(86) Data 1 numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/IB95/00452

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (21) Numer zgłoszenia: (22) Data zgłoszenia (86) Data 1 numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/IB95/00452 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego , W095/34659, PCT Gazette nr 54/95 (13) B1 (5 1) IntCl7 C12N 15/53 C12N 15/82 C12N 5/10 A01H 1/00 A01H 1/04 C12Q 1/26 A61K 38/44 (54)Izolowana cząsteczka DNA kodująca białko z organizmu eukariota mająca aktywność protoporfirynogenu (protoks), cząsteczka DNA kodująca zmodyfikowaną oksydazę rotoporfirynogenu (protoks), chimerowy gen, zrekombinowany wektor, komórka pgospodarza, komórka roślinna włączając w to jej potomstwo, sposób kontrolowania wzrostu niepożądanej wegetacji, sposób testowania związku chemicznego na zdolność hamowania enzymu protoks z rośliny, sposób selekcji roślin, tkanek roślinnych lub komórek roślinnych, sposób wytwarzania komórki gospodarza, sposób wytwarzania komórki roślinnej oraz sposób wytwarzania potomstwa z rośliny rodzicielskiej (30) Pierwszeństwo: ,US,08/ ( 7 3 ) Uprawniony z patentu: Novartis AG, Bazylea, CH (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 09/97 (72) Twórcy wynalazku: Enc R. Ward, Durham, US Sandra Volrath, Durham, US (45) o udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 09/02 (74) Pełnomocnik: Wierzchoń Jan, JAN WIERZCHOŃ & PARTNERZY, Biuro Patentów i Znaków Towarowych s.c. (57) PL B1 1. Izolowana cząsteczka DNA kodująca białko z organizmu eukariota mające aktywność oksydazy protoporfirynogenu (protoks), która to cząsteczka DNA zawiera sekwencję nukleotydową selektywnie hybrydyzującą z sekwencją nukleotydową wybraną z grupy obejmującej SEK NR ID 1 i Chimerowy gen zawierający promotor zdolny do funkcjonowania w roślinie lub komórce roślinnej, dołączony w sposób funkcjonalny do i) cząsteczki heterologicznego DNA kodującej białko z wyższego eukariota, mające aktywność oksydazy protoporfirynogenu (protoks), która to cząsteczka DNA zawiera sekwencję nukleotydową selektywnie hybrydyzującą z sekwencją nukleotydową wybraną z grupy obejmującej SEK NR ID 1 i 3 lub ii) cząsteczki DNA kodującej zmodyfikowaną oksydazę protoporfirynogenu (protoks), która to oksydaza zawiera protoks eukariotyczny z co najmniej jedną modyfikacją aminokwasową i w której ten zmodyfikowany protoks wykazuje tolerancję na herbicyd w ilości, która hamuje protoks eukariotyczny zawierający sekwencję aminokwasową określoną jako SEK NR ID 2, przy czym ta co najmniej jedna modyfikacja aminokwasowa jest podstawieniem aminokwasu wybranego z grupy zawierającej alaninę w pozycji 220, glicynę w pozycji 221 oraz tyrozynę w pozycji 426 w SEK NR ID 2.

2 Izolowana cząsteczka DNA kodująca białko z organizmu eukariota mająca aktywność protoporfirynogenu (protoks), cząsteczka DNA kodująca zmodyfikowaną oksydazę protoporfirynogenu (protoks), chimerowy gen, zrekombinowany wektor, komórka gospodarza, komórka roślinna włączając w to jej potomstwo, sposób kontrolowania wzrostu niepożądanej wegetacji, sposób testowania związku chemicznego na zdolność hamowania enzymu protoks z rośliny, sposób selekcji roślin, tkanek roślinnych lub komórek roślinnych, sposób wytwarzania komórki gospodarza, sposób wytwarzania komórki roślinnej oraz sposób wytwarzania potomstwa z rośliny rodzicielskiej Zastrzeżenia patentowe 1. Izolowana cząsteczka DNA kodująca białko z organizmu eukariota mające aktywność oksydazy protoporfirynogenu (protoks), która to cząsteczka DNA zawiera sekwencją nukleotydową selektywnie hybrydyzującą z sekwencją nukleotydową wybraną z grupy obejmującej SEK NR ID 1 i Cząsteczka DNA według zastrz. 1, znamienna tym, że eukariotą jest gatunek Arabidopsis. 3. Cząsteczka DNA według zastrz. 1, znamienna tym, że koduje białko obejmujące sekwencję aminokwasową wybraną z grupy składającej się z SEK NR ID 2 i Cząsteczka DNA według zastrz. 3, znamienna tym, że zawiera sekwencję nukleotydową wybraną z grupy obejmującej SEK NR ID 1 i Cząsteczka DNA kodująca zmodyfikowaną oksydazę protoporfirynogenu (protoks), która to oksydaza zawiera protoks eukariotyczny z co najmniej jedną modyfikacją aminokwasową i w której ten zmodyfikowany protoks wykazuje tolerancję na herbicyd w ilości, która hamuje protoks eukariotyczny zawierający sekwencję aminokwasową określoną w SEK NR ID 2, przy czym ta co najmniej jedna modyfikacja aminokwasowa jest podstawieniem aminokwasu, wybranego z grupy zawierającej alaninę, pozycji 220, glicynę w pozycji 221 oraz tyrozynę w pozycji 426 w SEK NR ID Cząsteczka DNA według zastrz. 5, znamienna tym, że alanina w pozycji 220 jest zastąpiona przez aminokwas wybrany z grupy zawierającej walinę, treoninę, leucynę, cysteinę i tyrozynę. 7. Cząsteczka DNA według zastrz. 5, znamienna tym, że glicyna w pozycji 221 jest zastąpiona przez serynę. 8. Cząsteczka DNA według zastrz. 5, znamienna tym, że tyrozyna w pozycji 426 jest zastąpiona przez aminokwas wybrany z grupy zawierającej cysteinę, izoleucynę, leucynę i treoninę. 9. Chimerowy gen zawierający promotor zdolny do funkcjonowania w roślinie lub komórce roślinnej, dołączony w sposób funkcjonalny do i) cząsteczki heterologicznego DNA kodującej białko z wyższego eukariota, mające aktywność oksydazy protoporfirynogenu (protoks), która to cząsteczka DNA zawiera sekwencję nukleotydową selektywnie hybrydyzującą z sekwencją nukleotydową wybraną z grupy obejmującej SEK NR ID 1 i 3 lub ii) cząsteczki DNA kodującej zmodyfikowaną oksydazę protoporfirynogenu (protoks), która to oksydaza zawiera protoks eukariotyczny z co najmniej jedną modyfikacją aminokwasową i w której ten zmodyfikowany protoks wykazuje tolerancję na herbicyd w ilości, która hamuje protoks eukariotyczny zawierający sekwencję aminokwasową określoną jako SEK NR ID 2, przy czym ta co najmniej jedna modyfikacja aminokwasowa jest podstawieniem aminokwasu wybranego z grupy zawierającej alaninę w pozycji 220, glicynę w pozycji 221 oraz tyrozynę w pozycji 426 w SEK NR ID 2.

3 Chimerowy gen według zastrz. 9, znamienny tym, że zawiera promotor dołączony w sposób funkcjonalny do cząsteczki heterologicznego DNA kodującej białko z wyższego eukariota o aktywności oksydazy protoporfirynogenu (protoks), która to cząsteczka DNA zawiera sekwencję nukleotydową selektywnie hybrydyzującą z sekwencją nukleotydową wybraną z grupy obejmującej SEK NR ID 1 i Chimerowy gen według zastrz. 10, znamienny tym, że eukariotą jest gatunek Arabidopsis. 12. Chimerowy gen według zastrz. 9, znamienny tym, że zawiera promotor dołączony w sposób funkcjonalny do cząsteczki DNA kodującej zmodyfikowaną oksydazę protoporfirynogenu (protoks), która to oksydaza zawiera protoks eukariotyczny z co najmniej jedną modyfikacją aminokwasową i w której ten zmodyfikowany protoks wykazuje tolerancję na herbicyd w ilości, która hamuje protoks eukariotyczny zawierający sekwencję aminokwasową określoną jako SEK NR ID 2, przy czym ta co najmniej jedna modyfikacja aminokwasowa jest podstawieniem aminokwasu wybranego z grupy zawierającej alaninę w pozycji 220, glicynę w pozycji 221 oraz tyrozynę w pozycji 426 w SEK NR ID Chimerowy gen według zastrz. 12, znamienny tym, że alanina w pozycji 220 jest zastąpiona przez aminokwas wybrany z grupy zawierającej walinę, treoninę, leucynę, cysteinę i tyrozynę. 14. Chimerowy gen według zastrz. 12, znamienny tym, że glicyna w pozycji 221 jest zastąpiona przez serynę. 15. Chimerowy gen według zastrz. 12, znamienny tym, że tyrozyna w pozycji 426 jest zastąpiona przez aminokwas wybrany z grupy zawierającej cysteinę, izoleucynę, leucynę i treoninę. 16. Chimerowy gen według zastrz. 9, znamienny tym, że jego promotor jest aktywny w roślinie. 17. Chimerowy gen według zastrz. 9, znamienny tym, że dodatkowo zawiera sekwencję sygnałową połączoną w sposób funkcjonalny z cząsteczką DNA, przy czym sekwencja sygnałowa jest zdolna do kierowania białka kodowanego przez cząsteczkę DNA do chloroplastu. 18. Chimerowy gen według zastrz. 9, znamienny tym, że dodatkowo zawiera sekwencję sygnałową połączoną w sposób funkcjonalny z cząsteczką DNA, przy czym sekwencja sygnałowa jest zdolna do kierowania białka kodowanego przez cząsteczkę DNA do mitochondrium. 19. Chimerowy gen według zastrz. 9, znamienny tym, że jest częścią genomu roślinnego. 20. Zrekombinowany wektor, znamienny tym, że zawiera chimerowy gen z promotorem zdolnym do funkcjonowania w roślinie lub komórce roślinnej, dołączonym w sposób funkcjonalny do i) cząsteczki heterologicznego DNA kodującej białko z wyższego eukariota o aktywności oksydazy protoporfirynogenu (protoks), która to cząsteczka DNA zawiera sekwencję nukleotydową selektywnie hybrydyzującą z sekwencją nukleotydową wybraną z grupy obejmującej SEK NR ID 1 i 3 lub ii) cząsteczki DNA kodującej zmodyfikowaną oksydazę protoporfirynogenu (protoks), która to oksydaza zawiera protoks eukariotyczny z co najmniej jedną modyfikacją aminokwasową i w której ten zmodyfikowany protoks wykazuje tolerancję na herbicyd w ilości, która hamuje protoks eukariotyczny zawierający sekwencję aminokwasową określoną jako SEK NR ID 2, przy czym ta co najmniej jedna modyfikacja aminokwasowa jest podstawieniem aminokwasu wybranego z grupy zawierającej alaninę w pozycji 220, glicynę w pozycji 221 oraz tyrozynę w pozycji 426 w SEK NR ID Zrekombinowany wektor według zastrz. 20, znamienny tym, że promotor jest dołączony w sposób funkcjonalny do cząsteczki heterologicznego DNA, kodującej białko z wyższego eukariota o aktywności oksydazy protoporfirynogenu (protoks), która to cząsteczka DNA zawiera sekwencję nukleotydową selektywnie hybrydyzującą z sekwencją nukleotydową wybraną z grupy obejmującej SEK NR ID 1 i 3.

4 Zrekombinowany wektor według zastrz. 21, znamienny tym, że eukariotąjest gatunek Arabidopsis. 23. Zrekombinowany wektor według zastrz. 20, znamienny tym, że promotor jest dołączony w sposób funkcjonalny do cząsteczki DNA, kodującej zmodyfikowaną oksydazę protoporfirynogenu (protoks), która to oksydaza zawiera protoks eukariotyczny z co najmniej jedną modyfikacją aminokwasową i w której ten zmodyfikowany protoks wykazuje tolerancję na herbicyd w ilości, która hamuje protoks eukariotyczny zawierający sekwencję aminokwasową określoną jako SEK NR ID 2, przy czym ta co najmniej jedna modyfikacja aminokwasowa jest podstawieniem aminokwasu wybranego z grupy zawierającej alaninę w pozycji 220, glicynę w pozycji 221 oraz tyrozynę w pozycji 426 w SEK NR ID Zrekombinowany wektor według zastrz. 20, znamienny tym, że alanina w pozycji 220 jest zastąpiona przez aminokwas wybrany z grupy zawierającej walinę, treoninę, leucynę, cysteinę i tyrozynę. 25. Zrekombinowany wektor według zastrz. 20, znamienny tym, że glicyna w pozycji 221 jest zastąpiona przez serynę. 26. Zrekombinowany wektor według zastrz. 20, znamienny tym, że tyrozyna w pozycji 426 jest zastąpiona przez aminokwas wybrany z grupy zawierającej cysteinę, izoleucynę, leucynę i treoninę. 27. Zrekombinowany wektor według zastrz. 20, znamienny tym, że jest zdolny do stabilnej transformacji w komórce roślinnej. 28. Komórka gospodarza, znamienna tym, że zawiera chimerowy gen mający promotor zdolny do funkcjonowania w roślinie lub komórce roślinnej, dołączony w sposób funkcjonalny do i) cząsteczki hetero logicznego DNA, kodującej białko z wyższego eukariota o aktywności oksydazy protoporfirynogenu (protoks), która to cząsteczka DNA zawiera nukleotydową selektywnie hybrydyzującą z sekwencją nukleotydową wybraną z grupy obejmującej SEK NR ID 1 i 3 lub ii) cząsteczki DNA, kodującej zmodyfikowaną oksydazę protoporfirynogenu (protoks), która to oksydaza zawiera protoks eukariotyczny z co najmniej jedną modyfikacją aminokwasową i w której ten zmodyfikowany protoks wykazuje tolerancję na herbicyd w ilości, która hamuje protoks eukariotyczny zawierający sekwencję aminokwasową określoną jako SEK NR ID 2, przy czym ta co najmniej jedna modyfikacja aminokwasowa jest podstawieniem aminokwasu wybranego z grupy zawierającej alaninę w pozycji 220, glicynę w pozycji 221 oraz tyrozynę w pozycji 426 w SEK NR ID 2, z tym, że komórka gospodarza jest zdolna do ekspresji kodującej cząsteczki DNA. 29. Komórka gospodarza według zastrz. 28, znamienna tym, że promotor jest dołączony w sposób funkcjonalny do cząsteczki hetero logicznego DNA, kodującej białko z wyższego eukariota o aktywności oksydazy protoporfirynogenu (protoks), która to cząsteczka DNA zawiera sekwencję nukleotydową selektywnie hybrydyzującą z sekwencją nukleotydową wybraną z grupy obejmującej SEK NR ID 1 i Komórka gospodarza według zastrz. 29, znamienna tym, że eukariotą jest gatunek Arabidopsis. 31. Komórka gospodarza według zastrz. 28, znamienna tym, że promotor jest dołączony w sposób funkcjonalny do cząsteczki DNA, kodującej zmodyfikowaną oksydazę protoporfirynogenu (protoks), która to oksydaza zawiera protoks eukariotyczny z co najmniej jedną modyfikacją aminokwasową i w której ten zmodyfikowany protoks wykazuje tolerancję na herbicyd w ilości, która hamuje protoks eukariotyczny zawierający sekwencję aminokwasową określoną jako SEK NR ID 2, przy czym ta co najmniej jedna modyfikacja aminokwasowa jest podstawieniem aminokwasu wybranego z grupy zawierającej alaninę w pozycji 220, glicynę w pozycji 221 oraz tyrozynę w pozycji 426 w SEK NR ID Komórka gospodarza według zastrz. 31, znamienna tym, że alanina w pozycji 220 jest zastąpiona przez aminokwas wybrany z grupy zawierającej walinę, treoninę, leucynę, cysteinę i tyrozynę.

5 Komórka gospodarza według zastrz. 31, znamienna tym, że glicyna w pozycji 221 jest zastąpiona przez serynę. 34. Komórka gospodarza według zastrz. 31, znamienna tym, że tyrozyna w pozycji 426 jest zastąpiona przez aminokwas wybrany z grupy zawierającej cysteinę, izoleucynę, leucynę i treoninę. 35. Komórka gospodarza według zastrz. 28, znamienna tym, że jest wybrana z grupy obejmującej komórki roślinne, komórki bakteryjne, komórki drożdży i komórki owada. 36. Komórka roślinna włączając w to jej potomstwo, znamienna tym, że zawiera chimerowy gen mający promotor zdolny do funkcjonowania w roślinie lub komórce roślinnej, dołączony w sposób funkcjonalny do i) cząsteczki heterologicznego DNA, kodującej białko z wyższego eukariota o aktywności oksydazy protoporfirynogenu (protoks), która to cząsteczka DNA zawiera sekwencję nukleotydową selektywnie hybrydyzującą z sekwencją nukleotydową wybraną z grupy obejmującej SEK NR ID 1 i 3 lub ii) cząsteczki DNA, kodującej zmodyfikowaną oksydazę protoporfirynogenu (protoks), która to oksydaza zawiera protoks eukariotyczny z co najmniej jedną modyfikacją aminokwasową i w której ten zmodyfikowany protoks wykazuje tolerancję na herbicyd w ilości, która hamuje protoks eukariotyczny zawierający sekwencję aminokwasową określoną jako SEK NR ID 2, przy czym ta co najmniej jedna modyfikacja aminokwasową jest podstawieniem aminokwasu wybranego z grupy zawierającej alaninę w pozycji 220, glicynę w pozycji 221 oraz tyrozynę w pozycji 426 w SEK NR ID 2, z tym, że kodująca cząsteczka DNA podlega ekspresji w roślinie i nadaje, odpowiednio roślinie i komórce roślinnej, tolerancję na herbicyd w ilości, która hamuje naturalnie występującą aktywność protoks. 37. Komórka roślinna według zastrz. 36, znamienna tym, że promotor jest dołączony w sposób funkcjonalny do cząsteczki heterologicznego DNA, kodującej białko z wyższego eukariota o aktywności oksydazy protoporfirynogenu (protoks), która to cząsteczka DNA zawiera sekwencję nukleotydową selektywnie hybrydyzującą z sekwencją nukleotydową wybraną z grupy obejmującej SEK NR ID 1 i Komórka roślinna według zastrz. 37, znamienna tym, że eukariotą jest gatunek Arabidopsis. 39. Komórka roślinna według zastrz. 36, znamienna tym, że promotor jest dołączony w sposób funkcjonalny do cząsteczki DNA, kodującej zmodyfikowaną oksydazę protoporfirynogenu (protoks), która to oksydaza zawiera protoks eukariotyczny z co najmniej jedną modyfikacją aminokwasową i w której ten zmodyfikowany protoks wykazuje tolerancję na herbicyd w ilości, która hamuje protoks eukariotyczny zawierający sekwencję aminokwasową określoną jako SEK NR ID 2, przy czym ta co najmniej jedna modyfikacja aminokwasową jest podstawieniem aminokwasu wybranego z grupy zawierającej alaninę w pozycji 220, glicynę w pozycji 221 oraz tyrozynę w pozycji 426 w SEK NR ID Komórka roślinna według zastrz. 39, znamienna tym, że alanina w pozycji 220 jest zastąpiona przez aminokwas wybrany z grupy zawierającej walinę, treoninę, leucynę, cysteinę i tyrozynę. 41. Komórka roślinna według zastrz. 39, znamienna tym, że glicyna w pozycji 221 jest zastąpiona przez serynę. 42. Komórka roślinna według zastrz. 39, znamienna tym, że tyrozyna w pozycji 426 jest zastąpiona przez aminokwas wybrany z grupy zawierającej cysteinę, izoleucynę, leucynę i treoninę. 43. Sposób kontrolowania wzrostu niepożądanej wegetacji, znamienny tym, że stosuje się skuteczną ilość herbicydu hamującego protoks wobec populacji rośliny zawierającej chimerowy gen mający promotor zdolny do funkcjonowania w roślinie lub komórce roślinnej, dołączony w sposób funkcjonalny do i) cząsteczki heterologicznego DNA, kodującej białko z wyższego eukariota o aktywności oksydazy protoporfirynogenu (protoks), która to cząsteczka DNA zawiera sekwencję nukleotydową selektywnie hybrydyzującą z sekwencją nukleotydową wybraną z grupy obejmującej SEK NR ID 1 i 3 lub

6 ii) cząsteczki DNA, kodującej zmodyfikowaną oksydazę protoporfirynogenu (protoks), która to oksydaza zawiera protoks eukariotyczny z co najmniej jedną modyfikacją aminokwasową i w której ten zmodyfikowany protoks wykazuje tolerancję na herbicyd w ilości, która hamuje protoks eukariotyczny zawierający sekwencję aminokwasową określoną jako SEK NR ID 2, przy czym ta co najmniej jedna modyfikacja aminokwasowa jest podstawieniem aminokwasu wybranego z grupy zawierającej alaninę w pozycji 220, glicynę w pozycji 221 oraz tyrozynę w pozycji 426 w SEK NR ID 2, z tym, że stosuje się cząsteczkę DNA podlegającą ekspresji w roślinie i nadającą, odpowiednio roślinie, tolerancję na herbicyd w ilości, która hamuje naturalnie występującą aktywność protoks, przy czym jako herbicyd hamujący protoks stosuje się herbicyd wybrany z grupy składającej się z arylouracylu, difenyloeteru, oksydiazolu, cyklicznego imidu, fenylopirazolu, pochodnych pirydynowych, podstawionego w pozycji 3 2-arylo-4,5,6,7-tetrahydroindazolu, fenopilanu oraz O-fenylopirolidyno- i piperydynokarbanylowych analogów tego fenopilanu, N-podstawionych pirazoli, N-fenylopirazoli oraz związków o wzorach 18 i 19 i herbicyd ten, hamujący protoks, stosuje się w dawkach od 0,0001 do 10 kg/ha. 44. Sposób według zastrz. 43, znamienny tym, że stosuje się promotor dołączony w sposób funkcjonalny do cząsteczki heterologicznego DNA, kodującej białko z wyższego eukariota o aktywności oksydazy protoporfirynogenu (protoks), która to cząsteczka DNA zawiera sekwencję nukleotydową selektywnie hybrydyzującą z sekwencją nukleotydową wybraną z grupy obejmującej SEK NR ID 1 i Sposób według zastrz. 44, znamienny tym, że jako organizm eukariota stosuje się gatunek Arabidopsis. 46. Sposób według zastrz. 43, znamienny tym, że stosuje się promotor dołączony w sposób funkcjonalny do cząsteczki DNA, kodującej zmodyfikowaną oksydazę protoporfirynogenu (protoks), która to oksydaza zawiera eukariotyczny protoks z co najmniej jedną modyfikacją aminokwasową i w której ten zmodyfikowany protoks wykazuje tolerancję na herbicyd w ilości, która hamuje protoks eukariotyczny zawierający sekwencję aminokwasową określoną w SEK NR ID 2, przy czym ta co najmniej jedna modyfikacja aminokwasowa jest podstawieniem aminokwasu, wybranego z grupy zawierającej alaninę w pozycji 220, glicynę w pozycji 221 oraz tyrozyny w pozycji 426 w SEK NR ID Sposób według zastrz. 46, znamienny tym, że alaninę w pozycji 220 zastępuje się przez aminokwas wybrany z grupy zawierającej walinę, treoninę, leucynę, cysteinę i tyrozynę. 48. Sposób według zastrz. 46, znamienny tym, że glicynę w pozycji 221 zastępuje się przez serynę. 49. Sposób według zastrz. 46, znamienny tym, że tyrozynę w pozycji 426 zastępuje się przez aminokwas wybrany z grupy zawierającej cysteinę, izoleucynę, leucynę i treoninę. 50. Sposób według zastrz. 43, znamienny tym, że stosuje się roślinę wybraną z grupy składającej się z soi, bawełny, tytoniu, buraka cukrowego, rzepaku, kukurydzy, pszenicy, sorgo, żyta, owsa, trawy darniowej i ryżu. 51. Sposób według zastrz. 43, znamienny tym, że jako herbicyd hamujący protoks stosuje się imid o wzorze 5, w którym Q oznacza wzór 6 lub 7, lub 8, lub 9, lub 9a, lub 9b i gdzie R, oznacza H, Cl lub F, R2 oznacza Cl i R3 jest eterem, tioeterem, estrem, grupą aminową lub alkilową, przy czym R21R3razem mogą tworzyć 5- lub 6-składnikowy pierścień heterocykliczny. 52. Sposób według zastrz. 43, znamienny tym, że stosuje się imid wybrany z grupy składającej się ze związków o wzorze 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 i 17, w których R oznacza grupę (C2.6-alkenyloksy)karbonylo-C1-4-alkilową. 53. Sposób według zastrz. 43, znamienny tym, że jako herbicyd hamujący protoks stosuje się związek o wzorze wybranym z grupy obejmującej wzory 18,19, 20 i Sposób testowania związku chemicznego na zdolność hamowania enzymu protoks z rośliny, znamienny tym, że (a) do pierwszej mieszaniny reakcyjnej dodaje się enzym protoks, zawierający sekwencję aminokwasową wybraną z grupy składającej się z SEK NR ID 2 i 4 i protoporfirynogen IX w warunkach, w których enzym protoks ma zdolność do katalizowania przekształcenia protoporfirynogenu IX w protoporfirynę IX,

7 (b) do drugiej mieszaniny reakcyjnej dodaje się testowany związek chemiczny, enzym protoks i protoporfirynogen IX w takich samych warunkach jak w przypadku pierwszej mieszaniny reakcyjnej, (c) wzbudza się pierwszą i drugą mieszaninę przy 395 do 410 nm; (d) porównuje się fluorescencję pierwszej i drugiej mieszaniny reakcyjnej przy zakresie 622 do 635 nm i jeżeli fluorescencja drugiej mieszaniny reakcyjnej jest znacząco mniejsza od fluorescencji pierwszej mieszaniny reakcyjnej określa się, że związek chemiczny jest zdolny do hamowania aktywności enzymu protoks. 55. Sposób selekcji roślin, tkanek roślinnych lub komórek roślinnych stransformowanych transgenem będącym przedmiotem zainteresowania spośród roślin nie stransformowanych, znamienny tym, że (a) transformuje się rośliny, tkanki roślinne lub komórki roślinne transgenem będącym przedmiotem zainteresowania, zdolnym do podlegania ekspresji w roślinach i genem chimerowym, zawierającym promotor zdolny do funkcjonowania w roślinie lub komórce roślinnej i dołączony w sposób fu nkcjonalny do cząsteczki DNA, kodującej zmodyfikowaną oksydazę protoporfirynogenu (protoks), która to oksydaza zawiera protoks eukariotyczny z co najmniej jedną modyfikacją aminokwasową i w której ten zmodyfikowany protoks wykazuje tolerancję na herbicyd w ilości, która hamuje protoks eukariotyczny zawierający sekwencję aminokwasową określoną w SEK NR ID 2, przy czym ta co najmniej jedna modyfikacja aminokwasowa jest podstawieniem aminokwasu wybranego z grupy zawierającej alaninę w pozycji 220, glicynę w pozycji 221 oraz tyrozynę w pozycji 426 w SEK NR ID 2, (b) przenosi się tak stransformowane rośliny lub komórki roślinne do pożywki zawierającej inhibitor protoks, gdzie herbicyd hamujący protoks jest wybrany z grupy składającej się z arylouracylu, difenyloeteru, oksydiazolu, cyklicznego imidu, fenylopirazolu, pochodnych pirydynowych, podstawionego w pozycji 3 2-arylo-4,5,6,7-tetrahydroindazolu, fenopilanu oraz O-fenylopirolidyno- i piperydynokarbanylowych analogów tego fenopilanu, N-podstawionych pirazoli, N-fenylopirazoli, związków o wzorach 18 i 19, przy czym stężenie herbicydu hamującego protoks w pożywce wynosi 0,001 do 3000 części na milion, oraz (c) selekcjonuje się rośliny lub komórki roślinne, które przeżywają w pożywce. 56. Sposób wytwarzania komórki gospodarza zawierającej wyizolowaną cząsteczkę DNA, kodującą białko z eukariota mające aktywność oksydazy protoporfirynogenu (protoks), znamienny tym, że transformuje się komórkę gospodarza genem chimerowym zawierającym promotor zdolny do funkcjonowania w roślinie, dołączony w sposób funkcjonalny do cząsteczki DNA kodującej zmodyfikowaną oksydazę protoporfirynogenu (protoks), która to oksydaza zawiera protoks eukariotyczny z co najmniej jedną modyfikacją aminokwasową i w której ten zmodyfikowany protoks wykazuje tolerancję na herbicyd w ilości, która hamuje protoks eukariotyczny zawierający sekwencję aminokwasową określoną w SEK NR ID 2, przy czym ta co najmniej jedna modyfikacja aminokwasowa jest podstawieniem aminokwasu wybranego z grupy zawierającej alaninę w pozycji 220, glicynę w pozycji 221 oraz tyrozynę w pozycji 426 w SEK NR ID 2, z tym, że otrzymany wektor jest zdolny do stabilnej transformacji komórki gospodarza. 57. Sposób wytwarzania komórki roślinnej, zawierającej wyizolowaną cząsteczkę DNA kodującą białko z eukariota mające aktywność oksydazy protoporfirynogenu (protoks), znamienny tym, że transformuje się komórkę roślinną genem chimerowym zawierającym promotor zdolny do funkcjonowania w roślinie, dołączony w sposób funkcjonalny do cząsteczki DNA kodującej zmodyfikowaną oksydazę protoporfirynogenu (protoks), która to oksydaza zawiera protoks eukariotyczny z co najmniej jedną modyfikacją aminokwasową i w której ten zmodyfikowany protoks wykazuje tolerancję na herbicyd w ilości, która hamuje protoks eukariotyczny obejmujący sekwencję aminokwasową określoną w SEK NR ID 2, przy czym ta co najmniej jedna modyfikacja aminokwasowa jest podstawieniem aminokwasu wybranego z grupy zawierającej alaninę w pozycji 220, glicynę w pozycji 221 oraz tyrozynę w pozycji 426 w SEK NR ID 2, z tym, że otrzymany wektor jest zdolny do stabilnej transformacji komórki gospodarza.

8 Sposób wytwarzania potomstwa z rośliny rodzicielskiej, zawierającej wyizolowaną cząsteczkę DNA kodującą białko z eukariota mające aktywność oksydazy protoporfirynogenu (protoks), znamienny tym, że transformuje się roślinę rodzicielską genem chimerowym zawierającym promotor zdolny do funkcjonowania w roślinie, dołączony w sposób funkcjonalny do cząsteczki DNA, kodującej zmodyfikowaną oksydazę protoporfirynogenu (protoks), która to oksydaza zawiera protoks eukariotyczny z co najmniej jedną modyfikacją aminokwasową i w której ten zmodyfikowany protoks wykazuje tolerancję na herbicyd w ilości, która hamuje protoks eukariotyczny obejmujący sekwencję aminokwasową określoną w SEK NR ID 2, przy czym ta co najmniej jedna modyfikacja aminokwasowa jest podstawieniem aminokwasu wybranego z grupy zawierającej alaninę w pozycji 220, glicynę w pozycji 221 oraz tyrozynę w pozycji 426 w SEK NR ID 2, z tym, że wprowadzany wektor jest zdolny do stabilnej transformacji komórki gospodarza i przeniesienia cechy tolerowania herbicydu na potomstwo takiej rodzicielskiej rośliny w znanych technikach hodowli roślin. * * * Przedmiotem wynalazku jest izolowana cząsteczka DNA kodująca białko z organizmu eukanota mająca aktywność oksydazy protoporfirynogenu (protoks) oraz cząsteczka DNA kodująca zmodyfikowaną oksydazę protoporfirynogenu (protoks) i produkty inżynierii genetycznej z udziałem tych cząsteczek: chimerowy gen, zrekombinowany wektor, komórka gospodarza i komórka roślinna włączając w to jej potomstwo oraz sposoby inżynierii genetycznej z udziałem tych cząsteczek, a mianowicie: sposób kontrolowania wzrostu niepożądanej wegetacji, sposób testowania związku chemicznego na zdolność hamowania enzymu protoks z rośliny, sposób selekcji roślin, tkanek roślinnych lub komórek roślinnych, sposób wytwarzania komórki gospodarza, sposób wytwarzania komórki roślinnej oraz sposób wytwarzania potomstwa z rośliny rodzicielskiej. Wynalazek stosuje się do manipulowania aktywnością enzymatyczną odpowiedzialną za przekształcenie protoporfirynogenu IX w protoporfirynę IX w szlaku biosyntetycznym wspólnym dla wszystkich organizmów eukariotycznych. W jednym z aspektów, wynalazek stosuje się do opracowania oporności na herbicydy roślin, tkanek roślinnych i nasion. W innym aspekcie: do opracowania diagnostyki i leczenia braku takiej aktywności u zwierząt i u ludzi. Szlaki biosyntetyczne, które prowadzą do wytwarzania chlorofilu i hemu mają wiele wspólnych etapów. Chlorofil jest gromadzącym światło pigmentem obecnym u wszystkich zielonych organizmów prowadzących fotosyntezę. Hem jest kofaktorem hemoglobiny, cytochromów, oksygenaz P-450 o złożonym działaniu, peroksydaz oraz katalaz (patrz np. Lehninger, Biochemistry. Worth Publishers, New York (1975)), a zarazem jest niezbędnym składnikiem wszystkich organizmów aerobowych. Ostatnim wspólnym etapem biosyntezy chlorofilu i hemu jest utlenienie protoporfirynogenu IX do protoporfiryny IX. Oksydaza protopor firynogenu (określana tu jako protoks ) jest enzymem, który katalizuje ten ostatni etap utleniania (Matringe et al., Biochem. J. 260 : 231 (1989)). Enzym protoks został częściowo lub całkowicie oczyszczony z dużej liczby organizmów, włączając w to drożdże Saccharomyces cerevisiae (Labbe-Bois and Labbe, W Biosynthesis o f Heme and Chlorophyll, E.H. Dailey, ed. McGraw Hill: New York, str (1990)), etioplasty owsa (Jacobs and Jacobs, Biochem. J. 244: 219 (1987)), i mysią wątrobę (Dailey and Karr, Biochem. 26: 2697 (1987)). Geny kodujące protoks zostały wyizolowane z dwóch organizmów prokariotycznych, Escherichia coli (Sasarman et al., Can. J. Microbiol. 39:1155 (1993)) i Bacillus subtilis (Dailey et al., J. Biol. Chem. 269: 813 (1994)). Geny te nie wykazują podobieństwa sekwencji, jak również ich przewidywane produkty białkowe nie wykazują jakiegokolwiek podobieństwa sekwencji aminokwasowej. Białko E. coli ma wielkość około 21 kd i jest związane z błoną komórkową. Białko B. subtilis o wielkości około 51 kd ma aktywność rozpuszczalną, cytoplazmatyczną.

9 W chwili obecnej zbyt mało wiadomo o enzymie protoks, aby możliwe było izolowanie genów kodujących protoks z wyższych organizmów eukariotycznych (tj. zwierząt, roślin i wszystkich innych wielokomórkowych zawierających jądra organizmów, innych niż niższe mikroorganizmy eukariotyczne, takie jak drożdże, jednokomórkowe glony, pierwotniaki itd.) stosując znane podejścia. W szczególności, wiele ze standardowych technik izolacji nowych białek i genów opiera się na założeniu, że ich struktura pierwszorzędowa (tj. sekwencja aminokwasów i DNA) będzie wykazywać znaczące podobieństwo do znanych białek i genów, które mają taką samą funkcję. Takie standardowe techniki obejmują hybrydyzację kwasów nukleinowych i powielanie w reakcji łańcuchowej polimerazy przy zastosowaniu starterów oligonukleotydowych odpowiadających konserwowanym motywom w sekwencji aminokwasowej. Nie można się spodziewać przydatności tych technik do izolowania eukariotycznych genów protoks przy zastosowaniu obecnie dostępnej informacji o strukturze, która ogranicza się jedynie do prokariotycznych genów protoks, ponieważ nie ma podobieństwa strukturalnego nawet pomiędzy znanymi prokariotycznymi genami i białkami. Inne podejście, które było stosowane do izolowania genów biosyntetycznych z innych szlaków metabolicznych z wyższych eukariontów polega na komplementacji mutantów mikroorganizmów z brakiem aktywności będącej przedmiotem zainteresowania. W takim podejściu biblioteka cdna z wyższego eukarionta jest klonowana w wektorze, który może kierować ekspresją cdna w mikroorganizmie będącym gospodarzem. Wektor jest następnie transformowany lub wprowadzany w inny sposób do zmutowanego mikroorganizmu i izoluje się kolonie, które fenotypowo nie są już mutantami. Stratega ta powiodła się przy izolacji genów z wyższych eukariontów, które są związane z kilkoma drogami metabolicznymi, włączając w to biosyntezę histydyny (np. patent USA Nr i WO 94/ dla Ward i wsp., włączony tu w całości jako odnośnik), biosyntezę lizyny (np. Frisch et al., Mol. Gen. Genet. 228: 287 (1991)), biosyntezę puryn (np. Aimi et al., J. Biol. Chem. 265: 9011 (1990)), oraz biosyntezę tryptofanu (np. Niyogi et al., Plant Celi 5:1011 (1993)). Jednakże pomimo dostępności mutantów mikroorganizmów, które, jak się uważa, są defektywne pod względem aktywności protoks (np. E. coli (Sasarman et al., J. Gen. Microbiol. 113: 297 (1979)), Salmonella typhimurium (Xu et al., J. Bacteriol. 174: 3953 (1992)) i Saccharomyces cerevisiae (Camadro et al,. Biochem. Biophys. Res. Comm. 106: 724 (1982)), zastosowanie tej techniki do izolowania cdna kodujących eukariotyczną aktywność enzymatyczną protoks jest na podstawie dostępnych informacji co najmniej nieprzewidywalne. Istnieje wiele przyczyn tego faktu. Po pierwsze, poziom ekspresji sekwencji cdna eukariotycznego protoks może nie być odpowiedni w zmutowanym mikroorganizmie, na przykład z powodu użycia kodonów, pozostającego w niezgodzie z preferencjami użycia w mikroorganizmie będącym gospodarzem. Po drugie, pierwotny produkt translacji sklonowanej eukariotycznej sekwencji kodującej może nie wytwarzać funkcjonalnego polipeptydu, na przykład, gdy aktywność wymaga posttranslacyjnej modyfikacji, takiej jak glikozylacja, która nie jest przeprowadzana przez mikroorganizm. Po trzecie białko eukariotyczne może nie przyjmować aktywnej konformacji w mikroorganizmie będącym gospodarzem, np. gdy białko jest normalnie kierowane do specyficznego systemu błon organellamych, których nie posiada mikroorganizm będący gospodarzem. Ta ostatnia możliwość jest szczególnie prawdopodobna dla roślinnego enzymu protoks, który jest związany w komórce roślinnej z organellami nieobecnymi w mikroorganizmach, będących gospodarzami w teście komplementacji. W szczególności roślinny enzym protoks jest związany zarówno z błoną zewnętrzną chloroplastu, jak i błonami tylakoidu (Matringe et al., J. Biol. Chem. 267:4646 (1992) i prawdopodobnie dociera do tego systemu membran w rezultacie posttranslacyjnego mechanizmu transportu, obejmującego zarówno N-końcową sekwencję kierującą jak i własności samego dojrzałego polipeptydu (patrz np. Kohom and Tobin, Plant Celi 1:159 (1989); Li et al., Plant Celi 3: 709 (1991); Li et al., J. Biol. Chem. 267:18999 (1992)). Wiadomo, że enzym protoks odgrywa rolę w pewnych przypadkach chorób ludzkich. Pacjenci cierpiący na różnorodne porfirię, autosomalną chorobę dominującą, charakteryzującą

10 się zarówno symptomami neuropsychiatrycznymi, jak i defektami skóry, uzależnioną od wzrostu poziomu aktywności protoks (Brenner and Bloomer, New Engl. J. Med 302: 765 (1980)). Wskutek braku wiedzy odnośnie ludzkiego enzymu protoks i odpowiadającego mu genu, możliwości diagnostyki i leczenia tej choroby są w chwili obecnej bardzo ograniczone. Stosowanie herbicydów do kontrolowania niepożądanej wegetacji, takiej jak chwasty lub rośliny na zbiorach, stało się nieomalże powszechną praktyką. Związane z tym wydatki przekraczają rocznie bilion dolarów. Pomimo intensywnego stosowania, utrzymywanie pod kontrolą chwastów pozostaje znaczącym i kosztownym problemem dla rolników. Skuteczne użycie herbicydów wymaga rozsądnego postępowania. Przykładowo, czas i sposób zastosowania oraz stadium rozwojowe chwastów są krytyczne dla uzyskania dobrej kontroli chwastów poprzez herbicydy. Ponieważ różne gatunki chwastów są oporne na herbicydy, wytwarzanie skutecznych herbicydów staje się coraz ważniejsze. Niestety, herbicydy, które wykazują większą moc, szerszy zasięg działania wobec chwastów i szybszy rozpad w glebie, mogą mieć również większą fitotoksyczność dla upraw. Jednym z rozwiązań stosowanych w takim przypadku było wytworzenie roślin uprawnych, które są oporne lub tolerują herbicydy. Hybrydowe rośliny uprawne lub odmiany oporne na herbicydy umożliwiły użycie herbicydu w uprawach, w których jego użycie było uprzednio wykluczone lub ograniczone (np. do stosowania przed-zagrożeniowego) wskutek wrażliwości uprawy na herbicyd. Przykładowo Patent USA Nr 4,761,373 dla Anderson i wsp. odnosi się do roślin opornych na różnorodne herbicydy imidazolinonowe lub sulfonamidowe. Oporność jest uzyskiwana poprzez zmieniony enzym syntazę kwasu hydroksyoctowego (AHAS). Patent USA Nr 4,975,374 dla Goodmana i wsp. dotyczy komórek roślinnych i roślin zawierających gen kodujący zmutowaną syntetazę glutaminy (GS) oporn+ą na hamowanie przez herbicydy, o których wiadomo, że hamują GS, np. fosfinotiycynę i sulfoksyminę metioniny. Patent USA Nr 5,013,659 dla Bedbrooka i wsp. dotyczy roślin, w których następuje ekspresja zmutowanej syntazy acetylomleczanowej, co czyni roślinę oporną na hamowanie przez herbicydy sulfonylomoczmkowe. Patent USA Nr 5,162,602 dla Somersa i wsp. opisuje rośliny wykazujące tolerancję wobec hamowania przez herbicydy: cykloheksanedion i kwas arylooksyfenoksypropionowy. Tolerancja jest wynikiem zmienionej karborsylazy acetylokoenzymu A (ACCazy). Enzym protoks służy jako cel dla wielu związków będących herbicydami. Herbicydy, które hamują protoks obejmują wiele różniących się strukturalnie klas cząsteczek (Duke et al., Weed Sci. 39: 465 (1991); Nandihalli et al., Pesticide Biochem. Physiol. 43:193 (1992); Matringe et al., FEBS Lett. 245: 35 (1989); Yanase and Andoh, Pesticide Biochem. Physiol. 35: 70 (1989)). Herbicydy takie obejmują difenyloetery {np. acyfluorofen, kwas 5-[2-chloro-4- -(trifluorometylo)fenoksy]-2-nitrobenzoesowy; jego ester metylowy; lub oksyfiuorfen, 2-chloro- -1-(3-etoksy-4-nitrofenoksy)-4-(trifluorobenzen)}, oksydiazole, (np. oksydiazon, 3-[2,4-dichloro-5-(l-metyloetoksy)fenylo]-5-( 1,1 -dimetyloetylo)-1,3,4-oksadiazol-2-(3h)-on, cykliczne imidy (np. S-23142, N-(4-chloro-2-fluoro-5-propargiloksyfenylo)-3,4,5,6-tetrahydroftalimid; chloroftalim, N-(4-chlorofenylo)-3,4,5,6-tetrahydroftalimid), fenylopirazole (np. TNPP-etyl, 2-[l- -(2,3,4-trichlorofenylo)-4-nitropirazolilo-5-oksy]propionian etylu; M&B 39279), pochodne pirydyny (np. LS ) oraz fenopilan i jego analogi O-fenylopir-rolidynowe i piperydynokarbaminowe. Wiele z tych związków kompetytywnie hamuje normalną reakcję katalizowaną przez enzym, działając jako analogi substratów. Przewidywany sposób działania herbicydów hamujących protoks obejmuje akumulację protoporfirynogenu IX w chloroplastach. Uważa się, że akumulacja ta prowadzi do wyciekania protoporfirynogenu do cytoplazmy, gdzie jest on utleniany przez aktywność peroksydazy do protoporfiryny IX. Gdy protoporfiryna IX jest wystawiona na działanie światła, może powodować wytwarzanie singletowego tlenu w cytozolu. Ten singletowy tlen może z kolei prowadzić do powstania innych aktywnych związków tlenu, które powodują peroksydację tłuszczy i uszkodzenie błony, prowadząc do gwałtownej śmierci komórki (Lee et al., Plant Physiol.102: 881 (1993). Nie wszystkie enzymy protoks są wrażliwe na herbicydy, które hamują roślinne enzymy protoks. Zarówno enzymy proteks kodowane przez geny izolowane z Escherichia coli (Sasarman et al., Can. J. Microbiol. 39:1155 (1993), jak i Bacillus subtilis (Dailey et al., J. Biol.

11 Chem. 269: 813 (1994) są oporne na hamowanie przez herbicydy. Ponadto, opisano mutanty jednokomórkowych glonów Chlamydomonas reinhardtii oporne na fenyloimidowy herbicyd S (Kataoka et al., J. Pesticide Sci. 15: 449 (1990); Shibata et al., W Research in Photosynthesis, Vol.III; N. Murata, ed. Kluwer: Netherlands. str (1992)). Co najmniej jeden z takich mutantów okazał się mieć zmienioną aktywność protoks, która jest oporna nie tylko na herbicyd, na który mutant był wyselekcjonowany, ale również na inne klasy inhibitorów protoks (Oshio et al., Z. Naturforsch. 48c: 339 (1993); Sato et al., W ACS Symposium on Porphyric Pesticides, S. Duke, ed. ACS Press: Washington, D.C. (1994)). Opisano również linię komórkową mutanta tytoniu, która jest oporna na inhibitor S21432 (Che et al., Z. Naturforsch. 48c: 350 (1993). Według wynalazku izolowana cząsteczka DNA koduje białko z organizmu eukariota mające aktywność oksydazy protoporfirynogenu (protoks) i cząsteczka ta zawiera sekwencję nukleotydową selektywnie hybrydyzującą z sekwencją nukleotydową wybraną z grupy obejmującej SEK NR ID 1 i 3. Korzystnie według wynalazku eukariotą jest gatunek Arabidopsis, kodowane białko obejmuje sekwencję aminokwasową wybraną z grupy składającej się z SEK NR ID 2 i 4, a cząsteczka DNA zawiera sekwencję nukleotydową wybraną z grupy obejmującej SEK NR ID 1 i 3. Według wynalazku cząsteczka DNA koduje zmodyfikowaną oksydazę protoporfirynogenu (protoks), która to oksydaza zawiera protoks eukariotyczny z co najmniej jedną modyfikacją aminokwasową i w której ten zmodyfikowany protoks wykazuje tolerancję na herbicyd w ilości, która hamuje protoks eukariotyczny zawierający sekwencję aminokwasową określoną w SEK NR ED 2, przy czym ta co najmniej jedna modyfikacja aminokwasowa jest podstawieniem aminokwasu, wybranego z grupy zawierającej alaninę w pozycji 220, glicynę w pozycji 221 oraz tyrozynę w pozycji 426 w SEK NR ID 2. Korzystnie według wynalazku alanina w pozycji 220 jest zastąpiona przez aminokwas wybrany z grupy zawierającej walinę, treoninę, leucynę, cysteinę i tyrozynę, glicyna w pozycji 221 jest zastąpiona przez serynę, a tyrozyna w pozycji 426 jest zastąpiona przez aminokwas wybrany z grupy zawierającej cysteinę, izoleucynę, leucynę i treoninę. Zgodnie z wynalazkiem chimerowy gen zawiera promotor zdolny do funkcjonowania w roślinie lub komórce roślinnej, który jest dołączony w sposób funkcjonalny do i) cząsteczki heterologicznego DNA kodującej białko z wyższego eukariota, mające aktywność oksydazy protoporfirynogenu (protoks), która to cząsteczka DNA zawiera sekwencję nukleotydową selektywnie hybrydyzującą z sekwencją nukleotydową wybraną z grupy obejmującej SEK NR ID 1 i 3 lub ii) cząsteczki DNA kodującej zmodyfikowaną oksydazę protoporfirynogenu (protoks), która to oksydaza zawiera protoks eukariotyczny z co najmniej jedną modyfikacją aminokwasową i w której ten zmodyfikowany protoks wykazuje tolerancję na herbicyd w ilości, która hamuje protoks eukariotyczny zawierający sekwencję aminokwasową określoną jako SEK NR ID 2, przy czym ta co najmniej jedna modyfikacja aminokwasową jest podstawieniem aminokwasu wybranego z grupy zawierającej alaninę w pozycji 220, glicynę w pozycji 221 oraz tyrozynę w pozycji 426 w SEK NR ID 2. Korzystnie według wynalazku chimerowy gen zawiera promotor dołączony w sposób funkcjonalny do cząsteczki heterologicznego DNA kodującej białko z wyższego eukariota o aktywności oksydazy protoporfirynogenu (protoks), która to cząsteczka DNA zawiera sekwencję nukleotydową selektywnie hybrydyzującą z sekwencją nukleotydową wybraną z grupy obejmującej SEK NR ID 1 i 3, przy czym korzystnie eukariotą jest gatunek Arabidopsis. Równie korzystnie według wynalazku chimerowy gen zawiera promotor dołączony w sposób funkcjonalny do cząsteczki DNA kodującej zmodyfikowaną oksydazę protoporfirynogenu (protoks), która to oksydaza zawiera protoks eukariotyczny z co najmniej jedną modyfikacją aminokwasową i w której ten zmodyfikowany protoks wykazuje tolerancję na herbicyd w ilości, która hamuje protoks eukariotyczny zawierający sekwencję aminokwasową określoną jako SEK NR ID 2, przy czym ta co najmniej jedna modyfikacja aminokwasowa jest podstawieniem aminokwasu wybranego z grupy zawierającej alaninę w pozycji 220,

12 glicynę w pozycji 221 oraz tyrozynę w pozycji 426 w SEK NR ED 2 z tym, że korzystnie alanina w pozycji 220 jest zastąpiona przez aminokwas wybrany z grupy zawierającej walinę, treoninę, leucynę, cysteinę i tyrozynę, glicyna w pozycji 221 jest korzystnie zastąpiona przez serynę, a tyrozyna w pozycji 426 jest korzystnie zastąpiona przez aminokwas wybrany z grupy zawierającej cysteinę, izoleucynę, leucynę i treoninę. Korzystnie chimerowy gen według wynalazku zawiera promotor, który jest aktywny w roślinie i korzystnie gen ten dodatkowo zawiera sekwencję sygnałową połączoną w sposób funkcjonalny z cząsteczką DNA, zdolną do kierowania białka kodowanego przez cząsteczkę DNA do chloroplastu, albo zdolną do kierowania białka kodowanego przez cząsteczkę DNA do mitochondrium. Korzystnie chimerowy gen według wynalazku jest częścią genomu roślinnego. Zrekombinowany wektor według wynalazku charakteryzuje się tym, że zawiera chimerowy gen z promotorem zdolnym do funkcjonowania w roślinie lub komórce roślinnej, dołączonym w sposób funkcjonalny do i) cząsteczki heterologicznego DNA kodującej białko z wyższego eukariota o aktywności oksydazy protoporfirynogenu (protoks), która to cząsteczka DNA zawiera sekwencję nukleotydową selektywnie hybrydyzującą z sekwencją nukleotydową wybraną z grupy obejmującej SEK NR ID 1 i 3 lub ii) cząsteczki DNA kodującej zmodyfikowaną oksydazę protoporfirynogenu (protoks), która to oksydaza zawiera protoks eukariotyczny z co najmniej jedną modyfikacją aminokwasową i w której ten zmodyfikowany protoks wykazuje tolerancję na herbicyd w ilości, która hamuje protoks eukariotyczny zawierający sekwencję aminokwasową określoną jako SEK NR ID 2, przy czym ta co najmniej jedna modyfikacja aminokwasowa jest podstawieniem aminokwasu wybranego z grupy zawierającej alaninę w pozycji 220, glicynę w pozycji 221 oraz tyrozynę w pozycji 426 w SEK NR ID 2. Korzystnie zrekombinowany wektor według wynalazku ma promotor dołączony w sposób funkcjonalny do cząsteczki heterologicznego DNA, kodującej białko z wyższego eukariota o aktywności oksydazy protoporfirynogenu (protoks), która to cząsteczka DNA zawiera sekwencję nukleotydową selektywnie hybrydyzującą z sekwencją nukleotydową wybraną z grupy obejmującej SEK NR ID 1 i 3, a eukariotą korzystnie jest gatunek Arabidopsis. Korzystnie zrekombinowany wektor według wynalazku ma promotor dołączony w sposób funkcjonalny do cząsteczki DNA, kodującej zmodyfikowaną oksydazę protoporfirynogenu (protoks), która to oksydaza zawiera protoks eukariotyczny z co najmniej jedną modyfikacją aminokwasową i w której ten zmodyfikowany protoks wykazuje tolerancję na herbicyd w ilości, która hamuje protoks eukariotyczny zawierający sekwencję aminokwasową określoną jako SEK NR ID 2, przy czym ta co najmniej jedna modyfikacja aminokwasową jest podstawieniem aminokwasu wybranego z grupy zawierającej alaninę w pozycji 220, glicynę w pozycji 221 oraz tyrozynę w pozycji 426 w SEK NR ID 2 z tym, że korzystnie alanina w pozycji 220 jest zastąpiona przez aminokwas wybrany z grupy zawierającej walinę, treoninę, leucynę, cysteinę i tyrozynę, glicyna w pozycji 221 jest zastąpiona przez serynę, a tyrozyna w pozycji 426 jest zastąpiona przez aminokwas wybrany z grupy zawierającej cysteinę, izoleucynę, leucynę i treoninę. Zrekombinowany wektor według wynalazku jest korzystnie zdolny do stabilnej transformacji w komórce roślinnej. Komórka gospodarza według wynalazku zawiera chimerowy gen mający promotor zdolny do funkcjonowania w roślinie lub komórce roślinnej, dołączony w sposób funkcjonalny do i) cząsteczki heterologicznego DNA, kodującej białko z wyższego eukariota o aktywności oksydazy protoporfirynogenu (protoks), która to cząsteczka DNA zawiera nukleotydową selektywnie hybrydyzującą z sekwencją nukleotydową wybraną z grupy obejmującej SEK NR ID 1 i 3 lub ii) cząsteczki DNA, kodującej zmodyfikowaną oksydazę protoporfirynogenu (protoks), która to oksydaza zawiera protoks eukariotyczny z co najmniej jedną modyfikacją aminokwasową i w której ten zmodyfikowany protoks wykazuje tolerancję na herbicyd w ilości, która hamuje protoks eukariotyczny zawierający sekwencję aminokwasową określoną jako SEK

13 NR ID 2, przy czym ta co najmniej jedna modyfikacja aminokwasowa jest podstawieniem aminokwasu wybranego z grupy zawierającej alaninę w pozycji 220, glicynę w pozycji 221 oraz tyrozynę w pozycji 426 w SEK NR ID 2, z tym, że komórka gospodarza jest zdolna do ekspresji kodującej cząsteczki DNA. Korzystnie komórka gospodarza ma promotor dołączony w sposób funkcjonalny do cząsteczki heterologicznego DNA, kodującej białko z wyższego eukariota o aktywności oksydazy protoporfirynogenu (protoks), przy czym cząsteczka DNA zawiera sekwencję nukleotydową selektywnie hybrydyzującą z sekwencją nukleotydową wybraną z grupy obejmującej SEK NR ID 1 i 3, zaś eukariotąjest korzystnie gatunek Arabidopsis. Równie korzystnie komórka gospodarza według wynalazku ma promotor dołączony w sposób funkcjonalny do cząsteczki DNA, kodującej zmodyfikowaną oksydazę protoporfirynogenu (protoks), która to oksydaza zawiera protoks eukariotyczny z co najmniej jedną modyfikacją aminokwasową i w której ten zmodyfikowany protoks wykazuje tolerancję na herbicyd w ilości, która hamuje protoks eukariotyczny zawierający sekwencję aminokwasową określoną jako SEK NR ID 2, przy czym ta co najmniej jedna modyfikacja aminokwasowa jest podstawieniem aminokwasu wybranego z grupy zawierającej alaninę w pozycji 220, glicynę w pozycji 221 oraz tyrozynę w pozycji 426 w SEK NR ID 2 z tym, że alanina w pozycji 220 jest korzystnie zastąpiona przez aminokwas wybrany z grupy zawierającej walinę, treoninę, leucynę, cysteinę i tyrozynę, glicyna w pozycji 221 jest korzystnie zastąpiona przez serynę, a tyrozyna w pozycji 426 jest korzystnie zastąpiona przez aminokwas wybrany z grupy zawierającej cysteinę, izoleucynę, leucynę i treoninę. Komórka gospodarza według wynalazku jest korzystnie wybrana z grupy obejmującej komórki roślinne, komórki bakteryjne, komórki drożdży i komórki owada. Według wynalazku komórka roślinna włączając w to jej potomstwo zawiera chimerowy gen mający promotor zdolny do funkcjonowania w roślinie lub komórce roślinnej, dołączony w sposób funkcjonalny do i) cząsteczki heterologicznego DNA, kodującej białko z wyższego eukariota o aktywności oksydazy protoporfirynogenu (protoks), która to cząsteczka DNA zawiera sekwencję nukleotydową selektywnie hybrydyzującą z sekwencją nukleotydową wybraną z grupy obejmującej SEK NR ID 1 i 3 lub ii) cząsteczki DNA, kodującej zmodyfikowaną oksydazę protoporfirynogenu (protoks), która to oksydaza zawiera protoks eukariotyczny z co najmniej jedną modyfikacją aminokwasową i w której ten zmodyfikowany protoks wykazuje tolerancję na herbicyd w ilości, która hamuje protoks eukariotyczny zawierający sekwencję aminokwasową określoną jako SEK NR ID 2, przy czym ta co najmniej jedna modyfikacja aminokwasowa jest podstawieniem aminokwasu wybranego z grupy zawierającej alaninę w pozycji 220, glicynę w pozycji 221 oraz tyrozynę w pozycji 426 w SEK NR ID 2, z tym, że kodująca cząsteczka DNA podlega ekspresji w roślinie i nadaje, odpowiednio roślinie i komórce roślinnej, tolerancję na herbicyd w ilości, która hamuje naturalnie występującą aktywność protoks. Korzystnie komórka roślinna według wynalazku ma promotor dołączony w sposób funkcjonalny do cząsteczki heterologicznego DNA, kodującej białko z wyższego eukariota o aktywności oksydazy protoporfirynogenu (protoks), która to cząsteczka DNA zawiera sekwencję nukleotydową selektywnie hybrydyzującą z sekwencją nukleotydową wybraną z grupy obejmującej SEK NR ID 1 i 3, przy czym korzystnie eukariotą jest gatunek Arabidopsis. Komórka roślinna według wynalazku równie korzystnie ma promotor dołączony w sposób funkcjonalny do cząsteczki DNA, kodującej zmodyfikowaną oksydazę protoporfirynogenu (protoks), która to oksydaza zawiera protoks eukariotyczny z co najmniej jedną modyfikacją aminokwasową i w której ten zmodyfikowany protoks wykazuje tolerancję na herbicyd w ilości, która hamuje protoks eukariotyczny zawierający sekwencję aminokwasową określoną jako SEK NR ID 2, przy czym ta co najmniej jedna modyfikacja aminokwasową jest podstawieniem aminokwasu wybranego z grupy zawierającej alaninę w pozycji 220, glicynę w pozycji 221 oraz tyrozynę w pozycji 426 w SEK NR ID 2 z tym, że alanina w pozycji 220 jest korzystnie zastąpiona przez aminokwas wybrany z grupy zawierającej walinę, treoninę,

14 leucynę, cysteinę i tyrozynę, glicyna w pozycji 221 jest korzystnie zastąpiona przez serynę, a tyrozyna w pozycji 426 jest korzystnie zastąpiona przez aminokwas wybrany z grupy zawierającej cysteinę, izoleucynę, leucynę i treoninę. Sposób kontrolowania wzrostu niepożądanej wegetacji według wynalazku charakteryzuje się tym, że stosuje się skuteczną ilość herbicydu hamującego protoks wobec populacji rośliny zawierającej chimerowy gen mający promotor zdolny do funkcjonowania w roślinie lub komórce roślinnej, dołączony w sposób funkcjonalny do i) cząsteczki heterologicznego DNA, kodującej białko z wyższego eukariota o aktywności oksydazy protoporfirynogenu (protoks), która to cząsteczka DNA zawiera sekwencję nukleotydową selektywnie hybrydyzującą z sekwencją nukleotydową wybraną z grupy obejmującej SEK NR ID 1 i 3 lub ii) cząsteczki DNA, kodującej zmodyfikowaną oksydazę protoporfirynogenu (protoks), która to oksydaza zawiera protoks eukariotyczny z co najmniej jedną modyfikacją aminokwasową i w której ten zmodyfikowany protoks wykazuje tolerancję na herbicyd w ilości, która hamuje protoks eukariotyczny zawierający sekwencję aminokwasową określoną jako SEK NR ED 2, przy czym ta co najmniej jedna modyfikacja aminokwasowa jest podstawieniem aminokwasu wybranego z grupy zawierającej alaninę w pozycji 220, glicynę w pozycji 221 oraz tyrozynę w pozycji 426 w SEK NR ID 2, z tym, że stosuje się cząsteczkę DNA podlegającą ekspresji w roślinie i nadającą, odpowiednio roślinie, tolerancję na herbicyd w ilości, która hamuje naturalnie występującą aktywność protoks, przy czym jako herbicyd hamujący protoks stosuje się herbicyd wybrany z grupy składającej się z arylouracylu, difenyloeteru, oksydiazolu, cyklicznego imidu, fenylopirazolu, pochodnych pirydynowych, podstawionego w pozycji 3 2-arylo-4,5,6,7-tetrahydroindazolu, fenopilanu oraz O-fenylopirolidyno- i piperydynokarbanylowych analogów tego fenopilanu, N-podstawionych pirazoli, N-fenylopirazoli oraz związków o wzorach 18 i 19 i herbicyd ten, hamujący protoks, stosuje się w dawkach od 0,0001 do 10 kg/ha. W sposobie kontrolowania wzrostu niepożądanej wegetacji według wynalazku korzystnie stosuje się promotor dołączony w sposób funkcjonalny do cząsteczki heterologicznego DNA, kodującej białko z wyższego eukariota o aktywności oksydazy protoporfirynogenu (protoks), która to cząsteczka DNA zawiera sekwencję nukleotydową selektywnie hybrydyzującą z sekwencją nukleotydową wybraną z grupy obejmującej SEK NR ID 1 i 3, przy czym korzystnie jako organizm eukariota stosuje się gatunek Arabidopsis. W sposobie kontrolowania wzrostu niepożądanej wegetacji według wynalazku równie korzystnie stosuje się promotor dołączony w sposób fiinkcjonalny do cząsteczki DNA, kodującej zmodyfikowaną oksydazę protoporfirynogenu (protoks), która to oksydaza zawiera eukariotyczny protoks z co najmniej jedną modyfikacją aminokwasową i w której ten zmodyfikowany protoks wykazuje tolerancję na herbicyd w ilości, która hamuje protoks eukariotyczny zawierający sekwencję aminokwasową określoną w SEK NR ID 2, przy czym ta co najmniej jedna modyfikacja aminokwasową jest podstawieniem aminokwasu, wybranego z grupy zawierającej alaninę w pozycji 220, glicynę w pozycji 221 oraz tyrozyny w pozycji 426 w SEK NR ID 2 z tym, że korzystnie alaninę w pozycji 220 zastępuje się przez aminokwas wybrany z grupy zawierającej walinę, treoninę, leucynę, cysteinę i tyrozynę, glicynę w pozycji 221 korzystnie zastępuje się przez serynę, a tyrozynę w pozycji 426 zastępuje się przez aminokwas wybrany z grupy zawierającej cysteinę, izoleucynę, leucynę i treoninę. W sposobie kontrolowania wzrostu niepożądanej wegetacji według wynalazku korzystnie stosuje się roślinę wybraną z grupy składającej się z soi, bawełny, tytoniu, buraka cukrowego, rzepaku, kukurydzy, pszenicy, sorgo, żyta, owsa, trawy darniowej i ryżu, a jako herbicyd hamujący protoks korzystnie stosuje się imid o wzorze 5, w którym Q oznacza wzór 6 lub 7, lub 8, lub 9, lub 9a, lub 9b i gdzie R1oznacza H, Cl lub F, R2 oznacza Cl i R3 jest eterem, tioeterem, estrem, grupą aminową lub alkilową, przy czym R2 I R3 razem mogą tworzyć 5- lub 6- składnikowy pierścień heterocykliczny. W sposobie kontrolowania wzrostu niepożądanej wegetacji według wynalazku równie korzystnie stosuje się imid wybrany z grupy składającej się ze związków o wzorze 10, 11, 12,

15 , 14, 15, 16 i 17, w których R oznacza grupę (C2.6-alkenyloksy)karbonylo-C1-4-alkilową oraz związek o wzorze wybranym z grupy obejmującej wzory 18,19, 20 i 21. Sposób testowania związku chemicznego na zdolność hamowania enzymu protoks z rośliny, według wynalazku, charakteryzuje się tym, że (a) do pierwszej mieszaniny reakcyjnej dodaje się enzym protoks, zawierający sekwencję aminokwasową wybraną z grupy składającej się z SEK NR ID 2 i 4 i protoporfirynogen IX w warunkach, w których enzym protoks ma zdolność do katalizowania przekształcenia protoporfirynogenu IX w protoporfirynę IX, (b) do drugiej mieszaniny reakcyjnej dodaje się testowany związek chemiczny, enzym protoks i protoporfirynogen IX w takich samych warunkach jak w przypadku pierwszej mieszaniny reakcyjnej, (c) wzbudza się pierwszą i drugą mieszaninę przy 395 do 410 nm; (d) porównuje się fluorescencję pierwszej i drugiej mieszaniny reakcyjnej przy zakresie 622 do 635 nm i jeżeli fluorescencja drugiej mieszaniny reakcyjnej jest znacząco mniejsza od fluorescencji pierwszej mieszaniny reakcyjnej określa się, że związek chemiczny jest zdolny do hamowania aktywności enzymu protoks. Sposób selekcji roślin, tkanek roślinnych lub komórek roślinnych stransformowanych transgenem będącym przedmiotem zainteresowania spośród roślin nie stransformowanych według wynalazku charakteryzuje się tym, że (a) transformuje się rośliny, tkanki roślinne lub komórki roślinne transgenem będącym przedmiotem zainteresowania, zdolnym do podlegania ekspresji w roślinach i genem chimerowym, zawierającym promotor zdolny do funkcjonowania w roślinie lub komórce roślinnej i dołączony w sposób funkcjonalny do cząsteczki DNA, kodującej zmodyfikowaną oksydazę protoporfirynogenu (protoks), która to oksydaza zawiera protoks eukariotyczny z co najmniej jedną modyfikacją aminokwasową i w której ten zmodyfikowany protoks wykazuje tolerancję na herbicyd w ilości, która hamuje protoks eukariotyczny zawierający sekwencję aminokwasową określoną w SEK NR ID 2, przy czym ta co najmniej jedna modyfikacja aminokwasową jest podstawieniem aminokwasu wybranego z grupy zawierającej alaninę w pozycji 220, glicynę w pozycji 221 oraz tyrozynę w pozycji 426 w SEK NR ID 2, (b) przenosi się tak stransformowane rośliny lub komórki roślinne do pożywki zawierającej inhibitor protoks, gdzie herbicyd hamujący protoks jest wybrany z grupy składającej się z arylouracylu, difenyloeteru, oksydiazolu, cyklicznego imidu, fenylopirazolu, pochodnych pirydynowych, podstawionego w pozycji 3 2-arylo-4,5,6,7-tetrahydroindazolu, fenopilanu oraz O-fenylopirolidyno- i piperydynokarbanylowych analogów tego fenopilanu, N-podstawionych pirazoli, N-fenylopirazoli, związków o wzorach 18 i 19, przy czym stężenie herbicydu hamującego protoks w pożywce wynosi 0,001 do 3000 części na milion, oraz (c) selekcjonuje się rośliny lub komórki roślinne, które przeżywają w pożywce. Sposób wytwarzania komórki gospodarza zawierającej wyizolowaną cząsteczkę DNA, kodującą białko z eukariota mające aktywność oksydazy protoporfirynogenu (protoks) według wynalazku charakteryzuje się tym, że transformuje się komórkę gospodarza genem chimerowym zawierającym promotor zdolny do funkcjonowania w roślinie, dołączony w sposób funkcjonalny do cząsteczki DNA kodującej zmodyfikowaną oksydazę protoporfirynogenu (protoks), która to oksydaza zawiera protoks eukariotyczny z co najmniej jedną modyfikacją aminokwasową i w której ten zmodyfikowany protoks wykazuje tolerancję na herbicyd w ilości, która hamuje protoks eukariotyczny zawierający sekwencję aminokwasową określoną w SEK NR ID 2, przy czym ta co najmniej jedna modyfikacja aminokwasowa jest podstawieniem aminokwasu wybranego z grupy zawierającej alaninę w pozycji 220, glicynę w pozycji 221 oraz tyrozynę w pozycji 426 w SEK NR ID 2, z tym, że otrzymany wektor jest zdolny do stabilnej transformacji komórki gospodarza. Sposób wytwarzania komórki roślinnej, zawierającej wyizolowaną cząsteczkę DNA kodującą białko z eukariota mające aktywność oksydazy protoporfirynogenu (protoks) według wynalazku charakteryzuje się tym, że transformuje się komórkę roślinną genem chimerowym zawierającym promotor zdolny do funkcjonowania w roślinie, dołączony w sposób funkcjonalny do cząsteczki

16 DNA kodującej zmodyfikowaną oksydazę protoporfirynogenu (protoks), która to oksydaza zawiera protoks eukariotyczny z co najmniej jedną modyfikacją aminokwasową i w której ten zmodyfikowany protoks wykazuje tolerancję na herbicyd w ilości, która hamuje protoks eukariotyczny obejmujący sekwencję aminokwasową określoną w SEK NR ID 2, przy czym ta co najmniej jedna modyfikacja aminokwasowa jest podstawieniem aminokwasu wybranego z grupy zawierającej alaninę w pozycji 220, glicynę w pozycji 221 oraz tyrozynę w pozycji 426 w SEK NR ID 2, z tym, że otrzymany wektor jest zdolny do stabilnej transformacji komórki gospodarza. Sposób wytwarzania potomstwa z rośliny rodzicielskiej, zawierającej wyizolowaną cząsteczkę DNA kodującą białko z eukariota mające aktywność oksydazy protoporfirynogenu (protoks), według wynalazku, charakteryzuje się tym, że transformuje się roślinę rodzicielską genem chimerowym zawierającym promotor zdolny do funkcjonowania w roślinie, dołączony w sposób funkcjonalny do cząsteczki DNA, kodującej zmodyfikowaną oksydazę protoporfirynogenu (protoks), która to oksydaza zawiera protoks eukariotyczny z co najmniej jedną modyfikacją aminokwasową i w której ten zmodyfikowany protoks wykazuje tolerancję na herbicyd w ilości, która hamuje protoks eukariotyczny obejmujący sekwencję aminokwasową określoną w SEK NR ID 2, przy czym ta co najmniej jedna modyfikacja aminokwasowa jest podstawieniem aminokwasu wybranego z grupy zawierającej alaninę w pozycji 220, glicynę w pozycji 221 oraz tyrozynę w pozycji 426 w SEK NR ID 2, z tym, że wprowadzany wektor jest zdolny do stabilnej transformacji komórki gospodarza i przeniesienia cechy tolerowania herbicydu na potomstwo takiej rodzicielskiej rośliny w znanych technikach hodowli roślin. Wynalazek znajduje zastosowanie do wytwarzania sond i sposobów wykrywania obecności i postaci genu protoks i określania poziomu transkryptów genu protoks w organizmie. Sposoby te mogą być użyte do diagnozowania chorób, które są związane ze zmienioną formą enzymu protoks lub zmienionymi poziomami ekspresji enzymu protoks. Izolowana cząsteczka DNA, która koduje eukariotyczną postać oksydazy protoporfirynogenu (określanego jako protoks ), koduje enzym katalizujący utlenienie protoporfirynogenu IX do proroporfiryny IX. Kodujące sekwencje DNA i odpowiadające sekwencje aminokwasowe dla enzymu protoks z Arabidopsis thaliana są przedstawione jako SEK NR ID 1-4 i Kodujące sekwencje DNA i odpowiadające sekwencje aminokwasowe dla enzymów protoks z kukurydzy są przedstawione jako SEK NR ID 5-8. W oparciu o ujawnione niżej dane może zostać wyizolowany dowolny, pożądany eukariotyczny DNA kodujący enzym protoks. Konkretne przykłady sposobu izolowania sekwencji kodującej protoks eukariotyczny są dalej przedstawione w opisie. W tych sposobach klony cdna kodujące protoks są identyfikowane w bibliotece klonów cdna, pochodzących z odpowiedniego organizmu eukariotycznego, w oparciu o ich zdolność do dostarczania enzymatycznej aktywności protoks zmutowanemu organizmowi gospodarza, któremu brak tej aktywności. Organizmami odpowiednimi do zastosowania w tej metodzie są takie organizmy, które mogą być użyte do przeszukiwania ekspresyjnych bibliotek cdna i dla których dostępne są lub mogą być rutynowo wytworzone mutanty defektywne pod względem aktywności protoks. Takie organizmy obejmują między innymi E. coli (Sasarman et al., J. Gen. Microbiol.113: 297 (1979)), Salmonella typhimurium (Xu et al., J. Bacteriol. 174: 3953 (1992)) i Saccharomyces cerevisiae (Camadro et al. Biochem. Biophys. Res. Comm.106: 724 (1982)). Alternatywnie, eukariotyczne sekwencje kodujące protoks mogą być izolowane według dobrze znanych technik opartych ohomologię ich sekwencji do sekwencji kodujących protoks z Arabidopsis thaliana (SEK NR ID: 1,3 i 9) i Zea mays SEK NR ID: 5 i 7), przedstawianych w niniejszym wynalazku. W tych technikach cała znana sekwencja kodująca protoks lub jej część jest stosowana jako sonda, która selektywnie hybrydyzuje do innych sekwencji kodujących protoks, obecnych w populacji sklonowanych genomowych fragmentów DNA lub fragmentów cd -NA (tj. bibliotek genomowych lub cdna) z wybranego organizmu. Takie techniki obejmują przeszukiwanie poprzez hybrydyzację wysianych bibliotek DNA (łysinek bądź kolonii; patrz Sambrook et al., Molecular Cloning, eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989)) i powielanie poprzez PCR przy zastosowaniu starterów oligonukleotydowych, odpowiadających sekwencji domen konserwowanych w obrębie znanych sekwencji aminokwasowych protoks (patrz

17 np. Innis et al., PCR tocols a Guide to Methods and Applications eds., Academic Press (1990)). Metody te są szczególnie odpowiednie do izolowania sekwencji kodujących protoks z organizmów pokrewnych z tymi, z których pochodziła sekwencja sondy. Przykładowo, można się spodziewać, że zastosowanie tych metod przy użyciu jako sond sekwencji kodujących z Arabidopsis będzie szczególnie odpowiednie do izolowania sekwencji kodującej protoks z innych gatunków roślin. Izolowane eukariotyczne sekwencje protoks, przedstawione w niniejszym wynalazku mogą być poddawane manipulacjom według standardowych technik inżynierii genetycznej, odpowiednio do potrzeb. Przykładowo, cała sekwencja protoks lub jej część może być użyta jako sonda mająca zdolność do specyficznej hybrydyzacji z sekwencjami kodującymi protoks i informacyjnymi RNA. Aby uzyskać specyficzną hybrydyzację w różnych warunkach, takie sondy obejmują sekwencje, które są unikalne wśród sekwencji kodujących protoks i mają długość co najmniej 10 nukleotydów, a korzystniej długość 20 nukleotydów. Takie sondy mogą być użyte do powielania i analizowania sekwencji kodującej protoks z wybranych organizmów przy zastosowaniu dobrze znanego procesu - reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR). Technika ta może być użyteczna do powielania i analizy sekwencji kodujących protoks z żądanych organizmów lub jako test diagnostyczny do stwierdzania obecności sekwencji kodującej protoks w organizmie i do skorelowania zmienionych sekwencji kodujących z niepomyślnymi przypadkami, takimi jak autosomalna dominująca choroba u ludzi, charakteryzująca się zarówno objawami neuropsychiatrycznymi, jak i skórnymi, w której zmniejszony jest poziom aktywności protoks (Brenner and Bloomer, New Engl. J. Med 302: 765 (1980)). Sondy do hybrydyzacji specyficzne dla protoks mogą być również użyte do ustalania lokalizacji natywnego eukariotycznego genu(genów) protoks w genomie wybranego organizmu przy zastosowaniu standardowych technik opartych o selektywną hybrydyzację sondy z genomowymi sekwencjami protoks. Techniki te obejmują między innymi identyfikację polimorfizmów DNA, zidentyfikowanych lub zawartych w obrębie sekwencji sondy protoks i zastosowanie takich polimorfizmów do śledzenia segregacji genu protoks w stosunku do innych markerów o znanej pozycji mapowej w pochodzącej z samozapłodnienia hybrydy dwóch polimorficznych linii rodzicielskich (patrz Helentjaris et al., Plant Mol. Biol. 5:109 (1985). Sommer et al. Biotechniąues 1282 (1992); D'Ovidio et al., Plant Mol. Biol. 15: 169 (1990)). Jakkolwiek dowolna eukariotyczna sekwencja protoks może być brana pod uwagę jako użyteczna do zastosowania jako sonda do mapowania genów protoks z dowolnego organizmu eukariotycznego, korzystnymi sondami są sekwencje protoks z organizmów bliżej spokrewnionych z wybranym organizmem, a najkorzystniejszymi sondami są sekwencje protoks z wybranego organizmu. Mapowanie genów protoks w taki sposób uważa się za szczególnie użyteczne w przypadku roślin ze względów hodowlanych. Przykładowo, znając pozycję na mapie genetycznej zmutowanego genu protoks, warunkującego oporność na herbicyd, można zidentyfikować otaczające markery DNA ze znanej mapy genetycznej (patrz np. Helentjaris, Trends Genet. 3: 217 (1987)). Podczas wprowadzania cechy oporności na herbicyd do nowej linii hodowlanej, markery te mogą być stosowane do śledzenia zasięgu otaczającego chromosomalnego DNA sprzężonego z protoks, nadal obecnego we wstecznym pokoleniu rodzicielskim po każdej rundzie krzyżowania wstecznego. Sondy specyficznie hybrydyzujące z protoks mogą być również używane do oznaczania poziomu mrna dla protoks w organizmie przy zastosowaniu standardowych technik, takich jak analiza Northern. Taka technika może być stosowana jako test diagnostyczny do wykrywania zmienionych poziomów ekspresji, co może być związane z niektórymi przypadkami chorób, takimi jak autosomalna dominująca choroba u ludzi, charakteryzująca się zarówno objawami neuropsychiatrycznymi, jak i skórnymi, w której zmniejszony jest poziom aktywności protoks (Brenner and Bloomer, New Engl. J. Med. 302: 765 (1980)). Celem wytworzenia zrekombinowanego enzymu w organizmie gospodarza, sekwencja kodująca protoks może być wstawiona do kasety ekspresyjnej, zaprojektowanej dla wybranego gospodarza i wprowadzonej do gospodarza, w którym protoks ma być wytworzony na drodze rekombinacji. Wybór specyficznych sekwencji regulacyjnych, takich jak promotor, sekwencja sygnałowa, sekwencje 5' i 3' nie podlegające translacji oraz sekwencje wzmacniające (ang. enhancer) pozostają w zakresie umiejętności biegłych w tej dziedzinie. Uzyskana

18 w rezultacie cząsteczka, zawierająca poszczególne elementy połączone w odpowiedniej ramce odczytu, może być włączona do wektora, którym można transformować komórki gospodarza. Odpowiednie wektory ekspresyjne i metody wytwarzania białek technikami rekombinowama DNA są dobrze znane dla organizmów gospodarzy, takich jak E. coli (patrz, np. Studier and Moffatt, J. Mol. Biol. 189:113 (1986); Brosius, DNA 8: 759 (1989)), drożdże (patrz np. Schneider and Guarente, Meth. Enzymol.194: 373 (1991)) i komórki owada (patrz np. Luckow and Summers, Biol. Technol. 6: 47 (1988)). Konkretne przykłady obejmują plazmidy, takie jak pbluescript (Stratagene, La Jolla, CA), pflag (International Biotechnologies, Inc., New Haven, CT), ptrchis (lnvitrogen, La Jolla, CA) oraz bakulowirusowe wektory ekspresyjne, np. takie, które pochodzą z genomu wirusa Auto-graphica califomica nuclear polyhedrosis virus (AcMNPV). Korzystnym systemem bakulowirus/owad są komórki pvi11392/sf21 (lnvitrogen, La Jolla, CA). Eukariotyczny enzym protoks, wytworzony poprzez rekombinowanie DNA ma wiele zastosowań. Przykładowo, może być on użyty do dostarczania enzymatycznej aktywności protoks in vitro. Może być również stosowany w teście in vitro do przeszukiwania związków chemicznych będących herbicydami, których cel nie został zidentyfikowany, dla określenia czy hamują one protoks. Taki test in vitro może być również stosowany jako bardziej ogólna metoda poszukiwań celem zidentyfikowania związków chemicznych, które hamują aktywność protoks i które są zatem kandydatami na herbicydy. Alternatywnie, enzym protoks wytwarzany poprzez rekombinowanie DNA może być użyty do dalszej charakteryzacji jego powiązania ze znanymi inhibitorami celem racjonalnego projektowania nowych inhibitorówherbicydów, jak również form enzymu tolerujących herbicyd. Typowo, hamujący wpływ na protoks jest określany poprzez pomiar fluorescencji przy około 395 do 410 nm (patrz np. Jacobs and Jacobs, Enyzme 28: 206 (1982); Sherman et al., Plant Physiol. 97: 280 (1991)). Test ten jest oparty na fakcie, że protoporfiryna IX jest pigmentem fluorescencyjnym, a protoporfirynogen jest niefluorescencyjny. Ekstrakty białkowe są przygotowywane z wybranych frakcji komórkowych np. etioplastów, mitochondriów, mikrosomów lub błony plazmatycznej poprzez różnicowe wirowanie (patrz np. Lee et al., Plant Physiol. 102:881 (1993); Prado et al, Plant Physiol. 65: 956 (1979); Jackson and Moore, w Plant Organelles. Reid, ed., str. 1-12; Jacobs and Jacobs, Plant Physiol. 101:1181 (1993)). toporfirynogen jest przygotowywany poprzez redukcję protoporfiryny amalgamatem sodu, jak opisano w Jacobs and Jacobs (1982). Mieszanina reakcyjna typowo zawiera 100 mm Hepes (ph 7.5), 5 mm EDTA, 2 mm DTT, około 2 M protoporfirynogen IX i około 1 mg/ml ekstraktu białkowego. Roztwory inhibitora w różnych stężeniach np.: 1 mm, 100 mm, 10 mm, 1 mm, 100 nm, 10 nm, 1 nm, 100 pm dodaje się do ekstraktu enzymatycznego przed rozpoczęciem reakcji enzymatycznej. Po dodaniu ekstraktu białkowego przez kilka minut śledzi się fluorescencję i oblicza się nachylenie krzywej (szybkość reakcji) z regionu liniowego. Określa się IC50 poprzez porównanie krzywej w reakcji hamowanej z reakcją kontrolną. Inne wykonanie niniejszego wynalazku obejmuje użycie enzymu protoks w teście do identyfikacji mutantów protoks opornych na inhibitor. Typowy test przedstawia się następująco: (a) inkubowanie pierwszej próbki protoks i jego substratu, protoporfirynogenu IX, w obecności drugiej próbki zawierającej inhibitor protoks; (b) pomiar aktywności enzymatycznej protoks z etapu (a); (c) inkubowanie pierwszej próbki zmutowanego protoks i jego substratu w obecności drugiej próbki zawierającej ten sam inhibitor protoks; (d) pomiar aktywności enzymatycznej zmutowanego protoks z etapu (c); oraz (e) porównanie enzymatycznej aktywności zmutowanego protoks z aktywnością niezmutowanego protoks. Mieszanina reakcyjna i warunki reakcji są takie same, jak w teście dla identyfikacji inhibitorów protoks (test inhibitora), z następującymi modyfikacjami. Po pierwsze, zmutowany protoks, otrzymany jak opisano powyżej, jest zastąpiony w jednej z mieszanin reakcyjnych przez protoks typu dzikiego w teście inhibitora. Po drugie, inhibitor protoks typu dzikiego jest obecny w obu mieszaninach reakcyjnych. Po trzecie, aktywność zmutowana (aktywność enzymatyczna w obecności inhibitora i zmutowanego protoks) i aktywność niezmutowana

19 (aktywność enzymatyczna w obecności inhibitora i protoks typu dzikiego) są porównywane dla określenia, czy obserwuje się znaczące zwiększenie aktywności przy porównaniu aktywności zmutowanej i niezmutowanej. Aktywnością zmutowaną jest każdy pomiar aktywności enzymatycznej zmutowanego enzymu w obecności odpowiedniego substratu i inhibitora. Aktywnością niezmutowaną jest każdy pomiar aktywności enzymatycznej enzymu protoks typu dzikiego w obecności odpowiedniego substratu i inhibitora. Znaczący wzrost jest zdefiniowany jako zwiększenie aktywności enzymatycznej, która jest większa niż margines błędu właściwy dla techniki pomiarowej, korzystnie około dwukrotny wzrost aktywności enzymu typu dzikiego w obecności inhibitora, korzystniej wzrost około 5-krotny, jeszcze korzystniej wzrost większy niż dziesięciokrotny. Herbicydy, które hamują protoks obejmują wiele różnych strukturalnych klas cząsteczek (Duke et al., Weed Sci. 39: 465 (1991); Nandihalli et al., Pesticide Biochem. Physiol. 43:193 (1992); Matringe et al., FEBS Lett. 245: 35 (1989); Yanase and Andoh, Pesticide Biochem. Physiol. 35: 70 (1989)). Herbicydy te obejmują difenyloetery {np. acyfluorofen, kwas 5-[2- -chloro-4-(trifluorometylo)fenoksy]-2-nitrobenzoesowy; jego ester metylowy; lub oksyfluorfen, 2-chloro-l-(3-etoksy-4-nitrofenoksy)-4-(trifluorobenzen)}, oksydiazole, (np. oksydiazon, 3-[2,4-dichloro-5-(1 -metyloetoksy)fenylo]-5 -(1,1 -dimetyloetylo)-1,3,4-oksadiazol-2-(3h)- on, cykliczne imidy (np. S-23142, N-(4-chloro-2-fluoro-5-propargiloksyfenylo)-3,4,5,6- -tetrahydroftalimid; chloroftalim, N-(4-chlorofenylo)-3,4,5,6-tetrahydroftalimid), fenylopirazole (np. TNPP-etyl, 2-[1-(2,3,4-trichlorofenylo)-4-nitropirazolilo-5-oksy]propionian etylu; M&B 39279), pochodne pirydyny (np. LS ) oraz fenopilan and jego analogi O-fenylopirrolidynowe i piperydynokarbaminowe. Difenyloeterami o szczególnym znaczeniu są te o wzorze ogólnym 1, w którym R odpowiada -COONa (wzór 2), -C0NHS02CH3(wzór 3) lub -COOCH2COOC2H5 (wzór 4; patrz Maigrot et al., Brighton Crop tection Conference-Weeds:47-51 (1989)). Kolejnymi difenyloeterami będącymi przedmiotem zainteresowania są takie, w których R oznacza związek o wzorze 4a. (Wzór 4a; patrz Hayashi et al., Brighton Crop tection Conference-Weeds: (1989)). Kolejny difenyloeter będący przedmiotem zainteresowania ma wzór 4b. (Wzór 4b; bifenoks, patrz Dest et al., c. Northeast Weed Sci. Conf. 27:31 (1973)). Znaczenie ma również klasa herbicydów, znana jako imidy, o wzorze ogólnym 5, gdzie Q oznacza wzór 6, 7, 8, 9 lub 9a lub 9b (patrz Hemper et al. (1995) w ceedings of the Eighth International Congress of Pesticide Chemistry, Ragdale et al., ed Amer. Chem. Soc, Washington, D.C., str (1994)), a R1oznacza H, Cl lub F, R2 oznacza Cl i R3 jest optymalnie podstawionym eterem tioeterem, estrem, grupą aminową lub alkilową. Alternatywnie, R2 i R3 razem mogą tworzyć 5- lub 6-składnikowy pierścień heterocykliczny. Przykładami herbicydów imidowych, będących przedmiotem szczególnego zainteresowania są imidy o wzorze 10, wzorze 11, wzorze 12 (patrz Miura et al., Brighton Crop tection Conference- Weeds: (1993)), wzorze 13, wzorze 14, wzorze 15 i wzorze 16. Działanie powyższych związków jako herbicydów jest opisane w ceedings of the 1991 Brighton Crop tection Conference, Weeds (British Crop tection Council) (wzór 10 i 16), ceedings of the 1993 Brighton Crop tection Conference, Weeds (British Crop tection Council) (wzór 12 i 13), Patent USA Nr 4,746,352 (wzór 11) oraz Abstracts of the Weed Science Society of America vol. 33, str. 9 (1993) (wzór 14). Najbardziej korzystnymi herbicydami imidowymi są te zaklasyfikowane jako aryluracyle o wzorze ogólnym 17, gdzie R oznacza grupę C2_6-alkenyloksy)karbonyIo-C1-4-alkilową, jak opisano w patencie USA Nr 5,183,492, włączonym tutaj jako odnośnik. Znaczenie mają również herbicydy o wzorze ogólnym 18 (tiadiazimina; patrz Weiler et al., Brighton Crop tection Conference-Weeds, str (1993)); o wzorze 19 (kar fentrazon, patrz Van Saun et al., Brighton Crop tection Conference-Weeds: pp (1993)); N-podstawione pirazole o wzorze ogólnym 20 (patrz międzynarodowe publikacje patentowe WO 94/08999, WO 93/10100 oraz Patent USA Nr 5,405,829 uzyskany przez Schering); N-fenylopirazole, takie jak ten o wzorze 21 (nipiraklofen; patrz strona 621 w The Pesticide Manual, 9th ed., wyd. przez C.R. Worthing, British Crop tection Council, Surrey

20 (1991)) oraz podstawione w pozycji 3 2-arylo-4,5,6,7-tetrahydroindazole (Lyga et al. Pesticide Sci (1994)). Poziomy herbicydu, które normalnie hamują aktywność protoks, uwzględniają normy stosowania znane w tej dziedzinie, i zależą częściowo od czynników zewnętrznych, takich jak środowisko, czas i metoda stosowania. Przykładowo, w przypadku herbicydów imidowych, opisanych wzorami od 10 do 17, dawki mieszczą się w zakresie od 0,0001 do 10 kg/ha, korzystnie od 0,005 do 2 kg/ha. To dawkowanie lub stężenie herbicydu może różnić się, zależnie od pożądanego działania i konkretnego zastosowanego związku i może być ustalone znanymi w tej dziedzinie metodami. Niniejszy wynalazek dotyczy ponadto roślin, tkanek roślinnych i nasion roślin tolerujących herbicydy, które hamują naturalnie występującą aktywność protoks w tych roślinach, gdzie tolerancja jest związana ze zmienioną aktywnością enzymu protoks. Reprezentatywne rośliny obejmują dowolne rośliny, dla których te herbicydy stosuje się zgodnie z ich normalnym przeznaczeniem. Korzystne są ważne uprawy rolne np. roślin nagonasiennych i okrytonasiennych, takich jak bawełna, soja, buraki cukrowe, kukurydza, ryż, pszenica, jęczmień owies, żyto, sorgo, proso, trawy darniowe i paszowe i temu podobne. Zmieniona aktywność enzymu protoks oznacza aktywność enzymatyczną protoks różniącą się od tej, która naturalnie występuje w roślinach (tj. aktywność protoks, która jest naturalnie obecna przy braku bezpośredniego lub pośredniego manipulowania taką aktywnością przez człowieka), wykazująca oporność na herbicydy, które hamują naturalnie występującą aktywność. Zmieniona aktywność enzymu protoks może być uzyskana w roślinie według wynalazku poprzez zwiększenie ekspresji protoks typu dzikiego, wrażliwego na herbicyd, ekspresji zmienionego, tolerującego herbicyd eukariotycznego enzymu protoks w roślinie, ekspresji niezmodyfikowanej lub zmodyfikowanej bakteryjnej postaci enzymu protoks, który jest oporny na herbicyd w roślinie lub poprzez kombinację tych technik. Uzyskanie zmienionej aktywności enzymu protoks poprzez zwiększoną ekspresję jest rezultatem osiągnięcia poziomu protoks w komórkach roślinnych co najmniej wystarczającego dla przezwyciężenia hamowania wzrostu powodowanego przez herbicyd. Poziom ekspresji protoks jest co najmniej dwukrotnie, korzystniej pięciokrotnie, a jeszcze korzystniej co najmniej dziesięciokrotnie wyższy od poziomu natywnej ekspresji. Zwiększona ekspresja może być wynikiem wielu kopii dzikiego genu protoks, wielokrotnego występowania sekwencji kodującej protoks w obrębie genu protoks (tj. amplifikacji genu lub mutacji w niekodującej sekwencji regulacyjnej endogennego genu protoks w komórce roślinnej. Rośliny zawierające taką zmienioną aktywność enzymu protoks mogą być otrzymane poprzez bezpośrednią selekcję w roślinach. Metoda ta jest znana w tej dziedzinie. Patrz Somers et al., w patencie USA Nr 5,162,602, i Anderson et al., w patencie USA Nr 4,761,373 iodnośmki tam cytowane. Takie rośliny mogą być również uzyskane poprzez techniki inżynierii genetycznej znane w tej dziedzinie. Zwiększona ekspresja protoks wrażliwego na herbicyd może być również uzyskana poprzez stabilną transformację komórki roślinnej zrekombinowaną lub chimerową cząsteczką DNA, zawierającą promotor zdolny do kierowania ekspresją związanego z nim genu struktury w komórce roślinnej DNA, połączony z homologicznym lub heterologicznym genem struktury kodującym protoks. Homologiczny oznacza, że gen protoks jest izolowany z organizmu, taksonomicznie identycznego z docelową komórką roślinną. Heterologiczny oznacza, że gen protoks jest otrzymany z organizmu taksonomicznie odrębnego od docelowej komórki roślinnej. Homologiczne geny protoks można otrzymać poprzez komplementację bakteryjnych lub drożdżowych mutantów auksotroficznych ekspresyjną biblioteką cdna z docelowej rośliny. Patrz np. przykład 1 i Snustad et al, Genetics 120: (1988) (syntaza glutaminy z kukurydzy); Delauney et al., Mol. Genet. 221: (1990) (reduktaza pirolino-5- -karboksylanu z soi); Frisch et al., Mol. Gen. Genet. 228: (1991) (syntaza dihydrodipikolinianu z kukurydzy); Eller et al., Plant Mol. Biol (1992) (chloroplastowa dehydrogenaza 3-izopropylojabłczanu z rzepaku); c. Natl. Acad Sci, USA 88: (1991); Minet et al., Plant J. 2: (1992) (dehydrogenaza dihydroorotanowa) i odnośniki tam cytowane. Inne znane metody obejmują przeszukiwanie bibliotek genomowych lub cdna

21 wyższych roślin, na przykład pod kątem sekwencji, które hybrydyzują ze specyficznymi kwasami nukleinowymi-sondami lub poprzez przeszukiwanie bibliotek ekspresyjnych pod kątem wytwarzania enzymu protoks, który reaguje krzyżowo ze specyficznymi przeciwciałami. Korzystna metoda obejmuje komplementację auksotroficznych mutantów E. coli hemg przy użyciu biblioteki cdna z kukurydzy lub Arabidopsis thaliana. Przykłady promotorów zdolnych do funkcjonowania w roślinach lub komórkach roślinnych, tj. takich, które mają zdolność do kierowania ekspresją w komórkach roślinnych połączonych z nimi genów struktury, takich jak protoks, obejmują promotory 19S i 35S wirusa mozaiki kalafiora (CaMV) i podwójne promotory CaMV; promotory syntazy nopaliny; promotory białka związanego z patogenezą (PR); promotory małej pod-jednostki karboksylazy rybulozobifosforanu (ssurubisco) i temu podobne. Korzystne są: promotor aktyny z ryżu (McElroy et al., Mol. Gen. Genet. 231:150 (1991)), promotor ubikwityny z kukurydzy (EP ; Taylor et al., Plant Celi Rep. 12: 491 (1993)) oraz promotor Pr-1 z tytoniu, Arabidopsis lub kukurydzy (patrz Międzynarodowe Zgłoszenie Patentowe Nr PCT/IB9S/00002 dla Ryals et al., dołączone tu w całości jako odnośnik). Korzystny jest również promotor 35S i wzmacniacz lub podwójny promotor 35S, taki jak opisany w Kay et al., Science 236: (1987) i podwójny promotor 35S sklonowany wpcgn2ii3, zdeponowany jako ATCC 40587, które są ujawnione w EP-A , a których odpowiedni opis jest tu w całości włączony jako odnośnik. Same promotory mogą być modyfikowane celem manipulowania siłą promotora dla zwiększenia ekspresji protoks, zgodnie ze sposobami znanymi w tej dziedzinie. W chimerowych konstruktach DNA według wynalazku, do sekwencji kodującej protoks mogą być dołączone sygnałowe lub kierujące peptydy, celem kierowania transportem powstającego w wyniku ekspresji enzymu protoks do pożądanego miejsca działania. Przykłady sygnałowych peptydów obejmują takie, które są natywnie połączone z roślinnymi białkami związanymi z patogenezą, np. PR-1, PR-2 i temu podobne. Patrz Payne et al., Plant Mol. Biol. 11:89-94 (1988). Przykłady peptydów tranzytowych obejmują chloroplastowe peptydy tranzytowe, takie jak opisane w Von Heijne et al., Plant Mol. Biol. Rep. 9: (1991); Mazur et al., Plant Physiol. 85:1110 (1987); Vorst et al., Gene 65: 59 (1988) i mitochondrialne peptydy tranzytowe, takie jak opisane w Boutry et al., Nature (1987). Chloroplastowe i mitochondrialne peptydy tranzytowe są uważane w niniejszym wynalazku za szczególnie użyteczne, ponieważ aktywność enzymatyczna protoks występuje typowo w mitochondriach i chloroplastach. Bardziej korzystne jest użycie chloroplastowych peptydów tranzytowych ponieważ uważa się że hamowanie aktywności enzymatycznej protoks w chloroplastach leży u podłoża działania herbicydów hamujących protoks (Witkowski and Halling, Plant Physiol. 87: 632 (1988); Lehnen et al., Pestic. Biochem. Physiol (1990); Duke et al., Weed Sei. 39: 465 (1991)). Uwzględnione są również sekwencje, które powodują lokalizację kodowanego białka w różnych przedziałach komórkowych, takich jak wakuole. Patrz na przykład Neuhaus et al., c. Natl. Acad. Sei. USA 88: (1991) oraz Chrispeels, Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 42: (1991). Odpowiednie publikacje są tu załączone w całości jako odnośniki. Chimerowy konstrukt(y) DNA według wynalazku mogą zawierać wiele kopii promotora lub wiele kopii genów struktury protoks. Dodatkowo, konstrukt(y) mogą obejmować sekwencje kodujące dla markerów i sekwencje kodujące dla innych peptydów, takich jak peptydy sygnałowe lub tranzytowe, każdy w odpowiedniej ramce odczytu w stosunku do innych funkcjonalnych elementów w cząsteczce DNA. Przygotowanie takich konstruktów mieści się w zwykłym zakresie umiejętności w tej dziedzinie. Użyteczne markery obejmują peptydy dające oporność na herbicyd, antybiotyk lub lek, jak na przykład oporność na hydromycynę, kanamycynę, G418, gentamycynę, linkomycynę, metotreksat, glifosat, fosfimtrycynę i temu podobne. Markery te mogą być stosowane do wyselekcjonowania komórek stransformowanych chimerowymi konstruktami DNA według wynalazku spośród komórek niestransformowanych. Innymi użytecznymi markerami są enzymy peptydowe, które mogą być łatwo wykrywane poprzez widoczną reakcję, na przykład reakcję barwną przykładowo lucyferaza, b-glukuronidaza lub b-galaktozydaza.

22 Zmienioną aktywność protoks można równ ież uzyskać poprzez wytworzenie lub identyfikację zmienionej postaci wyizolowanej eukariotycznej sekwencji kodującej protoks, mającej co najmniej jedno podstawienie aminokwasowe, wstawienie lub delecję, która koduje zmieniony enzym protoks oporny na herbicyd, który hamuje nie zmienioną naturalnie występującą postać (tj. postać, która naturalnie występuje w organizmie eukariotycznym nie poddanym manipulowaniu, bądź bezpośrednio na drodze rekombinowania DNA lub pośrednio poprzez selektywną hodowlę itd., przez człowieka). Geny kodujące takie enzymy można otrzymać stosując wiele strategii znanych w tej dziedzinie. Pierwsza ogólna strategia obejmuje pośrednie lub bezpośrednie sposoby mutagenezy w mikroorganizmach. Przykładowo, podatny na manipulacje genetyczne mikroorganizm, np. E. coli lub S. cerevisiae, może być poddany losowej mutagenezie in vivo, przy użyciu np. światła UV lub metanosulfonianu etylu lub metylu. Sposoby mutagenezy są opisane na przykład w Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1972); Davis et al., Advanced Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1980); Sherman et al., Methods m Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1983); i Patent USA Nr 4,975,374 (Goodman et al.). Mikroorganizm selekcjonowany pod kątem mutagenezy zawiera normalnie wrażliwy na herbicyd eukariotyczny gen protoks i jest zależny od aktywności protoks warunkowanej przez ten gen. Poddane mutagenezie komórki hoduje się w obecności herbicydu w stężeniach, które hamują niezmodyfikowany enzym protoks. Kolonie poddanego mutagenezie mikroorganizmu, które rosną w obecności inhibitora lepiej, niż mikroorganizm nie poddany mutagenezie, są wybrane do dalszej analizy. Geny protoks z tych kolonii są izolowane, bądź poprzez klonowanie, bądź poprzez powielanie w reakcji łańcuchowej polimerazy i ustala się ich sekwencje. Sekwencje kodujące zmieniony enzym protoks są następnie klonowane ponownie w mikroorganizmie celem potwierdzenia ich zdolności do nadawania oporności na inhibitor. Druga metoda otrzymywania zmutowanych alleli eukariotycznego enzymu protoks opornych na herbicyd obejmuje bezpośrednią selekcję w roślinach. Przykładowo, wpływ inhibitora protoks, takiego jak te opisane powyżej na hamowanie wzrostu roślin, takich jak Arabidopsis, soja, lub kukurydza można określić poprzez wysiew nasion sterylizowanych metodami znanymi w tej dziedzinie ma płytki z prostą pożywką minimalną z soli mineralnych, zawierającą wzrastające stężenie inhibitora. Takie stężenia zawierają się w zakresie 0,001, 0,003, 0,01, 0,03, 0,1, 0,3, 1, 3, 10, 30, 110, 300, 1000 i 3000 części na milion (ppm). Najniższa dawka, przy której można powtarzalnie wykrywać znaczące zahamowanie wzrostu, jest stosowana do kolejnych eksperymentów. Mutageneza materiału roślinnego może być stosowana do zwiększenia częstości, z którą w wybranej populacji pojawiają się oporne allele. Mutagenizowany materiał nasienny może pochodzić z różnych źródeł, włączając w to chemiczną lub fizyczną mutagenezę nasion lub chemiczną lub fizyczną mutagenezę pyłku (Neuffer, In Maize for Biologicai Research. Sheridan, ed. Univ. Press, Grand Forks, ND., str (1982)), który jest następnie używany do zapładniania roślin i gdzie zbiera się powstałe w rezultacie zmutowane nasiona M,. Typowo, dla Arabidopsis, nasiona M2 (Lehie Seeds, Tucson, AZ), tj. potomne nasiona roślin powstałych z nasion mutagenizowanych związkami chemicznymi, takimi jak metanosulfonian etylu lub czynnikami fizycznymi, takimi jak promienie gamma lub szybkie neutrony, są wysiewane, przy gęstości do nasion/płytkę (10 cm średnicy) na minimalną pożywkę mineralną zawierającą odpowiednie stężenie inhibitora, celem selekcji na oporność. Kiełki, które nadal rosną i pozostają zielone 7-21 dni po wysianiu, przenosi się do gleby i hoduje do dojrzałości i wydania nasion. Potomstwo z tych nasion jest testowane pod kątem oporności na herbicyd. Jeżeli cecha oporności jest dominująca, rośliny, których nasiona segregują 3:1:: oporne:wrażliwe, są uważane za heterozygotyczne pod względem oporności w pokoleniu M2. Rośliny, które dają wszystkie nasiona oporne, są uważane za homozygotyczne pod względem oporności w pokoleniu M2. Taka mutageneza na nienaruszonych nasionach i przeszukiwanie nasion z pokolenia M2 mogą być również prowadzone dla innych gatunków, na przykład soi (patrz np. Pat. USA Nr 5,084,082 (Sebastian)). Zmutowane nasiona, które mają być przeszukiwane pod

23 kątem tolerancji wobec herbicydów, można również otrzymać w wyniku zapłodnienia pyłkiem mutagenizowanym sposobami chemicznymi lub fizycznymi. Można zastosować dwa podejścia dla potwierdzenia, że podstawą genetyczną oporności jest zmieniony gen protoks. Po pierwsze, alíele genu protoks z roślin wykazujących oporność na inhibitor mogą być izolowane przy zastosowaniu starterów PCR w oparciu o konserwowane regiony w sekwencjach cdna protoks Arabidopsis i kukurydzy, pokazanych poniżej w SEK ID NR : 1,3,5,7 lub, korzystniej, w oparciu o niezmienione sekwencje genu protoks z rośliny użytej do wytworzenia alleli opornych. Po sekwencjonowaniu alleli celem ustalenia obecności mutacji w sekwencji kodującej, allele mogą być testowane pod kątem ich zdolności do nadawania oporności roślinom, do których alelle przypuszczalnie nadające oporność zostały wtransformowane. Roślinami tymi może być bądź Arabidopsis lub inna dowolna roślina, której wzrost jest wrażliwy na inhibitory. Po drugie, geny protoks mogą być zmapowane względem znanych polimorfizmów długości fragmentów restrykcyjnych (RFLP) (patrz na przykład, Chang et al. c. Natl. Acad, Sci, USA 85: (1988); Nam et al., Plant Celi 1: (1989)). Cecha oporności może być niezależnie zmapowana przy zastosowaniu tych samych markerów. Jeżeli oporność jest powodowana mutacją w takim genie protoks, cecha oporności będzie mapować się w pozycji nieodróżnialnej od pozycji genu protoks. Trzecia metoda otrzymywania alleli protoks opornych na herbicydy jest poprzez selekcję w kultury komórek roślinnych. Eksplanty tkanki roślinnej, np. zarodków, dysków liściowych itd. lub szybko rosnący kalus lub hodowla w zawiesinie z rośliny będącej przedmiotem zainteresowania, hoduje się na zdefiniowanej pożywce nie zawierającej hemu w obecności rosnących stężeń herbicydu o działaniu hamującym lub analogicznego inhibitora odpowiedniego do zastosowania w warunkach laboratoryjnych. Śledzi się zróżnicowanie stopnia wzrostu w różnych hodowlach. W niektórych hodowlach pojawiają się szybko rosnące odmiany kolonii, które kontynuują wzrost nawet w obecności stężeń inhibitora, które normalnie hamują wzrost. Częstość, z którą takie szybko rosnące warianty powstają, może być zwiększona poprzez traktowanie chemicznym lub fizycznym mutagenem przed poddaniem tkanek lub komórek działaniu herbicydu. Potencjalne allele genu protoks warunkujące oporność są izolowane i testowane tak, jak opisano w poprzednich paragrafach. Allele te, zidentyfikowane jako warunkujące oporność na herbicyd, mogą być następnie poddane zabiegom inżynierii genetycznej celem uzyskania maksymalnej ekspresji i transformowane do roślin. Alternatywnie, z tkanek i kultur komórkowych, zawierających te allele, mogą być regenerowane rośliny. Czwarta metoda obejmuje mutagenezę genów protoks typu dzikiego, wrażliwych na herbicyd w bakterii lub drożdżach, a następnie hodowanie mikroorganizmu w pożywce nie zawierającym hemu, ale która zawiera hamujące stężenia inhibitora i selekcjonowanie takich kolonii, które rosną w obecności inhibitora. Bardziej konkretnie, roślinny cdna, taki który koduje protoks z Arabidopsis lub kukurydzy jest klonowany w mikroorganizmie, który wykazuje brak aktywności protoks. Przykłady takich mikroorganizmów obejmują szczep E. coli SASX38 (Sasarman et al., J. Gen. Microbiol. 113: 297 (1979), szczep S. typhimurium TE2483 lub TT13680 (Xu et al., J. Bacteriol. 174: 3953 (1992)) oraz mutanta drożdży heml4-1 (Camadro et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 106: 724 (1982)). Stransformowany mikroorganizm poddaje się mutagenezie in vivo, takiej jak opisano tuż powyżej lub mutagenezie in vitro dowolną z wielu chemicznych lub enzymatycznych metod znanych w tej dziedzinie, np. dwusiarczkiem sodu (Shortle et al., Methods Enzymol. 100: (1983); metoksylaminą (Kadonaga et al., Nucleic Acids Res. 13: (1985); mutagenezą saturacyjną z użyciem oligonukleotydów (Hutchinson et al., c. Natl. Acad Sci. USA, 83: (1986) lub poprzez różne strategie z błędnym włączaniem przez polimerazę (patrz np. Shortle et al., c. Natl. Acad. Sci. USA, 79: (1982); Shiraishi et al., Gene (1988); oraz ng et al., Technique 1:11-15 (1989). Kolonie, które rosną w obecności stężeń inhibitora, normalnie wykazujących hamowanie, są zbierane i czyszczone poprzez powtarzanie posiewu redukcyjnego. Plazmidy są oczyszczane i testowane pod kątem ich zdolności do przenoszenia oporności na inhibitor poprzez ponowną transformację do mikroorganizmu me mającego aktywności protoks. Następnie ustala się sekwencje DNA wstawek cdna dla protoks z plazmidów, które przechodzą pomyślnie taki test.

24 Gdy allel protoks oporny na herbicyd zostanie zidentyfikowany, może być poddany zabiegom inżynierii genetycznej celem uzyskania optymalnej ekspresji w roślinie uprawnej. Może to obejmować zmianę sekwencji kodującej allelu oporności dla optymalnej ekspresji w gatunku rośliny uprawnej będącej przedmiotem zainteresowania. Sposoby modyfikowania sekwencji kodujących dla osiągnięcia optymalnej ekspresji w konkretnym gatunku rośliny uprawnej są dobrze znane (patrz np. Perlak et al., c. Natl. Acad. Sei. USA 88: 3324 (1991); Cozily et al., Biotechnol. 11:194 (1993)). Zabiegi inżynierii genetycznej dla allelu protoks w celu uzyskania optymalnej ekspresji mogą również obejmować dołączone w sposób funkcjonalny odpowiednie sekwencje regulacyjne (tj. promotor, sekwencję sygnałową terminatory transkrypcji). Korzystnymi promotorami będą takie, które warunkują wysoki konstytutywny poziom ekspresji lub, korzystniej, takie, które warunkują wysoki specyficzny poziom ekspresji w tkankach podatnych na uszkodzenie przez herbicyd. Cząsteczki zrekombinowanego DNA mogą być wprowadzane do komórki roślinnej wieloma sposobami znanymi w tej dziedzinie. Dla biegłych będzie jasne, że wybór metody będzie zależał od typu rośliny, tj. jednoliściennej czy dwuliściennej, będącej celem transformacji. Odpowiednie sposoby transformowania komórek roślinnych obejmują mikroinjekcję (Crossway et al., BioTechniques (1986)), elektroporacię (Riggs et al, c. Natl. Acad Sei. USA 83: (1986), transformację za pośrednictwem Agrobacterium (Hinchee et al., Biotechnology 6: (1988)), bezpośrednie przeniesienie genu (Paszkowski et al., EMBO J (1984)), oraz balistyczne przyspieszenie cząstek przy zastosowaniu urządzeń dostępnych z Agracetus, Inc., Madison, Wisconsin and Dupont, Inc., Wilmington, Delaware (patrz na przykład, Sanford et al, Patent USA 4,945,050; and McCabe et al., Biotechnology (1988)). Patrz także, Weissinger et al., Annual Rev. Genet. 22: (1988); Sanford et al., Particulate Science and Technology (1987) (cebula); Christou et al., Plant Physiol (1988) (soja); McCabe et al., Bio/Technology 6: (1988) (soja); Datta et al., Bio/Technology 8: (1990) (ryż); Klein et al., c. Natl. Acad Sei. USA, 85: (1988) (kukurydza); Klein et al., BiolTechnology E (1988) (kukurydza); Klein et al., Plant Physiol. 91: (1988) (kukurydza); Fromm et al., BiolTechnology (1990); oraz GordonKamm et al., Plant Celi 2: (1990) (kukurydza). Ponadto, w zakres wynalazku wchodzą komórki roślinne i ich potomstwo, w szczególności komórki zmodyfikowanych genetycznie płodnych roślin stransformowanych przy stosowaniu wcześniej opisanych sposobów, powstałe na drodze bezpłciowej i płciowej, które nadal pozostają oporne lub co najmniej tolerują hamowanie przez herbicyd na poziomie, który ma działanie hamujące w stosunku do naturalnie występującej w roślinie aktywności protoks. Szczególnie korzystne jest stosowanie hybrydowych roślin, które są oporne lub co najmniej tolerują hamowanie przez herbicyd na poziomie, który ma działanie hamujące w stosunku do naturalnie występującej w roślinie aktywności protoks. Komórką roślinną według wynalazku może być komórka pochodząca z rośliny dwuliściennej lub jedno liściennej. Korzystne jest stosowanie roślin jedno liściennych z rodziny Graminaceae, włączając w to Lolium, Zea, Triticum, Triticale, Sorghum, Saccharum, Bromus, Oijizae, Avena, Hordeum, Secale i Setaria. Szczególnie korzystne są tu rośliny: kukurydza, pszenica, jęczmień, sorgo, żyto, owies, trawy darniowe i ryż. Wśród roślin dwuliściennych szczególnie preferowane są: soja, bawełna, tytoń, burak cukrowy, rzepak i słonecznik. Stosowany dalej termin potomstwo obejmuje potomstwo komórek transgenicznych i roślin powstałe zarówno na drodze bezpłciowej jak i płciowej. Definicja ta dotyczy również wszystkich mutantów i wariantów, które można otrzymać za pośrednictwem znanych sposobów, takich jak na przykład fuzja komórek lub selekcja mutantów, które nadal wykazują charakterystyczne właściwości wyjściowej transformowanej rośliny, łącznie ze wszystkimi produktami krzyżowania i fuzji transformowanego materiału roślinnego. Stosowany dalej termin materiał do namnażania jest zdefiniowany jako dowolny materiał, który może być namnażany na drodze płciowej lub bezpłciowej in vivo lub in vitro. Szczególnie korzystnym materiałem są protoplasty, komórki, kalus, tkanki, narządy, nasiona,

25 zarodki, pyłek, komórki jajowe, zygoty, łącznie z dowolnym innym materiałem rozrodczym otrzymanym z transgenicznych roślin. Przed sprzedażą roślinnego materiału rozrodczego jako produktu handlowego (owoce, bulwy, ziarno, nasiona) jest on zwykle traktowany ochronnym materiałem powlekającym zawierającym herbicydy, insektycydy, fungicydy, środki przeciw bakteriom, nicieniom i ślimakom lub mieszaninę kilku tych preparatów, jeżeli trzeba, łącznie z kolejnymi nośnikami, środkami powierzchniowo czynnymi lub dodatkami ułatwiającymi stosowanie, zwykle używanymi w dziedzinie wytwarzania preparatów do uzyskiwania ochrony przed uszkodzeniami powodowanymi przez szkodniki bakteryjne, grzybowe lub zwierzęce. Na nasionach, ziarnie i bulwach powłoka ochronna jest wytwarzana przez impregnację substancją płynną lub poprzez nanoszenie kombinacji mokrych i suchych związków. W specjalnych przypadkach, możliwe jest stosowanie innych metod, np. działanie skierowane na pączki lub owoce. Nasiona roślin zawierające sekwencję DNA kodującą białko z organizmu eukariotycznego, wykazujące aktywność oksydazy protoporfirynogenu (protoks) mogą być traktowane powłoką chroniąca nasiona, zawierającą związki stosowane do traktowania nasion, takie jak kapłan, karboksyna, tiram (TMTD ), metalaksyl (Apron ) i pirymifos-metyl (Actellic ) oraz inne, które są zwykle używane przy traktowaniu nasion. Gdy allel protoks oporny na herbicyd jest otrzymany poprzez bezpośrednią selekcję w roślinie uprawnej lub kulturze komórek roślinnych, z których roślina uprawna może być zregenerowana, może być ona przeniesiona do odmian handlowych przy zastosowaniu tradycyjnych technik hodowlanych dla wytworzenia rośliny uprawnej tolerującej herbicyd bez potrzeby poddawania allelu zabiegom inżynierii genetycznej i transformowania go do rośliny. Alternatywnie, allel oporny na herbicyd może być izolowany, poddany zabiegom inżynierii genetycznej dla uzyskania optymalnej ekspresji, a następnie transformowany do pożądanej odmiany. Geny kodujące zmieniony protoks oporny na inhibitor protoks, mogą być stosowane jako marker selekcyjny w metodach transformacji komórek roślinnych. Przykładowo, rośliny, tkanki roślinne lub komórki roślinne transformowane transgenem mogą być również transformowane genem kodującym zmieniony protoks, mogący podlegać ekspresji w roślinie. Tak transformowane komórki są przenoszone do pożywki zawierającej inhibitor protoks, w której tylko komórki stransformowane przeżyją. Inhibitorami protoks, które uważa się za szczególnie użyteczne czynniki selektywne, są: difenyloetery {np. acyfluorofen, kwas 5-[2-chloro-4- -(trifluorometylo)fenoksy]-2-nitrobenzoesowy; jego ester metylowy; lub oksyfluorfen, 2-chloro-1-(3-etoksy-4-nitrofenoksy)-4-(trifluorobenzen)}, oksydiazole, (np. oksydiazon, 3-[2,4-dichloro-5-( 1 -metyloetoksy)fenylo]-5-( 1,1 -dimetyloetylo)-1,3,4-oksadiazol-2-(3h)-on, cykliczne imidy (np. S-23142, N-(4-chloro-2-fluoro-5-propargiloksyfenylo)-3,4,5,6-tetrahydroftalimid; chloroftalim, N-(4-chlorofenylo)-3,4,5,6-tetrahydroftalimid), fenylopirazole (np. TNPP-etyl, 2-[l-(2,3,4-trichlorofenylo)-4-nitropirazolilo-5-oksy]propionian etylu; M&B 39279), pochodne pirydyny (np. LS ) oraz fenopilan oraz jego analogi O-fenylopirrolidynowe i piperydynokarbaminowe. Metoda ma zastosowanie dla dowolnej komórki roślinnej mogącej podlegać transformacji zmienionym genem kodującym protoks i może być użyta dla dowolnego transgenu, będącego przedmiotem zainteresowania. Ekspresja transgenu i genu protoks może być kierowana przez ten sam promotor funkcjonalny w komórkach roślinnych lub przez odrębne promotory. Depozyty Następujące cząsteczki wektorów zostały zdeponowane w Agricultural Research Service, Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 North University Street. Peoria, Illinois 61604, USA w terminie wskazanym poniżej: toks-1, w wektorze pbluescript SK, zdeponowano 5 kwietnia 1994 jako pwdc-2 (#B-21238). toks-2, w wektorze pfl-61, zdeponowano 5 kwietnia 1994 jako pwdc-1 (NRRL #B21237). Mztoks-1, w wektorze pbluescript SK, zdeponowany 20 maja 1994 jako pwdc-4 pod nazwą NRRL (#B-21260), pokazany w SEK NR ID: 5.

26 Mztoks-l, w wektorze pbluescript SK, zdeponowany ponownie 11 lipca 1994 jako pwdc-4 pod nazwą NRRL (#B-21260N), pokazany w SEK ID NR: 5. Mztoks-2, w wektorze pbluescript SK, zdeponowany 20 maja 1994, jako pwdc-3 pod nazwą NRRL (#B-21259), pokazany w SEK NR ID:7. toks-3, w wektorze pfl61, został zdeponowany 10 czerwca 1994, jako pwdc-5 (NRRL #B-21280). pmzc-1 Val, w wektorze pbluescript SK, został zdeponowany 30 września 1994 pod nazwą pwdc-8 i depozyt oznaczono NRRL # parac-2cys, w wektorze pfl61 wektor, zdeponowano 14 listopada 1994 pod nazwą pwdc-7 i depozyt oznaczono NRRL#21339N Przykłady Stosowane tutaj, standardowe techniki rekombinowania DNA i klonowania, są dobrze znane w tej dziedzinie i są opisane przez T. Maniatis, E. F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1982). T.J. Silhavy, M.L. Berman, and L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984). Przykład 1: Izolacja cdna dla genów kodujących protoks z Arabidopsis poprzez funkcjonalną komplementację mutanta E.coli. Otrzymano i powielono bibliotekę cdna Arabidopsis thaliana (Landsberg) na plazmidowym wektorze pfl61 (Minet et al., Plant J. 2: (1992)). Drugą bibliotekę cdna Arabidopsis (Columbia) w wektorze lambda UniZap (Stratagene) zakupiono i powielono jako plazmidy pbluescript poprzez masowe wycinanie in vivo z zawiesiny wyjściowej faga. Mutant E. coli hemg SASX38 (Sasarman et al., J. Gen. Microbiol. 113: 297 (1979)) został otrzymany i był utrzymywany na pożywce L zawierającej 20 mg/ml hematyny (United States Biochemicals). Bibliotekę plazmidów transformowano do SASX38, stosując elektroporację przy użyciu Bio-Rad Gene Pulser i warunki polecane przez producenta. Komórki wysiewano na agar L zawierający 100 mg/ml ampicyliny, przy gęstości około transformantów/szalkę o średnicy 10 cm. Komórki hodowano w 37 C przez 40 godzin przy słabym świetle i selekcjonowano na zdolność do wzrostu bez dodawania egzogennego hemu. totrofy hemowe odzyskiwano z częstością 400/107 biblioteki pfl61 i z częstością 2/107 z biblioteki pbluescript. DNA plazmidowy izolowano z 24 kolonii celem analizy sekwencji. Każdy z 24 był ponownie transformowany do SASX38 celem zweryfikowania zdolności do komplementacji. Analiza sekwencji wykazała obecność dwóch klas przypuszczalnych genów protoks. Dziewięć było typu oznaczonego jako toks-1. Każdy z nich pochodził tego samego genu, a dwa były klonami pełnej długości. cdna miało długość 1719 bp i kodowało białko o masie cząsteczkowej 57,7 kd. N-końcowa sekwencja peptydu miała cechy charakterystyczne dla chloroplastowego peptydu sygnałowego o długości około 60 aminokwasów. Przeszukanie bazy danych programem GAP (Deveraux et al., Nucleic Acids Res. 12: (1984) ujawniło homologię z białkiem hemy (protoks) z B. subtilis (Hansson and Hederstedt 1992, Dailey et al., J. Biol. Chem. 269: 813 (1994)). Te dwa białka wykazują 53% podobieństwa, 31% identyczności i mają regiony wysokiej homologii, włączając w to proponowaną domenę białka hemy wiążącą dinukleotyd (Dailey et al., J. Biol. Chem. 269: 813 (1994)). 15 innych klonów cdna należało do typu oznaczonego jako toks-2. One również okazały się pochodzić z pojedynczego genu. Uzyskany pełnej długości cdna ma wielkość 1738 bp i koduje białko o masie cząsteczkowej 55,6 kd. Koniec aminowy jest charakterystyczny dla mitochondrialnego peptydu tranzytowego. Białko toks-2 ma ograniczoną homologię do toks-1 (53% podobieństwa, 28% identyczności) i do protoks z B. subtilis (50% podobieństwa, 27% identyczności). toks-1, w wektorze pbluescript SK, został zdeponowany 5 kwietnia 1994, jako pwdc-2 (NRRL #B-21238). toks-2, w wektorze pfl61, został zdeponowany 5 kwietnia 1994, jako pwdc-1 (NRRL #B21237).

27 cdna kodujący protoks-1 z Arabidopsis, zawarty w pwdc-2, i protoks-2, zawarty w pwdc-1, są przedstawione poniżej w SEK NR ID:1 i 3, odpowiednio. Przykład 2: Izolacja cdna dla genów kodujących protoks z kukurydzy poprzez funkcjonalną komplementację mutantów E. coli. Bibliotekę cdna z Zea Mays (odmiana B73) w wektorze lambda UniZap otrzymano ze Stratagene i przekształcono w bibliotekę na plazmidzie pbluescript poprzez masowe wycięcie in vivo. Drugą handlowo dostępną bibliotekę cdna z kukurydzy na wektorze UniZ otrzymano z firmy Clontech i podobnie przekształcono w plazmidy pbluescript. Selekcję pod kątem funkcjonalnych genów protoks z kukurydzy przeprowadzono, jak opisano powyżej w przykładzie 1 dla bibliotek Arabidopsis. Z biblioteki Stratagene spośród 107 transformantów wyizolowano dwa hemowe prototrofy, dla których wykazano ponowną komplementację i ustalono sekwencję. cdna były identyczne i udowodniono, że są homologiczne ztoks-1 z Arabidopsis. Ten klon kukurydzy, oznaczony jako Mztoks-1, jest niekompletny. cdna ma długość 1698 bp i koduje jedynie przypuszczalny dojrzały enzym protoks; brak jest sekwencji peptydu tranzytowego i inicjacyjnego kodonu metioninowego. Gen jest w 68% identyczny z genem Arab toks-1 na poziomie nukleotydów i w 78% identyczny (87% podobieństwa) na poziomie aminokwasów (pokazane w tabeli 1). Z biblioteki Clontech spośród 107 transformantów wyizolowano jednego hemowego prototrofa, dla którego wykazano ponowną komplementację i ustalono sekwencję. cdna okazał się kompletny, ma długość 2061 bp i koduje białko o masie 59 kd. Klon ten koduje homolog toks-2 z Arabidopsis i jest oznaczony jako Mztoks-2. Gen jest w 58% identyczny z genem Arab toks-1 na poziomie nukleotydów i 58% identyczny (76% podobieństwa) na poziomie aminokwasów (pokazane w tabeli 2). Klon kukurydzy ma N-końcową sekwencję, która jest o 30 aminokwasów dłuższa niż klon Arabidopsis. Tak jak w przypadku klonów Arabidopsis, homologia pomiędzy dwoma genami protoks z kukurydzy jest niska, wynosi jedyme 31% identyczności między dwiema sekwencjami białkowymi. Mztoks-1, w wektorze pbluescript SK, zdeponowany 20 maja 1994, jako pwdc-4 pod nazwą NRRL (#B-21260), pokazany w SEK NR ID:5. Mztoks-1, w pbluescript SK wektor, ponownie zdeponowany 11 lipca 1994, jako pwdc-4 pod nazwą NRRL (#B-21260N), pokazany w SEK NR ID:5. Mztoks-2, w wektorze pbluescript SK, zdeponowany 20 maja 1994, jako pwdc-3 pod nazwą NRRL (#B-21259), pokazany w SEK NR ID:7. Przykład 3: Izolacja dalszych genów protoks w oparciu o homologię sekwencji ze znanymi sekwencjami kodującymi protoks. Fagowa lub plazmidowa biblioteka została wysiana przy gęstości około łysinek na płytkę Petriego o średnicy 10 cm i łysinki przeniesiono na filtr po inkubacji płytek przez noc w 37 C. Przeniesione łysinki były przeszukiwane przy użyciu jednego z cdna z zestawu SEK NR ID:1, 3, 5 lub 7, wyznakowanego 32P-dCTP metodą losowych starterów, stosując PrimeTime kit (International Biotechnologies, Inc., New Haven, CT). Warunki hybrydyzacji były następujące: 7% sodowy siarczan dodecylu (SDS), 0,5 M NaP04 ph 7, 0,1 mm EDTA w 50 C. Po prowadzonej przez noc hybrydyzacji filtry były płukane w 2X SSC, 1% SDS. Pozytywnie hybrydyzujące łysinki wykrywano poprzez autoradiografię. Po oczyszczeniu do pojedynczej łysinki, izolowano wstawkę cdna i oznaczano jej sekwencję metodą terminacji łańcucha, stosując terminatory dideoksy wyznakowane barwnikami fluorescencyjnymi (Applied Biosystems, Inc., FosterCity, CA). Standardowy protokół doświadczalny opisany powyżej może być użyty przez biegłego w tej dziedzinie do otrzymania genów protoks homologicznych pod względem sekwencji do znanych sekwencji kodujących protoks z dowolnego innego organizmu eukariotycznego, a w szczególności z innych gatunków roślin wyższych. Wzajemne porównanie przewidywanych sekwencji aminokwasowych odpowiednich białek, kodowanych przez sekwencje pokazane w SEK NR ID: 2 i 6, jest przedstawione w tabeli 1. Wzajemne porównanie przewidywanych sekwencji aminokwasowych odpowiednich białek, kodowanych przez sekwencje pokazane w SEK NR ID: 4 i 8, jest przedstawione w tabeli 2.

28 Tabela 1 Porównanie sekwencji aminokwasowych toks-1 z Arabidopsis (SEK NR ID 2) i kukurydzy (SEK NR ID 6) cent podobieństwa: 87,137 cent identyczności: 78,008 toks-i.pep x Mzprotoks-I.Pep GGTTITTDCVIV GGGISGLCIAQALATKHP DAAPNLIVTEAKDR VGGNII. I I I : 1.. l l l : l l l l l l l : l l l l l : l.llll.. NSADCVWGGGISGLCTAQALATRH.. GVGDVLVTEARARPGGNIT T.. REENGFLWE EGPNSFQPSDPMLTMWDSGLKDDLVLGDPTAPRFVLW l l - l : l : l l l MMMMMIMII.II :111.1 MMII TVERPEEGYLWE EGPNSFQPSDPVLTMAVD SGLKDDLVFGDPNAPRFVLW NGKLRPVPSKLT DLPFFDLMSIGGKIRAGF GALGIRPSPPGREE SVEEFV : l l l l l l l l l. l l l l l l l l l l 1 1 : 1 l l : l l l l l l l. l l l l l l llllll EGKLRPVPSKPADLPFFDLMSIPGKLRAGL GALGIRPPPPGREE SVEEFV RRN LGDEVFERL IEPFCSGVYAGDPSKLSM KAAFGKVWKLEQNG GSIIGG l l l l l l l l l l l l l l l l l l : 1 1 : 1 llllll RRN LGAEVFERL,IEPFCSGVYAGDPSKLSMKAAFGKVWRLEETG -GSIIGG TFK AIQERKNAP KAERDPRLPKPQGQTVGS FRKGLRMLPEAISA HLGSKV 1 : 1 l l l l... l 1 : - l l : l l l l l l l l l : l MIII 111:11...MIII TIK TIQERSKNP KPPRDARLPKPKGQTVAS FRKGLAMLPNAITS SLGSKV KLS WKLSGITKL,ESGGYNLTYETPDGLVSVQSKSWMTVPSHVA lsgllrp l l l l l l. : l l l : II 1 l l l l : l : l l l l. l l l : l l : l l. l l 1. : l l l KLSWKLTSITKS DDKGYVLEYETPEGWSVQAKSVIMTIPSYVAlSNILRP LSE SAANALSKL YYPPVAAVSISYPKEAIR TECLIDGELKGFGQ LHPRTQ :111:: : I I I I I I I I. 1 LSS DAADALSRF YYPPVAAVTVSYPKEAIR1CECLIDGELQGFGC LHPRSQ GVE TLGTIYSSS LFPNRAPPGRILLLNYIG GSTNTGILSKSEGE:l v e a v d : I I :11.1:1 l l l l l l GVE TLGTIYSSS LFPNRAPDGRVLLLNYIGGATNTGIVSKTESE:LVEAVD RDL RKMLIKPNSTDPLKLGVRVWPQAIPQF LVGHFDILDTAKSS LTSSGY l l l l l l l....l l l l l l I I l l I I l l l l I I l l : l : l :. I I. l 1.. : I I RDLRKMLINSTAVDPLVLGVRVWPQAIPQFLVGHLDLLEAAKAA1.DRGGY e g l : FLGGNYVAG VALGRCVEGAYETAIEVN NFMSRYAYK* : 1 1 MMMMI I I I I I I I I I I I I. 1 : : : 1 : - : I I l I I DGLFLGGNYVAG VALGRCVEGAYESASQIS DFLTKYAYK* Identyczne reszty są oznaczone poprzez pionowe kreski pomiędzy dwiema sekwencjami. Porównamie sekwencji zostało wykonane przy zastosowaniu programu GAP opisanego w Deveraux et al., Nucleic Acids Res (1984).

29 Tabela 2 Porównanie sekwencji aminokwasowych toks-2 z Arabidopsis (SEK NR ID 4) i kukurydzy (SEK NR ID 8) cent podobieństwa: cent identyczności: toks-2. Pep x Mzprotoks-2.Pep MASGAVAD- HQIEAVSGKRVAV. 1 1 : 1 :. :.. : :. MLALTASASSASSHPYRHĄSAHTRRPRLRAVLAMAGSDDPRAAPARSVAV VGAGVSGLYKLKSRGLNVTVFEADGRVGGKLRSVMQNGLIWDEGANT : 1 :. 1 : : : 1. :. 1 : : I I VGAGVSGLYRLRQSGVNVTVFEAADRAGGKIRTNSEGGFVWDEGANT MTEAEPEVGS LLDDLGLREKQQFPISQKKRYIVRNGVPVMLPTNPIELVT : 1 1. :. 1 : I I 1 I I. : : : : : : 1. : :. MTEGEWEASRLIDDLGLQDKQQYPNSQHKRYIVKDGAPALIPSDPISLMK SSVLSTQSKFQILLEPFLWKK KSSKVSDASAEESVSEFFQRHFGQE I I 1 1 I I. 1 1 :. : : : 1 I I 1 : : : :. 1 : 1 1 I I. 1 SSVLSTKSKIALFFEPFLYKKANTRNSGKVSEEHLSESVGSFCERHFGRE WDYLIDPFVGGTSAADPDSLSMKHSFPDLWNVEKSFGSIIVGAIRTKFA l l l l : : l l l l : l l l l : 1 1 : l l l : : l. l l. l l l : l :. : l l : l l l l l - l WDYFVDPFVAGTSAGDPESLSIRHAFPALWNLERKYGSVIVGAILSKLA AKGGKSRDTKSSPGTKKGSRGSFSFKGGMQILPDTLCKSLSHDEINLDSK I I I :. : : : I I I I. I I I I :... : :. 1 : :. 1 :.. AKGDPVKTRHDSSGKRRNRRVSFSFHGGMQSLINALHNEVGDDNVKLGTE V L SL S.. YNSGSRQENWSLSCVSHNETQRQ... NPHYDAVIMTAPLCNVK M I I. : : :.. :. I I : l. l : l. : l l l l l l l l l : l l : VLSLACTFDGVPALGRWSISVDSKDSGDKDLASNQTFDAVIMTAPLSNVR EMKVMKGGQPFQLNFLPEINYMPLSVLITTFTKEKVKRPLEGFGVLIPSK I I. I l l. l. M I I I. : : : M I : : :.. :. I I l l I l l l l l RMKFTKGGAPWLDFLPKMDYLPLSLMVTAFKKDDVKKPLEGFGVLIPYK E. QKHGFKTLGTLFSSMMFPDRSPSDVHLYTTFIGGSRNQELAKASTDEL 1 I I 1 1 : I I I I 1 I I I I I I 1. l. l. l I I I l : I I 1 : 1. : I I l. 1-1 EQQKHGLKTLGTLFSSMMFPDRAPDDQYLYTTFVGGSHNRDLAGAPTSIL KQVVTSDLQRLLGVEGEPVSVNHYYWRKAFPLYDSSYDSVMEAIDKMEND I I : I I : I I I I l l : l. l. l l l - l l l l l: I I I. : KQLVTSDLKKLLGVEGQPTFVKHVYWGNAFPLYGHDYSSVLEAIEKMEKN LPGFFYAGNHRGGLSVGKSIASGCKAADLVISYLESCSNDKKPNDSL* I I : : I I. I I. I I I I : I I I I I I 1...: LPGFFYAGNSKDGLAVGSVIASGSKAADLAISYLESHTKHNNSH*

30 Przykład 4: Izolowanie będącego zanieczyszczeniem drożdżowego klonu protoks z biblioteki cdna Arabidopsis. W celu podjęcia próby identyfikacji rzadko występujących cdna niosących aktywność protoks, dokonano ponownego przeszukania biblioteki Arabidopsis na wektorze pfl61, znowu uzyskując setki komplementujących klonów. Około 600 z nich wyszczepiono na osobne płytki szablonowe i hodowano w28 C przez 18 godzin. Wykonano dwie repliki kolonii na filtrach Colony/Plaque screen (NEN), zgodnie z instrukcjami producenta. cdna toks-1 i toks-2 wycięto z wektorów poprzez trawienie odpowiednio, EcoRI/Xhol i Notl. Wstawki rozdzielano poprzez elektroforezę w 1,0% agarozie SeaPlaque GTG (FMC), wycinano i znakowano 32P stosując losowe startery (Life Technologies). Jeden zestaw filtrów hybrydyzowano z każdą z sond. Hybrydyzacja i warunki płukania były jak opisane w Church and Gilbert, Kolonie (-20), które nie hybrydyzowały wyraźnie z toks-1 lub toks-2, namnażano w płynnej hodowli i otrzymywano plazmidowy DNA. DNA trawiono Notl, powtórzone próbki poddawano elektroforezie w 1,0% żelu agarozowym, a następnie przenoszono metodą Southema na filtr Gene Screen Plus (NEN) [New England Nuclear]. Sondy dla dwóch znanych genów protoks znakowano i hybrydyzowano jak poprzednio. Dwa identyczne klony nie były ani toks-1 ani toks-2. Wykazano, że ten klon ponownie komplementuje mutanta SASX38, jakkolwiek rośnie bardzo wolno, i nazwano go toks-3. toks-3, w wektorze pfl61, został zdeponowany 8 czerwca 1994 jako pwdc-5 (NRRL #B-21280). Stwierdzono, że ta sekwencja kodująca pochodzi z DNA drożdży, które było obecne jako niewielkie zanieczyszczenie biblioteki cdna Arabidopsis. Drożdżowy DNA kodujący protoks-3, zawarty w pwdc-5, jest przedstawiony poniżej w SEK NR ED:9. Przykład 5: Wykazanie wrażliwości roślinnego klonu protoks na herbicydy hamujące protoks w systemie bakteryjnym. Płynne kultury toks-l/sasx38, toks-2/sasx38 i pbluescript/xll-blue były hodowane w L amp100. Próbki po sto mikrolitrów z każdej hodowli wysiewano na pożywkę L amp100, zawierającą różne stężenia (1,0 nm-i 0 mm) arylouracylu-herbicydu hamującego protoks o wzorze 17. Powtórzoną serię płytek hodowano przez 18 godzin w 37 C przy słabym świetle lub w kompletnej ciemności. Szczep E. coli XL1-Blue nie wykazywał wrażliwości na żadne stężenie herbicydu, co pozostaje w zgodzie z opisywaną opornością natywnego bakteryjnego enzymu na podobne herbicydy. toks-1/sasx3 8 był wyraźnie wrażliwy, z murawą bakterii prawie całkowicie wyeliminowaną przy tak małym stężeniu inhibitora, jak 10 nm. toks-2/sasx38 był również wrażliwy, ale jedynie przy wyższym stężeniu herbicydu (10 M). Wpływ herbicydu na oba szczepy z roślinnym protoks był bardziej dramatyczny przy słabym świetle, ale również widoczny na płytkach trzymanych w całkowitej ciemności. Toksyczność herbicydu była całkowicie wyeliminowana poprzez dodanie do płytek 20 mg/ml hematyny. Różna tolerancja wobec herbicydu dwóch szczepów z roślinnym toks jest prawdopodobnie raczej wynikiem zróżnicowanej ekspresji z tych dwóch plazmidów niż jakąś swoistą różnicą we wrażliwości enzymu. toks-1/sasx3 8 rośnie znacznie szybciej niż toks- 2/SASX3B w każdej pożywce nie zawierającej hemu. Dodatkowo, szczep Mztoks-2/SASX38, który rośnie porównywalnie z Arab toks-l/sasx38, jest również bardzo wrażliwy na herbicyd w niższych (10-100nM) stężeniach. Wstępna charakterystyka drożdżowego toks-3 wykazała, że jest on również wrażliwy na herbicyd. Przykład 6: Selekcjonowanie roślinnych genów protoks opornych na herbicydy hamujące protoks w systemie ekspresji E. coli. Hamowanie roślinnych enzymów protoks w systemie bakteryjnym jest użyteczne przy poszukiwaniach na dużą skalę mutacji opornych na herbicyd w genach roślinnych. Wyjściowe doświadczenia z odpowiedzią na dawkę, wykonane poprzez wysiew z hodowli płynnych, prowadziły do powstania z dużą częstością opornych kolonii nawet przy wysokich stężeniach herbicydu. Oporność ta nie była zależna od plazmidu, co stwierdzono w oparciu o ponowną transformację/test na wrażliwość na herbicyd. Transformacja plazmidów toks do mutanta SASX38 i bezpośrednie wysianie na płytki zawierające herbicyd, prawie całkowicie redukują ten problem tła.

31 Roślinne plazmidy protoks mutagenizuje się na wiele sposobów, stosując opublikowane procedury mutagenezy chemicznej (np. dwusiarczkiem sodowym (Shortle et al., Methods Enzymol. 100: (1983); metoksylaminą (Kadonaga et al., Nucleic Acids Res. 13: (1985); mutagenezę saturacyjną za pośrednictwem oligonukleotydów (Hutchinson et al., c. Natl. Acad Sci. USA, 83: (1986); lub różne strategie oparte o błędne włączanie przez polimerazę (patrz, np. Shortle et al., c. Natl. Acad. Sci. USA, 79: (1982); Shiraishi et al., Gene (1988); and ng et al., Technique 1:11-15 (1989)). Spodziewane mutanty o podwyższonej aktywności promotora po mutagenezie całego plazmidu są eliminowane poprzez ponowne klonowanie sekwencji kodującej do wektora typu dzikiego i powtórzenie testu. Zakładając, że wyższa ekspresja prawdopodobnie prowadzi do lepszego wzrostu w nieobecności herbicydu, możliwe jest również wizualne poszukiwanie mutantów w sekwencji kodującej. Dowolny roślinny gen protoks, wywołujący oporność na herbicyd w systemie bakteryjnym, może być poddany zabiegom inżynierii genetycznej celem uzyskania optymalnej ekspresji i transformowany do roślin przy zastosowaniu opisanych tu standardowych technik. Otrzymane w rezultacie rośliny mogą być następnie traktowane herbicydem dla ilościowego potwierdzenia poziomu oporności warunkowanej przez wprowadzony gen protoks. Przykład 7: Konstrukty do ekspresji opornego na herbicyd genu (ów) protoks z mikroorganizmów w roślinach. Sekwencje kodujące genu protoks hem Y z B. subtilis (Hansson and Hederstedt, J. Bacteriol.174: 8081 (1992); Dailey et al., J. Biol. Chem. 269: 813 (1994)) i genu protoks hemg z E coli (Sasarman et al., Can. J. Microbiol. 39: 1155 (1993)) zostały wyizolowane ze szczepów laboratoryjnych poprzez powielanie w reakcji PCR, stosując standardowe warunki i startery otaczające te geny, zaprojektowane na podstawie opublikowanych sekwencji. Wiadomo, że geny te kodują postaci enzymu protoks oporne na herbicyd. Stosując standardowe techniki fuzji zachodzących na siebie produktów PCR (Ausubel et al., Current tocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, Inc. (1994)), oba bakteryjne geny zostały dołączone do dwóch różnych sekwencji chloroplastowych peptydów tranzytowych (CTP) z Arabidopsis. Pierwszym był CTP z syntetazy kwasu acetohydroksylowego, który powinien umożliwić import do stromy chloroplastów. Druga była z genu dla plastocyjaniny z Arabidopsis (Vorst et al., Gene 65: 59 (1988)), który ma dwuczęściowy peptyd tranzytowy. Aminokońcowa część tego CTP kieruje białko do chloroplastów, gdzie koniec karboksylowy wprowadza je do membran tylakoidu. Wszystkie cztery fuzje genowe zostały sklonowane za promotorem 2x35S w binarnym wektorze ekspresyjnym zaprojektowanym do wytwarzania transgenicznych roślin poprzez transformację z użyciem Agrobacterium. Po wyizolowaniu cdna dla protoks z Arabidopsis i kukurydzy, chloroplastowy peptyd tranzytowy z toks-1 lub Mztoks-1 może być również połączony z dwoma bakteryjnymi białkami protoks w taki sam sposób jak wyżej. Opisane powyżej wektory mogą być następnie transformowane do żądanych gatunków roślin i otrzymane transformanty testowane pod kątem wzrastającej oporności na herbicyd. Przykład 8: Zamiana domen między genami Arabidopsis/B.subtilis, celem wytworzenia protoks chimerowego, opornego na herbicydy. Jednym z podejść, które mogą być zastosowane do wytworzenia genu protoks, który jest zarówno oporny na herbicyd, jak i zdolny do dostarczania skutecznej aktywności enzymatycznej protoks w roślinie, jest łączenie części (jednej lub wielu) bakteryjnego i roślin-nego genu protoks. Powstałe w rezultacie chimerowe geny mogą być przeszukiwane pod kątem takich, które mają zdolność dostarczania komórce roślinnej opornej na herbicydy aktywności protoks. Przykładowo, sekwencje peptydu protoks z Arabidopsis i B. subtilis (hemy) są podobne, z regionami o wysokiej homologii. Sekwencję kodującą hemy klonuje się w plazmi-dzie pbluescript i testuje na zdolność do ekspresji w SASX38 aktywności protoks opornej na herbicydy. Chimerowe geny toks- 1/hem Y są konstruowane przy zastosowaniu technik fiizyjnej reakcji PCR, a następnie powtórną ligację do wektora pbluescript. Wyjściowa wymiana dotyczy środka białka. Fuzje te są testowane pod kątem funkcji protoks poprzez komplementację, a następnie testowane na oporność na herbicyd poprzez wysianie na herbicyd, z nienaruszonymi toks-1 i hemy jako kontrolą.

32 Przykład 9: Wytwarzanie roślin tolerujących herbicyd poprzez nadprodukcję roślinnych genów protoks. Celem uzyskania ekspresji białka Arabidopsis lub kukurydzy w transgenicznych roślinach, odpowiednie pełnej długości cdna wstawiono do roślinnego wektora ekspresyjnego pcgni 761 ENX, który powstał z pcgni761 jak następuje. PCGN1761 został strawiony w swoim unikalnym miejscu EcoRI i poddany ligacji z dwuniciowym fragmentem DNA, zawierającym dwie sekwencje oligonukleotydowe 5' AAT TAT GAC GTA ACG TAG GAA TT A GCG GCCC GCT CTC GAG T 3' (SEK NR ID: 11) i 5' AAT TAC TCG AGA GCG GCC GCG AAT TCC TAC GTT ACG TCA T 3' (SEK NR ID: 12). Uzyskany w rezultacie plazmid, pcgni761 ENX, zawiera unikalne miejsca EcoRI, Notl i XhoI, które leżą pomiędzy podwojonym promotorem 35S wirusa mozaiki kalafiora (Kay et al., Science 236: (1987)) i nie podlegającymi translacji sekwencjami 3' genu tml z Agrobacterium tumefaciens. Plazmid ten jest trawiony i poddawany ligacji z fragmentem powstałym w wyniku trawienia enzymami restrykcyjnymi jednego z plazmidów niosących cdna protoks, tak, że przenosi on kompletny cdna protoks. Z takiego plazmidu wycinany jest fragment Xbal zawierający cd- NA protoks z Arabidopsis, otoczony przez podwojony promotor 35S i nie podlegające translacji sekwencje 3' genu tml z A. tumefaciens. Ten fragment Xbal jest wstawiony do binarnego wektora pcib200 w jego pojedyncze miejsce Xbal, które leży między sekwencjami granicznymi T-DNA. Otrzymany w rezultacie plazmid, oznaczony jako pcib200 protoks jest transformowany do szczepu A. tumefaciens CIB542. Patrz np. Uknes et al., Plant Celi 5: (1993). Dyski liściowe Nicotiana tabacum cv. Xanthi-nc są infekowane A. tumefaciens CIB542, niosącym pcib2001gpd, tak, jak opisano whorsch et al, Science 227:1229 (1985). Pędy oporne na kanamycynę z 15 niezależnych dysków liściowych przeniesiono do pożywki do ukorzeniania, a następnie przesadzano do gleby i uzyskane w rezultacie rośliny hodowano w szklarni do osiągnięcia dojrzałości. Nasiona z tych roślin zbierano i pozostawiano do skiełkowania na agarze MS zawierającym kanamycynę. Wiele indywidualnych kiełków opornych na kanamycynę z każdego niezależnego pierwotnego transformanta hodowano do dojrzałości w szklarni, a ich nasiona zbierano. Nasiona te kiełkowały na pożywce agarowej MS zawierającej kanamycynę. Linie roślinne, które dawały wyłącznie kiełki oporne na kanamycynę są homozygotyczne dla wstawionego genu i są poddane dalszej analizie. Dyski liściowe z 15 niezależnych linii transgenicznych są wycinane z krążkiem papieru i umieszczane na agarze MS zawierającym różne wzrastające stężenia herbicydu hamującego protoks. Po trzech tygodniach dwa zestawy po 10 dysków z każdej linii ważono i wyniki rejestrowano. Linie transgeniczne bardziej oporne na inhibitor niż nie transformowane rośliny dzikiego typu wybierano do dalszej analizy. Z liści z każdej z tych linii izoluje się RNA. Totalny RNA z każdej niezależnej linii homozygotycznej i z nietransgenicznych roślin kontrolnych rozdziela się poprzez elektroforezę w żelu agarozowym w obecności formaldehydu (Ausubel et al., Current tocols w Molecular Biology, Wiley & Sons, New York (1987)). Przeprowadza się transfer z żelu na filtr (Ausubel et al., supra.) i hybrydyzuje się z wyznakowanym radioaktywnie cdna protoks z Arabidopsis. Hybrydyzacja i warunki płukania są takie, jak opisane przez Church and Gilbert, c. Natl. Acad. Sci. USA 81: (1984). Filtr jest poddawany autoradiografii; intensywne pasma RNA odpowiadające transgenowi protoks wykrywa się we wszystkich liniach roślin transgenicznych tolerujących herbicyd. W celu dalszej oceny oporności linii nadprodukującej protoks, rośliny są hodowane w szklarni i poddane działaniu różnych stężeń herbicydu hamującego protoks. Przykład 10: Wzrost komórek tytoniu w kulturze zawiesinowej. Pożywki: MX1: Pożywka ta składa się z roztworu soli podstawowych Murashige i Skoog ( MS, T. Murashige et al., Physiol. Plant. 15: ,1962), soli dodatkowych i Fe-EDTA (Gibco # ; 4,3 g/l), 100 mg/l mioinositolu, 1 mg/l kwasu nikotynowego, 1 mg/l pirydoksyny-hcl,

33 mg/l tiaminy-hcl, 2-3 g/l sacharozy, 0,4 mg/l kwasu 2,4-dichlorofenoksyoctowego oraz 0,04 mg/l kinetyny, ph 5,8. Pożywkę sterylizuje się poprzez autoklawowanie. N6: Pożywka to zawiera makroelementy, mikroelementy oraz Fe-EDTA jak opisano przez C-C. Chu et al., Scientia Sinica (1975) i następujące związki organiczne : pirydoksynę- HC1 (0,5 mg/l), tiaminę-hcl (0,1 mg/l), kwas nikotynowy (0,5 mg/l), glicynę (2,0 mg/l) oraz sacharozę (30,0 g/l). Roztwór jest autoklawowany. Końcowe ph wynosi 5,6. Uwagi: Makroelementy są przygotowywane jako 10x stężony roztwór wyjściowy, a mikroelementy jako 1000x stężony roztwór wyjściowy. Roztwór wyjściowy witamin jest normalnie sporządzany jako 100x stężony. Zawiesinę komórek Nicotiana tabacum, linii S3 (Harms and DiMaio, J. Plant Physiol 137, ,1991) hoduje się w płynnej pożywce hodowlanej MX ml kolby Erlenmeyera zawierające 25 ml pożywki MX1 zaszczepia się 10 ml kultury komórek hodowanych uprzednio przez 7 dni. Komórki inkubuje się w 25 C w ciemności w wytrząsarce orbitalnej przy 100 rpm (skok 2 cm). Komórki hoduje się dalej, co 7 dni przeszczepiając próbkę do świeżej pożywki, poprzez zlanie lub odpipetowanie 90% zawiesiny komórek, a następnie uzupełnienie świeżej pożywki, tak aby uzyskać żądaną objętość zawiesiny. 5-8 gramów świeżej masy komórkowej wytwarza się w ciągu 10 dni hodowli z inokulum mg komórek. Przykład 11: Wytwarzanie kultur komórek tytoniu tolerujących herbicydyinhibitory protoks poprzez wysiew komórek na zestaloną pożywkę selekcyjną. Komórki są wstępnie hodowane tak, jak w przykładzie 10. Komórki zbiera się poprzez umożliwienie im sedymentacji lub poprzez krótkie wirowanie przy 500 x g, a pożywkę odrzuca się. Komórki rozcieńcza się następnie w świeżą pożywką hodowlaną celem uzyskania gęstości komórek odpowiedniej do wysiewu komórek, czyli około jednostek tworzących kolonie na ml. W celu wysiania, komórki w małej objętości pożywki (około lm l) rozprowadza się równo na powierzchni zestalonej pożywki hodowlanej (MXI, 0,8% agar), zawierającej żądane stężenie inhibitora. Stosowano około ml pożywki na płytkę Petriego o średnicy 10 cm. Odpowiednie stężenie inhibitora określa się z krzywej odpowiedzi na dawkę (przykład 14) i jest ono co najmniej dwukrotnie wyższe niż IC50 komórek wrażliwych typu dzikiego. Płytki hodowlane zawierające komórki wysiane na pożywkę selekcyjną inkubuje się w normalnych warunkach wzrostu w C w ciemności aż do utworzenia kolonii komórek. Pojawiające się kolonie komórek są przenoszone do świeżej pożywki zawierającej inhibitor o pożądanym stężeniu. W korzystnej modyfikacji opisanej metody, hodowana wstępnie kultura zawiesinowa komórek jest najpierw wysiewana w małej ilości pożywki hodowlanej na powierzchnię zestalonego agaru. Dodaje się równą ilość ciepłej płynnej pożywki agarowej (1,2-1,6% agaru), trzymanego w formie upłynnionej w temp. około 40 C, i płytkę natychmiast przechyla się łagodnie, równo rozprowadzając komórki na powierzchni pożywki i mieszając komórki z pożywką agarową, zanim pożywka się zestali. Alternatywnie, komórki miesza się z roztopioną pożywką agarową przed wysianiem na powierzchnię pożywki selekcyjnej. Sposób ten ma tą zaletę, że komórki są zagłębione i unieruchamiane w cienkiej warstwie zestalonej pożywki, na powierzchni pożywki selekcyjnej. Pozwala to na lepsze napowietrzanie komórek w porównaniu z komórkami zagłębionymi w całkowitej objętości ml. Przykład 12: Wytwarzanie kultur komórek tytoniu tolerujących herbicyd-inhibitor protoks poprzez hodowanie komórek w płynnej pożywce selekcyjnej. Komórki hodowane tak, jak w przykładzie 10 są dodawane przy odpowiedniej gęstości kultury jako inokulum do pożywki płynnej MX1, zawierającej pożądane stężenie herbicyduinhibitora protoks. Komórki inkubuje się i hoduje tak, jak w przykładzie 10. Komórki są pasażowane po upływie 7-10 dni, z uwzględnieniem tempa wzrostu, przy zastosowaniu świeżej pożywki zawierającej pożądane stężenie inhibitora. W zależności od zastosowanego stężenia inhibitora, wzrost komórek może być wolniejszy niż w przypadku braku inhibitora.

34 Przykład 13: Wytwarzanie komórek tytoniu o podwyższonym poziomie enzymu protoks. Celem otrzymania kultury komórek lub kalusa o podwyższonym poziomie enzymu protoks, kultury płynne lub kalus przenoszone są sukcesywnie, do wzrastających skokowo stężeń herbicydu-inhibitora protoks. W szczególności przeprowadzone są następujące etapy: W celu otrzymania kultury zawiesinowej, kolonie komórek, pojawiające się ponad wysianymi komórkami z przykładu 11, są przenoszone do płynnej pożywki MX1 zawierającej takie same stężenie inhibitora protoks, jak stosowane przy selekcji według przykładu 11. Alternatywnie, wybrane zawiesinowe kultury komórkowe z przykładu 12 są dalej kodowane w pożywce płynnej MX1 zawierającej takie same stężenie inhibitora protoks, jak stosowane przy selekcji według przykładu 12. Kultury sąpasażowane 1-20 razy w odstępach tygodniowych, a następnie przeniesione do pożywki MX1, zawierającej kolejne wyższe stężenie herbicydu. Komórki są następnie hodowane przez 1-10 pasaży w pożywce zawierającej to wyższe stężenie herbicydu. Komórki przenosi się następnie do pożywki Mxl zawierającej kolejne wyższe stężenie herbicydu. Alternatywnie, kawałki wybranego kalusa z przykładu 11 przenosi się do zestalonej pożywki MX1, uzupełnionej pożądanym stężeniem herbicydu. Przeniesienie do wyższych stężeń herbicydu odbywa się według procedury omówionej w poprzednim paragrafie, z tym wyjątkiem, że stosowana jest zestalona pożywka. Przykład 14: Pomiar wzrostu komórek w kulturach zawiesinowych, zależnego od dawki herbicydu. W celu otrzymania krzywej odpowiedzi na dawkę oznaczono wzrost komórek przy różnych stężeniach herbicydu. Zawiesinową kulturę komórek S3 tytoniu typu dzikiego, wrażliwych na herbicyd-inhibitor protoks oraz wyselekcjonowanych lub transgenicznych komórek S3, tolerujących herbicyd hoduje się wstępnie na pożywce płynnej, tak jak w przykładzie 11, przy dużej gęstości, przez 2-4 dni. Komórki są przemywane, resztki pożywki odrzucane i dodawana jest świeża pożywka bez herbicydu do uzyskania pożądanej gęstości komórek (około 150 mg FW komórek na ml zawiesiny). Próbkami po 2,5 ml zawiesiny komórek, zawierającymi około mg FW komórek, zaszczepiano następnie około 30 ml pożywki płynnej o żądanym stężeniu herbicydu, zawartej w 100 ml kolbie Erlenmeyera. Dbano, aby każdą kolbę zaszczepić taką sama ilością komórek. Każda kolba zawierała taką samą objętość pożywki. Dla jednego stężenia herbicydu szczepiono 3-6 powtórzonych kolb. Dobrano stężenia herbicydu od zera (=kontrola), 0,1 ppb, 0,3 ppb, 1 ppb, 3 ppb, 10 ppb, 30 ppb, 100 ppb, 300 ppb, 1000 ppb, 3000 ppb, i ppb. W momencie zakładania hodowli pobierano również kilka próbek komórek stanowiących inokulum dla określenia masy komórkowej użytej jako inokulum na kolbę. Komórki inkubuje się następnie w kontrolowanych warunkach w 28 C w ciemności przez 10 dni. Komórki są zbierane poprzez wylanie zawartości każdej kolby na krążki bibuły filtracyjnej, połączonej z próżniowym urządzeniem ssącym, celem usunięcia całego płynu i otrzymania masy stosunkowo suchych świeżych komórek. Świeża masa jest następnie ważona. Sucha masa próbek może być otrzymana po wysuszeniu. Wzrost komórek jest określany i wyrażany jako komórki uzyskane wciągu 10 dni i przedstawiany w procentach względem komórek rosnących w nieobecności herbicydu, zgodnie ze wzorem: (końcowa masa komórek rosnących w obecności herbicydu minus masa x 100 podzielona przez końcową masę komórek rosnących bez herbicydu minus masa inokulum). Wartości IC50 są określone na podstawie wykresów lub płotów (względna masa komórek wobec stężenia herbicydu) oznacza stężenie herbicydu, przy którym wzrost komórek stanowi 50% wzrostu kontrolnego (komórki rosnące w nieobecności herbicydu). W modyfikacji metody, kilka kawałków kalusa pochodzącego z kultury komórek opornych na herbicyd, takich jak otrzymane w przykładach 11 i 13, przenosi się na zestaloną pożywkę do hodowli kalusa, zawierającą różne stężenia herbicydu. Względny wzrost określa się po okresie hodowli przez 2-6 tygodni poprzez ważenie kawałków kalusa i porównanie z kontrolną kulturą hodowaną na pożywce bez herbicydu. Jednakże metoda zawiesinowa jest korzystniejsza ze względu na większą dokładność.

35 Przykład 15: Określenie tolerancji krzyżowej Celem określenia stopnia w jakim komórki wykazują tolerancję wobec analogicznych lub innych herbicydów, przykład 14 jest powtarzany poprzez hodowanie komórek przy wzrastających stężeniach wybranych herbicydów. Dla porównania, dla każdego herbicydu określony jest względny wzrost komórek i ich wartość IC50. Przykład 16: Określenie stabilności fenotypu tolerancji na herbicyd w czasie. W celu określenia, czy fenotyp tolerancji na herbicyd kultury komórkowej jest utrzymywany w czasie, komórki przenosi się z pożywki zawierającej herbicyd do pożywki bez herbicydu. Komórki hoduje się tak, jak opisano w przykładzie 10, w nieobecności herbicydu przez okres 3 miesięcy, stosując regularne pasażowanie w odpowiednich odstępach czasu (7-10 dni dla kultur zawiesinowych; 3-6 tygodni dla kultury kalusowej). Znane ilości komórek przenosi się następnie z powrotem do pożywki zawierającej herbicyd i hoduje się przez 10 dni (hodowla zawiesinowa) lub 4 tygodnie (hodowla kalusowa). Względny wzrost określa się tak, jak w przykładzie 14. Przykład 17: Indukcja i hodowla embrioidalnego kalusa z tkanki tarczki kukurydzy. Kłosy są zbierane z samozapylonych roślin kukurydzy w osobnej linii Funk dni po zapyleniu. Łuski są usuwane i kłosy sterylizowane przez około 15 minut poprzez wytrząsanie w 20% roztworze handlowo dostępnego wybielacza Chlorox z kilkoma kroplami detergentu dodanego dla lepszego zwilżania. Kłosy płucze się następnie kilka razy sterylną wodą. Kolejne etapy przeprowadza się aseptycznie pod sterylnym wyciągiem. Zarodki o długości 1,5-2,5 mm usuwa się z ziaren szpatułką i umieszcza się, osią zarodkową skierowaną w dół, na pożywce hodowlanej MS zawierającej 2 mg/l kwasu 2,4-dichlorofenoksyoctowego (2,4-D) i 3% sacharozę, utwardzonej 0,24% Gelritem. Embrioidalny kalus tworzy się w tkance tarczki zarodków w ciągu 2-4 tygodni hodowli w 28 C w ciemności. Kalus usuwa się z eksplantu i przenosi do świeżej zestalonej pożywki MS, zawierającej 2 mg/l 2,4-D. Pasażowanie embrioidalnego kalusa powtarza się co tydzień. Przeszczepia się jedynie części kalusa mające morfologię zarodkową. Przykład 18: Selekcja kultur komórek kukurydzy tolerujących herbicydy inhibitory protoks a) Selekcja przy zastosowaniu embrioidalnego kalusa : embrioidalny kalus z przykładu 17 jest przenoszony do pożywki utrzymującej kalus, składającej się z pożywki N6, zawierającej 2 mg/l 2,4-D, 3 % sacharozę i inhibitor protoks w stężeniu wystarczającym dla opóźnienia wzrostu, ale który nie wpływa na stan zarodkowy kultury, zestalonej przy użyciu 0,24% GelrituR. Dla zwiększenia częstości mutacji tolerujących herbicyd, kultury mogą być przed selekcją wstępnie traktowane mutageniem chemicznym, np. sulfonianem etylometanu lub mutagenem fizycznym, np. światłem UV, w stężeniach tuż poniżej stężenia, przy którym wykrywane jest hamowanie wzrostu, tak jak się to określa w przykładzie 14. Kultury są hodowane w ciemności w 28 C. Po 14 dniach rosnący kalus jest przenoszony do świeżej pożywki o tym samym składzie. Dalszej hodowli poddaje się jedynie kultury o pożądanej zarodkowej morfologii, znanej jako luźny kalus embrioidalny o morfologii typu II. Kultury namnaża się poprzez 2-10 krotne pasażowamie kultury w odstępach tygodniowych do świeżej pożywki, dzięki czemu przeszczepiane są jedynie najszybciej rosnące kultury. Szybko rosnące kalusy są następnie przenoszone do pożywki utrzymującej kalus, zawierającej herbicyd hamujący protoks w odpowiednim stężeniu, jak określono w przykładzie 11. Jeżeli kalus rośnie dobrze na takim stężeniu herbicydu, zwykle po około pięciu do dziesięciu co tygodniowych pasażach, kalus przenosi do pożywki utrzymującej kalus, zawierającej trzykrotnie wyższe stężenie inhibitora, i hoduje ponownie, dopóki nie otrzyma się dobrze rosnącej kultury. ces ten jest powtarzany przy użyciu pożywki zawierającej inhibitor protoks w stężeniu dziesięciokrotnie wyższym niż odpowiednie stężenie wyjściowe, a następnie pożywki zawierającej 20-krotnie i 40-krotnie wyższe stężenia. Po wytworzeniu odpowiedniego kalusa jest on przenoszony do pożywki regeneracyjnej, odpowiedniej dla dojrzewania zarodka i regeneracji rośliny. Embrioidalny kalus, rosnący na każdym z zastosowanych stężeń herbicydu, jest przenoszony do pożywki regeneracyjnej. b) Selekcja przy zastosowaniu embrioidalnych kultur zawiesinowych: Embrioidalne kultury zawiesinowe w osobnej linii 2717 kukurydzy Funk są przygotowane według przykładu 24

36 i utrzymywane poprzez kolejne pasażowanie w odstępach tygodniowych do świeżej pożywki N6, zawierającej 2 mg/12,4-d. Dla zwiększenia częstości mutacji tolerujących herbicyd, kultury mogą być w tym czasie traktowane mutagenem chemicznym, np. sulfonianem etylometanu w stężeniu tuż poniżej stężenia, przy którym wykrywane jest hamowanie wzrostu, tak jak się to określa się w przykładzie 14. W celu selekcji, kultury przenosi się do płynnej pożywki N6 zawierającej 2 mg/l 2,4-D i stężenie inhibitora wystarczające do opóźnienia wzrostu, ale nie wpływające na stan embrioidalny kultury. Kultury hoduje się na wytrząsarce przy 120 rpm w 28 C w ciemności. W odstępach tygodniowych pożywkę usuwa się i dodaje świeżej pożywki. Kultury rozcieńcza się pożywką hodowlaną, biorąc pod uwagę ich tempo wzrostu, celem otrzymania około 10 ml upakowanych komórek z 50 ml pożywki. W każdym z kolejnych pasaży, kultury są badane i jedynie szybko rosnące kultury o pożądanej kruchej embrioidalnej morfologii są zachowywane do dalszych pasaży. Po dwóch do dziesięciu pasażach w pożywce N6 zawierającej... tempo wzrostu kultury zwiększa się co najmniej dwu - trzykrotnie na tygodniowy pasaż. Kultury przenosi się następnie do płynnej pożywki N6, zawierającej 2 mg/l 2,4-D i trzykrotnie wyższą dawkę inhibitora, niż stosowana oryginalnie. Rosnące kultury są pasażowane w tej pożywce dwa do dziesięciu razy tak, jak opisano powyżej. Szybko rosnące kultury o pożądanej luźnej, embrioidalnej morfologii wybiera się do dalszych pasaży. Szybko rosnące kultury przenosi się następnie do pożywki N6, zawierającej 2 mg/l 2,4-D i dziesięciokrotnie wyższą dawkę inhibitora, niż oryginalnie stosowana, i proces pasażowania rosnących kultur o pożądanej luźnej embrioidalnej morfologii jest powtarzany dwa do dziesięciu razy, aż do otrzymania szybko rosnących kultur. Kultury przenosi się następnie do pożywki N6, zawierającej 2 mg/l 2,4-D i 30-krotnie wyższą dawkę inhibitora, niż stosowana oryginalnie. Dla wytworzenia embrioidalnego kalusa, w celu regeneracji roślin, kultury przenosi się najpierw z każdej zarodkowej kultury płynnej, wybranej dla wspomnianego poziomu stężenia herbicydu, na podłoże N6 zestalone 0,24% Geiriterr* i zawierające 2 mg/l 2,4-D oraz, ewentualnie stężenie inhibitora, przy którym hodowle rosły. Embrioidalny kalus przeszczepia się na świeżą pożywkę utrzymującą kalus, aż do uzyskania odpowiedniej ilości kalusa do regeneracji. Pasażuje się jedynie kultury o pożądanej zarodkowej morfologii. Przykład 19: Regeneracja roślin kukurydzy z wybranego kalusa lub kultury zawiesinowej. Rośliny regeneruje się z wybranych kultur embrioidalnego kalusa z przykładu 13 poprzez przeniesienie do świeżej pożywki regeneracyjnej. Stosowanymi pożywkami regeneracyjnymi są: pożywka ON6 zakładająca się z pożywki N6 bez 2,4-D, lub N61 składająca się z pożywki N6 zawierającej 0,25 mg/l 2,4-D i 10 mg/l kinetyny (6-furfuryloaminopuryny) lub N62 składającej się z pożywki N6 zawierającej 0,1 mg/l 2,4-D i 1 mg/l kinetyny, wszystkich zestalonych przy użyciu 0,24% GeirituR. Kultury hoduje się w 28 C na świetle (16 godz. na dzień meinsteinów/m2sek z białych lamp fluorescencyjnych). Kultury pasażuje się co dwa tygodnie na świeżą pożywkę. Rośliny rozwijają się w ciągu 3 do 8 tygodni. Rośliny o wysokości co najmniej 2 cm usuwa się z przyległego kalusa i przenosi do pożywki uko-rzeniającej. Stosuje się różne pożywki ukorzeniające. Pożywka składa się z pożywki N6 lub MS bez witamin, bądź ze zwykłą ilością soli, bądź z solami zmniejszonymi do połowy, sacharozą zmniejszoną do 1 g/l, a dalej, bądź bez związków regulujących wzrost, bądź zawierającej 0,1 mg/l kwasu a-naftalenooctowego. Kiedy tylko korzenie dostatecznie się rozwiną roślinki są prze-sadzane do mieszanki doniczkowej składającej się z wermikulitu, torfowca i ziemi ogrodniczej. W czasie przesadzania wszystkie pozostałe części kalusa są odcinane, cały agar odpłukany i liście przycinane do połowy. Roślinki hoduje się w szklarni początkowo przez kilka dni przykryte odwróconym przezroczystym plastikowym kubkiem w celu utrzymania wilgotności, po czym hodowla jest zacieniana. Po aklimatyzacji rośliny są przesadzane i hodowane do osiągnięcia dojrzałości. Dla zapewnienia prawidłowego rozwoju roślin stosuje się nawóz Peters (Grace Sierra). Po zakwitnięciu, rośliny są zapylane, najkorzystniej samozapylane. Przykład 20: Konstrukcja wektorów do transformacji roślin. Dostępnych jest wiele wektorów do transformacji roślin, a geny według wynalazku mogą być stosowane w połączeniu z dowolnym z takich wektorów. Wybór wektora, który ma być zastosowany będzie zależał od korzystnej techniki transformacji i gatunku stanowiącego cel

37 transformacji. Dla niektórych gatunków docelowych, może być korzystny odmienny antybiotykowy lub herbicydowy marker do selekcji. Markery selekcyjne stosowane rutynowo przy transformacji obejmują gen nptii, który wywołuje oporność na kanamycynę i pokrewne antybiotyki (Messing & Vierra, Gene 19: (1982); Bevan et al., Naturę 304: (1983)), gen bar, który wywołuje oporność na herbicyd fosfmotrycynę (White et al., Nuci. Acids Res 18:1062 (1990), Spencer et al. Theor Appl Genet 79: (1990)), gen hph, który wywołuje oporność na antybiotyk higromycynę (Blochinger & Diggelmann, Mol Celi Biol 4: ) oraz gen dhfr, który wywołuje oporność na metotreksat (Bourouis et al., EMBO J. 2(7): (1983)). (1) Konstrukcja wektorów odpowiednich do transformacji z użyciem Agrobacterium Dostępnych jest wiele wektorów do transformacji przy zastosowaniu Agrobacterium tumefaciens. Przenoszą one co najmniej jedną skrajną sekwencję T-DNA i obejmują takie wektory, jak pbin19 (Bevan, Nuci. Acids Res. (1984)). Poniżej opisana jest konstrukcja dwóch typowych wektorów. Konstrukcja pcib200 i pcib2001 Binarne wektory pcib200 i pcib2001 są użyte do konstrukcji zrekombinowanych wektorów celem zastosowania z Agrobacterium i zostały skonstruowane w następujący sposób. ptjs75kan został utworzony poprzez trawienie Narl plazmidu ptjs75 (Schmidhauser & Helinski, J Bacteriol.164: (1985)), co umożliwiło wycięcie genu oporności na tetracyklinę, a następnie wstawienie fragmentu AccI zpuc4k niosącego NPTII (Messing & Vierra, Gene 19: (1982); Bevan et al., Naturę 304: (1983); McBride et al., Plant Molecular Biology 14: (1990)). Adaptery XhoI zostały dołączone w wyniku ligacji do fragmentu EcoRV plazmidu pcib7, który zawiera lewy i oprawy brzeg T-DNA, roślinny marker selekcyjny-chimerowy gen nos/nptii i polilinker zpuc (Rothstein et al., Gene 53: (1987)), po czym fragment strawiony XhoI został sklonowany w plazmidzie ptjs75kan, strawionym Sali, z utworzeniem pcib200 (patrz również EP O , przykład 19 [1338]). pcib200 zawiera następujące miejsca restrykcyjne w polilinkerze: EcoRI, Sstl, KpnI, BgIII, XbaI i Sali. pci82001 jest pochodną pcib200, która jest utworzona poprzez wstawienie do polilinkera dodatkowych miejsc restrykcyjnych. Pojedynczymi miejscami w polilinkerze pcib2001 są: EcoRI, SstI, KpnI, BgIII, XbaI, SaII, MIuI, BcII, AvrII, ApaI, HpaI i StuI. pcib2001, oprócz tego, że zawiera te unikalne miejsca restrykcyjne, ma również roślinny i bakteryjny marker selekcyjny-kanamycynę, lewy i prawy brzeg T-DNA do transformacji za pośrednictwem Agrobacterium, pochodzącą od RK2 fu nkcję trfa do przekazywania pomiędzy E.coli i innymi gospodarzami oraz funkcje OriT i OriV, również z RK2. Polilinker pcib2001 nadaje się do klonowania roślinnych kaset ekspresyjnych zawierających swoje własne sygnały regulacyjne. Konstrukcja pciblo i selekcja jego pochodnych na higromycynie Binarny wektor pciblo zawiera gen kodujący oporność na kanamycynę do selekcji w roślinach, lewą i prawą sekwencję skrajną T-DNA i włączone sekwencje z plazmidu prk252 o szerokim zakresie gospodarzy, umożliwiające jego replikację zarówno w E. coli, jak i Agrobacterium. Jego konstrukcja jest opisana przez Rothstein et al., Gene 53: (1987). Skonstruowano różne pochodne pcibio, w których dołączony jest gen dla fosfotransferazy higromycyny B, opisany przez Gritz et al., Gene 25: (1983)). Pochodne te umożliwiają selekcję transgenicznych roślin jedynie na higromycynie (pcib743) lub higromycynie i kanamycynie (pcib715, pcib717) [Rothstein et al., Gene 53: (1987)]. (2) Konstrukcja wektorów odpowiednich do transformacji nie poprzez Agrobacterium. Transformacja bez u życia Agrobacterium tumefaciens omija wymaganie sekwencji T- DNA w wybranym wektorze do transformacji i w konsekwencji wektory, które nie mają tych sekwencji mogą być stosowane obok wektorów, takich jak opisane powyżej, które zawierają sekwencje T-DNA. Techniki transformacji, które nie są zależne od Agrobacterium, obejmują transformację poprzez bombardowanie cząstkami, pobieranie przez protoplasty (np. PEG lub elektroporacja) i mikroiniekcja. Wybór wektora zależy w dużej mierze od korzystnej selekcji dla gatunku, który jest transformowany. Poniżej jest opisana konstrukcja niektórych typowych wektorów.

38 Konstrukcja pcib3064 pceb3064 jest wektorem pochodnym puc, nadającym się do stosowania technik bezpośredniego przeniesienia genu w kombinacji z selekcją przy użyciu herbicydu basta (lub fosfinorticyny). Plazmid pcib246 zawiera promotor 35S z CaMV funkcjonalnie połączony z genem GUS z E. coli i terminatorem transkrypcji 35S z CaMV i jest opisany w opublikowanym zgłoszeniu PCT WO 93/ motor 35S tego wektora zawiera dwie sekwencje ATG położone 5' od miejsca startu. Miejsca te zostały zmutowane przy zastosowaniu standardowych technik PCR w taki sposób, aby usunąć miejsca ATG i utworzyć miejsce restrykcyjne SspI i Pvul. Te nowe miejsca restrykcyjne znajdowały się 96 i 37 bp od pojedynczego miejsca SaII oraz 101 i 42 bp od miejsca startu. Uzyskana pochodna pcib246 została nazwana pcib3025. Gen GUS został następnie wycięty zpcib3025 poprzez trawienie SaII and SacI, końce przekształcone w tępe i ponownie ligowane, z wytworzeniem pcib3060. Plazmid pjit82 został otrzymany z John Innes Centre, Norwich i fragment Smal o długości 400 bp, zawierający gen bar ze Streptomyces viridochromogenes, został wycięty i wstawiony w miejsce Hpal plazmidu pcib3060 (Thompson et al. EMBO J 6: (1987)). Powstał w ten sposób plazmid pcib3064, który zawiera gen bar pod kontrolą promotora i terminatora 35S z CaMV, do selekcji na herbicyd, gen fro oporności na ampicylinę (do selekcji w E. coli) oraz polilinker z pojedynczymi miejscami cięcia SphI, Pstl, HindIII i BamHI. Wektor ten jest odpowiedni do klonowania roślinnych kaset ekspresyjnych zawierających swoje własne sygnały regulacyjne. Konstrukcja plazmidów psog19 i psog35 psog35 jest wektorem do transformacji, który wykorzystuje gen dla reduktazy dihydrofolanu (DHFR) z E coli jako marker selekcyjny przenoszący oporność na metotreksat. Reakcja PCR była zastosowana do powielenia promotora 35S (-800 bp), intronu 6 z genu Adhl kukurydzy (-550 bp) [Lou et al, Plant J 3: ,1993; Dennis et al, Nuci Acids Res 12: ,1984j oraz sekwencji nie podlegającego translacji lidera GUS o długości 18bp z plazmidu psogio. Fragment 250 bp kodujący reduktazę dihydrofolanu typu II z E. coli był również powielany poprzez PCR i te dwa fragmenty PCR były łączone z fragmentem SacI-Pstl z pb1221 (Clontech), który zawierał szkielet wektora puc19 i terminator syntazy nopaliny. W wyniku połączenia tych fragmentów powstał plazmid psog19, który zawiera promotor 35S przyłączony do sekwencji intronu 6 lidera GUS, genu DHFR i terminatora syntazy nopaliny. Poprzez zamianę lidera GUS w psog19 na sekwencję liderową z wirusa Maize Chlorotic Mottie Virus (MCMV) powstał wektor psog35. Plazmidy psog19 i psog35 przenoszą gen oporności na ampicylinę z puc i mają miejsca HindIII, SphI, PstI i EcoRI do klonowania obcych sekwencji. psog 10 Ten wektor ekspresyjny z P-glukuronidazą (GUS) pochodził od plazmidu pb1121, otrzymanego z Clonetech Laboratories; Palo Alto, California. Intron 6 z genu Adhl kukurydzy został powielony poprzez PCR z plazmidu pb428, opisanego w Bennetzen et al., c. Natl. Acad. Sci, USA 81: (1987), stosując startery oligonukleotydowe SON0003 i SON0004. SON0003:5 -CTCGGATCCAGCAGATTCGGTACAG-3' SON0004: 5'-ACGGGATCCAACTTCCTAGCTGAATGGG-3' dukt reakcji PCR był trawiony endonukleazą restrykcyjną BamHI, przecinając miejsce BamHI, dodane na końcu 5' każdego ze starterów. Uzyskany w rezultacie fragment DNA był oczyszczany w żelu agarorozowym i włączany w wyniku ligacji w miejsce BamHI plazmidu pbl 121, które znajduje się pomiędzy promotorem 35S z CaMV i genem GUS. Połączony w wyniku ligacji DNA był transformowany do E. coli i klony z intronem 6 Adhl w tej samej orientacji, co gen GUS, były identyfikowane poprzez trawienie enzymami restrykcyjnymi. psog 19 Ten wektor ekspresyjny z reduktazą dihydrofolianu (DHFR) powstał poprzez połączenie promotora 35S i intronu 6 Adhl z plazmidu psogi 0 do genu DHFR z plazmidu plazmid phco, opisanego w Bourouis i Jarry, EMBO J. 2: (1983). motor 35S i intron 6

39 Adhl wytworzono poprzez powielenie w reakcji PCR fragmentu z psogi 0, stosując startery SON0031 i SON0010. SON0031: 5 -CATGAGGGACTGACCACCCGGGGATC-3' S0 N001O: 5' - AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3' Otrzymany w rezultacie fragment był trawiony Pstl i BspHI i oczyszczony w żelu agarozowym. Region kodujący DHFR został wytworzony poprzez powielenie w reakcji PCR z phco przy zastosowaniu starterów SON0016 i SON0017. SONOO 16:5 '-GCTACCATGGCCACATAGAACACC-3' S0 N0017: 5'-CGAGAGCTCGCACTTCAACCTTG-3' Otrzymany w rezultacie fragment był trawiony Ncol i SacI i oczyszczony w żelu agarozowym. Dwa fragmenty opisane powyżej zostały połączone w wyniku ligacji z fragmentem wektora, otrzymanym zpb1121, poprzez trawienie nukleazami restrykcyjnymi PstI i SacI i oczyszczenie fragmentu o wielkości 3 kb zawierającego region terminatora N i region puc19 z pb1121 w żelu agarozowym. W wyniku takiej trójetapowej ligacji nastąpiło połączenie: promotor 35S-intron 6 Adhl-gen DHFR- terminator Nos we właściwym porządku i orientacji dla funkcjonalnej ekspresji w roślinach. psog 30 Wektor ekspresyjny GUS powstał z psog 10 poprzez wstawienie lidera z wirusa Maize Chlorotic Mottie Virus (MCMV), opisanego w Lommel et al., Virology 181: (1991), do nie ulegającego translacji lidera genu 35S-GUS w trzyetapowej ligacji. Obie nici sekwencji lidera białka kapsydu MCMV o długości 17 bp plus odpowiednie miejsca dla enzymów restrykcyjnych zostały zsyntetyzowane i połączone. Otrzymany dwumciowy fragment był trawiony BamHI i NcoI i oczyszczony w żelu akryloamidowym. Region kodujący genu GUS został powielony poprzez PCR przy użyciu starterów: SON0039 i SON0041 oraz pbl 121 jako matrycy. SON0039:5 -CGACATGGT ACGTCCTGTAGCCCACA-3' SON0041: 5 -ATCGCACCGGCAACAGGATTC-3' Startery te dodały miejsce Ncol na końcu 5' GUS i miejsce Sad na końcu 3' GUS. Uzyskany w rezultacie fragment był trawiony endonukleazami Ncol i SacI i oczyszczony w żelu agarozowym. Gen GUS został usunięty z plazmidu psog 10 poprzez trawienie endonukleazą restrykcyjną SacI i częściowe trawienie endonukleazą restrykcyjną BamHI. Uzyskany w rezultacie wektor, który ma miejsce BamHI i miejsce SacI do ponownego wstawienia regionu kodującego za promotorem 35S-intronem 6Adh1, był oczyszczony w żelu agarozowym. Trzy fragmenty opisane powyżej były łączone w wyniku trójetapowej ligacji z wytworzeniem fiizji genowej o strukturze: promotor 35S-intron 6 Adhl-lider MCMV-GUS-terminator Nos, wszystko w szkielecie wektora puc19. psog 35 Wektor z markerem selekcyjnym DHFR jest identyczny, jak psogi9 z tą różnicą, że lider MCMV jest wstawiony do nie podlegającego translacji lidera genu DHFR dla zwiększenia translacji. Został on utworzony w dwóch etapach. Najpierw region kodujący GUS w psog32, wektorze identycznym jak psog30 z tą różnicą że zawiera zmodyfikowany promotor Adh zamiast 35S, został zastąpiony regionem kodującym DHFR z psogi9 poprzez wycięcie GUS przez Ncol i SacI i włączenie w wyniku ligacji do DHFR jako fragment Ncol- SacI Uzyskano w rezultacie wektor psog33, który ma następującą strukturą: promotor Adhintron 6Adhl-lider MCMV-region kodujący DHFR-terminator Nos, z miejscem BgUI pomiędzy promotorem i intronem oraz miejscem Sad pomiędzy regionem kodującym i terminatorem. Fragment BgHI-SacI został wyizolowany poprzez trawienie enzymami restrykcyjnymi i oczyszczenie w żelu agarozowym i włączony w wyniku ligacji w miejsca BamHI i SacI psog30, zastępując intron 6 Adh1-lider MCMV-region kodujący GUS zpsogso przez intron 6 Adh1-lider MCMV-region kodujący DHFR zpsog33.

40 Przykład 21: Konstrukcja roślinnych kaset ekspresyjnych Sekwencje genów, które mają podlegać ekspresji w transgenicznych roślinach, są najpierw wstawione do kaset ekspresyjnych za odpowiednim promotorem i przed odpowiednim terminatorem transkrypcji. Takie kasety ekspresyjne mogą być następnie łatwo przenoszone do wektorów do transformacji roślin, opisanych powyżej w przykładzie 19. Wybór promotora Wybór promotora stosowanego w kasetach ekspresyjnych będzie określał przestrzenny i czasowy wzór ekspresji transgenu w roślinach transgenicznych. Wybrane promotory będą kierować ekspresją transgenów w specyficznych typach komórek (takich jak komórki epidermalne liścia, komórki mezofilu, komórki skóry korzenia) lub w specyficznych tkankach czy organach (na przykład korzeniach, liściach lub kwiatach) i ten wybór będzie odzwierciedlać pożądaną lokalizację ekspresji w transgenie. Alternatywnie, wybrany promotor może kierować ekspresją genu pod promotorem indukowanym przez światło lub promotorem regulowanym czasowo w inny sposób. Dalszą alternatywę stanowi regulacja chemiczna wybranego promotora. Dostarcza to możliwości indukowania ekspresji transgenu jedynie wtedy, gdy to jest pożądane, poprzez działanie induktora chemicznego. Terminatory transkrypcji Dostępnych jest wiele terminatorów transkrypcji do zastosowania w kasetach ekspresyjnych. Są one odpowiedzialne za terminację transkrypcji za transgenem i jego prawidłową poliadenylację. Odpowiednie terminatory transkrypcji oraz te, o których wiadomo, że działają w roślinach, obejmują terminator 35S z CaMV, terminator tml, terminator syntezy nopaliny, terminator rbcs E9 z grochu. Mogą być one stosowane zarówno u roślin jednoliściennych, jak i dwuliściennych. Sekwencje do zwiększenia lub regulowania ekspresji Stwierdzono, że liczne sekwencje zwiększają ekspresję genu w obrębie jednostki transkrypcyjnej i sekwencje te mogą być użyte w połączeniu z genami z tego wynalazku do zwiększania ich ekspresji w roślinach tamsgenicznych. Wykazano, że różnorodne sekwencje intronów zwiększają ekspresję, szczególnie w komórkach roślin jednoliściennych. Przykładowo, stwierdzono że introny genu Adhl z kukurydzy po wprowadzeniu do komórek kukurydzy znacząco zwiększają ekspresję genu typu dzikiego pod jego pokrewnym promotorem. Wykazano, że intron 1 jest szczególnie skuteczny i zwiększa ekspresję w połączeniu z genem dla acetylotransferazy chloramfenikolu (Callis et al.; Genes Develop.1: (1987)). W tym samym systemie eksperymentalnym, intron z genu bronze 1 z kukurydzy dawał podobny efekt zwiększania ekspresji (Callis et al., supra). Sekwencje intronowe są rutynowo włączane do wektorów do transformacji roślin, typowo w obrębie lidera nie podlegającego translacji. Wiadomo, że wiele sekwencji liderowych nie podlegających translacji pochodzących z wirusów, również zwiększa ekspresję, i są one szczególnie efektywne w komórkach roślin dwuliściennych. W szczególności wykazano, że sekwencje liderowe z Wirusa Mozaiki Tytoniu (Tobacco Mozaic WVrus, TMV; sekwencja-w ), Maize Chlorotic Mottle Virus (MC- MV) oraz Alfalfa Mosaic Virus (AMV) efektywnie zwiększają ekspresję (np. Gallie et al. Nuci. Acids Res. 15: (1987); Skuzeski et al. Plant Molec. Biol. 15: (1990)). Transport produktu genu wewnątrz komórki Wiadomo, że istnieją różne mechanizmy transportu produktów genów w roślinach i scharakteryzowano do pewnego stopnia sekwencje kontrolujące funkcjonowanie tych mechanizmów. Przykładowo, transport produktów genów do chloroplastów jest kontrolowany przez sekwencję sygnałową znajdywaną na końcu aminowym różnych białek, która jest odcinana w czasie importu do chloroplastów, wskutek czego powstaje dojrzałe białko (np. Comai et al. J. Biol. Chem. 263: (1988)). Te sekwencje sygnałowe mogą być dołączane do produktów heterologicznych genów w celu uzyskania transportu produktów heterologicznych genów do chloroplastów (van den Broeck et al. Naturę 313: (1985)). DNA kodujący odpowiednie sekwencje sygnałowe że być izolowany z końców 5' cdna kodującego białko RUBISCO, białko CAB, enzym syntazę EPSP, białko GS2 i wiele innych białek, o których wiadomo, że są zlokalizowane w chloroplastach.

41 Inne produkty genów są zlokalizowane w innych organellach, takich jak mitochondria i peroksyzomy (np. Ungeret al. Plant Molec. Biol. 13: (1989)). cdna kodujący te produkty może być również poddawany manipulacjom celem uzyskania transportu produktów genów heterologicznych do tych organelli. Przykładami takich sekwencji są kodowane w jądrze ATPazy i mitochondrialne izoformy aminotransferazy asparaginianu. Transport do komórkowych ciałek białkowych został opisany przez Rogers et al., c. Natl. Acad. Sci. USA 82: (1985). Ponadto scharakteryzowano sekwencje, które powodują transport produktów genów do innych części komórki. Sekwencje na końcu aminowym są odpowiedzialne za transport do ER, apoplastu, i wydzielanie na zewnątrz z komórek bielma (Koehler & Ho, Plant Celi 2: (1990)). Ponadto sekwencje na końcu aminowym, w połączeniu z sekwencjami na końcu karboksylowym, są odpowiedzialne za transport produktów genów do wakuoli (Shinshi et al., Plant Molec. Biol. 14: (1990)). Poprzez fuzje opisanych wyżej odpowiednich sekwencji sygnałowych z sekwencjami transgenu, będącymi przedmiotem zainteresowania, możliwe jest kierowanie produktu transgenu do dowolnego organellum lub części komórki. Na przykład dla transportu chloroplastów, sekwencję sygnałową chloroplastu z genu RUBISCO, genu CAB, genu syntazy EPSP lub genu GS2 przyłącza się w ramce odczytu do ATG na końcu aminowym transgenu. Wybrane sekwencje sygnałowe powinny zawierać znane miejsce cięcia i w skonstruowanych fuzjach należy uwzględnić obecność za miejscem cięcia dowolnego aminokwasu wymaganego do cięcia. W niektórych przypadkach to wymaganie może być zrealizowane poprzez dodanie niewielkiej liczby aminokwasów pomiędzy miejscem cięcia i ATG transgenu lub alternatywnie zamianę niektórych aminokwasów w obrębie transgenu. Fuzje skonstruowane do transportu do chloroplastów mogą być testowane pod kątem wydajności pobrania przez chloroplast poprzez translacją in vitro konstruktów transkrybowanych in vitro, a następnie pobieranie przez chloroplast in vitro, stosując techniki opisane przez (Bartlett et al. W: Edelmann et al. (Eds.) Methods in Chloroplast Molecular Biology, Elsevier, str (1982); Wasmann et al. Mol. J Gen. Genet. 205: (1986)). Takie techniki konstrukcji są dobrze znane w tej dziedzinie i mają również zastosowanie do mitochondriów i peroksyzomów. Wybór lokalizacji, wymaganej do ekspresji transgenów, będzie zależał od komórkowej lokalizacji prekursora, będącego punktem wyjścia w danym szlaku. Będzie ona zwykle cytozolowa lub chloroplastowa, jakkolwiek w niektórych przypadkach może być mitochondrialna lub peroksyzomalna. dukt ekspresji transgenu zwykle nie wymaga transportu do ER, apoplastu lub wakuoli. Opisane powyżej mechanizmy transportu wewnątrzkomórkowego mogą być wykorzystane nie tylko w połączeniu z własnymi promotorami, ale również w połączeniu zheterologicznymi promotorami tak, aby uzyskać specyficzną lokalizację, a jednocześnie regulację transkrypcyjną promotora, którego wzór ekspresji jest odmienny od promotora, z którego pochodzi sygnał transportowy. Przykład 22: Transformacja roślin dwuliściennych Techniki transformacji roślin dwuliściennych są dobrze znane w tej dziedzinie i obejmują techniki oparte o Agrobacterium i techniki, które nie wymagają Agrobacterium. Techniki bez Agrobacterium obejmują pobieranie egzogennego materiału genetycznego bezpośrednio przez protoplasty lub komórki. Można to osiągnąć poprzez pobranie za pośrednictwem PEG lub elektroporacji, dostarczenie poprzez bombardowanie cząstkami lub mikroinjekcję. Przykłady tych technik są opisane przez Paszkowskiego et al., EMBO J 3: (1984), Potrykus et al., Mol. Gen. Genet. 199: (1985), Reich et al., Biotechnology 4: (1986) oraz Klein et al., Naturę (1987). W każdym przypadku transformowane komórki są regenerowane do całych roślin przy użyciu standardowych technik znanych w tej dziedzinie. Transformacja za pośrednictwem Agrobacterium jest preferowana techniką transformacji roślin dwuliściennych ze względu na swoją wysoką wydajność transformacji i swoje szerokie zastosowanie dla wielu różnych gatunków. Liczne gatunki roślin uprawnych, które mogą rutynowo podlegać transformacji przez Agrobacterium obejmują: tytoń, pomidory, słonecznik, bawełnę, rzepak, ziemniaki, soję, lucerną i topolą ((EP ) (bawełna), EP

42 (pomidor, Calgene), WO 87/07299 (kapusta, Calgene), US 4:795,855 (topola)). Transformacja Agrobacterium zwykle obejmuje przeniesienie binarnego wektora niosącego obcy DNA, będący przedmiotem zainteresowania (np. pceb200 lub pcib2001), do odpowiedniego szczepu Agrobacterium, które może zależeć od komplementacji genów vir, przenoszonych przez szczep gospodarza Agrobacterium bądź na współobecnym plazmidzie Ti, bądź na chromosomie (np. szczep CIB542 dla pceb200 i pcib2001 (Uknes et al. Plant Celi 5: (1993)). Przeniesienie zrekombinowanego binarnego wektora do Agrobacterium osiąga się poprzez procedurę trójrodzicielskiego krzyżowania przy zastosowaniu E. coli niosącej zrekombinowany wektor binarny, pomocniczego szczepu E. coli, który przenosi plazmid, taki jak prk2013 i który jest zdolny do mobilizowania zrekombinowanego wektora binarnego do wejścia do szczepu Agrobacterium. Alternatywnie, zrekombinowany wektor binarny może być przenoszony do Agrobacterium poprzez transformację DNA (Hofgen & Willmitzer, Nuci. Acids Res. 16: 9877(1988)). Transformacja docelowego gatunku rośliny przez zrekombinowane Agrobacterium zwykle obejmuje równoczesne hodowanie Agrobacterium z eksplantami z roślin według protokołów dobrze znanych w tej dziedzinie. Transformowaną tkankę, niosącą marker odporności na antybiotyk lub herbicyd pomiędzy skrajnymi T-DNA w wektorze binarnym, regeneruje się na pożywce selekcyjnej. Przykład 23: Transformacja roślin jednoliściennych Transformacja większości gatunków roślin jednoliściennych stała się ostatnio czynnością rutynową. Korzystne techniki obejmują bezpośrednie przeniesienie genu do protoplastów przy zastosowaniu technik z użyciem PEG lub elektroporacji oraz bombardowanie cząstkami tkanki kalusa. Transformację można wykonywać przy użyciu pojedynczego rodzaju DNA lub wielu rodzajów DNA (np. kotransformacja) i obie te techniki są odpowiednie do użycia w tym wynalazku. Korzystną stroną kotransformacji jest możliwość uniknięcia skomplikowanych konstrukcji wektora i powstawanie roślin transgenicznych z niesprzężonymi loci dla genu będącego przedmiotem zainteresowania i markera selekcyjnego, umożliwiające usunięcie markera selekcyjnego w kolejnych pokoleniach, co może okazać się pożądane. Jednakże wadą stosowania kotransformacji jest mniej niż 100% częstość, z którą odrębne rodzaje DNA są integrowane do genomu (Schocher et al. Biotechnology 4: (1986)). Zgłoszenie Patentowe EP (Ciba-Geigy), EP (Ciba-Geigy) i WO 93/07278 (Ciba-Geigy) opisują techniki przygotowania kalusa i protoplastów wsobnej linii élite kukurydzy, transformacie protoplastów przy użyciu PEG lub elektroporacji i regenerację roślin kukurydzy ze stransformowanych protoplastów. Gordon-Kamm et al., Plant Cell 2: (1990)) i Fromm et al., Biotechnology 8: (1990)) opublikowali techniki transformacji linii kukurydzy pochodzącej od A l88 przy użyciu bombardowania cząstkami. Ponadto, zgłoszenie WO 93/07278 (Ciba-Geigy) i Kozieł et al., Biotechnology 11: (1993)) opisują techniki transformacji wsobnej linii kukurydzy élite poprzez zastosowanie bombardowania cząstkami. Technika ta stosuje niedojrzałe zarodki kukurydzy o długości 1,5-2,5 mm wycięte kłosów kukurydzy dni po zapyleniu oraz urządzenie PDS-1000He Biolistics do bombardowania. Transformacja ryżu może być także wykonana poprzez techniki bezpośredniego przenoszenia genu przy zastosowaniu protoplastów lub bombardowania cząstkami. Transformacja przy użyciu protoplastów została opisana dla typu Japonica i typu Indica (Zhang et al., Plant Celi Rep (1988); Shimamoto et al. Nature 338: (1989); Datta et al. Biotechnology 8: (1990)). Oba typy są rutynowo transformowane przy zastosowaniu bombardowania cząstkami (Chnstou et al. Biotechnology 9: (1991)). Zgłoszenie Patentowe EP (Ciba-Geigy) opisuje techniki wytwarzania, transformacji i regeneracji protoplastów Pooideae. Techniki te umożliwiają transformację Dactylis i pszenicy. Ponadto, transformacja pszenicy została opisana przez Vasil et al., Biotechnology 10: (1992)) z zastosowaniem bombardowania cząstkami do komórek typu C kalusa długotrwale ulegającego regeneracji, a także przez Vasil et al., Biotechnology 11: (1993)) i Weeks et al., Plant Physiol. 102: (1993) z zastosowaniem bombardowania cząstkami niedojrzałych zarodków i niedojrzałych kalusów pochodzenia zarodkowego. Jednakże korzystna technika transformacji pszenicy, to transformacja pszenicy poprzez bombardowanie

43 cząstkami niedojrzałych zarodków, obejmująca etap z wysokim stężeniem sacharozy bądź maltozy przed dostarczeniem genu. Przed bombardowaniem, dowolna liczba zarodków (długości 0,75-1 mm) jest wysiewana na pożywkę MS zawierającą 3% sacharozę (Murashige & Skoog, Physiologia Plantarum 15: (1962)) i 3 mg/l 2,4-D celem indukcji zarodków somatycznych, która odbywa się w czasie hodowania w ciemności. W wybranym dniu bombardowania, zarodki są usuwane z pożywki indukującej i umieszczane w środowisku osmotycznym (tj. pożywce indukującej z dodaną sacharozą lub maltozą w pożądanym stężeniu, zwykle 15%). Zarodkom umożliwia się plazmolizę przez 2-3 godz. i następnie bombarduje. Zwykle na szalce jest dwadzieścia zarodków, chociaż nie jest to liczba bezwzględnie wymagana. Odpowiednie przenoszące gen plazmidy (takie jak pceb3064 lub p5g35) są osadzane na cząstkach złota o wielkości mikrometra przy użyciu standardowej procedury. Do każdej płytki z zarodkami strzela się przy użyciu DuPont Biolistics, urządzenia z helem, stosując uderzenie ciśnienia psi stosując standarowy ekran 80 mesh. Po bombardowaniu zarodki są ponownie umieszczanie na 24 godz. w ciemności w celu regeneracji (stale w środowisku osmotycznym). Po 24 godz. zarodki są usuwane ze środowiska osmotycznego i umieszczane ponownie na pożywce indukcyjnej, gdzie pozostają przez około miesiąc przed regeneracją. W przybliżeniu jeden miesiąc później eksplanty zarodkowe z rozwijającym się kalusem embnoidalnym przenosi się do pożywki regeneracyjnej (MS + 1 mg/litr NAA, 5 mg/litr GA), zawierającej nadal odpowiedni czynnik selekcyjny (10 mg/l basta w przypadku pcib3064 i 2 mg/l metotreksatu w przypadku psog35) Po upływie około jednego miesiąca, rozwijające się korzenie przenosi się do dużego, jałowego pojemnika, znanego jako GA7s, który zawiera o połowę mniej stężony MS, 2% sacharozę i to samo stężenie czynnika selekcyjnego. Zgłoszenie Patentowe 08/147,161 opisuje metody transformacji pszenicy i jest tu załączone jako odnośnik. Przykład 24: Selekcja roślinnych genów protoks opornych na herbicydy-inhibitory protoks w systemie ekspresyjnym E. coli Plazmid pwdc-4, kodujący chloroplastowy enzym protoks z kukurydzy jest transformowany do szczepu XL1-Red (Stratagene, La Jolla, CA), w którym uzyskuje się losową mutagenezę. Transformacja jest wysiewana na pożywkę L, zawierającą 50 g/ml ampicyliny i inkubowana przez 48 godzin w 37 C. Murawka stransformowanych komórek jest zdrapywana z szalek i DNA plazmidowy otrzymywany przy użyciu zestawu Wizard Megaprep (mega, Madison, WI). Przewiduje się, że DNA plazmidowy izolowany ze szczepu mutatorowego zawiera około jedną losową zmianę na 2000 nukleotydów (patrz Greener et al., Strategies 7(2)32-34 (1994)). Zmutowany plazmidowy DNA transformuje się do mutanta hemg SASX38 (Sasarman et al., J. Gen. Microbiol. 1113: 297 (1979) i wysiewa się na pożywkę L zawierającą 100 g/ml ampicyliny i na tą samą pożywkę zawierającą różne stężenia herbicydu hamującego protoks. Płytki są inkubowane przez 2-3 dni w 37 C. DNA plazmidowy jest izolowany ze wszystkich kolonii, które rosną w obecności stężeń herbicydu, które skutecznie zabijają szczep typu dzikiego. Izolowany DNA jest następnie transformowany do SASX38 i wysiewany ponownie na herbicyd dla upewnienia się, że oporność pochodzi od plazmidu. Zmutowany DNA plazmidu pwdc-4 jest ponownie izolowany z opornych kolonii i sekwencja kodująca protoks jest wycinana poprzez trawienie EcoRI i Xholl. Wycięta sekwencja kodująca protoks jest następnie ponownie wklonowana do nie zmutagenizowanego wektora pbluescript i jeszcze raz testowana na oporność na herbicyd hamujący protoks w ten sam sposób, jak opisano powyżej. ces ten eliminuje mutacje w sekwencji niekodującej, które nadają oporność, takie jak mutanty z podwyższoną aktywnością promotora (to jest mutanty, których oporność jest skutkiem mutacji powodujących zwiększoną ekspresję niezmodyfilcowanego protoks) i pozostawia jedynie mutanty, których oporność jest wynikiem mutacji w sekwencji kodującej genu protoks. Określa się sekwencję DNA dla wszystkich przypuszczalnych genów protoks tolerujących herbicyd zidentyfikowanych w taki sposób i identyfikuje się mutacje poprzez porównanie z sekwencją protoks typu dzikiego w plazmidzie pwdc-4.

44 Stosując procedurę opisaną powyżej, zidentyfikowano mutację oporności zmieniającą C do T w pozycji nukleotydowej 498 w sekwencji pwdc-4 (SEK NR ID 5). Plazmid niosący tą mutację został oznaczony jako pmzc-1 Val. Zmiana ta zmienia kodon GCT dla alaniny w pozycji aminokwasowej 166 (SEK NR ED 6) w kodon G IT dla waliny i powoduje powstanie enzymu protoks, który jest co najmniej I0x bardziej oporny na herbicyd hamujący protoks w teście bakteryjnym. Plazmid pmzc-1 Val, w wektorze pbluescript SK został zdeponowany 30 września 1994 pod nazwą pwdc-8 w Agricultural Research Culture Collection i otrzymał oznaczenie depozytowe NRRL # Ta sama strategia była stosowana do poszukiwania form opornych na herbicydy z genem toks-1 z Arabidopsis w różnych wektorach. Jedną mutację oporności zidentyfikowano jako zmianę C do T w nukleotydzie 689 w sekwencji pwdc-2 (SEK NR ID 1); plazmid ten jest oznaczony jako parac-1 Val. Ta zmiana jest identyczna, jak w zmutowanym plazmidzie pmzc-1 Val powyżej, zmieniająca kodon GCT dla alaniny w pozycji aminokwasowej 220 (SEK NR ID 2) do kodonu GTT dla waliny w odpowiadającej pozycji sekwencji białka protoks z Arabidopsis. Drugi gen oporności zawiera zmianę A do G w pozycji nukleotydowej 1307 w sekwencji pwdc-2 (SEK NR EDI); plazmid ten jest oznaczony jako parac-2cys. Zmiana ta zamienia kodon TAC dla tyrozyny w pozycji aminokwasowej 426 (SEK NR ID 2) w kodon TGC dla cysteiny. Odpowiadający kodon tyrozynowy w sekwencji protoks-1 kukurydzy w pozycji nukleotydowej (SEK NR ID 5; pozycja aminokwasowa 372 w SEK NR ID 6) może być zmutowana w podobny sposób celem wytworzenia postaci tego enzymu opornej na herbicyd. Trzeci mutant oporności ma zmianę G do A w pozycji 691 sekwencji nukleotydowej pwdc-2 (SEK NR ID 1); ten plazmid jest oznaczony jako parac-3ser. Mutacja ta zmienia kodon GGT dla glicyny w pozycji aminokwasowej 221 (SEK NR ED 2) do kodonu AGT dla seryny, sąsiadującego z mutacją w parac-1. Odpowiadający glicynie kodon w sekwencji protoks-1 kukurydzy w pozycji nukleotydowej (SEK NR ID 5; pozycja aminokwasowa 167 w SEK NR ID 6) może być podobnie zmutowana celem utworzenia postaci tego enzymu opornej na herbicyd. W wyniku wszystkich mutacji opisanych powyżej, enzym protoks jest przynajmniej 10x bardziej oporny na herbicyd hamujący protoks w teście bakteryjnym. parac-2cys, w wektorze pfl61, został zdeponowany 14 listopada 1994 pod oznaczeniem pwdc-7 w Agricultural Research Culture Collection i otrzymał oznaczenie depozytowe NRRL #21339N. Przykład 25: Dodatkowe, nadające oporność na herbicyd podstawienia w kodonach, identyfikowane poprzez przeszukiwanie losowe Aminokwasy identyfikowane jako miejsca oporności na herbicyd w losowym przeszukiwaniu są zastępowane przez inne aminokwasy i testowane pod kątem funkcji i tolerancji na herbicyd w systemie bakteryjnym. Mutageneza sekwencji toks-1 z Arabidopsis z zastosowaniem oligonukleotydów jest wykonywana przy użyciu zestawu Transformer Site-Directed Mutagenesis Kit (Clontech, Palo Alto, CA). Później zamiany aminokwasu są potwierdzane poprzez analizę sekwencji, zmutowane plazmidy są transformowane do SASX38 i wysiewane na pożywkę L-amp100, celem testowania funkcji, i na różne stężenia herbicydu hamującego protoks, celem badania tolerancji. cedura ta była zastosowana dla kodom alaniny w pozycji nukleotydowej i kodonu tyrozyny w pozycji nukleotydowej w sekwencji protoks z Arabidopsis (SEK NR ID 1). Wyniki wykazują, że kodon alaniny w pozycji nukleotydowej może być zmieniony do kodonu waliny, treoniny, leucyny lub cysteiny, prowadząc do powstania enzymu protoks opornego na herbicyd, który zachowuje funkcjonalność. Wyniki wykazują ponadto, że kodon tyrozyny w pozycji nukleotydowej może być zmieniony do cysteiny, izoleucyny, leucyny, waliny lub treoniny, prowadząc do powstania enzymu protoks opornego na herbicyd, który zachowuje funkcjonalność.

45 Przykład 26: Wykazanie tolerancji krzyżowej mutacji oporności na różne związki hamujące protoks. Zmutowane plazmidy oporności, wyselekcjonowane na oporność wobec pojedynczego herbicydu, są testowane na szereg innych związków hamujących protoks. Szczep SASX38 zawierający plazmid typu dzikiego jest wysiewany na różne stężenia każdego ze związków dla określenia stężenia letalnego każdego z nich. Szczep SASX38 ze zmutowanymi plazmidami oporności jest wysiewany i testowany pod kątem zdolności przeżycia na stężeniu każdego ze związków, które jest co najmniej 10-krotnie wyższe od stężenia, które jest letalne dla szczepu SASX38, zawierającego plazmid typu dzikiego. Wyniki testowania tolerancji krzyżowej pokazują, że każda ze zidentyfikowanych mutacji warunkuje tolerancję na różne związki hamujące protoks. Konkretnie, wyniki pokazują, że 1) mutacja AraCI-Val nadaje oporność na inhibitory protoks obejmujące między innymi związki o wzorach 4, 11, 13, 14, 15 i 17; 2) mutacja AraC-2Cys nadaje oporność na inhibitory protoks obejmujące między innymi związki o wzorach 11, 13, 15 i 17; 3) Mutacja MzC-I Val nadaje oporność na inhibitory protoks obejmujące między innymi związki o wzorach 11, 12, 13, 14, 15, 16 i 17; 4) Mutacja AraC-3Ser nadaje oporność na inhibitory protoks obejmujące między innymi bifenoks oraz związki o wzorach 4, 12, 13, 14, 15 i 17. Przykład 27: Wytwarzanie roślin opornych na herbicyd poprzez nadprodukcję roślinnych genów protoks. Sekwencje kodujące toks-1 z Arabidopsis, zarówno z genów typu dzikiego, jak i mutanta oporności AraC-1 Val, są wycięte poprzez częściowe trawienie EcoRI i Xhol i sklonowane w roślinnym wektorze ekspresyjnym pcgni761enx. Kasety ekspresyjne zawierające fuzje genowe 2X355-toks są wycinane przez Xbal i klonowane w binarnym wektorze pceb200. Te binarne plazmidy protoks są transformowane poprzez elektroporację do Agrobacterium, a następnie do Arabidopsis, przy zastosowaniu metody infiltracji pod próżnią (Bechtold et al.,1993). Transformanty są transformowane na kanamycynę i z różnych niezależnych linii wytwarzane są nasiona T2. Nasiona te wysiewa się na pożywki GM zawierające różne stężenia herbicydu hamującego protoks i testowane pod kątem kiełkowania i przeżywania. Liczne linie transgeniczne nadprodukujące protoks, bądź typu dzikiego, bądź zmutowany-opomy, wytwarzają znaczną liczbę zielonych kiełków przy stężeniu herbicydu, który jest letalny dla kontroli z pustym wektorem. Rozmaite modyfikacje opisanego tu wynalazku będą oczywiste dla biegłych w tej dziedzinie. Modyfikacje te mają pozostać w zakresie dołączonych zastrzeżeń.