BIOSYNTEZA I NADPRODUKCJA AMINOKWASÓW. Nadprodukcja podstawowych produktów metabolizmu (kwas cytrynowy, enzymy aminokwasy)

Transkrypt

1 BIOSYNTEZA I NADPRODUKCJA AMINOKWASÓW Nadprodukcja podstawowych produktów metabolizmu (kwas cytrynowy, enzymy aminokwasy)

2 KTÓRE AMINOKWASY OTRZYMYWANE SĄ METODAMI BIOTECHNOLOGICZNYMI? Liczba aminokwasów znanych ponad 200 Liczba aminokwasów białkowych ponad 20 Liczba aminokwasów egzogennych dla człowieka 8 (a-aminokwasy o konfiguracji L: Phe, Ile, Leu, Lys, Met, Thr, Try, Val) Aminokwasy względnie egzogenne 2: His, Asn

3 Metody otrzymywania aminokwasów: Biosynteza Wydzielanie z hydrolizatów białkowych Synteza chemiczna Umożliwiają selektywne otrzymanie aminokwasów L Powstaje mieszanina D/L aminokwasów

4 Zastosowanie aminokwasów: Składnik żywności Dodatki do pasz Składniki leków Składniki kosmetyków W produkcji dominują: Kwas L-glutaminowy: 50% produkcji, > ton/rok stosowany w postaci soli sodowej jako przyprawa smakowo zapachowa, L-lizyna: ton/rok, aminokwas egzogenny, dodawany do produktów spożywczych

5 NEGATYWNA KONTROLA METABOLICZNA BIOSYNTEZY AMINOKWASÓW Stężenie aminokwasu potrzebne dla normalnego rozwoju organizmu blokuje syntezę enzymów uczestniczących w wytwarzaniu Okresowy nadmiar aminokwasu hamuje aktywność wszystkich kluczowych enzymów szlaku, względnie pierwszego enzymu w jego odgałęzieniu

6 MIKROORGANIZMY WYKORZYSTYWANE W OTRZYMYWANIU AMINOKWASÓW Powinny cechować się nadprodukcją aminokwasów, czyli: Powinny nie mieć sprawnie działających mechanizmów kontrolnych Powinny mieć możliwość (zdolność) transportu aminokwasów na zewnątrz komórki

7 Które organizmy spełniają te warunki? Grzyby nie - sprawnie działające mechanizmy kontrolne Bakterie tak, ale istnieją duże różnice między gatunkami, np. E. coli precyzyjna regulacja

8 METODY STOSOWANE DLA UZYSKANIA NADPRODUKCJI AMINOKWASÓW Zmiana preferencji metabolicznych przez zmianę preferencyjnego kierunku syntezy w punkcie rozgałęzienia szlaku, przez hamowanie jednego z z nich nadmiarem produktu Dodatek prekursorów Zmiana (zwiększenie) aktywności enzymów limitujących proces biosyntezy Uzyskanie wzrostu przepuszczalności przez błonę cytoplazmatyczną

9 Modyfikacja szczepów zakłócenie lub wyeliminowanie kontroli metabolicznej: Mutanty auksotroficzne (żywieniowe) auksotrofia- blokada enzymatyczna szlaku metabolicznego wytworzone białko pozbawione jest aktywności katalitycznej wymagają uzupełnienia podłoża brakującym metabolitem przy jego ograniczonej ilości mogą wytwarzać duże ilości metabolitów pośrednich lub produktów odgałęzień szlaku Mutanty regulatorowe mutacja genu regulatorowego lub operatorowego - mutanty niewrażliwe na nadmiar odpowiednich metabolitów Szczepy uzyskane metodami inżynierii genetycznej

10 KWAS L-GLUTAMINOWY Jakie mikroorganizmy stosowane są w produkcji kwasu glutaminowego? Batrerie z rodzajów Corynebacterium, Brevibacterium, Microbacterium, Arthrobacter Głównie C. glutamicum i B. flavum Dlaczego te rodzaje bakterii? Mają zdolność wydajnej biosyntezy kwasu L-glutaminowego (nadprodukcji) specyfika metabolizmu Mają zdolność wydzielania produktu do podłoża efekt niepełnosprawnej błony cytoplazmatycznej, jeżeli są hodowane w podłożu deficytowym w stosunku do biotyny

11 Podłoże zawiera: TECHNOLOGIA Źródło węgla: glukoza, sacharoza, octan, etanol, n-alkany Źródło azotu: mocznik, amoniak Składniki są dozowane!! ph podłoża 7-8 Temperatura o C Wysokie natlenianie, 3-5 mmoli O 2 /ml. min!!! Zbyt słabe natlenianie- produkt kwas bursztynowy Zbyt silne natlenianie produkt kwas 2-oksoglutarowy

12 Dla uzyskania wydzielania kwasu glutaminowego do podłoża: Biotyna w stężeniu 2,5 ug/ml niskie stężenie kluczowe dla wydzielania produktu do podłoża. Przy stężeniu optymalnym dla szczepu (25ug/ml) 1/3 kwasu glutaminowego pozostaje w komórce hamując dalszą syntezę. 20 mg/1gs.m mg/1g s.m. Detergenty również ułatwiają uwalnianie produktu Dodatek penicylin i cefalosporyn(antybiotyki hamujące syntezę peptydoglikanu) Dodatek nasyconych kwasów tłuszczowych hamuje syntezą kwasu oleinowego ( i znosi barierę przepuszczalności błony

13 BIOSYNTEZA SCP (BIAŁKA MIKROBIOLOGICZNEGO)

14 Korzyści wynikające z zastosowania mikroorganizmów do syntezy białka mikroorganizmy w optymalnych warunkach wykazują bardzo szybki wzrost, a niektóre z nich podwajają swoją masę co 0,5-1 godz; efektywność biosyntezy białka przez zwierzęta (bydło), rośliny (soja) i drobnoustroje (drożdże) wyraża się stosunkiem 1:81: ; mikroorganizmy można namnażać w sposób ciągły, co zapewnia dużą wydajność biosyntezy niezależnie od warunków klimatycznych

15 OPTYMALIZACJA PROCESU mikroorganizmy łatwiej podlegają modyfikacji genetycznej dla nadania ich biomasie cech wymaganych przez człowieka (np. szybkości wzrostu, poprawy składu aminokwasowego) aniżeli rośliny i zwierzęta; mikroorganizmy mogą przetwarzać produkty uboczne, surowce odpadowe i ścieki; poprzez zmianę składu pożywki i parametrów hodowli można zmieniać skład aminokwasowy białka.

16 Jakość produktu mikroorganizmy zawierają dużą ilość białka odpowiedniej jakości; mogą zawierać również dużą ilość tłuszczów, węglowodanów i witamin Wada często wysoka zawartość kwasów nukleinowych

17 Wysoka zawartość kwasów nukleinowych w SCP: (bakterie głównie DNA; grzyby głównie RNA Zasady purynowe są metabolizowane do kwasu moczowego, którego nagromadzenie w organizmie jest szkodliwe. Eliminacja RNA i DNA z komórek grzybowych: Autoliza komórek w temperaturze C. Enzymy proteolityczne są inaktywowane, a nukleazy i rybonukleazy trawią kwasy nukleinowe do zasad azotowych, które można łatwo oddzielić od SCP. INNE WADY: Niekorzystne właściwości organoleptyczne głównie bakterie Obecność substancji toksycznych głównie grzyby (mykotoksyny)

18 JAKIE MIKROORGANIZMY MOŻNA WYKORZYSTAĆ DO BIOSYNTEZY SCP? Grzyby (głównie pleśniowe) Drożdże Bakterie

19 Drobnoustroje używane do biosyntezy białka powinny odznaczać się: Ze względu na wartości odżywcze i bezpieczeństwo stosowania: odpowiednim składem chemicznym biomasy, odpowiadającym wysokoodżywczym produktom spożywczym i paszowym (wysoką zawartością białka, tłuszczu, węglowodanów i witamin, brakiem substancji antyżywieniowych, niską zawartością kwasów nukleinowych);

20 właściwościami syntetyzowania korzystnych i wymaganych w środkach odżywczych, substancji o działaniu oligodynamicznym (witamin i specyficznych organicznych połączeń związków mineralnych); brakiem zdolności syntezy substancji toksycznych; brakiem zdolności adsorpcji substancji toksycznych lub rakotwórczych z pożywki

21 Ze względów technologicznych zdolnością do wszechstronnego i maksymalnego wykorzystania odżywczych składników podłoża (węglowodanów, związków azotowych, kwasów organicznych, alkoholi, aldehydów, substancji mineralnych); dobrze rozbudowanym kompleksem enzymów oddechowych, warunkujących szybki wzrost biomasy

22 odpornością na niekorzystne zmiany składu podłoża i warunków hodowli; korzystnymi cechami technologicznymi, ułatwiającymi dalszą obróbkę technologiczną biomasy (wydzielanie, dezintegrację itp.);

23 DROBNOUSTROJE WYKORZYSTYWANE DO OTRZYMYWANIA SCP: Drożdże: Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces carlsbergensis, Candida utilis, Candida tropicalis, Candida lipolytica, Kluyveromuces marxianus Grzyby: Fusarium gravinearum, Paecilomyces varioti Bakterie: Methylomonas, Methylococcus, Arthrobacter, Bacillus, Pseudomonas, Micrococcus

24 Zestawienie substratów i mikroorganizmów w procesie produkcji białka mikrobiologicznego

25 PRZYKŁADY INNYCH NIŻ BIOTECHNOLOGIA FARMACEUTYCZNA I ŻYWNOŚCI ZASTOSOWAŃ METOD BIOTECHNOLOGICZNYCH

26 Enzymatyczna synteza tlenków alkenów Wg S. Russel Biotechnologia

27 ZARYS BEZTLENOWEGO ROZKŁADU ZWIĄZKÓW ORGANICZNYCH W PROCESIE FERMENTACJI METANOWEJ Wg S. Russel Biotechnologia