(12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11)

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (21) Numer zgłoszenia : (22) Data zgłoszenia: (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/JP98/00568 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego: , WO98/35698, PCT Gazette nr 33/98 (13) B1 (51) IntCl7: A61K 39/395 C07K 16/30 C07K 16/46 A61P 35/02 (54) Środek terapeutyczny do leczenia nowotworów układu chłonnego (30) Pierwszeństwo: ,JP.9/41410 (73) Uprawniony z patentu: CHUGAI SEIYAKU KABUSHIKI KAISHA, Tokio, JP (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 07/00 (72) Twórcy wynalazku: Yasuo Koishihara, Shizuoka, JP Yasushi Yoshimura, Shizuoka, JP (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 10/05 (74) Pełnomocnik: Płotczyk Leokadia, POLSERVICE Sp. z o.o. PL B1 (57) 1. Środek terapeutyczny do leczenia nowotworów układu chłonnego (wyłączając szpiczaki), który zawiera jako substancję aktywna przeciwciało specyficznie wiążące się z białkiem mającym sekwencję aminokwasową przedstawioną na SEQ ID NO: 1 i posiadające działanie cytotoksyczne. 2. Środek terapeutyczny według zastrz. 1, znamienny tym, że nowotwór układu chłonnego jest nowotworem limfocytów T. 3. Środek terapeutyczny według zastrz. 1, znamienny tym, że nowotwór układu chłonnego jest nowotworem limfocytów B (wyłączając szpiczaki). 7. Środek terapeutyczny według zastrz. 4, znamienny tym, że przeciwciało zawiera region stały CƔ przeciwciała ludzkiego. 8. Środek terapeutyczny według zastrz. 7, znamienny tym, że region stały CƔ przeciwciała ludzkiego jest regionem CƔ1 lub CƔ3. 9. Środek terapeutyczny według zastrz. 4, znamienny tym, że przeciwciało jest przeciwciałem przeciw antygenowi HM 1.24.

2 Środek terapeutyczny do leczenia now otw orów układu chłonnego Zastrzeżenia patentowe 1. Środek terapeutyczny do leczenia nowotworów układu chłonnego (wyłączając szpiczaki), który zawiera jako substancję aktywna przeciwciało specyficznie wiążące się z białkiem mającym sekwencję aminokwasową przedstawioną na SEQ ID NO: 1 i posiadające działanie cyto toksyczne. 2. Środek terapeutyczny według zastrz. 1, znamienny tym, że nowotwór układu chłonnego jest nowotworem limfocytów T. 3. Środek terapeutyczny według zastrz. 1, znamienny tym, że nowotwór układu chłonnego jest nowotworem limfocytów B (wyłączając szpiczaki). 4. Środek terapeutyczny według zastrz. 1, znamienny tym, że przeciwciało jest monoklonalnym przeciwciałem. 5. Środek terapeutyczny według zastrz. 1, znamienny tym, że aktywność cytotoksyczna jest aktywnością typu ADCC. 6. Środek terapeutyczny według zastrz. 1, znamienny tym, że aktywność cytotoksyczna jest aktywnością typu CDC. 7. Środek terapeutyczny według zastrz. 4, znamienny tym, że przeciwciało zawiera region stały Cy przeciwciała ludzkiego. 8. Środek terapeutyczny według zastrz. 7, znamienny tym, że region stały Cy przeciwciała ludzkiego jest regionem Cyl lub Cy3. 9. Środek terapeutyczny według zastrz. 4, znamienny tym, że przeciwciało jest przeciwciałem przeciw antygenowi HM Środek terapeutyczny według zastrz. 4, znamienny tym, że przeciwciało jest przeciwciałem chimerowym lub przeciwciałem o cechach przeciwciała ludzkiego. 11. Środek terapeutyczny według zastrz. 9, znamienny tym, że przeciwciało jest przeciwciałem chimerowym przeciw antygenowi HM Środek terapeutyczny według zastrz. 9, znamienny tym, że przeciwciało jest przeciwciałem o cechach przeciwciała ludzkiego przeciw antygenowi HM Środek terapeutyczny według zastrz. 1, znamienny tym, że przeciwciało specyficznie wiąże się z epitopem rozpoznawanym przez przeciwciało przeciw antygenowi HM Przeciwciało, znamienne tym, że specyficznie wiąże się z białkiem mającym sekwencję aminokwasową przedstawioną na SEQ ID NO: 1 i posiadające działanie cytotoksyczne. 15. Przeciwciało według zastrz. 13, znamienne tym, że jego aktywność cytotoksyczna jest aktywnością typu ADCC. 16. Przeciwciało, według zastrz. 13, znamienne tym, że jego aktywność cytotoksyczna jest aktywnością typu CDC. * * * Zakres wynalazku Przedmiotem wynalazku są środki terapeutyczne do leczenia nowotworów układu chłonnego (wyłączając szpiczaki) zawierające jako substancję aktywną przeciwciało specyficznie wiążące się z białkiem, które ulega ekspresji w nowotworach układu chłonnego. Przedmiotem wynalazku jest także środek terapeutyczny do leczenia nowotworów limfocytów T i limfocytów B (wyłączając szpiczaki). Przedmiotem wynalazku jest także przeciwciało o działaniu cytotoksycznym, specyficznie wiążące się z białkiem, które ulega ekspresji w nowotworach limfocytowych.

3 Podłoże wynalazku Komórki limfatyczne są odpowiedzialne za odpowiedź immunologiczną organizmu. Wszystkie komórki limfatyczne pochodzą od tych samych krwiotwórczych komórek macie' rzystych szpiku, które są stale uwalniane do krwioobiegu. Uwolnienie następuje po zróżnicowaniu występujących w szpiku lub innych organach komórek macierzystych wywołanym oddziaływaniem różnorodnych czynników różnicujących lub czynników wzrostowych. Ze względu na różnice w tym różnicowaniu limfocyty dzieli się ogólnie na dwie klasy, limfocyty B i limfocyty T. Przyjmuje się, że komórki B zdolne są do wytwarzania przeciwciał, podczas gdy limfocyty T zdolne są do prezentowania antygenów, oddziaływań cytotoksycznych i tym podobnych. Jeżeli limfocyty takie ulegną na jakimś etapie różnicowania przemianie nowotworowej, zaczną w sposób niekontrolowany namnażać się w szpiku kostnym, tkankach limfatycznych, we krwi lub tym podobnych, stan taki nazywamy nowotworem układu chłonnego. Wraz z wprowadzeniem nowych technologii szczególnie zastosowaniu przeciwciał monoklonalnych przeciw antygenom różnicowania na powierzchni komórek, stało się możliwe określenie pochodzenia i/lub stopnia zróżnicowania komórek limfatycznych. Możliwe stało się także nie tylko określenie czy takie komórki nowotworowe pochodzą od komórek T czy od komórek B ale możliwe jest także określenie stopnia dojrzałości komórek nowotworowych. Na podstawie pochodzenia komórek nowotworowych nowotwory układu chłonnego ogólnie dzieli się na nowotwory komórek B i nowotwory komórek T. Na podstawie dojrzałości komórek nowotworowych nowotwory układu chłonnego pochodzące od komórek B dziali się na ostre białaczki limfocytowe z komórkami B (B-ALL), chroniczne białaczki limfocytowe B z komórkami (B-CLL), chłoniak z komórkami pre-b, chłoniak Burkitta, chłoniak grudkowy, chłoniak grudkowy płaszcza i chłoniak rozproszony. Nowotwory układu chłonnego pochodzące od komórek T dzieli się na ostre białaczki limfocytowe z komórkami T (T-ALL), chroniczne białaczki limfocytowe z komórkami T (T-CLL), białaczkę limfocytową z dojrzałymi komórkami T (ATL), chłoniak nie-atl z komórkami T (PNTL) i jak (Zukai Rinso [Gan] (Illustrated Clinical: Cancer), serie nr 17 Leukemia and Lymphoma, Takashi Sugimura i wsp.,medical View Co., Ltd., 1987, Bcell tumors, Kiyoshi Takatsuki, Nishimura Shoten, 1991). Pomimo postępu w naukach medycznych leczenie nowotworów układu chłonnego nie daje zadawalających rezultatów. Stopień wyleczeń ostrych białaczek limfocytowych (ALL) wynosi około 20% lub mniej, a zaawansowanych chłoniaków około 50%, chociaż stopień wyleczeń białaczek B dzięki postępowi w terapii wielolekowej jest stosunkowo wysoki. Natomiast chłoniaki T są oporne na leczenie i ich stopień wyleczeń wynosi około 30%, a stopień wyleczeń białaczki limfocytowej z dojrzałymi komórkami T (ATL) wynosi poniżej 10%. Goto i wsp. opisują przeciwciało monoklonalne (przeciwciało przeciw antygenowi HM1.24) uzyskane przez immunizację myszy ludzkimi komórkami szpiczaka (Blood (1994) 84, ). Po podaniu przeciwciała przeciw antygenowi HM 1.24 myszom z przeszczepionymi komórkami ludzkiego szpiczaka, przeciwciało to gromadzi się specyficznie w tkankach nowotworowych (Masaki Kosaka i wsp., Nippon Rinsho (Japan Clinical) (1995) 53, ), co pokazuje, że przeciwciała tego można użyć do wykrywania i lokalizowania nowotworów metodami znakowania związkami radioaktywnymi i w terapiach docelowych, takich jak radioimmunoterapia. Jednakże nie wykazano, że przeciwciało przeciw antygenowi HM1.24 jest użyteczne do leczenia innych typów nowotworów. Opis wynalazku Stosowane obecnie sposoby leczenia nowotworów układu chłonnego obejmują różne rodzaje chemoterapii, napromienienie promieniami X i przeszczepy szpiku kostnego. Jednakże jak wspomniano powyżej żaden z tych sposobów leczenia nie daje zadawalających rezultatów. Wciąż poszukuje się nowych środków terapeutycznych iub sposobów leczenia nowotworów układu chłonnego i sposobów przedłużenia życia pacjentów. Przedmiotem wynalazku jest dostarczenie nowego środka terapeutycznego do leczenia nowotworów układu chłonnego, wyłączając szpiczaki. W celu otrzymania takiego środka terapeutycznego wynalazcy przeprowadzili intensywne badania in vitro włączając analizę metodą cytometrii przepływowej (FCM), określenie aktywności cytotoksycznej, takiej jak aktywność ADCC, aktywność CDC, badania in vivo działania przeciwnowotworowego przeciwciała przeciw antygenowi HM1.24 (Goto, T. I wsp.,

4 Blood (1994) 84, ) oraz podjęli próbę izolacji białka antygenu z którym specyficznie wiąże się przeciwciało przeciw antygenowi HM W wyniku tych badań wynalazcy stwierdzili, że białko antygenu rozpoznawanego przez przeciwciało przeciw antygenowi HM1.24, wyrażane jest przez nowotwory układu chłonnego, a przeciwciało przeciw antygenowi HM1.24 ma działanie przeciwnowotworowe na nowotwory układu chłonnego. Sposób według wynalazku dostarcza środek terapeutyczny do leczenia nowotworów układu chłonnego (wyłączając szpiczaki) zawierający jako substancję czynną przeciwciało specyficznie wiążące się z białkiem mającym sekwencję aminokwasową przedstawioną na SEQ ID NO: 1 i mające działanie cytotoksyczne. Sposób według wynalazku dostarcza także środek terapeutyczny do leczenia nowotworów limfocytów T lub środka terapeutycznego do leczenia nowotworów limfocytów B (wyłączając szpiczaki) zawierający jako substancję czynną przeciwciało specyficznie wiążące się z białkiem mającym sekwencję aminokwasową przedstawioną na SEQ ID NO: 1 i mające działanie cytotoksyczne. Sposób według wynalazku dostarcza także środek terapeutyczny do leczenia nowotworów limfocytów T lub środek terapeutyczny do leczenia nowotworów limfocytów B (wyłączając szpiczaki) zawierający jako substancję czynną, monoklonalne przeciwciało specyficznie wiążące się z białkiem mającym sekwencję aminokwasową przedstawioną na SEQ ID NO: 1 i mające działanie cytotoksyczne. Sposób według wynalazku dostarcza także środek terapeutyczny do leczenia nowotworów limfocytów T lub środka terapeutycznego do leczenia nowotworów limfocytów B (wyłączając szpiczaki) zawierający jako substancję czynną przeciwciało specyficznie wiążące się z białkiem mającym sekwencję aminokwasową przedstawioną na SEQ ID NO: 1i jako działanie cytotoksyczne mające aktywność ADCC lub CDC. Sposób według wynalazku dostarcza także środek terapeutyczny do leczenia nowotworów limfocytów T lub środek terapeutyczny do leczenia nowotworów limfocytów B (wyłącza z białkiem mającym sekwencję aminokwasową przedstawioną na SEQ ID NO: 1 i mające działanie cytotoksyczne oraz mające Cy ludzkiego przeciwciała jako region stały. Sposób według wynalazku dostarcza także środek terapeutyczny do leczenia nowotworów limfocytów T lub środka terapeutycznego do leczenia nowotworów limfocytów B (wyłączając szpiczaki) zawierający jako substancję czynną chimerowe przeciwciało lub przeciwciało o cechach przeciwciała ludzkiego specyficznie wiążące się z białkiem mającym sekwencję aminokwasową przedstawioną na SEQ ID NO: 1 i mające działanie cytotoksyczne. Sposób według wynalazku dostarcza także środek terapeutyczny do leczenia nowotworów limfocytów T lub środka terapeutycznego do leczenia nowotworów limfocytów B (wyłączając szpiczaki) zawierający jako substancję czynną przeciwciało specyficznie wiążące się z epitopem rozpoznawanym przez przeciwciało przeciw antygenowi HM Sposób według wynalazku dostarcza także środek terapeutyczny do leczenia nowotworów limfocytów T lub środka terapeutycznego do leczenia nowotworów limfocytów B (wyłączając szpiczaki) zawierający przeciwciało przeciw antygenowi HM1.24. Przedmiotem wynalazku jest także przeciwciało o działaniu cytotoksycznym, specyficznie wiążące się z białkiem, które ulega ekspresji w nowotworach układu chłonnego. Opis figur Figura 1 przedstawia histogram analizy metodą FCM opisanej linii limfocytów B przy zastosowaniu pośredniej metody wykrywania z użyciem przeciwciała przeciw antygenowi HM1.24 i kontrolnego mysiego przeciwciała IgG2a. Figura 2 przedstawia histogram analizy metoda FCM opisanej linii limfocytów B przy zastosowaniu pośredniej metody wykrywania z użyciem przeciwciała przeciw antygenowi HM 1.24 i kontrolnego mysiego przeciwciała IgG2a. Figura 3 przedstawia histogram analizy metoda FCM opisanej linii limfocytów B przy zastosowaniu pośredniej metody wykrywania z użyciem przeciwciała przeciw antygenowi HM1.24 i kontrolnego mysiego przeciwciała IgG2a. Figura 4 przedstawia histogram analizy metodą FCM opisanej linii limfocytów B przy zastosowaniu pośredniej metody wykrywania z użyciem przeciwciała przeciw antygenowi HM 1.24 i kontrolnego mysiego przeciwciała IgG2a.

5 Figura 5 przedstawia histogram analizy metodą FCM opisanej linii limfocytów B przy zastosowaniu pośredniej metody wykrywania z użyciem przeciwciała przeciw antygenowi HM1.24 i kontrolnego mysiego przeciwciała IgG2a. Figura 6 przedstawia histogram analizy metodą FCM opisanej linii limfocytów B przy zastosowaniu pośredniej metody wykrywania z użyciem przeciwciała przeciw antygenowi HM 1.24 i kontrolnego mysiego przeciwciała IgG2a. Figura 7 przedstawia histogram analizy metodą FCM opisanej linii limfocytów B przy zastosowaniu pośredniej metody wykrywania z użyciem przeciwciała przeciw antygenowi HM 1.24 i kontrolnego mysiego przeciwciała IgG2a. Figura 8 przedstawia histogram analizy metodą FCM opisanej linii limfocytów B przy zastosowaniu pośredniej metody wykrywania z użyciem przeciwciała przeciw antygenowi HM1.24 i kontrolnego mysiego przeciwciała IgG2a. Figura 9 przedstawia histogram analizy metoda FCM opisanej linii limfocytów B przy zastosowaniu pośredniej metody wykrywania z użyciem przeciwciała przeciw antygenowi HM 1.24 i kontrolnego mysiego przeciwciała IgG2a. Figura 10 przedstawia histogram analizy metodą FCM opisanej linii limfocytów T przy zastosowaniu pośredniej metody wykrywania z użyciem przeciwciała przeciw antygenowi HM 1.24 i kontrolnego mysiego przeciwciała IgG2a. Figura 11 przedstawia histogram analizy metoda FCM opisanej linii limfocytów T przy zastosowaniu pośredniej metody wykrywania z użyciem przeciwciała przeciw antygenowi HM 1.24 i kontrolnego mysiego przeciwciała IgG2a. Figura 12 przedstawia histogram analizy metoda FCM opisanej linii limfocytów T przy zastosowaniu pośredniej metody wykrywania z użyciem przeciwciała przeciw antygenowi HM 1.24 i kontrolnego mysiego przeciwciała IgG2a. Figura 13 przedstawia histogram analizy metoda FCM opisanej linii limfocytów T przy zastosowaniu pośredniej metody wykrywania z użyciem przeciwciała przeciw antygenowi HM 1.24 i kontrolnego mysiego przeciwciała IgG2a. Figura 14 przedstawia histogram analizy metoda FCM opisanej linii limfocytów T przy zastosowaniu pośredniej metody wykrywania z użyciem przeciwciała przeciw antygenowi HM 1.24 i kontrolnego mysiego przeciwciała IgG2a. Figura 15 przedstawia histogram analizy metoda FCM opisanej linii limfocytów T przy zastosowaniu pośredniej metody wykrywania z użyciem przeciwciała przeciw antygenowi HM 1.24 i kontrolnego mysiego przeciwciała IgG2a. Figura 16 przedstawia histogram analizy metoda FCM opisanej linii limfocytów T przy zastosowaniu pośredniej metody wykrywania z użyciem przeciwciała przeciw antygenowi HM1.24 i kontrolnego mysiego przeciwciała IgG2a. Figura 17 przedstawia histogram analizy metodą FCM opisanej linii limfocytów T przy zastosowaniu pośredniej metody wykrywania z użyciem przeciwciała przeciw antygenowi HM1.24 i kontrolnego mysiego przeciwciała IgG2a. Figura 18 przedstawia histogram analizy metodą FCM opisanej linii limfocytów T przy zastosowaniu pośredniej metody wykrywania z użyciem przeciwciała przeciw antygenowi HM1.24 i kontrolnego mysiego przeciwciała IgG2a. Figura 19 przedstawia histogram analizy metodą FCM o-pisanej linii limfocytów T przy zastosowaniu pośredniej metody wykrywania z użyciem przeciwciała przeciw antygenowi HM 1.24 i kontrolnego mysiego przeciwciała IgG2a. Figura 20 przedstawia histogram analizy metodą FCM opisanej linii limfocytów nie-t, nie-b przy zastosowaniu pośredniej metody wykrywania z użyciem przeciwciała przeciw antygenowi HML24 i kontrolnego mysiego przeciwciała IgG2a. Figura 21 przedstawia histogram analizy metodą FCM o-pisanej linii limfocytów nie-t, nie-b przy zastosowaniu pośredniej metody wykrywania z użyciem przeciwciała przeciw antygenowi HM 1.24 i kontrolnego mysiego przeciwciała IgG2a. Figura 22 przedstawia histogram analizy metodą FCM opisanej linii limfocytów nie-t, nie-b przy zastosowaniu pośredniej metody wykrywania z użyciem przeciwciała przeciw antygenowi HM 1.24 i kontrolnego mysiego przeciwciała IgG2a.

6 Figura 23 przedstawia histogram analizy metodą FCM opisanej linii limfocytów nie-t, nie-b przy zastosowaniu pośredniej metody wykrywania z użyciem przeciwciała przeciw antygenowi HM1.24 i kontrolnego mysiego przeciwciała IgG2a. Figura 24 przedstawia wykres pokazujący, że cytotoksyczne działanie przeciwciała przeciw antygenowi HM 1.24 na nowotworowe linie komórkowe limfocytów T CCRF-CEM, CCRF-HSB-2 i HPB-MTL jest zależne od dawki. Figura 25 przedstawia wykres pokazujący, że cytotoksyczne działanie przeciwciała przeciw antygenowi HM1.24 na nowotworowe linie komórkowe limfocytów B EB-3, MCI 16 i CCRF-SB jest zależne od dawki. Figura 26 przedstawia wykres pokazujący, że wzrost nowotworu w myszach, którym przeszczepiono ludzki nowotwór układu chłonnego jest zahamowany w grupie myszy, którym podawano przeciwciało przeciw antygenowi HM 1.24 w porównaniu do grupy myszy, którym podawano kontrolne przeciwciało I-gG2a. Figura 27 przedstawia wykres pokazujący, że długość życia myszy, którym przeszczepiono ludzki nowotwór układu chłonnego jest większa w grupie myszy, którym podawano przeciwciało przeciw antygenowi FiMl.24 w porównaniu do grupy myszy, którym podawano kontrolne przeciwciało IgG2a. Opis wynalazku Wytworzenie przeciwciała 1-1. Otrzymanie linii hybrydowych Linię hybrydowa wytwarzającą przeciwciało sposobem według wynalazku wytwarza się sposobami znanymi w sztuce. Immunizację prowadzi się tradycyjnymi sposobami. Jako antygenu uczulającego używa się białka antygenu HM1.24 lub komórek wyrażających antygen HM1.24. Uzyskane w ten sposób komórki wytwarzające przeciwciała łączy się metodą fuzji ze znanymi liniami macierzystymi, stosując tradycyjne sposoby fuzji. Z otrzymanych hybryd tradycyjnymi sposobami wybiera się te, które wytwarzają przeciwciała. Specyficzne przeciwciała monoklonalne wytwarza się następująco: jako komórek wyrażających antygen HM1.24, który jest antygenem uczulającym do wytwarzania przeciwciała używa się ludzkiej linii szpiczaka wielokrotnego KPMM2 (Japoński Niebadany Dokument Patentowy (Kokai) Nr ) lub KPC-32 (Goto T. I wsp., Jpn. J. Clin. Hematol. (1991) 32, 1400). Jako antygenu uczulającego możną też użyć białka mającego sekwencję aminokwasową przedstawioną na SEQ ID NO: 1lub peptydu lub polipeptydu zawierającego epitop rozpoznawany przez przeciwciało przeciw antygenowi HM1.24. Sposobem według wynalazku cdna kodujące białko, mające sekwencję aminokwasową przedstawioną na SEQ ID NO: 1 wstawia się w miejsce rozpoznawane przez enzym restrykcyjny Xbal wektora puc19 i otrzymuje się plazmid prs38-puc19. Bakterie E. coli zawierające ten plazmid zostały złożone zgodnie z postanowieniami międzynarodowego Traktatu Budapesztańskiego jako Escherichia coli DH5a (prs38-puc19) 5 października 1993 roku w National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, 1-3 Higashi 1-chome, Tsukuba city, Ibaraki pref., Japonia jako FERM BP-4434 (patrz Japoński Niebadany Dokument Patentowy (Kokai) No ). Fragmentu cdna zawartego w plazmidzie prs38-puc19 używa się do wytworzenia metodami inżynierii genetycznej peptydu lub polipeptydu, zawierającego epitop rozpoznawany przez przeciwciało przeciw antygenowi HM1.24. Sposobem według wynalazku, zwierzę korzystne do immunizacji antygenem immunizującym, wybiera się pod kątem jego zgodności z komórkami linii macierzystej, użytymi w czasie fuzji komórek. Zwierzęta takie obejmują, ale bez ograniczania gryzonie, takie jak myszy, szczury, chomiki i tym podobne. Immunizację zwierząt antygenem immunizującym prowadzi się tradycyjnymi sposobami. Ogólnie, metoda taka obejmuje dootrzewnowe lub podskórne podanie zwierzęciu antygenu immunizującego. Odpowiednią ilość antygenu immunizującego rozcieńczonego i zawieszonego w roztworze soli zbuforowanym fosforanem (PBS) lub soli fizjologicznej miesza się, jeśli to potrzebne z odpowiednią ilością pełnego adjuwanta Freuda. Po uzyskaniu emulsji, mieszaninę korzystnie podaje się zwierzęciu kilka razy co 4 do 21 dni. Alternatywnie odpowiedniego nośnika używa się jednocześnie z immunizacją antygenem immunizującym.

7 Po immunizacji i stwierdzeniu wzrostu poziomu^ pożądanego przeciwciała w osoczu komórki wytwarzające przeciwciała pobiera się ze zwierzęcia i poddaje fuzji z komórkami linii macierzystej. Korzystnie komórki wytwarzające przeciwciała obejmują komórki śledziony. Komórki szpiczaka ssaków i inne komórki linii macierzystej, które poddaje się fuzji z opisanymi powyżej komórkami wytwarzającymi przeciwciała, korzystnie obejmują różne znane linie komórkowe takie jak P3X63Ag8.653 (J. Immunol. (1979) 123: ), P3X63Aq8U.l (Current Topics In Microbiology and Immunology (1978) 81: 1-7), NS-1 (Kohler, G. And Milstrein, C., Eur J. Immunol. (1976)6: ), MPC-11 (Margulies, D. H. i wsp., Celi (1976)8: ), SP2/0 (Shulman, M. i wsp., Naturę (1978) 276: ), FO (de St. Groth, S. F. i wsp., J. Immunol. Methods (1980) 35:1-21), S194 (Trowbridge, I.S., J. Exp. Med. (1978) 148: ), R210 (Galfre, G. I wsp., Nature (1979) 277: ). Fuzję komórek szpiczaka z opisanymi powyżej komórkami wytwarzającymi przeciwciała prowadzi się dokładnie według znanych sposobów, takich jak opisany przez (Kohler, G. I Milstein, C., Methods Enzymol. (1981) 73:3-46). Bardziej szczegółowo, fuzję tę prowadzi się w tradycyjnym podłożu odżywczym w obecności na przykład, czynnika przyśpieszającego fuzję. Jako czynnika przyspieszającego fuzję używa się glikolu polietylenowego (PEG), wirusa Sendai (HV.T) lub podobnych. W celu zwiększenia wydajności fuzji używa się także adjuwanta, takiego jak sulfotlenek dwumetylowy. Korzystny stosunek komórek wytwarzających przeciwciała i komórek szpiczaka wynosi na przykład, 1 do 10 razy więcej komórek wytwarzających przeciwciała niż komórek szpiczaka. Przykłady podłoży do hodowli jakich używa się do opisanej fuzji komórek obejmują odpowiednie do hodowli linii komórek szpiczaka podłoże RPMT1640 i podłoże MEM oraz inne tradycyjne podłoża do hodowli do które można wzbogacić o surowicę taką jak płodowa surowica bydlęca (FCS). W czasie fuzji dokładnie miesza się w podłożu do hodowli wcześniej określoną liczbę komórek wytwarzających przeciwciała i komórek szpiczaka, do którego dodaje się roztwór PEG, wcześniej podgrzany do temperatury 37 C, na przykład, dodaje się roztwór PEG o średniej masie molowej około 1000 do 6000 do stężenia od 30% do 60%. Komórki miesza się do uzyskania fuzji komórek (hybryd). Następnie kilkakrotnie dodając odpowiednie podłoże do hodowli i wirując usuwa się nadsącz i środki wspomagające fuzje, które nie są pożądane w czasie hodowli hybryd. Hybrydy selekcjonuje się hodując je w tradycyjnym podłożu do selekcji na przykład, podłożu HAT (podłoże do hodowli zawierające hipoksantynę, aminopterynę i tymidynę). Komórki hoduje się w tym podłożu przez okres czasu konieczny do zabicia komórek innych niż komórki hybrydy (komórek, które nie uległy fuzji). Zwykle kilka dni do kilku tygodni. Hybrydy wytwarzające pożądane przeciwciało selekcjonuje się tradycyjną metodą ograniczonych rozcieńczeń i namnaża. Sposobem według wynalazku oprócz wytworzenia komórek hybrydowych uzyskanych metodą immunizacji zwierząt, można też uczulić na antygen HM 1.24 lub na komórki wyrażające an-ib tygen HM1.24 ludzkie limfocyty in vitro. Takie limfocyty poddaje się następnie fuzji z ludzkimi komórkami szpiczaka, na przykład U266 i otrzymuję się pożądane ludzkie przeciwciało mające zdolność wiązania się z antygenem HM 1.24 lub komórkami wyrażającymi antygen HM1.24 (patrz Japoński Dokument Patentowy po badaniu (Kokoku) nr ). Metodą opisaną w (Międzynarodowym zgłoszeniu patentowym WO 93/12227, WO 92/03918, WO 94/02602, WO 96/34096 i WO 96/33735) immunizuje się także zwierzę transgeniczne mające pełen zestaw genów kodujących ludzkie przeciwciało. Używając do immunizacji antygenu HM1.24 lub komórek wyrażających antygen HM1.24 otrzymuje się pożądane przeciwciało o cechach przeciwciała ludzkiego. Linie hybrydowe wytwarzające monoklonalne przeciwciała hoduje się w tradycyjnym podłożu do hodowli lub przechowuje przez długi okres czasu zamrożone w ciekłym azocie. W celu otrzymania przeciwciała z opisanych linii hybrydowych używa się tradycyjnych metod polegających na pozyskiwaniu przeciwciała z nadsączu hodowli komórkowych lub metod polegających na wszczepieniu linii hybrydowej i jej hodowli w zwierzęciu, które jest zgodne z opisana linią hybrydową i pozyskiwaniu przeciwciała z wysięku. Pierwsza metoda

8 jest korzystna do wytwarzania przeciwciała o wysokiej czystości podczas gdy druga metoda jest przydatna do wytwarzania przeciwciał na dużą skalę. Bardziej szczegółowo, przeciwciało przeciw antygenowi HM 1.24 z linii hybrydowej wytwarzającej takie przeciwciało uzyskuje się używając metody opisanej przez Goto, T. I wsp., (Blood (1994) 84: ). Przeciwciało uzyskuje się metodą, w której linię hybrydową produkującą przeciwciało przeciw antygenowi HM1.24, złożoną zgodnie z postanowieniami międzynarodowego Traktatu Budapesztańskiego jako FERM BP września 1995 roku w National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, 1-3 Higashi 1-chome, Tsukuba city, Ibaraki pref., Japonia wstrzykuje się dootrzewnowe myszom BALB/C (dostarczonym przez CLEA Japonia) i uzyskuje się wysięk z którego izoluje się przeciwciało przeciw antygenowi HM1.24. Do wytwarzania przeciwciała używa się też metody w której linię hybrydową hoduje się w odpowiednim podłożu takim jak RPMI1640 zawierającym 10% surowicy płodowej i 5% BM-Condiment HI (Boehringer- Mannheim), podłoża dla linii hybrydowych SFM (GIBCO-BRL), podłoża PFHMII (GIBCO- -BRL) a przeciwciało przeciw antygenowi HM1.24 uzyskuje się z nadsączu. 1-2 Zrekombinowane przeciwciało Sposobem według wynalazku jako monoklonalnego przeciwciała używa się także zrekombinowanego przeciwciała wytworzonego metodami inżynierii genetycznej. Gen kodujący przeciwciało klonuje się z linii hybrydowej i włącza się go w odpowiedni wektor, który następnie wprowadza się do komórek gospodarza (patrz na przykład Carl, A.K., Borrebaeck, i James, W. Larrick, Therapeutic Monoclonal Antibodies, opublikowane w Wielkiej Brytanii przez MacMillan Publishers LTD. 1990). Bardziej szczegółowo, mrna kodujący region zmienny (region V) pożądanego przeciwciała izoluje się z linii hybrydowej wytwarzającej to przeciwciało. Izolację tego mrna prowadzi się metodą izolacji całkowitego RNA znanymi metodami metodą na przykład, przez ultrawirowanie w roztworze guanidyny (Chirgwin, J.M., i wsp., Biochemistry (1979) 18, ), lub metodą AGPC (Chomczyński, P. i wsp., Analytical Biochemistry (1987) 162, ). mrna izoluje się z całkowitego RNA przy użyciu mrna Purification Kit (Pharmacia). Można też bezpośrednio otrzymać mrna przy użyciu Quick Prep mrna Purification Kit (Pharmacia). Z mrna syntetyzuje się cdna regionu V przeciwciała przy użyciu odwrotnej transkryptazy. cdna syntetyzuje się przy użyciu AMV Reverse Transcriptase Firststrand cdna Synthesis Kit. Syntezę i powielenie cdna można prowadzić też metodą 5'-RACE (Froman, M.A. i wsp., Proc Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85, ; Belyavski, A. I wsp., Nucleic Acids Res (1989) 17, ), w której wykorzystuje się reakcję łańcuchową polimerazy (PCR), przy użyciu zestawu 5'-Ampli FINDER RACE Kit (Clontech). Pożądany fragment cdna oczyszcza się z uzyskanego produktu PCR i łączy z wektorem, a Zrekombinowany wektor wprowadza się do E. coli. Kolonie zawierające Zrekombinowane wektor izoluje się i otrzymuje z nich wektor. Sekwencję nukleotydową wektora potwierdza się znanymi metodami, takimi jak metoda terminacji syntezy DNA dideoksynukleotydami. Po wytworzeniu DNA kodującego region V pożądanego przeciwciała, DNA to łączy się z DNA kodującym region stały (region C) pożądanego przeciwciała, a następnie cały konstrukt wstawia w wektor ekspresyjny. Sposobem według wynalazku można też DNA kodujący region V pożądanego przeciwciała wstawić w wektor ekspresyjny, który już zawiera DNA kodujący region stały (region C) przeciwciała. W celu wytworzenia przeciwciała sposobem według wynalazku gen kodujący przeciwciało włącza się do wektora ekspresyjnego tak, że jest on pod kontrolą regionu regulującego ekspresję na przykład, regionu wzmacniającego i promotorowego. Następnie wektor ekspresyjny wprowadzą się do komórek gospodarza, które wytwarzają to przeciwciało. 1-3 Zmienione przeciwciała W celu zmniejszenia heterogenicznej odpowiedzi immunologicznej u człowieka, sposobem według wynalazku wytwarza się też zmienione Zrekombinowane przeciwciało, takie jak przeciwciało chimerowe lub przeciwciało o cechach przeciwciała ludzkiego. Takie zmienione przeciwciało wytwarza się znanymi metodami. Przeciwciało chimerowe wytwarza się przez połączenie DNA kodującego region V pożądanego przeciwciała z DNA kodującym region stały ludzkiego przeciwciała, a następnie

9 wstawienie całego konstruktu w wektor ekspresyjny i wprowadzenie takiego wektora do komórek gospodarza, które wytwarzają to przeciwciało (patrz Europejskie zgłoszenie patentowe EP i Międzynarodowe zgłoszenie patentowe WO 96/02576). Chimerowc przeciwciało użyteczne sposobem według wynalazku wytwarza się tymi metodami. Na przykład, bakterie E. coli niosące plazmid zawierający DNA kodujący łańcuch L regionu V lub łańcuch H regionu V chimerowego przeciwciała przeciw antygenowi HM1.24, zostały złożone zgodnie z postanowieniami międzynarodowego Traktatu Budapesztańskiego jako Escherichia coli DH5a (puc l-gk) i Escherichia coli DH5a (puc h-gyl), 29 sierpnia 1996 roku w National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, 1-3 Higashi 1-chome, Tsukuba city, Ibaraki pref., Japonia jako odpowiednio FERM BP-5646 i FERM BP-5644 (patrz Japońskie Zgłoszenie Patentowe No ). Przeciwciało o cechach przeciwciała ludzkiego, zwane także przeciwciałem ludzkim o zmienionym kształcie wytwarza się przez przeniesienie regionu określającego komplementamość (CDR) przeciwciała ssaka innego niż człowiek, na przykład myszy, do CDR ludzkiego przeciwciała. Ogólne techniki rekombinacji DNA umożliwiające wytworzenie takich przeciwciał są także znane (patrz Europejskie zgłoszenie patentowe EP i Międzynarodowe zgłoszenie patentowe WO 96/02576). Bardziej szczegółowo, sekwencję DNA łącząca CDR regionu mysiego przeciwciała z regionem szkieletowym (FR) ludzkiego przeciwciała syntetyzuje się metodą PCR z kilku oddzielnych oligonukleotydów mających na końcach nakładające się sekwencje. Tak wytworzony DNA łączy się z DNA kodującym region C ludzkiego przeciwciała, a następnie wstawia się cały konstrukt w wektor ekspresyjny. Taki wektor wprowadza się w do komórek gospodarza, które wytwarzają to przeciwciało (patrz Europejskie zgłoszenie patentowe EP i Międzynarodowe zgłoszenie patentowe WO 96/02576). Regiony szkieletowe ludzkiego przeciwciała połączone przez CDR wybiera się tak, żeby regiony określające komplementamość tworzyły korzystne miejsce wiązania antygenu. Jeżeli istnieje taka potrzeba aminokwasy regionów szkieletowych regionu zmiennego przeciwciała należy tak zastąpić, żeby regiony określające komplementamość przeciwciała o zmienionym kształcie tworzyły odpowiednie miejsce wiązania antygenu (Sato, K. I wsp., Cancer Res. (1993) 53, ). Na przykład, bakterie E. coli niosące plazmid zawierający DNA kodujący wersję r (SEQ ID NO: 2) łańcucha L regionu V i kodujący wersję r (SEQ ID NO: 3) łańcucha H, regionu V przeciwciała przeciw antygenowi HM1.24, o cechach przeciwciała ludzkiego zostały złożone zgodnie z postanowieniami międzynarodowego Traktatu Budapesztańskiego jako Escherichia coli DH5a (puc19-rvla-ahm-gk) i Escherichia coli DH5oc (puc19-rvhr- AHM-gyl) 29 sierpnia 1996 roku w National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, 1-3 Higashi 1-chome, Tsukuba city, Ibaraki pref., Japonia jako odpowiednio FERM BP-5645 i FERM BP-5643 (patrz Japońskie Zgłoszenie Patentowe No ). Ponadto, bakterie E. coli niosące plazmid zawierający DNA kodujący kodujący wersję s (SEQ ID NO: 4) łańcucha H, regionu V przeciwciała przeciw antygenowi HM1.24, o cechach przeciwciała ludzkiego zostały złożone zgodnie z postanowieniami międzynarodowego Traktatu Budapesztańskiego jako Escherichia coli DH5a (puc19-rvhs-ahm- gyl) 29 sierpnia 1996 roku w National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, 1-3 Higashi 1-chome, Tsukuba city, Ibaraki pref., Japonia jako FERM BP-6127 (patrz Japońskie Zgłoszenie Patentowe No ). Region C ludzkiego przeciwciała użyty jako region stały do wytworzenia chimerowego przeciwciała lub przeciwciała o cechach przeciwciała ludzkiego jest korzystnie ludzkim regionem Cyl, Cy2, Cy3 łub Cy4. Z przeciwciał zawierających te regiony, korzystne są przeciwciała zawierające region Cyl i Cy3 ponieważ maja silną aktywność cytotoksyczną, to znaczy aktywność ADCC i aktywność CDC. Chimerowe przeciwciało zawiera region zmienny przeciwciała pochodzącego od ssaka, innego niż człowiek i region C, pochodzący z przeciwciała ludzkiego. Przeciwciało o cechach przeciwciała ludzkiego, zawiera regiony określające komplementamość, pochodzące

10 z przeciwciała ssaka innego niż człowiek, a regiony szkieletowe i region C, pochodzące z przeciwciała ludzkiego. Antygenowość takich przeciwciał w organizmie człowieka jest mała, dlatego są one użyteczne jako substancje czynne wytworzone sposobem według wynalazku. Korzystny przykład wykonania sposobem według wynalazku ludzkiego przeciwciała, obejmuje przeciwciało przeciw antygenowi HM1.24 o cechach przeciwciała ludzkiego (patrz Japońskie Zgłoszenie Patentowe No ). Korzystny przykład wykonania sposobem według wynalazku łańcucha L regionu V przeciwciała przeciw antygenowi HM1.24 o cechach przeciwciała ludzkiego obejmuje łańcuch L regionu V o sekwencji aminokwasowej przedstawionej na SEQ ID NO: 2. Korzystny przykład wykonania sposobem według wynalazku łańcucha H regionu V przeciwciała przeciw antygenowi HM1.24 o cechach przeciwciała ludzkiego obejmuje łańcuch H regionu V o sekwencji aminokwasowej przedstawionej na SEQ ID NO: 3 lub Ekspresja i wytwarzanie Znanymi w sztuce metodami poddaje się ekspresji opisane powyżej geny kodujące przeciwciała i otrzymuje się te przeciwciała. W przypadku komórek ssaków ekspresję prowadzi się przy użyciu wektora ekspresyjnego zawierającego popularny promotor, gen przeciwciała i funkcjonalnie z nim połączony w kierunku 3' DNA zawierający sygnał poli A lub wektor zawierający to DNA. Przykład regionu wzmacniającego/promotorowego obejmuje wczesny region wzmacniający/promotorowy ludzkiego cytomegalowirusa. Inne regiony wzmacniające/promotorowe, których używa się sposobem według wynalazku do uzyskania ekspresji przeciwciała, obejmują wirusowe regiony wzmacniające/promotorowe, takie jak region wzmacniaj ący/promotorowy retrowirusów, wirusa poliomy, adenowirusa i wirusa małpiego 40 (SV40) i regiony wzmacniające/promotorowe pochodzące z komórek ssaków, takie jak ludzki czynnik wydłużający l a (HEF1α). Ekspresję łatwo prowadzi się metodą opisaną przez Mullingan i wsp., (Nature (1990) 18, 5322) przy użyciu regionu wzmacniaj ącego/promotorowego wirusa SV40 lub metodą opisaną przez Mizushima i wsp., (Nucleic acid Res. (1990) 18, 5322) przy użyciu regionu wzmacniaj ącego/promotorowego HEF1α. W przypadku E. coli ekspresję uzyskuje się łącząc funkcjonalnie jeden ze znanych promotorów, sekwencję sygnałową wydzielania przeciwciała i gen kodujący przeciwciało. Jako promotorów używa się, na przykład promotor lacz i promotor arab. Ekspresję łatwo prowadzi się metodą opisaną przez Ward i wsp., (Naturę (1998) 341, ; FASEB J. (1992) 6, ) przy użyciu promotora lacz lub metodą opisaną przez Better i wsp., (Science (1988) 240, ) przy użyciu promotora arab. Jeżeli przeciwciało wytwarza się w periplazmie E. coli jako sekwencji sygnałowej używa się sekwencji sygnałowej pe1b (Lei, S.P. i wsp., J. Bacteriol. (1987) 169, 4379). Po wyizolowaniu przeciwciała wytworzonego w periplazmie, przed jego zastosowaniem przywraca się odpowiednią strukturę przeciwciała (patrz na przykład WO 96/30394). Sposobem według wynalazku używa się miejsce początku replikacji, pochodzące z wirusa SV40, wirusa poliomy, adenowirusa lub wirusa brodawczaka bydła (BVP). W celu zwiększenia liczby kopii genu w komórkach gospodarza, wektor ekspresyjny może zawierać marker selekcyjny, taki jak gen transferazy aminoglikozydowej (AHP), gen kinazy tymidyno wej (TH), gen fosforybozylotransferazy ksantyna:guanina E. coli (Ecogtp) lub gen reduktazy dihydrofolianowej (dhfr). Do wytwarzania przeciwciała sposobem według wynalazku można użyć każdego systemu. System wytwarzania przeciwciała obejmuje systemy wytwarzania in vitro i in vivo. Systemy in vitro obejmują systemy wytwarzania wykorzystujące komórki eukariotyczne i systemy wytwarzania wykorzystujące komórki prokariotyczne. Jeżeli używa się komórek eukariotycznych systemy wytwarzania obejmują komórki zwierzęce, komórki roślinne i komórki grzybów. Znane komórki zwierzęce obejmują (1) komórki ssaków, takie jak komórki CHO, komórki COS, komórki szpiczaka, komórki nerki chomika miniaturowego (BHK), komórki HeLa i komórki Vero, (2) komórki gadów, takie jak oocyty Kenopus lub (3) komórki owadów, takie jak komórki sf9, komórki sf21 i komórki Tn5. Znane komórki roślinne obejmują, na przykład komórki pochodzące od roślin z rodzaju Nicotiana, bardziej szczegółowo Nicotiana tabacum (tytoń), znajdujące się w hodowli w po-

11 staci kallusa. Znane komórki grzybowe obejmują, na przykład komórki drożdży z rodzaju Saccharomyces, bardziej szczegółowo Saccharomyces cereviceae lub grzybów strzępkowych takie jak grzyby z rodzaju Aspergillus, bardziej szczegółowo Aspergillus niger. Jeżeli używa się komórek prokariotycznych systemy wytwarzania obejmują komórki bakteryjne. Znane komórki bakteiyjne obejmują Escherichia coli (E. coli) i Bacillus subtilis. Przeciwciało wytwarza się wprowadzając metodą transformacji gen kodujący pożądane przeciwciało do tych komórek i hodując transformowane komórki in vitro. Hodowle prowadzi się znanymi sposobami. Jako podłoża do hodowli używa się na przykład, DMEM, MEM, RPMI1640 i IMDM wzbogaconego w surowicę na przykład, płodową surowicę bydlęcą (FCS). Ponadto przeciwciało można wytwarzać in vivo, wszczepiając komórki zawierające gen kodujący przeciwciało do jamy brzusznej zwierzęcia. Kolejnym systemem wytwarzania przeciwciała in vivo jest system wykorzystujący zwierzęta i system wykorzystujący rośliny. System wykorzystujący zwierzęta obejmuje system wykorzystujący ssaki i owady. W systemie wykorzystującym ssaki używa się kóz, świń, owiec, myszy i bydła (Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993). W systemie wykorzystującym owady używa się jedwabników. W systemie wykorzystującym rośliny używa się, na przykład tytoniu. Do takich zwierząt lub roślin wprowadza się geny kodujące przeciwciało i odzyskuje się przeciwciała wytwarzane przez takie zwierzęta lub rośliny. Na przykład, w celu wytworzenia genu połączonego, gen kodujący przeciwciało wprowadza się w środek genu kodującego białko, które jest naturalnie wytwarzane w mleku, takie jak [3-kazeina kóz. Fragment DNA zawierający gen połączony do którego wstawiono gen kodujący przeciwciało wstrzykuje się embrionowi kozy i taki embrion umieszcza się w macicy kozy. Pożądane przeciwciało uzyskuje się z mleka transgenicznego zwierzęcia urodzonego przez kozę której wszczepiono zmieniony embrion lub od jej potomstwa. W celu zwiększenia ilości mleka zawierającego pożądane przeciwciało wytwarzanego przez transgeniczną kozę, można jej podawać odpowiednie hormony (Ebert, K.M. i wsp., Bio/Technology (1994) 12, ). W przykładzie wykonania sposobu według wynalazku, w którym używa się jedwabników, jedwabniki te infekuje się bakulowirusem, do którego wstawia się gen kodujący pożądane przeciwciało. Przeciwciało to odzyskuje się z płynów ciała jedwabnika (Susumu, M. I wsp., Naturę (1985) 315, ). W przykładzie wykonania sposobu według wynalazku w którym używa się tytoniu, gen kodujący pożądane przeciwciało wstawia się w roślinny wektor ekspresyjny, na przykład pmon 530 i taki wektor wprowadza się do bakterii, takich jak Agrobacterium tumefaciens. W celu uzyskania pożądanych przeciwciał z liści rośliny, bakteriami zawierającymi wektor infekuje się tytoń, taki jak Nicotiana tabacum (Julian, K.-C. Ma i wsp., Eur J. Immunol. (1994) 24, ). Jeżeli przeciwciało wytwarza się w opisanych powyżej systemach in vitro lub in vivo, DNA kodujący ciężki łańcuch (łańcuch H) przeciwciała i DNA kodujący lekki łańcuch (łańcuch L) przeciwciała, wprowadza się do dwóch oddzielnych wektorów ekspresyjnych, a komórki gospodarza transfermuje się jednocześnie oboma wektorami, lub DNA kodujący ciężki łańcuch (łańcuch H) przeciwciała i DNA kodujący lekki łańcuch (łańcuch L) przeciwciała, wprowadza się do jednego wektora ekspresyjnego, którym transformuje się komórki gospodarza (patrz Międzynarodowe zgłoszenie patentowe WO ). W celu otrzymania zmodyfikowanego przeciwciała, przeciwciało wytworzone sposobem według wynalazku, można sprzęgnąć z różnymi cząsteczkami, takimi jak glikol polietylenowy (PEG). Użyty tu termin pizeciwciało obejmuje także takie zmodyfikowane przeciwciała. W celu otrzymania zmodyfikowanego przeciwciała, przeciwciało wytworzone sposobem według wynalazku można zmodyfikować metodami chemicznymi. Metody te są znane biegłym w sztuce. 2. Izolowanie i oczyszczanie przeciwciała 2-1. Izolowanie i oczyszczanie przeciwciała Przeciwciało wytworzone sposobem według wynalazku izoluje się z wnętrza komórki lub z jej otoczenia lub z gospodarza, a następ-

12 nie oczyszcza się je do postaci homogennej. Izolowanie i oczyszczanie przeciwciała wytworzonego sposobem według wynalazku prowadzi się metodą chromatografii powinowactwa. W tym celu używa się kolumny Protein A lub kolumny Protein G. Nośnikami używanymi w kolumnie Protein A są Hyper D, POROS i Sepharose F.F. Przeciwciała wytworzone sposobem według wynalazku, izoluje się i oczyszcza także wszystkimi znanymi tradycyjnymi metodami izolowania i oczyszczania białek. Izolowanie i oczyszczanie przeciwciała wytworzonego sposobem według wynalazku prowadzi się łącząc inne rodzaje chromatografii, ultrafiltrację, wysalanie i dializę. Chromatografia obejmuje, na przykład chromatografię hydrofobową, filtrację przez żel. Do chromatografii można użyć HPLC. Używa się także H chromatografii z odwróconymi fazami. 2-2 Określenie stężenia przeciwciała Stężenie przeciwciała wytworzonego w punkcie 2-1 określa się mierząc absorbancję lub metodą immunosorbcyjną (ELISA). Jeżeli określenia stężenia przeciwciała dokonuje się metodą pomiaru absorbancji, przeciwciało wytworzone sposobem według wynalazku lub próbkę zawierającą takie przeciwciało, rozcieńcza się odpowiednio PBS(-) i mierzy się absorbancję przy długości fali 280 nm. Ilość przeciwciała oblicza się na podstawie współczynnika absorbancji wynoszącego 1,35 OD dla roztworu 1 mg/ml. Jeżeli określenia stężenia przeciwciała dokonuje się metodą immunosorbcyjną pomiar prowadzi się następująco: do studzienek 96- -studzienkowej mikropłytki (NUNC) dodaje się 100 μl przeciwciała przeciw człowiekowi IgG kozy (BIO SOURCE) rozcieńczonego do stężenia 1 μg/ml 0,2 M buforem węglanowym, ph 9,6 i inkubuje się taką mikropłytkę przez noc w temperaturze 4 C w celu immobilizacji przeciwciała. Po zablokowaniu mikropłytki, do studzienek dodaje się 100 μl odpowiednio rozcieńczonych przeciwciał wytworzonych sposobem według wynalazku lub 100 μl próbki zawierającej takie przeciwciała lub jako standard 100 μl ludzkich przeciwciał IgG o znanym stężeniu i inkubuje się przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Po przepłukaniu do studzienek dodaje się 100 μl 5000 razy rozcieńczonego roztworu przeciwciała przeciw człowiekowi IgG sprzęgniętego z fosfatazą alkaliczną (BIO SOURCE) i inkubuje się przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Po przepłukaniu, do studzienek dodaje się roztworu substratu i mierzy absorbancję przy długości fali 405 nm, za pomocą MICROPLATE READER Model 3550 (Bio Rad). Następnie oblicza się stężenie pożądanego przeciwciała. 3. Analiza FCM Zdolność wiązania się przeciwciała wytworzonego sposobem według wynalazku z komórkami nowotworów układu chłonnego bada się metodą cytometrii przepływowej (FCM). Do badań używa się komórek nowotworów układu chłonnego pochodzących od stałych linii lub świeżo wyizolowanych. Stałe linie obejmują, na przykład linie limfocytów T RPMI 8402 (ATCC CRL-1994), CCRF-CEM (ATCC ĆCL-119) pochodząca od pacjenta z ostrą białaczką limfoblastyczną, HBP-ALL (FCCH1018) pochodząca od pacjenta z ostrą białaczką limfocytową, HBP-MTL (FCCH1019) pochodząca od pacjenta z białaczką limfocytów T, JM (FCCH1023) pochodząca od pacjenta z ostrą białaczką limfocytową, MOLT-4 (ATCC CRL- 1582) pochodząca od pacjenta z ostrą białaczką limfoblastyczną, Jurkat (FCCFI1024) pochodząca od pacjenta z ostrą białaczką limfocytową, CCRF-HSB-2 (ATCC CCL-120.1) pochodząca od pacjenta z ostrą białaczką limfoblastyczną, MT-1 (FCCH1043) pochodząca od pacjenta z białaczką limfocytową z dojrzałymi komórkami T, KT-3 pochodząca od pacjenta z białaczką Lennerta (LIT). Linie limfocytów B obejmują transformowane wirusem EB komórki CESS (ATCC TIB-190), wykazujące obecność wirusa EB limfocyty B linii SKW 6.4 (ATCC TIB-215), MC116 (ATCC CRL-1649) pochodząca od pacjenta z białaczką limfocytową z komórkami B, CCRF-SB (ATCC CCL-120) pochodząca od pacjenta z ostrą białaczką limfoblastyczną z komórkami B, RPMI 6410 (FCCH6047) pochodząca od pacjenta z ostrą białaczką mielocytamą, linię Daudi (ATCC CCL-213) pochodzącą od pacjenta z białaczką Burkitta, EB-3 (ATCC CCL-85) pochodzącą od pacjenta z białaczką Burkitta, Jijoye (ATCC CCL-87) pochodząca od pacjenta z białaczką Burkitta, Raj i (ATCC CCL-86) pochodzącą od pacjenta z białaczką Burkitta. Linie komórek nie-t i nie-b obejmują linię HL60 (ATCC CCL- -240) pochodzącą od pacjenta z ostrą białaczką mielocytarną, linię THP-1 (ATCC TIB- -202) pochodzącą od pacjenta z ostrą białaczką monocytarną, linię U937 (ATCC CRL-

13 ) pochodzącą od pacjenta z chłoniakiem monocytamym, linię K562 (ATCC CCL-243) pochodząca od pacjenta z chroniczną białaczką mielocytarną. Po przemyciu wymienionych komórek buforem PBS(-), dodaje się do nich 100 μl przeciwciała lub przeciwciała kontrolnego rozcieńczonego, do stężenia 25 μg/ml buforem FACS (PBS(-) zawierającym 2% płodowej surowicy cielęcej i 0,1% azydku sodowego) i inkubuje się przez 30 minut na lodzie. Po przemyciu buforem FACS dodaje się 100 μl roztworu 25 μg/ml przeciwciała kozy przeciw myszy znakowanego FITC (GAM, Becton Dickinson) i inkubuje się przez 30 minut na lodzie. Po przemyciu buforem FACS komórki zawiesza się w 600 ml lub 1ml buforu FACS i mierzy się intensywność fluorescencji przy użyciu FACScan (Becton Dickinson). Mierząc wartość intensywności fluorescencji dla poszczególnych komórek określa się reaktywność przeciwciała wytworzonego sposobem według wynalazku w stosunku do tych komórek. Mierząc wartość intensywności fluorescencji dla poszczególnych komórek określa się czy antygen HM1.24 znajduje się na powierzchni komórki (odpowiedź pozytywna lub negatywna) i można określić intensywność ekspresji tego antygenu. Obecność i intensywność ekspresji antygenu HM1.24 na powierzchni komórek nowotworów układu chłonnego, zmierzona metodą FCM, przedstawiono w przykładzie 2.2 poniżej. Przeciwciało wytworzone sposobem według wynalazku niszczy tylko komórki nowotworów układu chłonnego, które maja antygen HM1.24 na powierzchni. Bardziej szczegółowo, przeciwciało wytworzone sposobem według wynalazku niszczy tylko takie komórki nowotworów układu chłonnego, które dają odpowiedź pozytywną na obecność antygenu HM1.24 w ilości nie mniejszej niż 5%. Bardziej szczegółowo, przeciwciało wytworzone sposobem według wynalazku niszczy tylko takie komórki nowotworów układu chłonnego, które dają odpowiedź pozytywna na obecność antygenu HM1.24, w ilości 20% łub więcej. Bardziej szczegółowo, przeciwciało wytworzone sposobem według wynalazku, niszczy tylko takie komórki nowotworów układu chłonnego, które dają odpowiedź pozytywną na obecność antygenu HM1.24, w ilości 50%) lub więcej. Bardziej szczegółowo, przeciwciało wytworzone sposobem według wynalazku niszczy tylko takie komórki nowotworów układu chłonnego, które dają odpowiedź pozytywną na obecność antygenu HM1.24 w ilości 80% lub więcej. 4. Aktywność cytotoksyczna 4-1. Pomiar aktywności CDC Przeciwciało wytworzone sposobem według wynalazku wykazuje jako aktywność cytotoksyczna aktywność CDC. Aktywność CDC środka terapeutycznego wytworzonego sposobem według wynalazku mierzy się następująco: w odpowiednim podłożu przygotowuje się 4 x 105 komórek testowych, na przykład w podłożu RPMI1640 zawierającym 10% płodowej surowicy bydlęcej (Gibco-BRL). Jako komórek testowych używa się CCRF-CEM (ATCC CCL-119), CCRF- HSB-2 (ATCC CCL-120.1) HBP-MTL (FCCH1019), MCH6 (ATCC CRL-1649), CCRF-SB (ATCC CCL-120), EB-3 (ATCC CCL-85), K562 (ATCC CCL-243). 50 μl zawiesiny komórek, dodaję się do studzienek, 96-studzienkowej mikropłytki o studzienkach z płaskim dnem (FALCON) i inkubuje się taką mikropłytkę przez noc, w temperaturze 37 C w atmosferze CO2. Następnie dodaje się takiego przeciwciała, którego aktywność CDC ma być zmierzona, i inkubuje się przez 60 minut. Po inkubacji, do studzienek dodaje się na 2 godziny, odpowiednio rozcieńczony roztwór komplementu, na przykład Baby Rabbit Complement (CADARLANE) i do każdej studzienki dodaje się 10 μl Alamar Bulę (BIO SOURCE) i inkubuje przez 4 godziny. Następnie mierzy się intensywność fluorescencji każdej studzienki, przy użyciu aparatu pomiarowego Cytoflour 2350 (MILLIPORE) przy długości fali wzbudzenia 530 nm i długości fali emisji 590 nm. Aktywność cytotoksyczna (%) oblicza się ze wzoru (A-C)/(B-C) x 100, w którym A oznacza intensywność fluorescencji próbek inkubowanych w obecności przeciwciała, B oznacza intensywność fluorescencji próbek, inkubowanych w podłożu bez przeciwciała, C oznacza intensywność fluorescencji próbek niezawierających komórek.

14 Pomiar aktywności ADCC Przeciwciało wytworzone sposobem według wynalazku wykazuje jako aktywność cytotoksyczna aktywność ADCC. Aktywność ADCC środka terapeutycznego wytworzonego sposobem według wynalazku mierzy się następująco: jako komórki efektorowe z ludzkiej krwi obwodowej lub ze szpiku kostnego, izoluje się metodą wirowania komórki jednojądrzaste. Przygotowuje się komórki testowe, na przykład CCRF-CEM (ATCC CCL-119), CCRF-HSB-2 (ATCC CCL-120.1) HBP-MTL (FCCH1019), EB-3 (ATCC CCL-85), MCI 16 (ATCC CRL-1649), CCRF-SB (ATCC CCL-120), K562 (ATCC CCL-243), wyznakowane 5 Cr. Do znakowanych komórek testowych dodaje się przeciwciała, którego aktywność ADCC ma być zmierzona, i inkubuje się. Po inkubacji, do komórek testowych dodaje się w odpowiedniej proporcji komórek efektorowych i znów inkubuje. Po inkubacji, zbiera się nadsącz i mierzy jego radioaktywność w liczniku gamma. Do określenia całkowitej aktywności próbki, rozpuszcza się komórki w 1% roztworze NP-40. Aktywność cytotoksyczna (%) oblicza się ze wzoru (A-C)/(B-C) x 100, w którym A oznacza radioaktywność (cpm) uwolnioną z próbek inkubowanych w obecności przeciwciała, B oznacza radioaktywność (cpm) uwolnioną przez NP-40, C oznacza radioaktywność (cpm), uwolnioną z próbek niezawierających komórek i przeciwciała Zwiększenie aktywności cytotoksycznej. Korzystne przeciwciało, wykazujące aktywność cytotoksyczną, taką jak CDC lub ADCC, posiada jako region stały (region C) region Cy, szczególnie Cyl i Cy3 ludzkiego przeciwciała. Można także uzyskać silniejszą aktywność CDC lub ADCC dodając, zaburzając lub modyfikując część aminokwasów regionu C przeciwciała. Jako przykład, można podać wytworzenie polimeru podobnego do IgM z IgG przez zastąpienie aminokwasów (Smith, R.I.F. & Morrison, S.L. BIO/TECHNOLOGY (1994) 12, ), wytworzenie polimeru podobnego do IgM z IgG przez dodanie aminokwasów (Smith, R.I.F. i wsp., J. Immunology (1995) 154, ), ekspresję genów kodujących łańcuch L połączonych w układ tandemowy (Shuford, W. i wsp., Science (1991) 252, ), dimeryzację IgG przez zastąpienie aminokwasów (Caron, P.C. i wsp., exp. Med. (1992) 176, , Shopes, B., Immunology (1992) 148, ), dimeryzację IgG przez chemiczną modyfikację aminokwasów (Wolff, E. A. I wsp., Cancer Res. (1993) 53, ), wprowadzenie funkcji efektorowej przez zmianę aminokwasu lub aminokwasów regionu zawiasowego przeciwciała (Norderhaug, L. I wsp., Eur. J. Immunol. (1991) 21, ). Można to osiągnąć metodą oligomerowej specyficznej miejscowo mutagenezy z zastosowaniem primerów, dodanie sekwencji zasad, wykorzystując miejsca rozpoznawane przez enzymy restrykcyjne lub używając związków chemicznych tworzących wiązanie kowalencyjne. 5. Potwierdzenie działania terapeutycznego Działanie terapeutyczne środka terapeutycznego, przeciw komórkom nowotworów układu chłonnego, wytworzonego sposobem według wynalazku, potwierdza się podając przeciwciało wytworzone sposobem według wynalazku zwierzętom, którym przeszczepiono komórki nowotworów układu chłonnego i badając przeciwnowotworowe działanie środka terapeutycznego. Komórki nowotworów układu chłonnego, które podaje się zwierzętom obejmują komórki pochodzące od stałych linii lub linii świeżo wyizolowanych. Komórki pochodzące od stałych linii obejmują komórki linii limfocytów T, na przykład CCRF-CEM (ATCC CCL- 119), HBP-MTL (FCCH1019), CCRF-HSB-2 (ATCC CCL-120.1). komórki linii limfocytów B, na przykład CESS (ATCC TIB-190), SKW 6.4 (ATCC TIB-215), CCRF-SB (ATCC CCL-120), RPML 6410 (FCCH6047) EB-3 (ATCC CCL-85). Do potwierdzenia działania terapeutycznego korzystnie używa się zwierząt o zmniejszonej odpowiedzi immunologicznej łub zwierząt jej pozbawionych. Przykładami takich zwierząt, których używa się do potwierdzenia działania terapeutycznego sposobu według wynalazku są myszy nudę, myszy SCID, myszy beige i szczury nudę. Działanie przeciwnowotworowe mierzy się określając objętość i wagę nowotworu lub czas przeżycia zwierząt. Jak pokazano w przykładach poniżej przeciwciała przeciw antygenowi HM1.24 powodują zahamowanie wzrostu objętości nowotworu i co więcej wydłużenie czasu przeżycia

15 zwierząt z przeszczepionym nowotworem. Potwierdza to przeciwnowotworowe działanie przeciwciał przeciw antygenowi HM Sposób podawania i preparowanie farmaceutyczne Środek terapeutyczny przeciw komórkom nowotworów układu chłonnego wytworzony sposobem według wynalazku, podaje się systemowo lub miejscowo, drogą pozajelitową, na przykład jako wstrzyknięcie dożylne w postaci infuzji kroplowej, wstrzyknięcie domięśniowe, wstrzyknięcie dootrzewnowe i wstrzyknięcie podskórne. Sposób podawania wybiera się w zależności od wieku i stanu pacjenta. Dawka efektywna wynosi od 0,01 mg do 100 mg na kilogram wagi ciała, na jedno traktowanie. Alternatywnie podaje się dawkę od 1mg do 5000 mg, korzystnie od 5 mg do 50 mg na pacjenta. W zależności od sposobu podania, środek terapeutyczny przeciw komórkom nowotworów układu chłonnego wytworzony sposobem według wynalazku, może zawierać farmaceutycznie akceptowane nośniki lub dodatki, Takie nośniki lub dodatki obejmują wodę, farmaceutycznie akceptowane rozpuszczalniki organiczne, kolagen, alkohol poliwinylowy, poliwinylopirolidynę, polimer karboksy winylowy, sól sodową karboksymetylocełulozy, poliakrylan sodowy, ałginian sodowy, dekstran rozpuszczalny w wodzie, sól sodową karboksymetyloskrobii, pektynę, metylocelulozę, etylocelulozę, gumę ksantanowa, gumę arabską, kazeinę, żelatynę, agar, diglicerynę, glikol propylenowy, glikol polietylenowy, wazelinę, parafinę, alkohol stearynowy, kwas stearynowy, albuminę surowicy ludzkiej (HSA), mannitol, sorbitol, laktozę i farmaceutycznie akceptowany związek powierzchniowoczynny. W zależności od dawki i formy podawania, wybiera się dodatki z wymienionej wyżej listy, która jednak nie wyczerpuje wszystkich możliwych dodatków, lub tworzy się ich połączenia. Sposobem według wynalazku leczy się nowotwory układu chłonnego (wyłączają szpiczaki) których komórki na swojej powierzchni mają antygen, z którym może się związać przeciwciało wytworzone sposobem według wynalazku. Wymienić można ostre białaczki limfocytowe z komórkami B (B-ALL), chroniczne białaczki limfocytowe B z komórkami (B- -CLL), chłoniak z komórkami pre-b, chłoniak Burkitta, chłoniak grudkowy, chłoniak grudkowy płaszcza i chłoniak rozproszony, ostre białaczki limfocytowe z komórkami T (T-ALL), chroniczne białaczki limfocytowe z komórkami T (T-CLL), białaczkę limfocytową z dojrzałymi komórkami T (ATL), chłoniak nie-atl z komórkami T (PNTL). Środek terapeutyczny wytworzony sposobem według wynalazku jest użyteczny do leczenia tych nowotworów układu chłonnego. Przykłady Sposób według wynalazku będzie bardziej szczegółowo wyjaśniony poniżej w oparciu o ilustrujące go przykłady. Należy pamiętać poniższe przykłady nie ograniczają zakresu wynalazku. Przykład 1. Wytwarzanie przeciwciała przeciw antygenowi HM Wytwarzanie wysięku zawierającego przeciwciało przeciw antygenowi HM1.24. Komórki hybrydowe wytwarzające przeciwciało przeciw antygenowi HM1.24 otrzymano według metody opisanej przez Goto i wsp. (Blood (1994) 84, ). 5 x 105 komórek hybrydowych wstrzykuje się dootrzewnowo myszom BALB/c (CLEA, Japonia), którym 11 i 3 dni wcześniej podano dootrzewnowe po 500 (il 2,6,10,14-tetrametylopentadekanu (Wako Pure Chemical Industries, Ltd). Od 10 dnia po wstrzyknięciu komórek hybrydowych wysięk zbierający się w jamie brzusznej myszy, pobiera się poprzez założoną na stałe igłę typu Happycas nr 19 (Medikit). Zebrany wysięk wiruje się dwa razy, przy szybkości 1000 i 3000 obrotów na minutę, na wirówce wolnoobrotowej RLK-131 (Tomy Seiko), w celu usunięcia komórek hybrydowych i zanieczyszczeń, takich jak komórki krwi. 2. Oczyszczanie przeciwciała przeciw antygenowi HM1.24 otrzymanego z mysiego wysięku Oczyszczanie przeciwciała przeciw antygenowi HM1.24 otrzymanego z mysiego wysięku prowadzi się następująco: do wysięku dodaje się równa ilość PBS(-) i mieszaninę filtruję się przez włóknisty filtr płuczkowy Mediaprep (MILLIPORE) i oczyszcza się metodą chromatografii powinowactwa, przy użyciu aparatu do szybkiego oczyszczania przeciwciał ConSep LC100 (MILLIPORE) stosując kolumnę Hyper D Protein A (objętość kolumny 20 ml, wytwórca Nihon Gaisi), i zgodnie z załączoną instrukcją PBS(-), jako bufor do adsorpcji i 0,1 M cytrynian sodowy (ph 4), jako bufor do wymywania. Wymyte frakcję natychmiast doprowadza się do ph

16 ,4 przez dodanie 1 M Tris-HCl (ph 8,0), zatęża za pomocą aparatu do ultra-filtracji grawitacyjnej Centriprep 10. Jednocześnie z zatężeniem prowadzi się wymianę buforu na PBS. Po zatężeniu, roztwór przeciwciała sterylizuje się poprzez filtrację się przez filtr membranowy MILLEX-GV (MILLIPORE), o wielkości porów 0,22 μm i uzyskuje się oczyszczone przeciwciało przeciw antygenowi HM Określenie stężenia przeciwciała Stężenia oczyszczonego przeciwciała określa się mierząc absorbancję. Oczyszczone przeciwciało rozcieńcza się w PSS(-) i mierzy się absorbancję przy długości fali 280 nm. Ilość przeciwciała oblicza się na podstawie współczynnika absorbancji wynoszącego 1,35 OD dla roztworu 1 mg/ml. Przykład 2. Badanie reaktywności przeciwciała przeciw antygenowi HM 1.24 przeciw nowotworom układu chłonnego 1. Oczyszczanie kontrolnego mysiego IgG2a. Kontrolne mysie IgG2a oczyszcza się następująco: dostępny w handlu wysięk przeciwciał IgG2a (KAPPA) (UPC 10) (wytwórca KAPPA) rozpuszcza się w wodzie i PBS(-). Roztwór filtruje się przez filtr membranowy Acrodisc (wytwórca Gelman Sciences) o wielkości porów 0,22 μm i oczyszcza się metoda chromatografii powinowactwa, przy użyciu aparatu do szybkiego oczyszczania przeciwciał ConSep LC100 (MILLIPORE), stosując kolumnę Hyper D Protein A (objętość kolumny 20 ml, wytwórca Nihon Gaisi), i zgodnie z załączoną instrukcją PBS(-) jako bufor do adsorpcji i 0,1 M cytryian sodowy (ph 4) jako bufor do wymywania. Wymyte frakcje natychmiast doprowadza się do ph 7,4 przez dodanie 1 M Tris-HCl (ph 8,0), zatęża za pomocą aparatu do ultrafiltracji grawitacyjnej Centriprep 10. Jednocześnie z zatężeniem prowadzi się wymianę buforu na PBS. Po zatężeniu roztwór przeciwciała sterylizuje się poprzez filtrację przez filtr membranowy MILLEX-GV (MILLIPORE) o wielkości porów 0,22 μm i uzyskuje się oczyszczone kontrolne mysie przeciwciało I-gG2a. Określenie stężenia przeciwciała Stężenie oczyszczonego kontrolnego mysiego przeciwciała IgG2a określa się tak jak w punkcie 3 powyżej. 2. Analiza FCM Reaktywność wytworzonego sposobem według wynalazku przeciwciała przeciw antygenowi HM 1.24, przeciw komórkom nowotworów układu chłonnego, bada się metoda cytometrii przepływowej (FCM). Po przemyciu buforem PBS(-) linii limfocytów T RPMI 8402 (ATCC CRL-1994), linii CCRF-CEM (ATCC CCL-119) pochodzącej od pacjenta z ostrą białaczką limfoblastyczną, linii HBP-ALL (FCCH1018) pochodzącej od pacjenta z ostrą białaczką limfocytową, linii HBP-MTL (FCCH1019) pochodzącej od pacjenta z białaczką limfocytów T, linii JM (FCCH1023) pochodzącej od pacjenta z ostrą białaczką limfocytową, linii MOLT-4 (ATCC CRL-1582) pochodzącej od pacjenta z ostrą białaczką limfoblastyczną, linii Jurkat (FCCH1024) pochodzącej od pacjenta z ostrą białaczką limfocytową, linii CCRF-HSB-2 (ATCC CCL-120.1) pochodzącej od pacjenta z ostrą białaczką limfoblastyczną, linii MT-1 (FCCH1043) pochodzącej od pacjenta z białaczką limfocytową z dojrzałymi komórkami T, linii KT-3 pochodzącej od pacjenta z białaczką Lennerta (LIT), lub linii limfocytów B, na przykład transformowanych wirusem EB komórek CESS (ATCC TIB-190), wykazujących obecność wirusa EB limfocytów B linii SKW 6.4 (ATCC TIB-215), linii MCII6 (ATCC CRL ) pochodzącej od pacjenta z białaczka limfocytowa z komórkami B, linii CCRF-SB (ATCC CCL-120) pochodzącej od pacjenta z ostra białaczką limfoblastyczną z komórkami B, linii RPMI 6410 (FCCH6047) pochodzącej od pacjenta z ostrą białaczką mielocytamą, linii Daudi (ATCC CCL-213) pochodzącej od pacjenta z białaczką Burkitta, linii EB-3 (ATCC CCL-85) pochodzącej od pacjenta z białaczką Burkitta, linii Jijoye (ATCC CCL-87) pochodzącej od pacjenta z białaczką Burkitta, linii Raj i (ATCC CCL-86) pochodzącej od pacjenta z białaczką Burkitta, lub linii komórek nie-t i nie-b, na przykład linii HL60 (ATCC CCL-240) pochodzącej od pacjenta z ostrą białaczką mielocytamą, linii THP-1 (ATCC TIB-202) pochodzącej od pacjenta z ostrą białaczką monocytamą, linii U937 (ATCC CRL-1593) pochodzącej od pacjenta z chłoniakiem monocytamym, linii K562 (ATCC CCL-243) pochodzącej od pacjenta z chroniczną białaczką mielocytamą dodaje się do nich 100 μl przeciwciała przeciw

17 antygenowi HM 1.24 lub mysiego przeciwciała IgG2a rozcieńczonego do stężenia 25 μg/ml buforem FACS (PBS(-) zawierającym 2% płodowej surowicy cielęcej i 0,1% azydku sodowego i inkubuje się przez 30 minut w lodzie. Po przemyciu buforem FACS dodaje się 100 μl roztworu 25 μg/ml przeciwciała kozy przeciw myszy, znakowanego FITC (GAM, Becton Dickinson) i inkubuje się przez 30 minut w lodzie. Po przemyciu buforem FACS, komórki zawiesza się w 600 ml lub 1 ml buforu FACS i mierzy się intensywność fluorescencji przy użyciu FACScan (Becton Dickinson). Wyniki pokazane na figurach 1-23 wskazują, że wszystkie linie limfocytów T i limfocytów B reagują z przeciwciałem przeciw antygenowi HM1.24, antygen ten ulega w komórkach tych linii silnej ekspresji (oprócz linii Daudi i Raji, które nie reagują). Wyniki wskazują także, że żadna z linii komórek nie-t i nie-b nie reaguje z przeciwciałem przeciw antygenowi HM1.24 i że w żadnej z tych linii antygen ten nie ulega wykrywalnej ekspresji. Na histogramach przedstawionych na figurach 1-23 markery są tak ustawione, że gdy używa się kontrolnego mysiego przeciwciała IgG2a, liczba komórek niedających sygnału wynosi 98%, a liczba komórek dających sygnał wynosi 2%. Wyniki pokazane w tabeli 1 oznaczają procent komórek posiadających antygen HM1.24, wykryty przeciwciałem przeciw antygenowi HM1.24 z uwzględnieniem markerów. Biorąc pod uwagę procent komórek posiadających antygen HM1.24, intensywność ekspresji tego antygenu podzielono na 5 stopni: +, ++, +++. Podobnie jak wykazano na figurach 1-23, badania te potwierdziły, że w komórkach linii limfocytów T i limfocytów B antygen HM1.24 ulega silnej ekspresji (oprócz linii Daudii Raji), Wyniki wskazują także, że we wszystkie komórki, linii komórek nie-t i nie-b nie reagują z przeciwciałem przeciw antygenowi HM1.24 lub, że procent komórek posiadających antygen HM1.24 jest mniejszy niż 5%. Wynika z tego, że w tych liniach antygen HM1.24 nie występuje lub jest go bardzo mało. Tabela 1 Nazwa komórek Intensyw ność ekspresji Linii lim focytów B CESS ,5 SKW ,8 MCI ,0 CCRF-SB ,4 R PM I ,5 EB ,3 Jijoye ,3 Daudi - 2,8 Raji - 2,0 Linii lim focytów T RPMI ,0 CCRF-CEM ,8 HBP-ALL 63 8 HBP-M TL ,6 JM ,6 MOLT ,1 Jurkat ++ 70,9

18 Ciąg dalszy tabeli CCRF-HSB ,0 MT ,9 KT ,0 Linie komórek HL60-2,9 nie-t i nie-b THP-1 1,5 <5%; +/-, 5-20%; +,20-50; ++, 50-80% ; +++, >80% U937-1,1 K562-3,9 Przykład 3. Określenie aktywności CDC Aktywność CDC przeciwciała przeciw antygenowi HM1.24, przeciw nowotworom układu chłonnego mierzy się następująco: 1. Przygotowanie komórek testowych Przygotowuje się komórki testowe linii CCRF-CEM (ATCC CCL-119) pochodzącej od pacjenta z ostrą białaczką limfoblastyczną, linii CCRF-HSB-2 (ATCC CCL-120.1) pochodzącej od pacjenta z ostrą białaczką limfoblastyczną, linii HPB-MLT (FCCH1019) pochodzącej od pacjenta z białaczką limfocytową z komórkami T, linii EB-3 (ATCC CCL-85) pochodzącej od pacjenta z białaczką Burkitta, linii MCII6 (ATCC CRL-1649) pochodzącej od pacjenta z białaczką limfocytową z komórkami B, linii CCRF-SB (ATCC CCL-120) pochodzącej od pacjenta z ostrą białaczką limfoblastyczną z komórkami B, linii K562 (ATCC CCL-243) pochodzącej od.pacjenta z chroniczną białaczką mielocytamą. W podłożu RPMI1640 zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej (Gibco-BRL) zawiesza się 4 x 105 komórek testowych. 50 μl zawiesiny komórek dodaje się do studzienek 96-studzienkowej mikropłytki o studzienkach z płaskim dnem (FALCON) i inkubuje się taką mikropłytkę przez noc w temperaturze 37 C w atmosferze CO2 w inkubatorze o wysokiej wilgotności (wytwórca TUBAI). 2. Przygotowanie przeciwciała przeciw antygenowi HM 1.24 Przygotowuje się roztwór wytworzonego w przykładzie 1 przeciwciała przeciw antygenowi HM1.24, o stężeniu 0, 0,2, 2 i 20 μg/ml, w podłożu RPMI1640 zawierającym 10% płodowej surowicy bydlęcej (Gibco-BRL). 50 μl każdego z tych roztworów dodaje się do studzienek, przygotowanej w punkcie 1 96-studzienkowej mikropłytki o studzienkach z płaskim dnem (FALCON) i inkubuje się przez 60 minut w temperaturze 37 C, w atmosferze CO2, w inkubatorze o wysokiej wilgotności (wytwórca TUBAI). Po inkubacji płytkę wiruje się przez 5 minut w wirówce wolnoobrotowej 05PR-22 (Wytwórca Hitachi), przy szybkości 1000 obrotów na minutę. Po wirowaniu usuwa się 50 μl nadsączu. 3. Przygotowanie komplementu Jedno opakowanie Baby Rabbit Complement (wytwórca CADARLANE) rozpuszcza się w 1 ml oczyszczonej wody, a następnie rozcieńcza się 5 ml podłoża RPMI1640 (Gibco- BRL)n, zawierającego FCS. 50 μl roztworu komplementu, dodaje się do każdej studzienki 96- -studzienkowej mikropłytki o studzienkach z płaskim dnem i inkubuje się przez 2 godziny, w temperaturze 37 C, w atmosferze CO2, w inkubatorze o wysokiej wilgotności (wytwórca TUBAI). 4. Określenie aktywności CDC Do każdej studzienki 96-studzienkowej mikropłytki o studzienkach z płaskim dnem, przygotowanej jak w punkcie 3, dodaje się 10 μl Alamar Bule (BIO SOURCE) i inkubuje się przez 4 godziny w temperaturze 37 C, w atmosferze CO2, w inkubatorze o wysokiej wilgotności (wytwórca TUBAI). Następnie mierzy się intensywność fluorescencji każdej studzienki, przy użyciu aparatu pomiarowego Cytoflour 2350 (MILLIPORE), przy długości fali wzbudzenia 530 nm i długości fali emisji 590 nm. Aktywność cytotoksyczną (%) oblicza się ze wzoru (A-C)/(B-C) x 100, w którym A oznacza intensywność fluorescencji próbek inkubowanych

19 w obecności przeciwciała, B oznacza intensywność fluorescencji próbek inkubowanych w podłożu bez przeciwciała, C oznacza intensywność fluorescencji próbek niezawierających komórek. Wyniki przedstawione na figurze 24 i 25 potwierdziły, że komórki linii k562, które nie reagowały z przeciwciałem przeciw antygenowi HM 1.24 w czasie pomiaru metodą FCM, nie giną/nawet gdy dodaje się przeciwciała przeciw antygenowi HM1.24, podczas gdy komórki linii CCRF-CEM, CCRF-HSB-2, HPB-MLT, EB-3, MCI 16 i CCRF-SB, które reagowały z przeciwciałem przeciw antygenowi HM 1.24, giną w sposób zależny od stężenia przeciwciała przeciw antygenowi HM1.24. Potwierdza to, że przeciwciało przeciw antygenowi HM1.24 wykazuje działanie cytotoksyczne CDC w stosunku do komórek nowotworów układu chłonnego, na których powierzchni obecny jest białko antygenowe HM1.24, z którym specyficznie wiąże się przeciwciało przeciw antygenowi HM1.24. Przykład 4. Przeciwnowotworowe działanie przeciwciała przeciw antygenowi HM1.24 na zwierzęta z przeszczepionymi komórkami ludzkich nowotworów układu chłonnego 1. Przygotowanie przeciwciała 1-1. Przygotowanie przeciwciała przeciw antygenowi HM1.24 W następujących doświadczeniach używa się oczyszczonego przeciwciała przeciw antygenowi HM 1.24 wytworzonego według przykładu 1 rozcieńczonego do stężenia 1 mg/ml i 200 μg/ml wysterylizowanym przez filtrację PBS(-) Przygotowanie kontrolnego mysiego przeciwciała I-gG2a W następujących doświadczeniach używa się oczyszczonego przeciwciała wytworzonego według przykładu 2, rozcieńczonego do stężenia 1 mg/ml, wysterylizowanym przez filtrację PBS(-). 2. Przeciwnowotworowe działanie przeciwciała przeciw antygenowi HM 1.24, na zwierzęta z przeszczepionymi komórkami ludzkich nowotworów układu chłonnego Przygotowanie myszy z przeszczepionymi komórkami ludzkich nowotworów układu chłonnego Myszy z przeszczepionymi komórkami ludzkich nowotworów układu chłonnego przygotowuje się następująco. Komórki CCRF-HSB-2 (ATCC CCL-120.1) pochodzące od pacjenta z ostrą białaczką limfoblastyczną, które były hodowane in vivo w myszach SCID (CLEA Japonia), zawiesza się w gęstości 1 x 108 komórek/ml w podłożu RPMI 1640, zawierającym 10% płodowej surowicy bydlęcej (Gibco-BRL). Taką zawiesinę komórkową wstrzykuje się podskórnię do jamy brzusznej myszom SCID (samce, w wieku 6 tygodni), którym poprzedniego dnia podano przez wstrzyknięcie dootrzewnowe 100 μl anti-asialo GM1 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) Podanie przeciwciała 7 dnia po przeszczepieniu komórek nowotworowych za pomocą zacisków, mierzy się średnicę nowotworu w miejscu w którym myszy były nastrzyknięte komórkami CCRF-HSB-2. Po obliczeniu objętości nowotworu, zwierzęta dzieli się tak, żeby średnia objętość w każde grupie była prawie jednakowa, tzn. na 3 grupy po 8 zwierząt. Tego samego dnia poszczególnym grapom podaje się przez wstrzyknięcie dootrzewnowe 100 μl roztworu, 1 mg/ml przeciwciała przeciw antygenowi HM 1.24, 100 μl roztworu 200 μg mg/ml przeciwciała przeciw antygenowi HM 1.24 lub 100 μl roztworu 1 mg/ml kontrolnego mysiego przeciwciała IgG2a. Podawanie prowadzi się dwa razy w tygodniu, w sumie 19 razy. W tym czasie dwa razy w tygodniu za pomocą zacisków mierzy się średnicę nowotworu i oblicza objętość nowotworu Określenie przeciwnowotworowego działania przeciwciała przeciw antygenowi HM 1.24 na zwierzęta z przeszczepionym komórkami ludzkiego nowotworu układu chłonnego Działanie przeciwnowotworowe przeciwciała przeciw antygenowi HM 1.24 na zwierzęta z przeszczepionym komórkami ludzkiego nowotworu układu chłonnego określa się na podstawie zmian objętości nowotworu oraz zmian czasu przeżycia myszy. Jak pokazano na figurze 26 podawanie przeciwciała przeciw antygenowi HM1.24, powoduje zahamowanie wzrostu objętości nowotworu w grupie zwierząt, którym podawano przeciwciało przeciw antygenowi HM1.24, w porównaniu do grupy zwierząt, którym podawano kontrolne mysie przeciwciało I-gG2a. Jak pokazano na figurze 27 podawanie przeciwciała przeciw antygenowi HM1.24 powoduje większe wydłużenie czasu przeżycia w grupie zwierząt, którym podawano przeciwciało

20 przeciw antygenowi HM1.24, w porównaniu do grupy zwierząt, którym podawano kontrolne mysie przeciwciało IgG2a. Wyniki te świadczą, że.przeciwciało przeciw antygenowi HM1.24 ma przeciwnowotworowe działanie na zwierzęta z przeszczepionym komórkami ludzkiego nowotworu układu chłonnego. Przykład odniesienia 1. Otrzymanie komórek hybrydowych wytwarzających mysie przeciwciało monoklonalne przeciw antygenowi HM 1.24 Komórki hybrydowe wytwarzające mysie przeciwciało monoklonalne przeciw antygenowi HM1.24 otrzymuje się według metody opisanej przez Goto, T. 1 wsp., Blood (1994)84, ). Linię komórek krwi KPC-32 (1 x 107) pochodząca ze szpiku pacjenta ze szpiczakiem mnogim (Goto, T. I wsp., Jpn. J. Glin. Hematol. (1991) 32, 1400) wstrzykuje się dwukrotnie w odstępie sześciu tygodni do jamy brzusznej myszy BALB/c (Charles River). Trzy dni przed zabiciem zwierzęcia 1,5 X 106 komórek KPC-32 wstrzykuje się do śledziony myszy w celu dodatkowego zwiększenia zdolności myszy do wytwarzania przeciwciał (Goto, T. I wsp., Tokushima, J. Exp. Med. (1990) 37, 89). Po zabiciu myszy wycina się śledzionę i jej komórki poddaję fuzji z komórkami szpiczaka SP2/0 według metody Groth, de St. & Schreidegger (Cancer Research (1981) 41, 3465). Nadsącz z hodowli komórek hybrydowych bada się na obecność przeciwciał przy użyciu komórek KPC-32 i metody Celi ELISA (Posner, M.R. i wsp., J. Immunol. Methods (1982) 48,23). 5 X 104 komórek KPC-32 zawiesza się w 50 ml PBS i rozpipetowuje do studzienek 96-studzienkowej mikropłytki (o dnie w kształcie litery U, Corning, Iwaki) i pozwala wyschnąć na powietrzu przez noc. Po zablokowaniu buforem PBS zawierającym 1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA), do studzienek dodaje się nadsączu z hodowli komórek hybrydowych i inkubuje przez 2 godziny w temperaturze 4 C. Następnie do studzienek dodaje się przeciwciała kozy przeciw mysiemu I-gG, sprzęgniętego z peroksydaza korzenia chrzanu (wytwórca Zymed) i pozostawia na 1 godzinę w temperaturze 4 C. Po przemyciu, do studzienek dodaje się roztworu ofenylenodwuaminy (wytwórca Sumimoto Bakelite) i pozostawia na 30 minut w temperaturze pokojowej. Rcakcję hamuje się dodając 2 N kwas siarkowy i mierzy się absorbancję przy długości fali 492 nm, za pomocą czytnika ELISA (Bio-Rad). W celu usunięcia komórek hybrydowych, które wytwarzają przeciwciała przeciw ludzkim immunoglobułinom, nadsącz z hodowli wytwarzających pożądane przeciwciało, które były wcześniej Zaadsorbowane na albuminie surowicy ludzkiej, bada się metodą ELISA pod kątem reaktywności wobec innych ludzkich komórek. Komórki hybrydowe dające pozytywny wynik izoluje się i bada się ich reaktywność wobec różnych komórek metodą cytometrii przepływowej. W celu otrzymania wysięku, najlepszy wybrany klon komórek hybrydowych klonuje się dwa razy i wstrzykuje do jamy brzusznej myszy BALB/c, wcześniej traktowanych pristanem. Monoklonalne przeciwciało oczyszcza się z wysięku z myszy metoda wytrącania siarczanem amonu i zestawem do chromatografii powinowactwa Protein A (Ampure PA, Amersham). Oczyszczone przeciwciało znakuje się FITC, za pomocą zestaw do znakowania Quick Tag FITC (Boehringer Mannheim). W wyniku takiej procedury otrzymano monoklonalne przeciwciała reagujące z komórkami KPC-32 i RPMI 8226, wytwarzane przez 30 klonów' komórek hybrydowych. Zbadano także reaktywność nadsączu z hodowli tych komórek z innymi liniami komórkowymi i z jednojądrzastymi komórkami krwi obwodowej. Z otrzymanych klonów 3 klony wytwarzały monoklonalne przeciwciała, które specyficznie reagowały z komórkami plazmy. Z tych trzech klonów, wybrano klon komórek hybrydowych, który był najbardziej użyteczny do analizy metodą cytometrii przepływowej i wykazywał aktywność CDC w stosunku do komórek RPMI 8226 i oznaczono go HM Podklasę przeciwciał wytwarzanych przez te komórki hybrydowe oznaczono za pomocą testu ELISA, wykorzystując przeciwciała królika przeciw myszom, specyficznie reagujące z poszczególnymi podklasami przeciwciał mysich (wytwórca Zymed). Przeciwciało przeciw antygenowi HM 1.24 należy do podklasy IgG2a k.komórki hybrydowe HM1.24 wytwarzające przeciwciało przeciw antygenowi HM1.24, złożono zgodnie z postanowieniami międzynarodowego Traktatu