(12) OPIS PATENTOWY. (54)Immunokoniugat, sposób wytwarzania immunokoniugatu i kompozycja farmaceutyczna. (74) Pełnomocnik:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (12) OPIS PATENTOWY (21) Numer zgłoszenia: (22) Data zgłoszenia: (19) PL (11) (13) B1 (51) IntCl7: A61K 47/48 C07K 19/00 C12N 15/62 A61P 35/00 (54)Immunokoniugat, sposób wytwarzania immunokoniugatu i kompozycja farmaceutyczna (30) Pierwszeństwo: ,EP, (73) Uprawniony z patentu: Merck Patent Gesellschaft mit beschrankter Haftung, Darmstadt, DE (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 06/96 (72) Twórcy wynalazku: Wolfgang Hölzer, Darmstadt, DE Ilka von Hoegen, Darmstadt, DE Wolfgang Strittmatter, Darmstadt, DE Siegfried Matzku, Darmstadt, DE (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 02/02 (74) Pełnomocnik: Buczyński Edward, POLSERVICE PL B1 (57) 1. Immunokoniugat, znamienny tym, że obejmuje przeciwciało monoklonalne lub jego fragment pochodzące z mysiego humanizowanego lub chimerycznego MAb 425, skierowane przeciwko komórce nowotworowej posiadającej epitop antygenowy receptora epidermalnego czynnika wzrostowego (EGFR), oraz białko chemokiny IL-8 z rodziny C-X-C poddane fuzji z tym przeciwciałem lub fragmentem przeciwciała. 9. Sposób wytwarzania immunokoniugatu obejmującego przeciwciało monoklonalne skierowane przeciwko komórce nowotworowej posiadającej epitop antygenowy połączony z aktywnym biologicznie ligandem polegający na fuzji sekwencji DNA kodującej przeciwciało lub fragment przeciwciała i ligand aktywny biologicznie, znamienny tym, że poddaje się fuzji na jednoniciowym DNA sekwencji kodujących przeciwciało monoklonalne lub jego fragment pochodzące z mysiego humanizowanego lub chimerycznego MAb 425, skierowane przeciwko komórce nowotworowej posiadającej epitop antygenowy receptora epidermalnego czynnika wzrostowego (EGFR), oraz białko chemokiny IL-8 z rodziny C-X-C poddane fuzji z tym przeciwciałem lub fragmentem przeciwciała, z zastosowaniem oligonukleotydu komplementarnego do sekwencji DNA pożądanej fuzji, umieszcza się uzyskanąkonstrukcję w wektorze ekspresyjnym, transformuje się tym wektorem organizm gospodarza, prowadzi się hodowle komórek gospodarza w roztworze zawierającym składniki odżywcze i prowadzi się ekspresję białka fuzyjnego 16. Kompozycja farmaceutyczna do leczenia nowotworów, znamienna tym, że zawiera immunokoniugat obejmujący przeciwciało monoklonalne lub jego fragment pochodzące z mysiego humanizowanego lub chimerycznego MAb 425, skierowane przeciwko komórce nowotworowej posiadającej epitop antygenowy receptora epidermalnego czynnika wzrostowego (EGFR), oraz białko chemokiny IL-8 z rodziny C-X-C poddane fuzji z tym przeciwciałem lub fragmentem przeciwciała i fizjologicznie dopuszczalny nośnik.

2 Immunokoniugat, sposób wytwarzania immunokoniugatu i kompozycja farmaceutyczna Zastrzeżenia patentowe 1. Immunokoniugat, znamienny tym, że obejmuje przeciwciało monoklonalne lub jego fragment pochodzące z mysiego humanizowanego lub chimerycznego MAb 425, skierowane przeciwko komórce nowotworowej posiadającej epitop antygenowy receptora epidermalnego czynnika wzrostowego (EGFR), oraz białko chemokiny IL-8 z rodziny C-X-C poddane fuzji z tym przeciwciałem lub fragmentem przeciwciała. 2. Immunokoniugat według zastrz. 1, znamienny tym, że przeciwciałem jest fragment Fab lub fragment F(ab'), składający się ze zmiennego regionu ciężkiego łańcucha przeciwciała, domeny CH1 regionu stałego i odpowiedniego łańcucha lekkiego (koniugat CH1 przeciwciała) 3. Immunokoniugat według jednego z zastrz. 1, albo 2, znamienny tym, że przeciwciałem jest fragment przeciwciała składający się ze zmiennego regionu ciężkiego łańcucha przeciwciała, domen CH1 i CH2 regionu stałego i odpowiedniego łańcucha lekkiego (koniugat CH2 przeciwciała). 4. Immunokoniugat według jednego z zastrz. 1, albo 2, znamienny tym, że przeciwciałem jest fragment przeciwciała składający się ze zmiennego regionu ciężkiego łańcucha przeciwciała, domen CH1, CH2 i CH3 regionu stałego i odpowiedniego łańcucha lekkiego (koniugat CH3 przeciwciała). 5. Immunokoniugat według zastrz. 1, znamienny tym, że przeciwciało składa się z regionu zmiennego łańcucha ciężkiego przeciwciała, odpowiedniego łańcucha lekkiego i sekwencji polipeptydowej, która łączy lekki i ciężki łańcuch (koniugat Fv przeciwciała). 6. Immunokoniugat według zastrz. 1, znamienny tym, że obejmuje aminokwas (sekwencję), dający się wyznaczyć na podstawie miejsca restrykcyjnego DNA pomiędzy przeciwciałem/fragmentem przeciwciała, a ligandem aktywnym biologicznie, przy czym miejsce restrykcyjne jest unikalne w całej konstrukcji fuzyjnej. 7. Immunokoniugat według zastrz. 1, znamienny tym, że obejmuje peptyd łącznikowy pomiędzy przeciwciałem/fragmentem przeciwciała i ligandem aktywnym biologicznie. 8. Immunokoniugat według zastrz. 1, znamienny tym, że wybrany jest z grupy obejmującej CH1 MAb 425-IL-8, CH2 MAb 425-(NcoI)-IL8, CH2 MAb 425-(Bc1I)-IL8, Fv MAb 425-IL8, CH3 MAb 425-IL Sposób wytwarzania immunokoniugatu obejmującego przeciwciało monoklonalne skierowane przeciwko komórce nowotworowej posiadającej epitop antygenowy połączony z aktywnym biologicznie ligandem polegający na fuzji sekwencji DNA kodującej przeciwciało lub fragment przeciwciała i ligand aktywny biologicznie, znamienny tym, że poddaje się fuzji na jednoniciowym DNA sekwencji kodujących przeciwciało monoklonalne lub jego fragment pochodzące z mysiego humanizowanego lub chimerycznego MAb 425, skierowane przeciwko komórce nowotworowej posiadającej epitop antygenowy receptora epidermalnego czynnika wzrostowego (EGFR), oraz białko chemokiny IL-8 z rodziny C-X-C poddane fuzji z tym przeciwciałem lub fragmentem przeciwciała, z zastosowaniem oligonukleotydu komplementarnego do sekwencji DNA pożądanej fuzji, umieszcza się uzyskaną konstrukcję w wektorze ekspresyjnym, transformuje się tym wektorem organizm gospodarza, prowadzi się hodowle komórek gospodarza w roztworze zawierającym składniki odżywcze i prowadzi się ekspresję białka fiizyjnego. 10. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że poddaje się fuzji na jednoniciowym DNA sekwencji kodujących przeciwciało będące fragmentem Fab lub fragmentem F(ab'), składające się ze zmiennego regionu ciężkiego łańcucha przeciwciała, domeny CH1 regionu stałego i odpowiedniego łańcucha lekkiego (koniugat CH1 przeciwciała).

3 Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że poddaje się fuzji na jednoniciowym DNA sekwencji kodujących przeciwciało składające się ze zmiennego regionu ciężkiego łańcucha przeciwciała, domen CH1 i CH2 regionu stałego i odpowiedniego łańcucha lekkiego (koniugat CH2 przeciwciała). 12. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że poddaje się fuzji na jednoniciowym DNA sekwencji kodujących przeciwciało będące fragmentem przeciwciała składającego się ze zmiennego regionu ciężkiego łańcucha przeciwciała, domen CH1, CH2 i CH3 regionu stałego i odpowiedniego łańcucha lekkiego (koniugat CH3 przeciwciała). 13. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że poddaje się fuzji na jednoniciowym DNA sekwencji kodujących przeciwciało składające się zregionu zmiennego łańcucha ciężkiego przeciwciała, odpowiedniego łańcucha lekkiego i sekwencji polipeptydowej, która łączy lekki i ciężki łańcuch (koniugat Fv przeciwciała). 14. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że jako sekwencję kodującą stosuje się sekwencję kodującą aminokwas przewidywalny na podstawie miejsca restrykcyjnego DNA pomiędzy przeciwciałem/fragmentem przeciwciała, a ligandem aktywnym biologicznie, przy czym miejsce restrykcyjne jest unikalne w całej konstrukcji fuzyjnej. 15. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że jako sekwencję kodującą stosuje się sekwencję kodującąpeptyd łącznikowy pomiędzy przeciwciałem/fragmentem przeciwciała i ligandem aktywnym biologicznie. 16. Kompozycja farmaceutyczna do leczenia nowotworów, znamienna tym, że zawiera immunokoniugat obejmujący przeciwciało monoklonalne lub jego fragment pochodzące z mysiego humanizowanego lub chimerycznego MAb 425, skierowane przeciwko komórce nowotworowej posiadającej epitop antygenowy receptora epidermalnego czynnika wzrostowego (EGFR), oraz białko chemokiny IL-8 z rodziny C-X-C poddane fuzji z tym przeciwciałem lub fragmentem przeciwciała i fizjologicznie dopuszczalny nośnik. 17. Kompozycja według zastrz. 16, znamienna tym, że zawiera przeciwciało będące fragmentem Fab lub fragmentem F(abr), składające się ze zmiennego regionu ciężkiego łańcucha przeciwciała, domeny CH1 regionu stałego i odpowiedniego łańcucha lekkiego (koniugat CH1 przeciwciała). 18. Kompozycja według zastrz. 17, znamienna tym, że jako przeciwciało zawiera fragment przeciwciała składający się ze zmiennego regionu ciężkiego łańcucha przeciwciała, domen CH1 i CH2 regionu stałego i odpowiedniego łańcucha lekkiego (koniugat CH2 przeciwciała). 19. Kompozycja według zastrz. 17, znamienna tym, że jako przeciwciało zawiera fragment przeciwciała składający się ze zmiennego regionu ciężkiego łańcucha przeciwciała, domen CH1 i CH2 regionu stałego i odpowiedniego łańcucha lekkiego (koniugat CH2 przeciwciała). 20. Kompozycja według zastrz. 17, znamienna tym, że jako przeciwciało zawiera fragment przeciwciała składający się ze zmiennego regionu ciężkiego łańcucha przeciwciała, domen CH1, CH2 i CH3 regionu stałego i odpowiedniego łańcucha lekkiego (koniugat CH3 przeciwciała). 21. Kompozycja według zastrz. 17, znamienna tym, że zawiera ponadto fragment przeciwciała dający się ocenić na podstawie miejsca restrykcyjnego DNA pomiędzy przeciwciałem/fragmentem przeciwciała, a ligandem aktywnym biologicznie, przy czym miejsce restrykcyjne jest unikalne w całej konstrukcji fuzyjnej. 22. Kompozycja według zastrz. 19, znamienna tym, że zawiera ponadto peptyd łącznikowy pomiędzy przeciwciałem/fragmentem przeciwciała i ligandem aktywnym biologicznie. * * * Niniejszy wynalazek dotyczy immunokonigatu, sposobu wytwarzania immunokoniugatu i kompozycji farmaceutycznej. Immunokoniugat stanowi nowe białko fuzyjne, które składa się z elementu wiążącego się w sposób ukierunkowany z nowotworem, w szczególności przeciwciała monoklonalnego lub jego fragmentu, rozpoznającego cząsteczkę, która ulega ekspresji głównie

4 na powierzchni ludzkich komórek nowotworowych, taką jak ludzki receptor epidermalnego czynnika wzrostowego (EG-FR), oraz biologicznie aktywnego ligandu wybranego z grupy białek chemokin, korzystnie z rodziny C-X-C. Otrzymane białka fuzyjne można wykorzystać do dostarczania ligandu aktywnego biologicznie do określonej komórki lub tkanki docelowej. Nowe immunokoniugaty można wykorzystywać w terapii nowotworów. W leczeniu pacjentów chorych na raka wykorzystuje się różnorodne koncepcje terapeutyczne. W przeszłości prowadzono próby kliniczne z przeciwciałami monoklonalnymi specyficznie lub preferencyjnie rozpoznającymi cząsteczki ulegające ekspresji na powierzchni komórek złośliwych. Celem tego podejścia jest indukowanie komórkowej cytotoksyczności zależnej od przeciwciał (ADCC) lub cytotoksyczności zależnej od dopełniacza dla eliminacji komórek nowotworowych. Inne podejście polega na aktywacji odpowiedzi immunologicznej zależnej od cy tokin. Indukowana cytokinami aktywność przeciwnowotworowa może polegać na: 1) bezpośrednim cytotoksycznym/cytostatycznym wpływie na wzrost nowotworu 2) zależnych od antygenu nowotworowego mechanizmach niespecyficznych, takich jak aktywność komórek LAK lub cytotoksyczność zależna od monocytów/granulocytów 3) specyficznych dla antygenu nowotworowego odpowiedziach immunologicznych zależnych od komórek T CD4-dodatnich i CD8-dodatnich. Na modelach zwierzęcych obserwowano w takich warunkach uogólnioną odporność na nowotwór. Jednakże, cytotoksyczność wysokich dawek cytokin i ich niewystarczająca obecność in situ prowadzą do koncepcji ukierunkowanej terapii nowotworów. Zasada tej terapii opiera się na fizycznym związaniu kierującej cząsteczki, takiej jak przeciwciało monoklonalne specyficzne wobec antygenu związanego z nowotworem, z aktywnąbiologicznie cząsteczkę efektorową. Dostarczanie cząsteczek efektorowych przez cząsteczkę kierującą powinno zwiększać stężenie cytokin w nowotworze i zmniejszyć wymaganą dawkę maksymalną. Na modelach zwierzęcych wykazano, że obecność cytokin in situ spowodowana iniekcją donowotworową lub wydzielaniem przez stransfekowane komórki nowotworowe może prowadzić do regresji nowotworu (patrz w pracy przeglądowej: Colombo i Fomi, Immunology Today 15: 48-51, 1994). W tych układach cytokiny nie zakłócają proliferacji nowotworowej, ale są w stanie aktywować szybką i silną reakcję przeciwnowotworową. Dlatego też, fizyczne połączenie cząsteczki efektorowej z elementem kierującym stanowi sposób zmniejszania obwodowej obecności i zwiększania wewnątrznowotworowej dostępności ligandu aktywnego biologicznie. Ponadto, cząsteczki te mogą również kierować się do pojedynczych komórek nowotworowych oraz mikroprzerzutów. Ligand aktywny biologicznie do ukierunkowywania za pośrednictwem przeciwciała powinien indukować niszczenie komórki docelowej w sposób bezpośredni lub poprzez tworzenie letalnego dla niej środowiska. Można to osiągnąć poprzez takie cytokiny jak: I L-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-10, IL-13, IFN, TNFα lub CSF. Wykazano, że cytokiny te wywołują reakcję przeciwnowotworową bezpośrednio lub pośrednio przez aktywację mechanizmów obronnych gospodarza (Mire-Sluits, TIBTECH 11: 74-77, 1993; Colombo i in., Cancer Res. 52: , 1992; Thomas i Balkwill, Pharmac. Ther. 52: , 1991). Jednakże, większość tych cytokin aktywując komórki efektorowe, wykazuje wobec nich brak lub tylko słabą aktywność chemotaktyczną, tak że przy braku odpowiedniej ilości komórek efektorowych w tkance nowotworowej ich aktywność przeciwnowotworowa może być niska. Jednakże, chemokiny są chemotaktyczne wobec wielu komórek efektorowych, a zatem będą one zwiększać ich obecność w miejscu nowotworu, a poza tym indukują różnorodne ich funkcje (patrz na przykład: Miller i Krangel (1992), Biology and Biochemistry of the Chemoki nes: A Novel Family of Chemotactic and Inflammatory Cytokines, Critical Reviews in Immunology 12, 17). IL-8, MIP 2a (znana również jako GRO-P) i MIP 2β (GRO-γ) należą do nadrodziny chemokin C-X-C (znanej również jako nadrodzina małych cytokin lub interkryn). Działają one jako czynniki chemotaktyczne oraz aktywują funkcje komórek efektorowych, i dlatego mogłyby stanowić optymalne cząsteczki efektorowe. Ta rodzina chemokin C-X-C jest grupą ostatnio scha-

5 rakteryzowanych małych (8-10 kd) białek wykazujących od 20 do 50% homologii sekwencji aminokwasowej i mających aktywność chemotaktycznąi prozapalną. IL-8 posiada dobrze scharakteryzowaną strukturę trzeciorzędową (Clore i in., Biochemistry 29: , 1990) i ma wspólny z niektórymi chemokinami CXC N-końcowy motyw ELR. Należy oczekiwać, że ze względu na homologię sekwencji wśród chemokin CXC, ich struktura trzeciorzędowa będzie dość podobna. Wykazano to już dla MCAF/MCP-1 (Gronenbom i Clor, Prot. Eng. 4, , 1991). W roztworze IL-8 tworzy stabilne dimery (Clore i in., Biochemistiy 2 9 : , 1990) i jest możliwe, że białko fiizyjne F(ab')-IL-8 ulega dimeryzacji poprzez oddziaływania dwóch monomerów IL-8, tworząc dwuwartościowy immunokoniugat. Wzmacniać to będzie oddziaływania białka fiizyjnego z antygenem. Opisani dotąd przedstawiciele grupy C-X-C wykazują aktywność wobec granulocytów obojętnochłonnych. Ich geny zlokalizowano w chromosomie 4. Przedstawicielami tej grupy są PF4, zasadowe białko płytek krwi, hip10, IL-8, MIP 2α i MIP 2ß. Efektem działania tych białek na granulocyty obojętnochłonne są: aktywność chemotaktyczna, degranulacja i wybuch oddechowy (Sherry i Cerami, Current opinion in Immunology 3 : 56-60, 1991; Oppenheim i in., Annu. Rev. Immunol. 9: , 1991; Miller i Krangel, Critical Reviews in Immunology 12: 17-46, 1992; Clark-Lewis i in., J. Biol. Chem. 266: , 1991). Przedstawiciele zbliżonej rodziny chemokin C-C działają przede wszystkim na monocyty. Wszystkie ich geny są zlokalizowane w chromosomie 17. Tymi białkami są LD 78, Act-2, MCAF, 1309 i RANTES. Cząsteczki te wykazują silną aktywność chemotaktyczną wobec monocytów (Matsushima i in., Chem. Immunol. 51: , 1992; Oppenheim i in., Annu. Rev. Immunol. 9: , 1991). Epidermalny czynnik wzrostowy (EGF) jest hormonem polipeptydowym, mitogennym dla komórek nabłonkowych i śródbłonkowych. Podczas oddziaływania EGF z wrażliwymi komórkami wiąże się on z receptorami błonowymi (EGFR). EGRF jest transbłonową glikoproteiną o masie cząsteczkowej około i jest produktem protoonkogenu c-erb-b. Mysie przeciwciało monoklonalne MAb 425 otrzymano stosując ludzką linię komórek rakowych A431 (ATCC CRL 1555) i stwierdzono, że wiąże się ono z polipeptydowym epitopem na zewnętrznej domenie EGFR. Stwierdzono, że hamuje ono wiązanie EGF i ma udział w cyto toksyczności komórek nowotworowych in vitro oraz wywołuje in vitro supresję wzrostu komórek nowotworowych linii komórek rakowych pochodzących z nabłonka oraz okrężnicy i odbytnicy (Rodeck i in., 1987, Cancer Res. 47, 3692). Humanizowane i chimeryczne wersje MAb 425 są znane ze światowego opisu patentowego numer WO 92/ W EP opisane jest białko fuzyjne zawierające przeciwciało monoklonalne (L6) i interleukmę-2. Przeciwnie do mterleukiny-8, interleukina-2 posiada aktywność niechemota ktyczną, ale posiada natomiast co najmniej pośrednią aktywność cytotoksyczną. Białko fuzyjne, zgodnie z tym ujawnieniem wiąże się do komórek nowotworu i indukuje proliferację cytotoksy cznych limfocytów. Jednakże, limfocyty te w zasadzie maja swobodny dostęp do krwioobiegu i mogą powodować niepożądane efekty uboczne (z powodu ich cytotoksyczności). EP ujawnia immunokoniugaty zawierające przeciwciało i cytokinę takąjak in terleukina-1 do interleukiny-7 lub TNF-α, TNF-ß, INF-α, INF-ß i INF-γ. Wszystkie te związki mają wspólną naturę, taką, że mają one aktywność niechomotaktyczną ale cytotoksyczną. Podsumowując, zarówno EP jak i EP opisują immunokoniugaty zawierające przeciwciało skierowane na komórkę nowotworową i związek cytotoksyczny. Cząsteczki te były wykreowane w celu zabicia nowotworowych komórek. Celowym było zatem opracowanie takiego immunokoniugatu, który uczyniłby możliwym przeprowadzenie niskotoksycznej terapii przeciwnowotworowej. Celem opracowania niniejszego wynalazku było też polepszenie odpowiedzi immunologicznej dzięki potencjałowi patocytotoksycznemu neutrofili zdolnych do przyciągania i zagęszczania bezpośrednio w miejscu nowotworu we współdziałaniu z cząsteczką IL-8. Cząsteczki według wynalazku zostały wykreowane w celu poparcia naturalnej odpowiedzi immunologicznej bez jakiegokolwiek efektu cytotoksycznego.

6 Ta więc przedmiotem tego wynalazku było utworzenie przeciwciał lub ich fragmentów, zawierających epitop skierowany przeciw antygenowi EGFR na powierzchni komórki nowotworowej oraz aktywnego biologicznie ligandu o wysokiej aktywności chemotaktycznej w stosunku do ich komórek efektorowych prowadząc w ten sposób do niskotoksycznej, ukierunkowanej terapii nowotworów. Tak więc immunokoniugaty reprezentują ulepszoną wersję analogicznych immunokoniugatów cytokina-przeciwciało, które mają podobną aktywność pod względem wywoływania liz nowotworów, ale nie pod względem ich możliwości efektywnego przyciągania komórek efektorowych do określonego miejsca ze względu na ich właściwości chemotaktyczne. Przedmiotem wynalazku jest immunokoniugat, obejmujący przeciwciało monoklonalne lub jego fragment pochodzące z mysiego humanizowanego lub chimerycznego MAb 425, skierowane przeciwko komórce nowotworowej posiadającej epitop antygenowy receptora epider malnego czynnika wzrostowego (EGFR), oraz białko chemokiny IL-8 z rodziny C-X-C poddane fuzji z tym przeciwciałem lub fragmentem przeciwciała. Przeciwciałem w immunokonigacie korzystnie jest fragment Fab lub fragment F(ab'), składający się ze zmiennego regionu ciężkiego łańcucha przeciwciała, domeny CH1 regionu stałego i odpowiedniego łańcucha lekkiego (koniugat CH1 przeciwciała). Bardziej korzystnie przeciwciałem jest fragment przeciwciała składający się ze zmiennego regionu ciężkiego łańcucha przeciwciała, domen CH1 i CH2 regionu stałego i odpowiedniego łańcucha lekkiego (koniugat CH2 przeciwciała). Również korzystnie immunokoniugat według wynalazku obejmuje przeciwciało, które jest fragmentem przeciwciała składającego się ze zmiennego regionu ciężkiego łańcucha przeciwciała, domen CH1, CH2 i CH3 regionu stałego i odpowiedniego łańcucha lekkiego (koniugat CH3 przeciwciała). W innym korzystnym wykonaniu wynalazku immunokoniugat obejmuje przeciwciało składające się z regionu zmiennego łańcucha ciężkiego przeciwciała, odpowiedniego łańcucha lekkiego i sekwencji polipeptydowej, która łączy lekki i ciężki łańcuch (koniugat Fv przeciwciała). Również korzystnie immunokoniugat obejmuje aminokwas (sekwencję), dający się wyznaczyć na podstawie miejsca restrykcyjnego DNA pomiędzy przeciwciałem/fragmentem przeciwciała, a ligandem aktywnym biologicznie, przy czym miejsce restrykcyjne jest unikalne w całej konstrukcji fuzyjnej. Immunokoniugat może obejmować też peptyd łącznikowy pomiędzy przeciwciałem/fragmentem przeciwciała i ligandem aktywnym biologicznie. W korzystnym wykonaniu wynalazku immunokoniugat, może być wybrany z grupy obejmującej CH1 MAb 425-IL-8, CH2 MAb 425-(Ncol)-IL8, CH2 MAb 425-(Bc1I)-IL8, Fv MAb 425-IL8, CH3 MAb 425-IL-8. Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania immunokoniugatu obejmującego przeciwciało monoklonalne skierowane przeciwko komórce nowotworowej posiadającej epitop antygenowy połączony z aktywnym biologicznie ligandem polegający na fuzji sekwencji DNA kodującej przeciwciało lub fragment przeciwciała i ligand aktywny biologicznie polegający na tym, że, poddaje się fuzji na jednoniciowym DNA sekwencji kodujących przeciwciało monoklonalne lub jego fragment pochodzące z mysiego humanizowanego lub chimerycznego MAb 425, skierowane przeciwko komórce nowotworowej posiadającej epitop antygenowy receptora epidermalnego czynnika wzrostowego (EGFR), oraz białko chemokiny IL-8 z rodziny C-X-C poddane fuzji z tym przeciwciałem lub fragmentem przeciwciała, z zastosowaniem oli ginukleotydu komplementarnego do sekwencji DNA pożądanej fuzji, umieszcza się uzyskaną konstrukcję w wektorze ekspresyjnym, transformuje się tym wektorem organizm gospodarza, prowadzi się hodowlę komórek gospodarza w roztworze zawierającym składniki odżywcze i prowadzi się ekspresję białka fuzyjnego. Korzystnie poddaje się fuzji na jednoniciowym DNA sekwencji kodujących przeciwciało będące fragmentem Fab lub fragmentem F(ab'), składające się ze zmiennego regionu ciężkiego łańcucha przeciwciała, domeny CH1 regionu stałego i odpowiedniego łańcucha lekkiego (koniugat CH1 przeciwciała). Bardziej korzystnie poddaje się fuzji na jednoniociowym DNA sekwencji kodujących przeciwciało składające się ze zmiennego regionu ciężkiego łańcucha przeciwciała, domen CH1 i CH2 regionu stałego i odpowiedniego łań-

7 cucha lekkiego (koniugat CH2 przeciwciała). Również korzystnie, poddaje się fuzji na jednoniciowym DNA sekwencji kodujących przeciwciało będące fragmentem przeciwciała składającego się ze zmiennego regionu ciężkiego łańcucha przeciwciała, domen CH1, CH2 i CH3 regionu stałego i odpowiedniego łańcucha lekkiego (koniugat CH3 przeciwciała). Najbardziej korzystnie poddaje się fuzji na jednoniciowym DNA sekwencji kodujących przeciwciało składające się z regionu zmiennego łańcucha ciężkiego przeciwciała, odpowiedniego łańcucha lekkiego i sekwencji polipeptydowej, która łączy lekki i ciężki łańcuch (koniugat Fv przeciwciała). W sposobie według wynalazku jako sekwencję kodującą stosuje się sekwencję kodującą aminokwas przewidywalny na podstawie miejsca restrykcyjnego DNA pomiędzy przeciwciałem/fragmentem przeciwciała, a ligandem aktywnym biologicznie, przy czym miejsce restrykcyjne jest unikalne w całej konstrukcji fuzyjnej. Korzystnie, jako sekwencje kodującą stosuje się sekwencję kodującą peptyd łącznikowy pomiędzy przeciwciałem/fragmentem przeciwciała i ligandem aktywnym biologicznie. Następnym przedmiotem wynalazku jest kompozycja farmaceutyczne do leczenia nowotworów, charakteryzująca się tym, że zawiera immunokoniugat obejmujący przeciwciało mono klonalne lub jego fragment pochodzące z mysiego humanizowanego lub chimerycznego MAb 425, skierowane przeciwko komórce nowotworowej posiadającej epitop antygenowy receptora epider malnego czynnika wzrostowego (EGFR), oraz białko chemokiny IL-8 z rodziny C-X-C poddane fuzji z tym przeciwciałem lub fragmentem przeciwciała i fizjologicznie dopuszczalny nośnik. Korzystnie kompozycja według wynalazku zawiera przeciwciało będące fragmentem Fab lub fragmentem F(ab'), składające się ze zmiennego regionu ciężkiego łańcucha przeciwciała, domeny CH1 regionu stałego i odpowiedniego łańcucha lekkiego (koniugat CH1 przeciwciała). Bardziej korzystnie, kompozycja wynalazku jako przeciwciało zawiera fragment przeciwciała składający się ze zmiennego regionu ciężkiego łańcucha przeciwciała, domen CH1 i CH2 regionu stałego i odpowiedniego łańcucha lekkiego (koniugat CH2 przeciwciała). Ewentualnie, jako przeciwciało zawiera fragment przeciwciała składający się ze zmiennego regionu ciężkiego łańcucha przeciwciała, domen CH1 i CH2 regionu stałego i odpowiedniego łańcucha lekkiego (koniugat CH2 przeciwciała). Również korzystnie kompozycja jako przeciwciało może zawierać fragment przeciwciała składający się ze zmiennego regionu ciężkiego łańcucha przeciwciała, domen CH1, CH2 i CH3 regionu stałego i odpowiedniego łańcucha lekkiego (koniugat CH3 przeciwciała). Kompozycja według wynalazku może korzystnie zawierać ponadto fragment przeciwciała dający się ocenić na podstawie miejsca restrykcyjnego DNA pomiędzy przeciwciałem/fragmen tem przeciwciała, a ligandem aktywnym biologicznie, przy czym miejsce restrykcyjne jest unikalne w całej konstrukcji fuzyjnej. Najbardziej korzystnie kompozycja według wynalazku zawiera ponadto peptyd łącznikowy pomiędzy przeciwciałem/fragmentem przeciwciała i ligandem aktywnym biologicznie. Konstrukcje kodujące białka fuzyjne tworzy się wykorzystując metody rekombinacji DNA. Białka fuzyjne zawierają zmienny region ciężkiego łańcucha przeciwciała oraz domenę CH1 z regionu stałego (koniugaty CH1, fragment Fab) i odpowiedni lekki łańcuch lub region zmienny ciężkiego łańcucha przeciwciała oraz domenę CH1 i CH2 regionu stałego lub też zmienny region ciężkiego łańcucha przeciwciała oraz domenę CH1, CH2 i CH3 regionu stałego, w każdym przypadku poddane fuzji z ligandem aktywnym biologicznie. W wyniku koekspresji z odpowiednim lekkim łańcuchem, można utworzyć białko fuzyjne skierowane przeciw komórkom posiadającym antygen oraz dostarczające aktywny ligand do określonego miejsca w organizmie. Analogicznie, można uzyskać inny immunokoniugat poprzez fuzję chemokiny z końcem C fragmentu Fv przeciwciała. W tym przypadku łańcuchy lekki i ciężki ulęgają ekspresji jako jeden polipeptyd, gdzie oba elementy łączy odpowiednia sekwencja łącznikowa, co zapewnia właściwe sfałdowanie miejsca wiążącego antygen. Na figurze 1 przedstawiono różne konstrukcje. Wynikiem ekspresji immunokoniugatów są nowe cząsteczki łączące dwie funkcje po pierwsze są skierowane przeciw komórkom posiadającym antygen (EGFR) i po drugie dostarczają

8 one aktywny ligand do określonego miejsca w organizmie. Ligandy te są silnymi chemoatraktan tami i cząsteczkami aktywującymi, w wyniku czego przenikają do komórek efektorowych w miejscu nowotworu i mogą powodować dalej niszczenie nowotworu. Wykorzystując immunokoniugaty według niniejszego wynalazku, można wykrywać i z powodzeniem leczyć, bez znacznych ogólnych efektów toksycznych, nowotwory takie jak czerniak, glejak czy rak. Będący przedmiotem wynalazku immunokoniugat skierowany przeciw komórce nowotworowej posiadającej epitop antygenowy receptora epidermalnego czynnika wzrostowego (EGFR) oraz ligand będący białkiem należącym do chemokin, jest poddany fuzji z przeciwciałem lub fragmentem przeciwciała. Istnieją różne grupy chemokin, takie jak chemokiny C-X-C i C-C. Białko należące do chemokin wybiera się z rodziny C-X-C. W rodzinie C-X-C, korzystnym rozwiązaniem według wynalazku jest IL-8. W wynalazku dostarcza się immunokoniugat, w którym białko chemokiny wybierane jest z rodziny C-X-C i jest nim Interleukina 8 (IL-8). Przeciwciałami, które można stosować zgodnie z wynalazkiem są albo całe przeciwciała albo ich fragmenty. Odpowiednimi fragmentami sąfv, Fab lub F(ab') 2 (fragmenty CH1 przeciwciała zgodnie z oznaczeniami użytymi w tym zgłoszeniu), fragmenty CH3 i CH2 przeciwciała (fig. 1). Korzystnymi rozwiązaniami są fragmenty Fv, CH1-, CH2 i CH3 przeciwciała. Miejsca restrykcyjne zawarte w immunokoniugacie według wynalazku mogą znajdować się między przeciwciałem (fragmentem) a białkiem chemokiny, umożliwiając w ten sposób wprowadzenie, na przykład, określonego peptydu łącznikowego w celu zapewnienia optymalnego wiązania koniugatu z docelowym epitopem. Odpowiednie peptydy łącznikowe i metody ich wprowadzania są dobrze znane w nauce i opisane poniżej. Zgodnie z wynalazkiem, jako miejsce restrykcyjne wybiera się miejsce, które jest unikalne w danej konstrukcji DNA. Korzystnymi miejscami restrykcyjnymi s ą Ncol i Bell. Immunokoniugaty według tego wynalazku są odpowiednie do zastosowań terapeutycznych a zwłaszcza do stosowania w terapii nowotworów. Celem tego wynalazku jest utworzenie białka fuzyjnego składającego się z przeciwciała monoklonalnego jako elementu kierującego i chemokiny IL-8 jako cząsteczki efektorowej o właściwościach chemotaktycznych i aktywujących. Po raz pierwszy mogło być wykazane, że IL-8 i inne chemokiny (takie jak MIP) zachowują aktywność biologiczną kiedy N-koniec jest zablokowany przez dodatkowe aminokwasy, takie jak przeciwciała. A zatem cząsteczka ta będzie użyteczna w ukierunkowanej terapii nowotworów, w której komórki efektorowe sąkierowane do komórek nowotworowych posiadających receptor EGF i aktywowane in situ. Wykazano, że cdna kodujące ciężki łańcuch MAb 425 i białko IL-8 można poddać fuzji metodami biologii molekularnej, a białka mogą ulegać ekspresji w odpowiednich układach ekspresyjnych oraz, że białka fuzyjne zachowują zdolność wiązania receptora EGF (fig. 2). Głównymi komórkami docelowymi IL-8 są granulocyty obojętnochłonne posiadające trzy funkcje biologiczne: ruch chemotaktyczny wzdłuż gradientu chemotaktycznego uwalnianie zmagazynowanych ziarnistości zawierających uprzednio wytworzone enzymy proteolityczne natychmiastowe wytwarzanie anionów ponadtlenkowych (wybuch oddechowy) A zatem, przetestowano białka fuzyjne MAb 425/NcoI7IL-8 i MAb 425/Bc1I/IL-8 pod względem aktywności chemotaktycznej, indukcji uwalniania MPO oraz uwalniania ponadtlenków. Ponadto, można było wykazać, że białka fuzyjne według wynalazku (na przykład MAb 425/NcoI/IL-8 oraz MAb 425/Bc1I/IL-8) powodują aktywność chemotaktyczną, indukcję uwalniania MPO oraz uwalniania ponadtlenków. Wyniki przedstawione na fig. 3a wykazują, że oba białka fuzyjne sąchemotaktyczne wobec ludzkich granulocytów obojętnochłonnych w zakresie zrekombinowanej EL-8. (fig. 3b). Oprócz białek fuzyjnych MAb 425/NcoI/IL-8 oraz MAb 425/BclI/IL-8, które powinny łączyć się w postać dwuwartościową utworzono jednowartościo-

9 we białko fuzyjne F (ab ')-IL -8, którego ekspresję prowadzono wis. coli i oczyszczono je. Figura 4 pokazuje, że białko fuzyjne F(ab')-IL-8, w porównaniu MAb 425 F(ab') w porównaniu z analogicznie eksprymowanym w E. coli i oczyszczonym, jest chemotaktyczne wobec ludzkich granulo cytów obojętnochłonnych. Białko fuzyjne MAb 425/Bc1I/IL-8 posiada raczej silną zdolność uwalniania ponadtlen ków w porównaniu z wolną IL-8 (fig. 5); białko fuzyjne MAb 425/NcoI/IL-8 jest mniej aktywne, ale wartości są znacząco wyższe od wartości kontrolnych (fig. 5). Samo MAb 425 nie wykazuje aktywności. Wszystkie testy przeprowadzono przy użyciu cytochalazyny B jako substancji wzmacniającej, która sama nie wykazuje aktywności (dane nie przedstawione). Oba białka fuzyjne indukują uwalnianie mieloperoksydazy (MPO), ale białko fuzyjne MAb 425/NcoI/IL-8 jest bardziej aktywne niż białko fuzyjne MAb 425/Bc1I/IL-8 (fig. 6). Wszystkie dane obliczono w odniesieniu do danych komórek lizowanych tritonem, gdzie zawartość enzymu przyjęto za 100%. Wszystkie dane otrzymano przy użyciu cytochalazyny B jako substancji wzmacniającej. Uprzednio wykazano, że N-końcowa cześć cząsteczki IL-8 z silnie konserwatywnym motywem E-L-R jest wymagana do wiązania receptora i przekazywania sygnału. Trzeciorzędowa struktura IL-8 jest homodimerem, w którym oba końce N są eksponowane. Prawdopodobnie aktywność biologiczna IL-8 została zahamowana, kiedy końce N zostały zablokowane dodatkowymi aminokwasami. Dlatego też dla wprowadzenia peptydów łącznikowych i w ten sposób przywrócenia dostępności końca N pomiędzy dwa cdna wprowadzono miejsca restrykcyjne (NcoI/Bc1I). Inne podejścia do wytwarzania białek fuzyjnych, takie jak sprzęganie chemiczne obu elementów prowadzą do niezdefiniowanych struktur, które mogą być różne w różnych preparatach. Ponadto, sprzęganie chemiczne może niszczyć drugorzędową strukturę ligandu lub powodować sytuacje, w której z braku dostępności, większość białek będzie nieaktywna pod względem wiązania receptora. W przeciwieństwie, podejście według wynalazku pozwala na wytwarzanie białek fuzyjnych o zdefiniowanej strukturze, które mogą ulegać ekspresji z powtarzalną jakością, prawie bez ograniczeń. Podsumowując, białka fuzyjne według wynalazku posiadają następujące właściwości: - wiążą się z komórkami EGFR-dodatnimi, - powodują aktywność chemotaktyczną, - indukują uwalniania MPO i ponadtlenków, - indukują lizę nowotworów in situ. KRÓTKI OPIS TABEL I FIGUR Tab. 1. Tabela I przedstawia sekwencje starterów użytych w reakcji PCR do wytworzenia miejsc NcoI lub Be1I w celu utworzenia białek fuzyjnych do ekspresji w komórkach eukariotycznych. Figura 1: Modele immunokoniugatów cytokina-przeciwciało. c = cytokina; VH = region zmienny łańcucha ciężkiego; VL = region zmienny łańcucha lekkiego; CH = region stały łańcucha ciężkiego; CL = region stały łańcucha lekkiego. Figura 2: Wykazanie obecności MAb 425 w supematantach transfekowanych komórek COS-7 przez test ELISA na wiązanie z EGFR: kwadraty: supematant CH3 MAb 425 trójkąty: supematant CH2 MAb 425-(NcoI)-IL-8 odwrócone trójkąty: supematant CH2 MAb 425-(Bc1I)-IL-8 kropki: supematant phcmv oś odciętych: rozcieńczenie supematantów oś rzędnych: gęstość optyczna przy długości fali 490 nm.

10 Figura 3a: Indukcja chemotaksji przez supematanty transfekowanych komórek COS-7: słupek 1: kontrola DMEM/PS słupek 2: nierozcieńczony supernatant phcmv słupek 3: supernatant CH3 MAb 425 rozcieńczony 1:14 (zgodnie z wynikami testu ELISA przeciw EGFR) słupek 4: supernatant CH3 MAb 425 rozcieńczony 1:28 (zgodnie z wynikami testu ELISA przeciw EGFR) słupek 5: nierozcieńczony supernatant CH2 MAb 425-(BclI)-IL-8 (1,76 x mola/litr*) słupek 6: supernatant CH2 MAb 425-(BclI)-IL-8 rozcieńczony 1:2 słupek 7: nierozcieńczony supernatant CH2 Mab 425-(Ncol)-IL-8 (2,0 x mola/litr*) słupek 8: supernatant CH2 MAb 425-(NcoI)-IL-8 rozcieńczony 1:2*, stężenie IL-8 określono testem ELISA (Amersham) oś rzędnych: ilość komórek w polu liczenia Figura 3b: Indukcja chemotaksji przez oczyszczoną IL-8 oś rzędnych: ilość komórek w polu liczenia oś odciętych: stężenie IL-8 (mola/litr) Figura 4: Indukcja chemotaksji przez CH1 MAb 425-IL-8 (E. coli) kropki: CH1 MAb 425-IL-8 ulegający ekspresji w E. coli kwadraty: F(ab') MAb 425 ulegający ekspresji w E. coli trójkąty: kontrola Dulbecco/BSA oś rzędnych: ilość komórek w polu liczenia oś odciętych: stężenie (mole/litr) Fig. 5: Indukcja uwalniania ponadtlenków przez supematanty transfekowanych komórek COS-7: słupek 1: komórki niestymulowane słupek 2: 10-7 M IL-8 słupek 3: nierozcieńczony supernatant CH2 425-(NcoI)-IL-8 (2,0 x mola/litr*) słupek 4: nierozcieńczony supernatant CH2 MAb 425-(Bc1I)-IL-8 (1,76 x mola/litr*) słupek 5: nierozcieńczony supernatant CH3 MAb 425 (0 mola/litr*) * stężenie IL-8 określono testem ELISA (Amersham) oś rzędnych: gęstość optyczna przy długości fali 550 nm. Figura 6: Indukcja uwolnienia MPO przez supematanty transfekowanych komórek COS-7: słupek 1: komórki niestymulowane słupek 2: komórki stymulowane cytochalazyną B słupek 3: 10-7M IL-8 słupek 4: nierozcieńczony supernatant CH3 MAb 425 słupek 5: supernatant CH3 MAb 425 rozcieńczony 1:2 słupek 6: nierozcieńczony supernatant CH2 MAb 425-(NcoI)-IL-8 słupek 7: supernatant CH2 MAb 425-(NcoI)-IL-8 rozcieńczony 1:2 słupek 8: nierozcieńczony supernatant CH2 MAb 4252-(Bc1I)-IL-8 słupek 9: supernatant CH2 MAb 425-(BclI)-IL-8 rozcieńczony 1:2 oś pionowa: % aktywności MPO w porównaniu z całkowitą ilością MPO ( 100%) Szczegółowy opis UWAGI OGÓLNE Wszystkie mikroorganizmy, linie komórkowe, plazmidy, promotory, markery oporności, miejsca początku replikacji, miejsca restrykcyjne oraz inne fragmenty wektorów, o których

11 wspomina się w zgłoszeniu, są komercjalnie lub w inny sposób ogólnie dostępne. Zakładając, że nie wspomniano inaczej, stosuje się je jedynie jako przyldady i nie mają zasadniczego znaczenia dla wynalazku oraz można je zastąpić, odpowiednio, innymi odpowiednimi narzędziami i materiałami biologicznymi. Techniki, które są zasadniczo zgodne z wynalazkiem opisano szczegółowo poniżej. Inne techniki, których nie opisano szczegółowo, odpowiadają znanym metodom standardowym, które są dobrze znane specjalistom w tej dziedzinie lub zostały opisane bardziej szczegółowo w cytowanych odnośnikach i zgłoszeniach patentowych oraz standardowej literaturze (np. Antibodies, A Laboratory Manual, Harlow, Lane, Cold Spring Harbor, 1988). PRZECIWCIAŁA MONOKLONALNE Mysie przeciwciało monoklonalne MAb 425 z podklasy IgG1 otrzymano stosując ludzka linię komórek rakowych A431 (ATCC CRL 1555).MAb 425 wiąże się z polipeptydowym epito pem zewnętrznej domeny ludzkiego receptora EGF i współzawodniczy z wiązaniem EGF. Stwierdzono, że MAb 425 ma udział w cytoksyczności komórek nowotworowych in vitro i hamuje in vitro wzrost komórek nowotworowych linii komórek rakowych pochodzących z nabłonka lub okrężnicy i odbytnicy (Rodeck i in., Cancer Res. 47: 3692,1987). Humanizowane i chimeryczne wersie MAb 425 ujawniono w światowym opisie patentowym WO 92/ CHEMOKINY cdna kodujące chemokiny albo zakupiono z British Biotechnology Limited (ludzka IL-8 BBG; Herrmann Biermann GmBH, Bad Nauheim, Niemcy) lub utworzono na matrycy mrna wyizolowanego z ludzkiej linii komórkowej wytwarzającej cytokinę U 937 (ATCC CRL 1593). Całkowity RNA z komórek wytwarzających chemokinę wyizolowano stosując RNAzol (WAKchemie, Niemcy) zgodnie z zaleceniami producenta. Następnie RNA poddano transkrypcji na cdna i sekwencję kodujące chemokinę zamplifikowano stosując odpowiednie startery o sekwencjach przewidzianych na podstawi opublikowanych sekwencji DNA. WEKTORY puc 19 jest jednym z serii zbliżonych wektorów klonujących opartych na plazmidzie E. coli o wysokiej liczbie kopii i zawiera części pbr322 i M13mpl9. puc 19 zawiera indukowalny bakteryjny promotor-operator lac, po którym następuje miejsce wielokrotnego klonowania (Yanisch-Perron i in., Gene 33: ,1985). Wektory puc są komercjonalnie dostępne (np. New England Biolabs). Wektory fagemidowe pbluescript KS/SK+ i KS/SK pochodzą od puc19. Wektory te są dostępne komercjalnie (Stratagene, Heidelberg). Prokariotyczne wektory ekspresyjne oparte są na wektorze psw1 (Ward i in., Nature 341: , 1989), który pochodzi od wektora PUC 19. psw1 zawiera sekwenvcję kodującąpeptyd liderowy bakteryjnego genu pelb z Erwinia coroto vora(leiin., J.Bact. 169: , 1987). W celu kierowania ulegającego ekspresji białka do pe ryplazmy, obce DNA można wprowadzać we właściwej ramce odczytu za sekwencją liderowąpe 1B. Eukariotyczny wektor ekspresyjny phcmv (Gillies i in., Cell 33: 717, 1983) zawiera region początku replikacji wirusa małpiego 40 (SV40)oraz region promotora i sekwencji wzmacniającej ludzkiego cytomegalowirusa. Za regionem promotor/sekwencja wzmacniająca występuje miejsce wielokrotnego klonowania do wprowadzania genów mających ulegać ekspresji. W wektorze tym połączono chimeryczną postać regionu zmiennego ciężkiego łańcucha MAb 425 i regionu cγ CH2 poddanych fuzji z chemokinąprzy końcu domeny CH2 w celu wytworzenia białka fuzyjnego ciężkiego łańcucha MAb 425. Fuzyjny łańcuch Ig można składać w immunokoniugat przez jego łączenie z odpowiednim lekkim łańcuchem, z utworzeniem jednowartościowego regionu wiążącego antygen, który może następnie asocjować z wytworzeniem dwuwartościowego immunokoniugatu specyficznego wobec antygenu docelowego. Konstrukcje ciężkiego i lekkiego łańcucha można umieścić w jednym, lub w oddzielnych wektorach. EKSPRESJA BIAŁEK FUZYJNYCH W KOMÓRKACH EUKARIOTYCZNYCH Konstruowanie eukariotycznych wektorów ekspresyjnych do ekspresji białka fuzyjnego Fab 425-chemokina

12 FUZJA MAB-425 I CHEMOKIN TECHNIKĄ PCR Ludzki region stały cγ 1 wstawiono do puc19 w postaci fragmentu BamHI/BamHI. Region stały cγ 1 zawiera dwa miejsca SacII: jedno położone w intronie 5'-końcowym, 40 bp za 5'-końco wym miejscem BamHI, i drugie, położone 580 bp za 5'-końcowym miejscem BamHI i 140 bp przed początkiem domeny CH3. Drugie miejsce SacII jest odpowiednie do dalszego subklonowa nia, a zatem pierwsze miejsce zniszczono przez wprowadzenie miejsca SnaBI z adaptora. W konstrukcji tej (ASac II cγ 1) łatwo można wymieniać fragmenty znajdujące się za miejscem SacII. Ludzką IL-8 wycięto z wektora puc18 (Bgl II/Eco RI) i wstawiono do pbluesęript SK+ (Stratagene GmbH,Heidelber) (Smal/EcoRI), także 3wydeletowano miejsca Bg1II SmaI. Fragment SacII/XbaI klonu ΔDacIIcγl wstawiono do pbluescript SK+. Stosując technikę PCR oba geny zamplifikowano wykorzystując odpowiednie startery: - dla ΔSac II cyl: starter 3'-końcowy: sekwencja końcowa domeny CH2 i miejsce Ncol starter 5'-końcowy: starter do odwrotnego sekwencjonowania - dla IL-8 starter 3'końcowy: uniwersalny starter do sekwencjonowania starter 5'-końcowy: miejsce Ncol i początek sekwencji IL-8 Produkty strawiono i zligowano z SK+ SacII/EcoRI. W sekwencji otrzymanego peptydu C-końcową lizynę domeny CH-2 wymieniono na metionionę, a N-końcową serynę części IL-8 wymieniono na glicerynę. Nowo utworzona sekwencja w miejscu połączenia dwóch polipeptydów jest następująca: 5' AAA GCC ATG GGT GCT 3' Lys Ala Met Gly Ala cych2 <= => IL-8 (2-72) Tę samąprocedurę przeprowadzono stosując startery (Tabela 1) do wprowadzania miejsca Bell pomiędzy dwa geny. Otrzymany gen fuzyjny posiada miejsce Be1I pomiędzy genem regionu stałego cyl i genem IL-8, kodując pełną sekwencję domeny CH2, dwa dodatkowe aminokwasy (walina, izoleucyna) i sekwencję IL-8 bez pierwszych dwóch aminokwasów (seryna, alanina). Nowo utworzona sekwencja w miej scu połączenia dwóch polipeptydów jest następująca: 5' GCC AAA GTG ATC AAA GAA 3' Ala Lys Val Ile Lys Glu cγch2 <= => IL-8 (3-72) Produkty PCR zsubklonowano w SK+ wykorzystując miejsca restrykcyjne SacI i EcoRI. Dla uzyskania ekspresji w komórkach eukariotycznych te geny füzyjne sklonowano w wektorze phcmy. Tabela Konstrukcja Starter Sekwencja DNA CH2/NcoI cγ5' cγl 3' IL8/NcoI IL-8 5' IL-8 3' CH2/BclI cγl 5' cγl 3' IL-8/BclI IL-8 5' IL-8 3' 5' -CAGGAAACAGCTATGAC-3' 5' -TGATCCATGGCTTTGGAGATGGTTTTCTCG-3' 5' -GATCTACCTGCCATGGGTGCTAAAGAA-3' 5' -GTAAAACGACGGCCAGT-3' 5' -CAGGAAACAGCTATGAC-3' 5' -CGCGTGATCACTTTGGCTTTGGAGATGGTT- 3' 5' -CTCGTGATCAAAGAACTTAGATGTCAATGC- 3' 5' -GTAAAACGACGGCCAGT-3 ' EKSPRESJA IMMUNOKONIUGATÓW W KOMÓRKACH EUKARIOTYCZNYCH Ekspresja immunokoniugatów w komórkach eukariotycznych wymaga wprowadzenia DNA wektora zawierającego sekwencje kodujące lekki i ciężki łańcuch do komórek gospodarza.

13 Opisano szereg różnych metod, takich jak elektroporacja, stosowanie DEAE-dekstranu, fosforanu wapniowego i Lipofectin oraz fuzja protoplastów. Można stosować każdy typ komórek gospodarza, pod warunkiem, że w tym typie komórek zrekombinowane sekwencje DNA kodujące immunokoniugat ulęgają właściwej transkrypcji do mrna. Komórkami gospodarza mogą być mysie komórki szpiczaka, które nie wytwarzają immunoglobulin, takie jak Sp2/0-AG14 (ATCC CRL 1581), P3X63Ag8.653 (ATCC CRL 1580), komórki chomika, takie jak CHO-K1 (ATCC CCL 61) lub CHO/DHFR- (ATCC CRL 9096), bądź BHK-21 (ATCC CCL 10). Do jednorazowej ekspresji można użyć komórek COS-1 (ATCC CRL 1650) lub COS-7 (ATCC CRL 1651). JEDNORAZOWA EKSPRESJA IMMUNOKONIUGATÓW Wektor ekspresyjny phcmv zawiera miejsce początku replikacji wirusa małpiego 40 (SV40). Linia komórkowa COS-7 pochodzi od małpiej linii komórkowej CV-1, którą stransfor mowano wirusem SV40 pozbawionym miejsca początku replikacji. Dlatego też, plazmidy zawierające miejsce początku replikacji SV40 będą ulegać amplifikacji, i wytwarzanie immunokoniugatów będzie ulepszone. Supematanty zbierano 24 godziny później i testowano pod względem wiązania z receptorem EGF i stężenia chemokiny przez test ELISA. CIĄGŁA EKSPRESJA IMMUNOKONIUGATÓW Wektory zawierające zrekombinowane konstrukcje do ekspresji immunokoniugatów wprowadzono do odpowiednich komórek gospodarza. Konstrukcje ciężkiego i lekkiego łańcucha można umieścić w tym samym lub oddzielnych wektorach; w tym ostatnim przypadku oba wektory mogą posiadać identyczne markery selekcyjne, takie jak gen oporności na neomycynę lub gen reduktazy dehydrofolianowej (DHFR), bądź dwa różne markery selekcyjne do selekcji obecności obu wektorów. Selekcję pod kątem markera DHFR można prowadzić tylko w DHFR-ujemnych liniach komórkowych, takich jak CHO/DHFR-. Mieszane populacje analizuje się pod względem ekspresji immunokoniugatów przez test ELISA specyficzny wobec receptora EGF. Dalszą selekcję dodatnich monoklonów prowadzi się przez klonowanie z ograniczonym rozcieńczaniem. Oczyszczanie immunokoniugatówmab425-chemokina Immunokoniugaty MAb 425 wytwarzane przez komórkę gospodarza można zbierać i oczyszczać każdą odpowiednią metodą, taką jak chromatografia powinowactwa z zastosowaniem docelowego antygenu, przeciwciał skierowanych przeciw cytokinie lub przeciwciał anty idiotypowych (np. Harlow, Lane, I. c.). W tym przypadku, oczyszczenie uzyskano przez przeciwciała antyidiotypowe, które otrzymano standardowymi metodami (np. Kostelny i in., (1992) J. Immunol. 148, 1547) wykorzystując MAb 426. Dla uzyskania czystych immunokoniugatów Fv, odpowiednie do ekspresji białka szczepy E. coli transformowano plazmidami ekspresyjnymi (patrz poniżej). Wzrost komórek prowadzono do uzyskania OD578 = 0,5 i indukowano izopropylo-β-d-tiogalaktopiranozydem (IPTG) (1 mm). Wzrost komórek prowadzono przez noc i zbierano supematanty i komórki. Supematant nakładano na kolumnę z przeciwciałem antyidiotypowym skierowanym przeciw MAb 425, przygotowaną zgodnie ze standardowymi procedurami. Kolumnę przemywano buforem fosforanowym z 0,5 M NaCl i związane białko eluowano 100 mm glicyną z 0,5 M NaCl o ph 2,5. Eluat natychmiast zobojętniano 2,5 M Tris ph 8,0. Frakcje zawierające CH1 MAb 425-IL8 łączono, zatężano i dializowano wobec PBS. KONSTRUOWANIE WEKTORÓW EKSPRESYJNYCH DO EKSPRESJI BIAŁEK FU ZYJNYCH FAB25-CHEMOKINA I Fv-CHEMOKINA W KOMÓRKACH PROKARIOTYCZ NYCH Fragment Fv utworzono zgodnie z Glockshuber i in. (Biochemistry 29: ,1990). Sekwencje DNA kodujące lekki łańcuch i fragment Fd ciężkiego łańcucha lub fragment Fv wprowadzono do miejsca wielokrotnego klonowania wektora psw1. Dojrzałą sekwencję kodującą lekki łańcuch, dojrzałą sekwencję kodującąciężki łańcuch i sekwencję kodującąfv poprzedzono sekwencją peptydu liderowego z bakteryjnego genu pel B. Sekwencja kodująca ciężki łańcuch zawiera miejsce Ncol (koniec 3'). cdna kodujące chemokiny tak zmodyfikowano przez PCR, aby zawierały miejsca restrykcyjne Ncol (koniec 5') i Notl (koniec 3') lub EcoRI (w przypadku fuzji Fv). Geny chemokin poddano fuzji we właściwej ramce odczytu bezpośrednio z domeną

14 CH1 ciężkiego łańcucha lub fragmentu Fv. Alternatywnie, pomiędzy domenę CH1 i gen chemo kiny można wprowadzić peptyd łącznikowy, taki jak (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)x, gdzie x ma wartość od 1 do 4. Takie łączniki i metody ich tworzenia są znane w literaturze (np. Curtis i in., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 88,5809). Wektory te umożliwiają wydajną ekspresję funkcjonalnych białek fuzyjnych F(ab')- (=CH1) i Fv-chemokina w E.coli. Sekwencje kodujące lekki łańcuch i białko fiizyjne ciężki łańcuch-chemokina umieszcza się na pojedyńczym dwucistronowym matrycowym RNA pozostającym pod kontrolą indukowalnego promotora lac (Skerra i Pliickthun, Science 242: , 1988). Dlatego też, ekspresję białka fuzyjnego Fab/Fv można indukować zgodnie z wymaganiami warunków hodowli. Translacja obu białek z dwucistronowego matrycowego RNA sprzyja syntezie równych ilości białka fuzyjnego Fd-che mokina i lekkiego łańcucha, zwiększając w ten sposób szanse właściwego łączenia w funkcjonalne białko fiizyjne Fab/Fv. Dwa polipeptydy są wydzielane do peryplazmy E. coli, gdzie zachodzi ich ufałdowanie, tworzenie wiązań dwusiarczkowych i łączenie w funkcjonalne białko fiizyjne FAb 425CH1/Fv. Wydłużona hodowla bakterii prowadzi do częściowej permeabilizacji zewnętrznej błony E. coli, co umożliwia dyfuzję białek fuzyjnych do podłoża hodowlanego. WŁAŚCIWOŚCI WIĄŻĄCE IMMUNOKONIUGATÓW MAB 425 Właściwości wiążące immunokoniugatów MAb 425 określano przez test ELISA specyficzny wobec receptora EGF. Krótko, płytki do mikromiareczkowania opłaszczano przez noc w temperaturze 4 C oczyszczonym receptorem EGF. Płytki inkubowano z supematantami zawierającymi białka fiizyjne lub supematantami zawierającymi nieskoniugowane fragmenty MAb. Płytki przemywano w celu usunięcia niezwiązanego materiału, i przeciwciało związane z receptorem wykrywano przez inkubację z ze skoniugowanymi z peroksydazą kozimi przeciwciałami skierowanymi przeciw ludzkim IgG i IgM (ciężki i lekki łańcuch), a następnie substratem. Ilość związanego białka specyficznego wobec receptora EGF określano przez pomiar absorpcji przy długości fali 490 nm. AKTYWNOŚĆ BIOLOGICZNA IMMUNOKONIUGATÓW MAB 425-IL-8. Izolowanie komórek efektorowych W celu określenia aktywności biologicznej, bezpośrednio przed użyciem z pełnej krwi zdrowych dawców izolowano ludzkie granulocyty obojętnochłonne krwi obwodowej, jak uprzednio opisali Hasłett i in. (Am. J. Pathol. 119: , 1985). Osocze oddzielano przez wirowanie, erytrocyty przez sedymentację z dekstranem, a na końcu limfocyty i leukocyty oddzielano przez wirowanie w gradiencie perkolu. Wyizolowane granulocyty obojętnochłonne wykorzystywano natychmiast. OKREŚLANIE AKTYWNOŚCI CHEMOTAKTYCZNEJ Badanie chemotaksji prowadzono według Falka i in. (J. Immunol. Methods 33: , 1980). Krótko, stosowano 48-studzienkową komorę Boydena i 5 μm membrany. Oczyszczone granulocyty obojętnochłonne ponownie zawieszano w podłożu DMEM (DMEM, 1% penicylina, 1% streptomycyna, 10% cielęca surowica płodowa, 2 mm L-glutamina, 1 mm pirogronian sodowy, 10 mm HEPES) w stężeniu 1 x 106 komórek/ml. W dolnych studzienkach umieszczano supematanty zawierające białka fiizyjne lub supematanty kontrolne, przykrywano je membranami i ostatecznie w górnych studzienkach umieszczono zawiesinę komórek. Po 30 minutach inkubacji w temperaturze 37 C membrany usuwano i w ciągu 10 minut utrwalano w 2% glutaraldehydzie. Następnie komórki przylegające do membrany barwiono w ciągu 3 minut w Weigeifs Iron Hematoxylin (odczynnik diagnostyczny Sigma). Ilość komórek związanych z membraną określano mikroskopowo. OKREŚLENIE ZDOLNOŚCI DO INDUKOWANIA UWALNIANIA ENZYMÓW Z GRANULOCYTÓW OBOJĘTNOCHŁONNYCH W celu oceny zdolności immunokoniugatów do indukowania uwalniania ziarnistości z granulocytów obojętnochłonnych, monitorowano aktywność mieloperoksydazy w supematan cie (Henson i in., J. Immunol. 121: 851, 1978). Oznaczanie prowadzono w 96-studzienkowych płytkach do miareczkowania z 5 x 105 komórkami na studzienkę. Po inkubacji (37 C) z czynnikami stymulującymi, płytki wirowano i pozbawione komórek supematanty przenoszono do in-

15 nej 96-studzienkowej płytki do mikromiareczkowania. Wolne od komórek supematanty inkubowano z dianizydyną (jako substratem) i mierzono absorbancję przy długości fali 492 nm. Jako kontrolę dodatnią stosowano FMLP w stężeniu 10-7 M. Dla określenia całkowitej zawartości enzymu, komórki bez czynników stymulujących lizowano tntionem. Aktywność obliczano jako procent całkowitej zawartości enzymu (liza). OKREŚLENIE ZDOLNOŚCI UWALNIANIA PONADTLENKÓW Cytochrom c ulega redukcji pod wpływem O2- i dlatego zmienia swoją absorbancję. Zmiany absorbancji stanowią wartościowy wskaźnik do oceny aktywności ponadtlenków. Oznaczanie prowadzono według Guthrie'go i in. (J. Exp. Med. 160: , 1984) w 96-studzienkowych płytkach do mikromiareczkowania z 5 x 105 na studzienkę. Po inkubacji z czynnikami stymulującymi i cytochromem c płytki wirowano i określono absorbancję superna tantu przy długości fali 550 nm. DALSZE IMMUNOKONIUGATY Zgodnie z powyższym opisem przygotowano i zbadano skierowane przeciw EGFR immu nokoniugaty CH1, CH2, CH3 i Fv (z/bez miejsca restrykcyjnego i łącznika), zawierające jako składnik chemokinowy MIP-2α i mip-2β. Konstrukcje te wykazują podobne właściwości jak pochodne IL-8. LECZNICZE ZASTOSOWANIE IMMUNOKONIUGATÓW Immunokoniugaty według wynalazku można podawać ludziom w celach leczniczych. Dlatego też, przedmiotem wynalazku jest dostarczenie postaci farmaceutycznej zawierającej jako składnik aktywny co najmniej jedno ze zdefiniowanych powyżej i w zastrzeżeniach białko fuzyjne, połączone z jednym lub więcej jego farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem, za róbką lub rozcieńczalnikiem. Zazwyczaj immunokoniugaty według tego wynalazku podawać się będzie jako iniekcje dożylne lub pozajelitowe. Ogólnie rzecz biorąc, zakresy dawek przy podawaniu immonokoniu gatów są dostatecznie duże do wywoływania pożądanego wpływu hamującego i lizującego nowotwór. Dawkowanie zależeć będzie od wieku, stanu, płci i zaawansowania choroby u pacjenta, i może wahać się od 0,1 mg/kg do 200 mg/kg, korzystnie od 0,1 mg/kg do 100 mg/kg/dawkę do podawania w jednej lub więcej dawek dziennie, w ciągu jednego lub kilku dni. Preparaty do podawania pozajelitowego obejmują jałowe roztwory wodne i niewodne, zawiesiny i emulsje. Przykładami rozpuszczalników niewodnych są glikol propylenowy, glikol polietylenowy, oleje roślinne, takie jak oliwy, i nadające się do iniekcji estry organiczne, takie jak oleinian etylowy, oraz inne rozpuszczalniki znane w nauce, które są odpowiednie do tych celów. Immunokoniugaty według wynalazku można stosować w kompozycji zawierającej fizjologicznie dopuszczalny nośnik. Przykładami takich odpowiednich nośników są sól fizjologiczna, sól fizjologiczna zbuforowana fosforanami, roztwór Ringera lub roztwór Ringera z mleczanem. W postaciach framaceutycznych mogą być obecne środki konserwujące i inne dodatki, takie jak antybiotyki, przeciwutleniacze i czynniki chelatujące. Farmaceutyczne postacie według niniejszego wynalazku są odpowiednie do leczenia wszystkich rodzajów nowotworów, włącznie z czerniakami, glejakami i rakami, jak również nowotworów krwi i guzów litych.

16 (1) INFORMACJA OGÓLNA: LISTA SEKWENCJI (i) ZGŁASZAJĄCY: (A) NAZWA: Merck Patent GmbH (B) ULICA: Frankfurterstr. 250 (C) MIEJSCOWOŚĆ: Darmstadt (E) KRAJ: Niemcy (F) KOD POCZTOWY (ZIP): (G) TELEFON: (H) TELEFAX: (ii) TYTUŁ WYNALAZKU: Immunokoniugaty II (iii) LICZBA SEKWENCJI: 8 (iv) ZAPIS KOMPUTEROWY: (A) TYP NOŚNIKA: Dyskietka (B) KOMPUTER: Kompatybilny 2 IBM PC (C) SYSTEM OPERACYJNY: PC-DOS/MS-DOS (D) OPROGRAMOWANIE: Patentin Release #1.0, wersja #1.30(EPO) (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 1: (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWECJI: (A) DłUGOŚĆ: 17 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: cdna (iii) HIPOTETYCZNA: nie (iv) ANTYSENSOWNA: nie (v ) RODZAJ FRAGMENTU: N-końcowy (vi) ŹRÓDŁO ORYGINALNE:

17 (A) ORGANIZM: starter 5'-końcowy c-gamma 1 (B) SZCZEP: E. coli (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 1: CAGGAAACAGCTATGAC 17 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 2: (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWECJI: (A) DłUGOŚĆ: 30 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: cdna (iii) HIPOTETYCZNA: nie (iv) ANTYSENSOWNA: nie (v) RODZAJ FRAGMENTU: N-końcowy (vi) ŹRÓDŁO ORYGINALNE: (A) ORGANIZM: starter 3'-końcowy c-gamma 1 (B) SZCZEP: E. coli (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 2: TGATCCATGGCTTTGGAGATGGTTTTCTCG 30 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 3: (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWECJI: (A) DłUGOŚĆ: 27 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa

18 (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: cdna (iii) HIPOTETYCZNA: nie (iv) ANTYSENSOWNA: nie (v ) RODZAJ FRAGMENTU: N-końcowy (vi) ŹRÓDŁO ORYGINALNE: (A) ORGANIZM: starter 5'-końcowy IL-8 (B) SZCZEP: E. coli (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 3: GATCTACCTGCCATGGGTGCTAAAGAA 27 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 4: (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWECJI: (A) DłUGOŚĆ: 17 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: CDNA (iii) HIPOTETYCZNA: nie (iv) ANTYSENSOWNA: nie (v) RODZAJ FRAGMENTU: N-końcowy (vi) ŹRÓDŁO ORYGINALNE: (A) ORGANIZM: starter 3'-końcowy IL-8 (B) SZCZEP: E. coli (XX) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 4: GTAAAACGACGGCCAGT 17

19 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 5: (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWECJI: (A) DłUGOŚĆ: 17 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: CDNA (iii) HIPOTETYCZNA: nie (iv) ANTYSENSOWNA: nie (v) RODZAJ FRAGMENTU: N-końcowy (vi) ŹRÓDŁO ORYGINALNE: (A) ORGANIZM: starter 5'-końcowy c-gamma 1 (B) SZCZEP: E. coli (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 5: CAGGAAACAGCTATGAC 17 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 6: (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWECJI: (A) DłUGOŚĆ: 30 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: CDNA (iii) HIPOTETYCZNA: nie (iv) ANTYSENSOWNA: nie (v) RODZAJ FRAGMENTU: N-końcowy (vi) ŹRÓDŁO ORYGINALNE: (A) ORGANIZM: starter 3'-końcowy c-gamma 1 (B) SZCZEP: E. coli

20 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 6: CGCGTGATCACTTTGGCTTTGGAGATGGTT 30 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 7: (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWECJI: (A) DłUGOŚĆ: 30 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: cdna (iii) HIPOTETYCZNA: nie (iv) ANTYSENSOWNA: nie (v) RODZAJ FRAGMENTU: N-końcowy (vi) ŹRÓDŁO ORYGINALNE: (A) ORGANIZM: starter 5'-końcowy IL-8 (B) SZCZEP: E. coli (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 7: CTCGTGATCAAAGAACTTAGATGTCAATGC 30 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 8: (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWECJI: (A) DłUGOŚĆ: 17 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: CDNA