jako starter w kombinacji z 3'-trypsyna, i w drugim PCR zastosowano 3'-Try-Ser172Ala (SEK NR ID: 11) jako starter w kombinacji z '-trypsyna. Wyizolowane fragmenty następnie użyto w trzecim PCR, aby wygenerować produkt pełnej długości. 3 Przykład 3: Klonowanie sztucznego DNA kodującego wariant zrekombinowanego trypsynogenu z trzustki świni w wektorach ekspresyjnych pochodzących od PICZαA [0099] Fragment DNA kodujący wariant zrekombinowanego trypsynogenu z trzustki świni, który był uzyskany z fragmentów PCR (patrz Przykład 2) wycięto EcoRI i Xball (Roche Diagnostics GmbH). Fragment wyizolowano stosując QIAquick Gel Extraction Kit według instrukcji producenta. [00] Fragment wligowano do wektora ppiczαa, w ten sposób łącząc sekwencję nukleotydową kodującą wariant zrekombinowanego trypsynogenu z trzustki świni do sekwencji nukleotydowej kodującej peptyd sygnałowy czynnika α z Saccharomyces cerevisiae. Przed reakcją ligacji, wektor podobnie przecięto EcoRI i Xbal i wyizolowano. [01] Następnie procedura klonowania wstawiła sekwencję nukleotydową kodującą wariant zrekombinowanego trypsynogenu z trzustki świni bezpośrednio i w fazie po sekwencji nukleotydowej kodującej peptyd sygnałowy czynnika α z Saccharomyces cerevisiae. 14