(86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/JP02/003312

Transkrypt

1 PL B1 RZECZPOSPOLITA POLSKA Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (21) Numer zgłoszenia: (22) Data zgłoszenia: (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/JP02/ (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego: , WO02/ (13) B1 (51) Int.Cl. A61K 39/395 ( ) A61K 45/00 ( ) A61P 19/02 ( ) Opis patentowy przedrukowano ze względu na zauważone błędy (54) Środek terapeutyczny do leczenia młodzieńczego reumatoidalnego zapalenia stawów o początku układowym i środek terapeutyczny do leczenia choroby Stilla wieku dorosłego (30) Pierwszeństwo: , JP, , JP, (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 26/04 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 04/14 (73) Uprawniony z patentu: CHUGAI SEIYAKU KABUSHIKI KAISHA, Tokio, JP (72) Twórca(y) wynalazku: KAZUYUKI YOSHIZAKI, Ashiya, JP NORIHIRO NISHIMOTO, Minoo, JP MASAHIRO IWAMOTO, Oyama, JP SEIJI MINOTA, Tokio, JP SHUMPEI YOKOTA, Chigasaki, JP TAKAKO MIYAMAE, Yokohama, JP (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Marta Kawczyńska

2 2 PL B1 Opis wynalazku Dziedzina wynalazku Przedmiotem niniejszego wynalazku środek terapeutyczny do leczenia młodzieńczego reumatoidalnego zapalenia stawów o początku układowym oraz środek terapeutyczny do leczenia choroby Stilla wieku dorosłego. Stan techniki IL-6 jest cytokiną zwaną czynnikiem stymulującym komórki B 2 (BSF2) lub interferonem β2. IL-6 odkryto jako czynnik różnicowania odpowiedzialny za pobudzenie komórek limfatycznych B (Hirano, T. i wsp., Nature (1986) 324, 73-76). Następnie stwierdzono, że IL-6 jest cytokiną o wielu funkcjach wpływającą na czynność różnych komórek (Akira, S. i wsp., Adv. in Immunology (1993) 54, 1-78). Opisywano, że IL-6 wpływa na dojrzewanie komórek limfatycznych T (Lotz, M. i wsp., J. Exp. Med. (1988) 167, ). IL-6 wywiera swą aktywność biologiczną za pośrednictwem dwóch białek na komórce. Jednym z nich jest białko wiążące się z ligandem, receptor IL-6, o masie cząsteczkowej ok. 80 kda, z którym wiąże się IL-6 (Taga, T. i wsp., J. Exp. Med. (1987) 166, ; Yamasaki, K. i wsp., Science (1987) 241, ). Receptor IL-6 występuje nie tylko w postaci związanej z błoną, przenikającej błonę komórkową i ulegającej w niej ekspresji, lecz również jako rozpuszczalny receptor IL-6 utworzony głównie z regionu pozakomórkowego. Drugim z tych białek jest związane z błoną komórkową białko niewiążące się z ligandami gp130 o masie cząsteczkowej ok. 130 kda uczestniczące w przekazywaniu sygnałów. IL-6 i receptor IL-6 tworzą kompleks IL-6/receptor IL-6, z którym wiąże się gp130, przez co dochodzi do rozprzestrzenienia się aktywności biologicznej IL-6 do komórki (Taga i wsp., Cell (1989) 58, ). Antagoniści IL-6 są to substancje hamujące przekazywanie aktywności biologicznych IL-6. Dotychczas znane były przeciwciała skierowane przeciwko IL-6 (przeciwciała anty-il-6), przeciwciała skierowane przeciwko receptorowi IL-6 (przeciwciała anty-il-6r), przeciwciała przeciwko gp130 (przeciwciała anty-gp130, IL-6 o zmienionym kształcie, częściowe peptydy IL-6 lub receptora IL-6 itp. Wielokrotnie opisywano przeciwciała skierowane przeciwko receptorowi IL-6 (Novick D. i wsp., Hybridoma (1991) 10, ; Huang, Y.W. i wsp., Hybridoma (1993) 12, ; międzynarodowe zgłoszenie patentowe WO ; francuskie zgłoszenie patentowe FR ; patent Stanów Zjednoczonych ). Humanizowane przeciwciało PM-1 wytwarzano poprzez implantację regionu determinującego dopasowanie (CDR) przeciwciała mysiego PM-1 (Hirata i wsp., J. Immunology (1989), jednego z przeciwciał skierowanych przeciwko receptorowi IL-6, 143, ) do przeciwciała ludzkiego (międzynarodowe zgłoszenie patentowe WO ). Przewlekłe zapalenia stawów w przebiegu chorób wieku dziecięcego obejmują przewlekłe zapalenia stawów wieku dziecięcego, chorobę Stilla itp. Przewlekłe zapalenie stawów wieku dziecięcego jest to grupa chorób obejmująca głównie przewlekłe zapalenie stawów pojawiające się przed ukończeniem 16 roku życia; ta grupa chorób występuje najczęściej spośród chorób kolagenowych występujących u dzieci. W przeciwieństwie do reumatoidalnego zapalenia stawów (RA) u dorosłych, tej grupy nie uważa się za jednorodną chorobę i występuje wiele typów tych chorób, tak więc zwykle traktuje się je jako jednostkę chorobową odmienną od reumatoidalnego zapalenia stawów u dorosłych. Przewlekłe zapalenia stawów wieku dziecięcego zwane są w Japonii młodzieńczym reumatoidalnym zapaleniem stawów (ang. juvenile rheumatoid arthritis - JRA)" zgodnie z kryteriami diagnostycznymi przyjętymi w Stanach Zjednoczonych, natomiast w Europie stosuje się zwykle termin młodzieńcze przewlekłe zapalenie stawów (ang. juvenile chronic arthritis - JCA)". Od niedawna używa się terminów takich jak idiopatyczne przewlekłe zapalenie stawów (ang. idiopathic chronic arthritis - ICA) i młodzieńcze idiopatyczne zapalenie stawów (ang. juvenile idiopathic arthritis - JIA). Typy chorób z grupy przewlekłych zapaleń stawów wieku dziecięcego klasyfikowano na wiele sposobów. Według Amerykańskiego Kolegium Reumatologii (American College of Rheumatology - ACR) dzieli się je, jako zapalenia stawów powstające u dzieci poniżej 16 roku życia utrzymujące się przez co najmniej 6 tygodni, na trzy typy: 1) JRA o początku ogólnoukładowym, 2) typ wielostawowy, 3) typ ubogostawowy (klasyfikacja ARA) (Podkomitet do Spraw Kryteriów JRA Komitetu do Spraw Kryteriów Rozpoznawania i Leczenia Amerykańskiego Stowarzyszenia Reumatologów, Arthritis Rheum 20 (Suppl) : 195, 1977). W Europie Europejska Liga Przeciwko Reumatyzmowi (ang. European League Against Rheumatism - EULAR) opracowała klasyfikację, w której; mimo że różni się ona od wyżej wspomnianej klasyfikacji ARA tym, że czas trwania zapalenia stawów wynosi co najmniej

3 PL B1 3 3 miesiące i z grupy tej wykluczono zapalenie stawów w przebiegu łuszczycy, zesztywniającego zapalenia stawów kręgosłupa itp.; trzy typy choroby są podobne (Biuletyn 4, Nomenclature and classification of Arthritis in Children. Bazylea, National Zeitung AG, 1977). Niedawno usiłowano dokonać modyfikacji tej klasyfikacji i Międzynarodowa Liga Stowarzyszeń Reumatologów (ang. International League of Associations for Rheumatology - ILAR) zaproponowała w 1995 r. plan klasyfikacji idiopatycznych zapaleń stawów wieku dziecięcego (Fink CW, Proposal for the development of classification criteria for idiopathic arthritides of childhood. J. Rheumatol., 22: 1566 (1955)); w 1997 roku zaproponowano zmiany jako plan ILAR (Southwood TR, Classifying childhood arthritis, Ann. Rheum. Dis. 56: 79 (1997)). W klasyfikacji tej proponuje się podział na: 1) ogólnoukładowe zapalenia stawów, 2) zapalenia wielostawowe z obecnością RF, 3) zapalenia wielostawowe bez obecności RF, 4) zapalenia niewielu stawów (skąpostawowe), 5) rozszerzone zapalenie niewielu stawów (skąpostawowe), 6) zapalenie stawów związane z zapaleniem przyczepów ścięgnistych 7) łuszczycowe zapalenie stawów i 8) inne. Ponadto, twórcy niniejszego wynalazku zaproponowali sposób klasyfikacji przewlekłych zapaleń stawów wieku dziecięcego na następujące grupy: 1) pierwotne przewlekłe zapalenia stawów wieku dziecięcego (1) zespół SPRASH (SPRASH: gorączka z pikami, zapalenie osierdzia, wysypka, zapalenie stawów, powiększenie śledziony, powiększenie wątroby) Choroba rozpoczyna się od uczucia gorąca w spoczynku i wysypki skórnej, a następnie dochodzi do zapalenia błon surowiczych i powiększenia wątroby oraz jednoczesnego opóźnionego pojawienia się zapalenia stawów; niekiedy zapalenie stawów nie występuje. (2) idiopatyczne przewlekłe zapalenia stawów wieku dziecięcego Rozwijają się one bez podłoża innej choroby: zapalenie stawów jest główną patologią. a) typ z obecnością czynnika reumatoidalnego (RF) b) typ z obecnością przeciwciał przeciwjądrowych (ANA) c) typ bez obecności RF/ANA 2) wtórne przewlekłe zapalenia stawów wieku dziecięcego Zapalenie stawów towarzyszy wielu chorobom genetycznym lub niegenetycznym (Shunpei Yokota, Advances in recent therapeutic methods for chronic arthritides diseases of childhood", Rheumatism, 39: 860 (1999)). Opisywano, że w patogenezie przewlekłych zapaleń stawów wieku dziecięcego biorą udział różne cytokiny. W szczególności uważa się, że chorobie tej towarzyszy brak równowagi cytokin zapalnych IL-1, IL-6, IL-12 i TNF-, cytokin przeciwzapalnych IL-1ra (antagonista receptora IL-1), IL-10, IL-13, stnfr (rozpuszczalny receptor TNF). W leczeniu przewlekłych zapaleń stawów wieku dziecięcego stosowano niesteroidowe leki przeciwzapalne, kortykosteroidy, leki przeciwreumatyczne (związki złota itd.), środki immunosupresyjne, metotreksat (MTX itp.). Jednakże, ze względu na to, że efekt terapeutyczny jest różny u poszczególnych pacjentów, nadal istnieją oczekiwania co do rozwoju skuteczniejszych sposobów leczenia. Choroba Stilla, po raz pierwszy opisana przez brytyjskiego pediatrę, dr Stilla, w 1897 r., cechuje się obrazem klinicznym wyraźnie odmiennym niż reumatoidalne zapalenie stawów wieku dorosłego i jest chorobą występującą zarówno u dorosłych, jak i u dzieci (zwłaszcza u młodzieży). Do głównych objawów należą: gorączka, rumień skóry, zapalenie stawów, zapalenie błon surowiczych itp. W tej grupie chorób typ z początkiem w wieku dorosłym określa się jako chorobę Stilla z początkiem w wieku dorosłym. W chorobie Stilla nie stwierdza się zwykle obecności czynnika reumatoidalnego. Choroba Stilla u dzieci jest inną nazwą ogólnoukładowego typu młodzieńczego reumatoidalnego zapalenia stawów (młodzieńcze reumatoidalne zapalenie stawów (JRA), JCA (młodzieńcze przewlekłe zapalenie stawów), młodzieńcze idiopatyczne zapalenie stawów (JIA)), które jest przewlekłym zapaleniem stawów pojawiającym się u dzieci poniżej 16 roku życia. Jeżeli chodzi o przyczyny choroby Stilla, sugerowano udział czynników środowiskowych, takich jak wirusy, czynników związanych z organizmem gospodarza, takich jak HLA i nieprawidłowości immunologicznych, lecz etiologia pozostaje nadal nieznana. Choroba Stilla u dorosłych i u dzieci wydaje się w zasadzie tą samą chorobą mimo istnienia niewielkich różnic w obrazie klinicznym, a nie tylko różnic dotyczących wieku wystąpienia choroby. Choroba Stilla u dzieci jest podobna do JRA typu ogólnoukładowego, jak to opisywano powyżej. Jednakże JRA i reumatoidalne zapalenie stawów (rheumatoid arthritis - RA) u dorosłych wykazują wiele

4 4 PL B1 różnic klinicznych i uważa się je za różne choroby, tak więc chorobę Stilla u dorosłych często traktuje się jako niezależną jednostkę chorobową w grupie chorób reumatycznych. Jeżeli chodzi o kryteria rozpoznawania choroby Stilla u dorosłych, znane są kryteria Yamaguchi (Journal of Rheumatology 19(3): , 1992), Reginato (Seminars in Arthritis & Rheumatism 17(1): 39-57, 1987), Cush (Rheumatology Grand Rounds, University of Pittsburgh Medical Center; Jan. 30, 1984), Goldman (Southern Medical Journal 73: , 1980) itp. W odniesieniu do związku choroby Stilla i cytokin opisywano jej związek z cytokinami takimi jak IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, TNF- i IFN-γ; spośród nich cytokiny zapalne takie, jak: IL-1, IL-6, TNF- i IFN-γ, wiązano z patologią choroby Stilla. W odniesieniu do IL-6 de Benedetti i wsp. opisywali, że w chorobie Stilla u dzieci poziom IL-6 w surowicy jest podwyższony (Arthritis Rheum. 34: 1158, 1991), i że w surowicy chorych z chorobą Stilla wieku dziecięcego obecny jest w dużych ilościach kompleks IL-6/rozpuszczalny receptor IL-6 (sil-6r), jak również można zaobserwować korelację między poziomem tego kompleksu a wartościami CRP (J. Clin. Invest. 93: 2114, 1994). Ponadto, Rooney i wsp. opisywali podwyższenie poziomu IL-6 i TNF- w osoczu u chorych z chorobą Stilla wieku dziecięcego (Br. J. Rheumatol. 34: 454, 1995). W leczeniu choroby Stilla stosuje się niesteroidowe leki przeciwzapalne, kortykosteroidy, leki przeciwreumatyczne (związki złota itd.), środki immunosupresyjne, preparaty gammaglobulin, metotreksat (MTX) itd. Jednakże, ze względu na to, że efekt terapeutyczny bywa różny u różnych pacjentów, dogodne byłoby opracowanie bardziej skutecznych sposobów leczenia. Ujawnienie wynalazku Przedmiotem niniejszego wynalazku jest środek terapeutyczny do leczenia młodzieńczego reumatoidalnego zapalenia stawów o początku układowym, charakteryzujący się tym, że jako składnik czynny zawiera przeciwciało przeciwko receptorowi interleukiny 6 (IL-6). Korzystnie przeciwciało przeciwko receptorowi IL-6 jest przeciwciałem monoklonainym skierowanym przeciwko receptorowi IL-6. Korzystniej przeciwciało przeciwko receptorowi IL-6 jest przeciwciałem monoklonalnym skierowanym przeciwko ludzkiemu receptorowi IL-6. Korzystniej przeciwciało przeciwko receptorowi IL-6 jest przeciwciałem monoklonalnym skierowanym przeciwko mysiemu receptorowi IL-6. Korzystnie przeciwciało przeciwko receptorowi IL-6 jest przeciwciałem rekombinowanym. Korzystniej przeciwciałem monoklonalnym skierowanym przeciwko ludzkiemu receptorowi IL-6 jest przeciwciało PM-1. Korzystniej przeciwciałem monoklonalnym skierowanym przeciwko mysiemu receptorowi IL-6 jest przeciwciało MR16-1. Korzystnie przeciwciało przeciwko receptorowi IL-6 jest przeciwciałem chimerowym, przeciwciałem humanizowanym lub przeciwciałem ludzkim skierowanym przeciwko receptorowi IL- 6. Korzystniej przeciwciałem humanizowanym skierowanym przeciwko receptorowi IL-6 jest humanizowane przeciwciało PM-1. Przedmiotem wynalazku jest ponadto środek terapeutyczny do leczenia choroby Stilla wieku dorosłego, charakteryzujący się tym, że jako składnik czynny zawiera przeciwciało przeciwko receptorowi interleukiny 6 (IL-6). Korzystniej przeciwciało przeciwko receptorowi IL-6 jest przeciwciałem monoklonalnym skierowanym przeciwko receptorowi IL-6. Jeszcze korzystniej przeciwciało przeciwko receptorowi IL-6 jest przeciwciałem monoklonalnym skierowanym przeciwko ludzkiemu receptorowi IL-6. Jeszcze korzystniej przeciwciało przeciwko receptorowi IL-6 jest przeciwciałem monoklonalnym skierowanym przeciwko mysiemu receptorowi IL-6. Korzystniej przeciwciało skierowane przeciwko receptorowi IL-6 jest przeciwciałem rekombinowanym. Korzystniej przeciwciałem monoklonalnym skierowanym przeciwko ludzkiemu receptorowi IL-6 jest przeciwciało PM-1. Korzystniej przeciwciałem monoklonalnym skierowanym przeciwko mysiemu receptorowi IL-6 jest przeciwciało MR16-1.

5 PL B1 5 Korzystnie przeciwciało skierowane przeciwko receptorowi IL-6 jest przeciwciałem chimerowym, przeciwciałem humanizowanym lub przeciwciałem ludzkim skierowanym przeciwko receptorowi IL-6. Korzystniej przeciwciałem humanizowanym skierowanym przeciwko receptorowi IL-6 jest humanizowane przeciwciało PM-1. Najlepszy sposób wykonania wynalazku Wyżej wspomniany antagonista IL-6 jest, korzystnie, przeciwciałem przeciwko receptorowi IL-6, korzystnie monoklonalnym przeciwciałem skierowanym przeciwko ludzkiemu receptorowi IL-6 lub monoklonalnym przeciwciałem skierowanym przeciwko mysiemu receptorowi IL-6. Takim monoklonalnym przeciwciałem skierowanym przeciwko ludzkiemu receptorowi IL-6 może być przeciwciało PM-1, a takim przeciwciałem monoklonalnym skierowanym przeciwko mysiemu receptorowi IL-6 może być zilustrowane przeciwciało MR16-1. Powyższe przeciwciało jest, korzystnie, przeciwciałem chimerowym, przeciwciałem humanizowanym lub przeciwciałem ludzkim, np. humanizowanym przeciwciałem PM-1. Do przewlekłych zapaleń stawów wieku dziecięcego, które można leczyć środkiem terapeutycznym według wynalazku, należą wszystkie choroby wymienione w powyżej wspomnianych klasyfikacjach ARA, EULAR i ILAR i w klasyfikacji twórców niniejszego wynalazku. W miarę postępu serologicznych metod diagnostycznych oraz sposobów leczenia klasyfikacja typów chorób w grupie przewlekłych zapaleń stawów wieku dziecięcego jest obecnie poddawana rewizji na skalę globalną i można powiedzieć, że jest ona niepewna. Zalecane jest leczenie środkiem terapeutycznym według wynalazku następujących chorób: według klasyfikacji ARA - zapaleń ogólnoukładowych, wielostawowych i obejmujących niewiele stawów; według klasyfikacji EULAR - chorób o początku ogólnoukładowym, wieiostawowych i ubogostawowych; według klasyfikacji ILAR - chorób o początku ogólnoukładowym, wielostawowych (RF-dodatnich), wielostawowych (RF-ujemnych), zapaleń obejmujących niewiele stawów i rozszerzonych zapaleń obejmujących niewiele stawów, i w klasyfikacji twórców niniejszego wynalazku - pierwotnych przewlekłych zapaleń stawów wieku dziecięcego (zespół SPRASH, idiopatyczne przewlekłe zapalenia stawów wieku dziecięcego (a. typ z obecnością czynnika reumatoidalnego (RF), b. typ z obecnością przeciwciał przeciwjądrowych (ANA), c. typ z nieobecnością RF/- ANA)). Najbardziej zalecanymi chorobami, które można leczyć środkami terapeutycznymi według wynalazku są: według klasyfikacji ARA choroby o początku ogólnoukładowym i wielostawowe, według klasyfikacji EULAR - choroby o początku ogólnoukładowym i wielostawowe; według klasyfikacji ILAR - choroby o początku ogólnoukładowym, wielostawowe (RF-dodatnie), wielostawowe (RF-ujemne) i rozszerzone zapalenia obejmujące niewiele stawów, natomiast w klasyfikacji twórców niniejszego wynalazku, pierwotne przewlekłe zapalenia stawów wieku dziecięcego (zespół SPRASH, idiopatyczne przewlekłe zapalenia stawów wieku dziecięcego (a. typ z obecnością czynnika reumatoidalnego (RF), b. typ z obecnością przeciwciał przeciwjądrowych (ANA)). Bardziej zalecanymi chorobami, które można leczyć środkami według wynalazku, są: według klasyfikacji ARA - choroby o początku ogólnoukładowym i wielostawowe; według klasyfikacji EULAR - choroby o początku ogólnoukładowym i wielostawowe; według klasyfikacji ILAR - choroby o początku ogólnoukładowym wielostawowe (RF-dodatnie) i rozszerzone zapalenia obejmujące niewiele stawów, natomiast w klasyfikacji autorów niniejszego wynalazku - pierwotne przewlekłe zapalenia stawów wieku dziecięcego (zespół SPRASH, idiopatyczne przewlekłe zapalenia stawów wieku dziecięcego (a. typ z obecnością czynnika reumatoidalnego (RF)). Antagoniści IL-6 do zastosowania tu opisanego mogą pochodzić z dowolnego źródła, mogą być dowolnego typu i w dowolnej postaci, o ile wykazują wpływ terapeutyczny na przewlekłe zapalenia stawów w przebiegu chorób wieku dziecięcego. Antagoniści IL-6 są to substancje blokujące przekazywanie sygnałów przez IL-6 i hamujące aktywność biologiczną IL-6. Antagoniści IL-6 są to substancje dogodnie hamujące działanie na wiązanie z dowolną z następujących substancji: IL-6, receptor IL-6 lub gp130. W odniesieniu do antagonistów IL-6 można wymienić na przykład przeciwciała anty-il-6, przeciwciała przeciwko receptorowi IL-6, przeciwciała anty-gp130, IL-6 o zmienionym kształcie, rozpuszczalny receptor IL-6 o zmienionym kształcie lub częściowe peptydy IL-6 lub receptora IL-6, jak również substancje o małej masie cząsteczkowej wykazujące podobne do nich aktywność. Przeciwciała anty-il-6 do zastosowania tu opisanego można wytwarzać jako przeciwciała poliklonalne lub monoklonalne sposobami znanymi ze stanu techniki. Korzystne do zastosowania tu opisanego w roli przeciwciał anty-il-6 są przeciwciała monoklonalne, zwłaszcza pochodzące od ssaków. Do przeciwciał monoklonalnych pochodzących od ssaków należą przeciwciała wytwarzane przez hy-

6 6 PL B1 brydomy oraz przeciwciała wytwarzane przez organizm gospodarza, przekształcony techniką inżynierii genetycznej, zawierający wektor ekspresyjny zawierający gen przeciwciała. Przeciwciała te, poprzez wiązanie się z IL-6, blokują wiązanie IL-6 z receptorem IL-6 i przez to blokują rozprzestrzenianie się aktywności biologicznej IL-6 do komórki. Przykładami takich przeciwciał są: przeciwciało MH166 (Matsuda i wsp., Eur. J. Immunology (1988) 18, ) i przeciwciało SK2 (Sato i wsp., The 21 st General Meeting of the Japanese Society for Immunology, Gakujutu Kiroku (1991) 21, 166) itd. Hybrydomę wytwarzającą przeciwciała IL-6 można w zasadzie skonstruować opisanymi poniżej sposobami znanymi ze stanu techniki. I tak, stosuje się IL-6 jako antygen uczulający, którym immunizuje się konwencjonalnym sposobem immunizacji i tak uzyskane komórki immunologiczne poddaje się fuzji ze znanymi komórkami macierzystymi w konwencjonalnym procesie fuzji komórek, a następnie dokonuje się konwencjonalnym sposobem przeszukiwania w celu selekcji komórek wytwarzających przeciwciała monoklonalne. Bardziej szczegółowo, przeciwciała anty-il-6 można wytworzyć w następujący sposób. Na przykład ludzkie IL-6, które ma być stosowane jako antygen uczulający do uzyskiwania przeciwciał można wytworzyć stosując gen IL-6/sekwencję aminokwasową opisaną w Eur. J. Biochem. (1987) 168, ; J. Immunol. (1988) 140, lub Agr. Biol. Chem. (1990) 54, Po wprowadzeniu sekwencji genowej IL-6 do znanego wektora ekspresyjnego w celu przekształcenia odpowiedniej komórki gospodarza, dogodne białko IL-6 można oczyszczać z komórki gospodarza lub z nadsączu jej hodowli znanym sposobem, a oczyszczone białko IL-6 można stosować jako antygen uczulający. Zamiast tego jako antygen uczulający można stosować białko fuzyjne, białka IL-6 i inne białka. Przeciwciała przeciwko receptorowi IL-6 do zastosowania tu opisanego można wytwarzać jako przeciwciało poliklonalne lub monoklonalne znanymi sposobami. Jako przeciwciała przeciwko receptorowi IL-6 do zastosowania tu opisanego szczególnie korzystne są przeciwciała monoklonalne, zwłaszcza pochodzące od ssaków. Do przeciwciał monoklonalnych pochodzących od ssaków należą przeciwciała wytwarzane przez hybrydomy, przeciwciała wytwarzane przez organizm gospodarza przekształcony technikami inżynierii genetycznej z zastosowaniem wektora ekspresyjnego zawierającego gen przeciwciała. Przeciwciała te poprzez wiązanie się z IL-6 blokują wiązanie IL-6 z receptorem IL-6, przez co blokują rozprzestrzenianie się aktywności biologicznej IL-6 do komórki. Przykładami takich przeciwciał są: przeciwciało MR16-1 (Tamura, T. i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) 90, ), przeciwciało PM-1 (Hirata, Y. i wsp., J. Immunology (1989) 143, ), przeciwciało AUK12-20, AUK64-7 lub AUK (międzynarodowe zgłoszenie patentowe nr WO ) itp. Najbardziej korzystne z nich jest przeciwciało PM-1. Nawiasem mówiąc, linię komórek hybrydomy wytwarzającą przeciwciało PM-1 złożono w międzynarodowym depozycie zgodnie z zasadami Traktatu Budapesztańskiego jako PM-1 dnia 12 lipca 1988 w Międzynarodowej Instytucji Depozytowej Opatentowanych Drobnoustrojów Narodowego Instytutu Nauk Przemysłowych i Techniki (Central 6, Higashi, Tsukuba City, Ibaraki Pref., Japonia) pod numerem FERM BP Również linia komórek hybrydomy wytwarzająca przeciwciało MR16-1 została złożona zgodnie z zasadami Traktatu budapesztańskiego jako hybrydoma szczurzo-mysia MR16-1 dnia 13 marca 1997 w Międzynarodowej Instytucji Depozytowej Opatentowanych Drobnoustrojów Narodowego Instytutu Nauk Przemysłowych i Techniki (Central 6, Higashi, Tsukuba City, Ibaraki Pref., Japonia) pod numerem FERM BP Hybrydomę wytwarzającą przeciwciało monoklonalne przeciwko receptorowi IL-6 można, w zasadzie, wytworzyć znanymi sposobami opisanymi poniżej. I tak, jako antygen uczulający wykorzystuje się receptor IL-6, którym immunizuje się konwencjonalnym sposobem immunizacji i w ten sposób wytworzone komórki immunologiczne poddaje się fuzji ze znanymi komórkami macierzystymi, w konwencjonalnym procesie fuzji komórkowej, po którym prowadzi się konwencjonalne przeszukiwanie w celu wyselekcjonowania komórek wytwarzających przeciwciało monoklonalne. Bardziej szczegółowo, przeciwciała przeciwko receptorowi IL-6 można wytworzyć w następujący sposób. Na przykład ludzki receptor IL-6, wykorzystywany jako antygen uczulający do wytwarzania przeciwciała, można uzyskać z zastosowaniem genu receptora IL-6/sekwencji aminokwasowej opisanej w europejskim zgłoszeniu patentowym nr EP , natomiast mysi receptor IL-6 można wytworzyć stosując gen receptora IL-6/sekwencję aminokwasową, opisane w japońskiej, niepoddanej badaniu publikacji patentowej (Kokai) nr

7 PL B1 7 Znane są dwa typy receptora IL-6: receptor IL-6 ulegający ekspresji na błonie komórkowej i receptor IL-6 oderwany od błony komórkowej (rozpuszczalny receptor IL-6; Yasukawa i wsp., J. Biochem. (1990) 108, ). Przeciwciało przeciwko rozpuszczalnemu receptorowi IL-6 utworzone jest z przeważnie zewnątrzkomórkowego regionu receptora IL-6, połączonego z błoną komórkową i różni się od związanego z błoną receptora IL-6 tym, że przeciwciało rozpuszczalne nie zawiera regionu przezbłonowego lub nie zawiera ani regionu przezbłonowego, ani regionu wewnątrzkomórkowego. Białkiem receptora IL-6 może być dowolny receptor IL-6, pod warunkiem, że można go wykorzystać jako antygen uczulający do wytwarzania przeciwciał przeciwko receptorowi IL-6, do zastosowania tu opisanego. Po wprowadzeniu genu kodującego receptor IL-6 do znanego systemu wektorów ekspresyjnych, w celu przekształcenia odpowiedniej komórki gospodarza, pożądane białko receptorowe IL-6 można oczyszczać z komórki gospodarza lub z nadsączu jej hodowli, znanymi sposobami, i w ten sposób oczyszczone białko receptorowe IL-6 można wykorzystywać jako antygen uczulający. Zamiast tego jako antygen uczulający można wykorzystywać komórki wykazujące ekspresję białka receptorowego IL-6 lub białka fuzyjnego białka receptorowego IL-6 i innego białka. Escherichia coli (E. coli) zawierająca plazmid pibibsf2r zawierający cdna kodujący ludzki receptor IL-6 została złożona zgodnie z zasadami Traktatu budapesztańskiego pod numerem HB101- -pibibsf2r 9 stycznia 1989 roku w Międzynarodowej Instytucji Depozytowej Opatentowanych Drobnoustrojów Narodowego Instytutu Nauk Przemysłowych i Techniki (Central 6, Higashi, Tsukuba City, Ibaraki Pref., Japonia) pod numerem FERM BP Przeciwciała przeciwko gp130 do zastosowania tu opisanego można wytwarzać jako przeciwciała poliklonalne lub monoklonalne znanymi sposobami. Zalecane jest stosowanie jako przeciwciał przeciwko gp130 do zastosowania tu opisanego przeciwciał monoklonalnych pochodzących w szczególności od ssaków. Do przeciwciał monoklonalnych pochodzących od ssaków należą przeciwciała wytworzone przez hybrydomę oraz przeciwciała wytworzone przez organizm gospodarza przekształcony techniką inżynierii genetycznej wektorem ekspresyjnym, zawierającym gen przeciwciała. Przeciwciała te poprzez wiązanie z gp130 blokują wiązanie gp130 z kompleksem IL-6/receptor IL-6, przez co blokują rozprzestrzenianie się aktywności biologicznej IL-6 do komórki. Przykładami takich przeciwciał są: przeciwciało AM64 (japońska niepoddana badaniu publikacja patentowa (Kokai) nr ), przeciwciało 4B11 i 2H4 (US ), przeciwciało B-S12 i przeciwciało B-P8 (japońska niepoddana badaniu publikacja patentowa (Kokai) nr ) itd. Hybrydomę wytwarzającą przeciwciało gp130 można w zasadzie wytwarzać znanym sposobem opisanym poniżej. I tak, jako antygen uczulający stosuje się gp-130 immunizowane konwencjonalnym sposobem immunizacji, po czym wytworzone tym sposobem komórki immunologiczne poddaje się fuzji ze znanymi komórkami macierzystymi w konwencjonalnym procesie fuzji komórkowej i następnie stosuje się konwencjonalną metodę przeszukiwania celem wyselekcjonowania komórek wytwarzających przeciwciało monoklonalne. Bardziej szczegółowo, przeciwciała monoklonalne można wytwarzać w następujący sposób. Na przykład gp130 wykorzystywane jako antygen uczulający do wytwarzania przeciwciała można wytwarzać z zastosowaniem genu gp130/sekwencji aminokwasowej opisanych w europejskim zgłoszeniu patentowym nr EP Sekwencję genową gp130 można wprowadzać do znanego wektora ekspresyjnego i wektor ten wykorzystywać do przekształcania odpowiedniej komórki gospodarza. Z komórki gospodarza lub z nadsączu hodowli tej komórki można oczyszczać znanymi sposobami białko gp130 i oczyszczone białko IL-6 można stosować jako antygen uczulający. Zamiast tego jako antygen uczulający można stosować komórki wykazujące ekspresję gp130 lub białko fuzyjne białka gp130 i innego białka. Ssaki, które mają być immunizowane antygenem uczulającym, dogodnie wybiera się pod kątem ich zgodności z komórkami macierzystymi, które będą stosowane do fuzji komórkowej; do ssaków takich zazwyczaj należą, jednak bez ograniczenia, gryzonie, takie jak myszy, szczury i chomiki. Immunizacji zwierząt antygenem uczulającym dokonuje się znanym sposobem. Ogólnie sposób ten obejmuje na przykład dootrzewnowe lub podskórne podanie antygenu uczulającego ssakowi. Bardziej szczegółowo, antygen uczulający po rozcieńczeniu i zawieszeniu w odpowiedniej ilości soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) lub soli fizjologicznej itd. miesza się z odpowiednią ilością znanego adiuwantu, takiego jak kompletny adiuwant Freunda. Po zemulgowaniu substancję tę, dogodnie, podaje się ssakowi kilka razy co 4 a 21 dni. Dodatkowo, w momencie immunizacji antygenem uczulającym można zastosować odpowiedni nośnik.

8 8 PL B1 Po immunizacji i potwierdzeniu zwiększenia poziomu pożądanego przeciwciała w surowicy konwencjonalnym sposobem, komórki immunologiczne pobiera się od ssaka i poddaje fuzji komórkowej. Jako zalecane komórki immunologiczne poddawane fuzji komórkowej można w szczególności wymienić komórki śledziony. Spośród komórek szpiczaka, pochodzących od ssaków, jako innego rodzaju komórek macierzystych poddawanych fuzji komórkowej z wyżej wymienionymi komórkami immunologicznymi, można, korzystnie, wymienić różne znane linie komórkowe, takie jak: P3x63Ag8.653 (Kearney, J. F. i wsp., J. Immunol. (1979) 123, ), P3x63Ag8U.1 (Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81, 1-7), NS-1 (Kohler, G. i Milstein, C., Eur. J. Immunol. (1976) 6, ), MPC-11 (Margulies, D. H. i wsp., Cell (1976) 8, , SP2/0 (Shulman, M. i wsp., Nature 1978) 276, ), FO (de St. Groth, S. F. i wsp., J. Immunol. Methods (1980) 35, 1-21), S194 (Trowbridge, I.S., J. Exp. Med. (1978) 148, ), R210 (Galfre, G. i wsp., Nature (1979) 217, ) itp., które można stosować w odpowiedni sposób. Fuzję komórkową między wyżej wymienionymi komórkami immunologicznymi a komórkami szpiczaka można w zasadzie prowadzić według znanych sposobów, jak to na przykład opisali Milstein i wsp. (Kohler, G i Milstein, C., Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46), itp. Bardziej szczegółowo, wyżej wymienioną fuzję komórkową prowadzi się w konwencjonalnym bulionie odżywczym w obecności na przykład substancji przyspieszających fuzję komórek. Jako substancję przyspieszającą fuzję komórek można stosować na przykład glikol polietylenowy (PEG), wirus Sendai (HVJ) i tp.; w celu zwiększenia skuteczności fuzji można dodawać adiuwant, np. dimetylosulfotlenek. Zalecanym stosunkiem komórek immunologicznych i komórek szpiczaka do zastosowania jest na przykład 1 do 10 razy więcej komórek immunologicznych niż komórek szpiczaka. Przykładowymi pożywkami hodowlanymi, które można stosować do przeprowadzenia powyższej fuzji komórek, są na przykład pożywka RPMI 1640 i pożywka do hodowli MEM, które są odpowiednie do prowadzenia w nich wzrostu wyżej wspomnianych linii komórek szpiczaka oraz konwencjonalna pożywka hodowlana stosowana do tego typu hodowli komórkowej; ponadto można dodawać suplement surowicy, np. płodową surowicę cielęcą (FCS). W przypadku fuzji komórkowej z góry ustaloną ilość wyżej wymienionych komórek immunologicznych i komórek szpiczaka miesza się dokładnie w powyższej cieczy do hodowli, do której dodaje się roztwór PEG uprzednio ogrzany do temperatury ok. 37 C, np. roztwór PEG o średniej masie cząsteczkowej wynoszącej od 1000 do 6000 w stężeniu od 30 do 60% (stężenie masa/obj.) i całość miesza się w celu wytworzenia pożądanych komórek poddanych fuzji (hybrydoma). Następnie poprzez kolejne sekwencyjne dodawanie odpowiedniej cieczy komórkowej i odwirowanie można usunąć nadsącz, środki użyte do fuzji komórkowej itd., które nie są pożądane dla wzrostu hybrydomy. Hybrydomę selekcjonuje się poprzez hodowanie w konwencjonalnej pożywce selekcyjnej, np. pożywce hodowlanej HAT (ciecz do hodowli zawierająca hipoksantynę, aminopterynę i tymidynę). Hodowlę w pożywce hodowlanej HAT prowadzi się zwykle przez czas wystarczający do uzyskania efektu zabicia komórek innych niż pożądana hybrydoma (komórek niepoddanych fuzji), zwykle przez okres od kilku dni do kilku tygodni. Prowadzi się proces konwencjonalnego rozcieńczenia ograniczającego, podczas którego selekcjonuje się i klonuje hybrydomy wytwarzające pożądane przeciwciało. Oprócz wytworzenia wyżej wymienionej hybrydomy poprzez immunizację antygenem zwierzęcia, innego niż człowiek, można również uczulać limfocyty ludzkie in vitro pożądanym białkiem antygenowym lub komórkami wykazującymi ekspresję antygenu, a następnie uzyskane uczulone limfocyty B poddawać fuzji z komórkami szpiczaka wykazującymi zdolność ustawicznego dzielenia się, np. U266, w celu wytworzenia hybrydomy wytwarzającej pożądane przeciwciało ludzkie, wykazujące aktywność wiązania się z pożądanym antygenem lub komórkami wykazującymi ekspresję antygenu (Japońska Publikacja Patentowa Poddana Ocenie (Kokoku) ). Następnie zwierzę transgeniczne posiadające geny przeciwciała ludzkiego immunizuje się antygenem lub komórkami wykazującymi ekspresję antygenu w celu wytworzenia pożądanego przeciwciała ludzkiego sposobami wymienionymi powyżej (zob. międzynarodowe zgłoszenia patentowe nr: WO 93/12227, WO 92/03918, WO 94/02602, WO 94/25585, WO 96/34096 oraz WO 96/33735). Tak wytwarzane hybrydomy wytwarzające przeciwciała monoklonalne można poddawać kolejnej hodowli w konwencjonalnej cieczy do hodowli lub przechowywać przez długi czas w ciekłym azocie.

9 PL B1 9 W celu wytworzenia z tej hybrydomy przeciwciał monoklonalnych można stosować sposób, w którym tę hybrydomę hoduje się konwencjonalnym sposobem i wytwarza się przeciwciała jako nadsącz lub sposobem, w którym hybrydomę implantuje się ssakowi, w którego organizmie następnie hybrydoma wzrasta, przy czym ssak ten musi wykazywać zgodność z hybrydomą, a przeciwciała uzyskuje się z płynu przesiękowego w jamie brzusznej. Pierwszy z tych sposobów nadaje się do wytwarzania przeciwciał o dużej czystości, natomiast drugi do wytwarzania przeciwciał na dużą skalę. Na przykład hybrydomę wytwarzającą przeciwciało przeciwko receptorowi IL-6 może stanowić polipeptyd wytwarzany sposobem opisanym w japońskiej niepoddanej badaniu publikacji patentowej (Kokai) nr Można stosować sposób, w którym hybrydomę wytwarzającą przeciwciało PM-1, złożoną w depozycie międzynarodowym zgodnie z Traktatem budapesztańskim z dnia 12 lipca 1988 w Międzynarodowej Organizacji Depozytowej Opatentowanych Drobnoustrojów Narodowego Instytutu Nauk Przemysłowych i Techniki (Central 6, Higashi, Tsukuba City, Ibaraki Pref., , Japonia) pod numerem FERM BP-2998, wstrzykuje się dootrzewnowo myszom BALB/c w celu uzyskania u nich płynu przesiękowego w jamie brzusznej, po czym to przeciwciało PM-1 oczyszcza się z płynu przesiękowego; można też stosować metodę, w której hybrydomę hoduje się w pożywce RPMI 1640 zawierającej 10-procentową płodową surowicę bydlęcą, 5% BM-Codimed H1 (produkcji firmy Boehringer Mannheim), pożywkę SFM hybrydoma (produkcji firmy GIBCO BRL), pożywkę PFHM-II (produkcji firmy GIBCO BRL lub tym podobne, z nadsączu hodowli, z którego można oczyszczać przeciwciało PM-1. W niniejszym wynalazku jako przeciwciało monoklonalne można stosować przeciwciało rekombinowane wytworzone przez klonowanie genu przeciwciała hybrydoma, po czym gen integruje się do odpowiedniego wektora, który wprowadza się do organizmu gospodarza celem wytworzenia przeciwciała rekombinowanego, stosując technikę rekombinacji genu (zobacz np. Borrebaeck, C.A.K. i Larric, J.W., THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, opublikowane w Wielkiej Brytanii przez MAC- MILLAN PUBLISHERS LTD. 1990). Bardziej szczegółowo, z komórki wytwarzającej dane przeciwciało, na przykład komórki hybrydomy izoluje się mrna kodujący region zmienny (region V) przeciwciała. Izolację mrna prowadzi się poprzez preparatykę RNA całkowitego znanym sposobem, takim jak metoda ultrawirowania guanidyny (Chirgwin, J.M. i wsp., Biochemistry (1979) 18, ), metoda AGPC (Chomczynski, P. i wsp., Anal. Biochem. (1987) 162, ), następnie mrna oczyszcza się z RNA całkowitego, stosując zestaw do oczyszczania mrna (produkcji firmy Pharmacia) itp. Zamiast tego mrna można preparować bezpośrednio, stosując zestaw do oczyszczania mrna Quick Prep (produkcji firmy Pharmacia). Z tak wytworzonego mrna można wytwarzać cdna regionu V przeciwciała, stosując odwrotną transkryptazę. cdna można wytwarzać za pomocą zestawu do syntezy pierwszej nici cdna za pomocą odwrotnej transkryptazy AMV lub podobnymi sposobami. Zamiast tego można do syntezy i powielania cdna wykorzystać zestaw 5'-Ampli FINDER RACE (produkcji firmy Clontech) i metodę 5'-RACE (Frohman, M.A. i wsp., Proc Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85, ; Belyaysky, A. i wsp., Nucleic Acids Res. (1989) 17, ), w którym wykorzystuje się PCR. Z wytworzonego produktu PCR oczyszcza się pożądany fragment DNA i można poddać go ligacji z DNA wektora. Następnie, wytwarza się z tego rekombinowany wektor, który następnie wprowadza się do E. coli itd., którego kolonie następnie selekcjonuje się celem wytworzenia pożądanego rekombinowanego wektora. Sekwencję zasad pożądanego DNA można potwierdzić znanymi sposobami, na przykład sposobem dideoksy. Po wytwarzaniu DNA kodującego region V pożądanego przeciwciała można poddać je ligacji z DNA kodującym region stały (region C) pożądanego przeciwciała, i następnie całość włączyć do wektora ekspresyjnego. Zamiast tego DNA kodujący region V przeciwciała można włączyć do wektora ekspresyjnego, który zawiera już DNA kodujący region C przeciwciała. W celu wytworzenia przeciwciała do zastosowania tu opisanego gen przeciwciała włącza się do wektora ekspresyjnego tak, aby ulegał on ekspresji pod kontrolą regionu regulacyjnego ekspresji, na przykład wzmacniacza i/lub promotora. Następnie wektor ekspresyjny transformuje się do komórki gospodarza, w której przeciwciało może ulegać ekspresji. W niniejszym wynalazku w celu obniżenia antygenowości heterologicznej skierowanej przeciwko organizmowi człowieka można stosować sztucznie zmienione przeciwciała rekombinowane, takie jak przeciwciała chimerowe, humanizowane oraz przeciwciała ludzkie. Te zmienione przeciwciała ludzkie mogą być wytwarzane znanymi sposobami.

10 10 PL B1 Przeciwciało chimerowe można wytwarzać poprzez poddanie ligacji tak otrzymanego DNA kodującego region V przeciwciała z DNA kodującym region C przeciwciała ludzkiego, które następnie włącza się do wektora ekspresyjnego i wprowadza do organizmu gospodarza po to, aby w organizmie tym wytworzyć przeciwciało (zob. europejskie zgłoszenie patentowe EP i międzynarodowe zgłoszenie patentowe WO ). Tym znanym sposobem można wytworzyć przeciwciało chimerowe korzystne do zastosowania do zastosowania tu opisanego. Plazmidy zawierające region V łańcucha L lub region V łańcucha H chimerowego przeciwciała PM-1, oznaczone odpowiednio jako ppm-k3 i ppm-h1, i E. coli zawierające odpowiedni plazmid złożono w depozycie międzynarodowym zgodnie z zasadami Traktatu budapesztańskiego pod numerami NCIMB40366 i NCIMB lutego 1991 w depozycie National Collections of Industrial and Marine Bacteria Limited (Narodowy Zbiór Bakterii Przemysłowych i Morskich Sp. z o.o.). Przeciwciało humanizowane, zwane również przeciwciałem ludzkim o zmienionym kształcie, wytworzono poprzez wstawienie regionu determinującego dopasowanie (CDR) przeciwciała ssaka, innego niż człowiek, np. przeciwciała mysiego, do CDR przeciwciała ludzkiego. Ogólna technika wytwarzania rekombinowanego DNA wykorzystywana do wytwarzania takich przeciwciał jest również znana (zob. europejskie zgłoszenie patentowe EP i międzynarodowe zgłoszenie patentowe WO ). Bardziej szczegółowo, sekwencję DNA przeznaczoną do ligacji CDR przeciwciała mysiego z regionem zrębowym (FR) przeciwciała ludzkiego syntetyzuje się z kilku podzielonych oiigonukleotydów, których części zachodzą na siebie nawzajem na końcach. Tak wytworzony DNA poddaje się ligacji i z DNA kodującym region C przeciwciała ludzkiego i następnie włącza do wektora ekspresyjnego, który wprowadza się do organizmu gospodarza celem wytwarzania przeciwciał (zob. europejskie zgłoszenie patentowe EP i międzynarodowe zgłoszenie patentowe WO ). Do FR przeciwciała ludzkiego poddanego ligacji przez CDR dobiera się CDR o dogodnym miejscu wiązania antygenu. Jeżeli jest to pożądane, aminokwasy w FR regionu V przeciwciała można podstawić tak, aby CDR przeciwciała humanizowanego mogło tworzyć odpowiednie miejsce wiązania antygenu (Sato, K. i wsp., Cancer Res. (1993) 53, ). Jako region C przeciwciała ludzkiego można stosować na przykład Cγ1 Cγ2, Cγ3 lub Cγ4. Region C przeciwciała ludzkiego można również modyfikować w celu ulepszenia stabilności przeciwciała i jego wytwarzania. Przeciwciało chimerowe składa się z regionu V przeciwciała pochodzenia ludzkiego innego niż ludzkie i regionu C przeciwciała ludzkiego, a przeciwciało humanizowane składa się z regionu determinującego dopasowanie przeciwciała pochodzenia ludzkiego, innego niż ludzkie, i regionu zrębowego oraz regionu C przeciwciała ludzkiego, przy czym ich antygenowość w organizmie człowieka jest zmniejszona, tak więc są one zalecane do zastosowania jako przeciwciała do zastosowania tu opisanego. Jako korzystne wykonania przeciwciał humanizowanych do zastosowania tu opisanego można wymienić humanizowane przeciwciało PM-1 (zob. międzynarodowe zgłoszenie patentowe WO ). Jako sposób wytwarzania przeciwciał ludzkich, oprócz sposobów opisanych powyżej, znany jest sposób uzyskiwania przeciwciała ludzkiego za pomocą panningu. Na przykład region zmienny przeciwciała ludzkiego poddaje się ekspresji na powierzchni faga metodą prezentacji na fagach (phage display method) jako przeciwciało jednołańcuchowe (scfv) celem wyselekcjonowania faga wiążącego się z antygenem. Analizując gen wybranego faga można zidentyfikować sekwencję DNA kodującą region zmienny przeciwciała ludzkiego wiążącego się z antygenem. Po znalezieniu sekwencji DNA scfv wiążącego się z antygenem sekwencję tę można wykorzystać do wytworzenia odpowiedniego wektora ekspresyjnego i wytworzenia przeciwciała ludzkiego. Sposoby te są już znane i można je znaleźć w publikacjach WO 92/01047, WO 92/20791, WO 93/06213, WO 93/11236, WO 93/19172, WO 95/01438 i WO 95/ Geny przeciwciał wytworzone w sposób opisany powyżej mogą ulegać ekspresji i można je wytwarzać w znany sposób. W przypadku komórek ssaków ekspresja może zachodzić przy użyciu DNA, w którym powszechnie stosowany zalecany promotor, gen przeciwciała, które ma ulegać ekspresji oraz sygnał poli A łączy się w sposób umożliwiający działanie w stronę końca 3' lub stosując wektor je zawierający. Jako promotor/wzmacniacz można wymienić na przykład bezpośredni wczesny promotor/wzmacniacz cytomegalowirusa człowieka.

11 PL B1 11 Dodatkowo, jako promotor/wzmacniacz, który można wykorzystać do ekspresji przeciwciała, które ma być stosowane według niniejszego wynalazku, można wykorzystać wirusowe promotory/wzmacniacze, takie jak: retrowirusy, wirusy poliomy, adenowirusy i wirus małpi 40 (SV40) oraz promotory/wzmacniacze pochodzące z komórek ssaczych, takie jak ludzki czynnik elongacyjny 1 (HEF1 ). Ekspresję można na przykład łatwo przeprowadzić sposobem opisanym przez Mulligana i wsp. (Mulligan, R. C. i wsp., Nature (1979) 277, ) przy wykorzystaniu promotora/wzmacniacza SV40 oraz sposobem Mizushimy S. i wsp. (Mizushima, S. i Nagata, S., Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322) przy wykorzystaniu promotora/wzmacniacza HEF1. W przypadku E. coli ekspresję można przeprowadzić poprzez połączenie w sposób umożliwiający działanie powszechnie stosowanego promotora sekwencji sygnałowej służącej wydzielaniu przeciwciała i genu przeciwciała, który ma ulegać ekspresji, a następnie poprzez przeprowadzenie ich ekspresji. Jako promotor można na przykład wymienić promotor IacZ i promotor arab. Przy stosowaniu promotora IacZ można wykorzystać sposób opisany przez Warda i wsp. (Ward, E.S. i wsp., Nature (1989) 341, ; Ward, E.S. i wsp., FASEB J. (1992) 6, ), a przy stosowaniu promotora arab można wykorzystać sposób opisany przez Bettera i wsp. (Better, M. i wsp., Science (1988) 240, ). Jako sekwencję sygnałową do wydzielania przeciwciała przy wytwarzaniu go w peryplazmie E. coli można zastosować sekwencję sygnałową pelb (Lei, S.P. i wsp., J. Bacteriol. (1987) 169, ). Po wydzieleniu przeciwciała wytworzonego w peryplazmie, a przed zastosowaniem, dokonuje się odtworzenia struktury przeciwciała (zob. np. WO ). Początek replikacji może pochodzić z SV40 wirusa polioma, adenowirusa, bydlęcego wirusa brodawczaka (BPV) itp. Ponadto, do wektorów ekspresji wykorzystywanych do powielenia pewnej liczby kopii genów w układzie komórkowych organizmu gospodarza należą, jako markery podlegające selekcji, gen transferazy aminoglikozydowej (APH), gen kinazy tymidynowej (TK), gen transferazy guaninofosforybozyloksantyny E. coli (Ecogpt), gen reduktazy dihydrofolanu (dhfr) itp. Do wytwarzania przeciwciała do zastosowania tu opisanego można wykorzystać dowolny system wytwarzania; systemy wytwarzania stosowane przy preparatyce przeciwciał obejmują systemy wytwarzania in vitro i in vivo. W odniesieniu do systemu wytwarzania in vitro można wymienić systemy wytwarzania wykorzystujące komórki eukariotyczne i systemy wytwarzania wykorzystujące komórki prokariotyczne. W odniesieniu do komórek eukariotycznych w systemach wytwarzania można wykorzystywać komórki zwierzęce, roślinne i komórki grzybów. Do znanych komórek zwierzęcych należą: (1) komórki ssaków, takie jak: komórki CHO, COS, komórki szpiczaka, komórki nerek noworodków chomiczych (BHK), komórki HeLa i komórki Vero, (2) komórki płazów, takie jak oocyty Xenopus, albo (3) komórki owadów takie jak sf9, sf21 i Tn5. Do znanych komórek roślinnych należą np. komórki pochodzące z Nicotiana tabacum hodowane na kallusie. Do znanych komórek grzybów należą komórki drożdży, np. z rodzaju Saccharomyces, bardziej szczegółowo Saccharomyces cerevisiae lub grzyby nitkowate, takie jak Aspergillus, a dokładnie Aspergillus niger. W odniesieniu do komórek prokariotycznych w systemach wytwarzania wykorzystuje się komórki bakteryjne. Do znanych komórek bakteryjnych należą komórki Escherichia coli i Bacillus subtilis. Poprzez wprowadzenie przez transformację genu pożądanego przeciwciała do tych komórek i hodowanie transformowanych komórek in vitro można wytworzyć przeciwciało. Hodowlę prowadzi się znanymi sposobami. Na przykład jako ciecz do hodowli komórek ssaczych można stosować pożywki DMEM, MEM, RPMI 1640, IMDM itp., jak również można do tych cieczy dodawać suplementy surowicy, takie jak płodowa surowica cielęca (FCS), w połączeniu. Ponadto przeciwciała można wytwarzać in vivo poprzez wszczepianie komórek do jamy brzusznej zwierzęcia, i tym podobne. Jako systemy wytwarzania in vivo można wymienić systemy wykorzystujące zwierzęta i systemy wykorzystujące rośliny. Jeżeli chodzi o wykorzystanie zwierząt, można wymienić systemy wytwarzania z wykorzystaniem ssaków i z wykorzystaniem owadów. Jako ssaki można wykorzystywać kozy, świnie, owce, myszy i bydło (Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993). Jako owady można również wykorzystywać jedwabniki, natomiast jako rośliny - na przykład tytoń. Geny przeciwciał wprowadza się do tych zwierząt i roślin, w których geny są wytwarzane i w których są następnie zbierane. Na przykład geny przeciwciał wprowadza się do środka genu kodującego białko, które jest zwykle wytwarzane w mleku, takie jak na przykład kozia kazeina β, w celu

12 12 PL B1 wytworzenia genów fuzyjnych. Fragmenty DNA zawierające gen fuzyjny, do którego wprowadzono gen przeciwciała wstrzykuje się zarodkom kozim, a następnie zarodki wprowadza się do organizmu samicy kozy. Pożądane przeciwciało uzyskuje się z mleka wytwarzanego przez transgeniczną kozę, to znaczy kozę, której wszczepiono zarodek lub jego potomstwo. W celu zwiększenia ilości mleka zawierającego pożądane przeciwciało, wytwarzanego przez transgeniczną kozę, można ewentualnie transgenicznej kozie podawać hormony (Ebert, K.M. i wsp., Bio/TechnoIogy (1994) 12, ). Przy stosowaniu jedwabników, jedwabnika zakaża się bakulowirusem, do którego wprowadzono pożądany gen przeciwciała, i pożądane przeciwciało można wytwarzać z płynów ustrojowych jedwabnika (Maeda, S. i wsp., Nature (1985) 315, ). Ponadto, przy stosowaniu tytoniu pożądany gen przeciwciała wprowadza się do wektora ekspresyjnego dla roślin, na przykład pmon 530, po czym wektor wprowadza się do bakterii, na przykład Agrobacterium tumefaciens. Następnie bakterię wykorzystuje się do zakażenia tytoniu, na przykład Nicotiana tabacum, celem wytworzenia z liści tytoniu pożądanego przeciwciała (Julian, K.C. Ma i wsp., Eur. J. Immunol. (1994) 24, ). Przy wytwarzaniu przeciwciała w systemach produkcji in vitro lub in vivo, jak to wspomniano powyżej, DNA kodujące łańcuch ciężki (łańcuch H) lub łańcuch lekki (łańcuch L) przeciwciała wprowadza się oddzielnie do wektora ekspresji i organizmy gospodarzy transformuje się jednocześnie lub też DNA kodujące łańcuch H i łańcuch L przeciwciała wprowadza się do pojedynczego wektora ekspresyjnego, którym transformuje się organizm gospodarza (zob. międzynarodowe zgłoszenie patentowe WO ). Przeciwciała do zastosowania tu opisanego mogą być fragmentami przeciwciał lub ich zmodyfikowanymi wersjami, pod warunkiem, że są odpowiednie do stosowania w niniejszym wynalazku. Na przykład jako fragmenty przeciwciał można wspomnieć Fab, F(ab')2, Fv lub jednołańcuchowy Fv (scfv), w którym fragmenty Fv łańcucha H i łańcucha L połączono odpowiednim łącznikiem. Bardziej szczegółowo, przeciwciała traktuje się enzymem, na przykład papainą lub pepsyną, w celu uzyskania fragmentów przeciwciał lub wytwarza się geny kodujące te fragmenty przeciwciał, po czym wprowadza się je do wektora ekspresyjnego, który ulega ekspresji w odpowiedniej komórce gospodarza (zob. na przykład Co, M.S. i wsp., J. Immunol. (1994) 152, ; Better, M. i Horwitz, A.H., Methods Enzymol. (1989) 178, ; Plucktrun, A. i Skerra, A., Methods Enzymol. (1989) 178, ; Lamoyi, E., Methods Enzymol. (1986) 121, ; Rousseaux, J. i wsp., Methods Enzymol. (1986) 121, ; Bird, R. E. i wsp., TI BTECH (1991) 9, ). scfv można wytwarzać poprzez połączenie regionu V łańcucha H i regionu V łańcucha L przeciwciała. W scfv region V łańcucha H i region V łańcucha L łączy się, dogodnie, za pośrednictwem łącznika, dogodnie łącznika peptydowego (Huston, J.S. i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85, ). Region V łańcucha H i region V łańcucha L w scfv mogą pochodzić z dowolnego z wyżej wymienionych przeciwciał. Jako łącznik peptydowy do połączenia regionów V można wykorzystać dowolny peptyd jednołańcuchowy zawierający na przykład reszt aminokwasowych. DNA kodujący scfv można wytwarzać stosując DNA kodujący łańcuch H lub region V łańcucha H wyżej wymienionego przeciwciała oraz DNA kodujące łańcuch L lub region V łańcucha L wyżej wymienionego przeciwciała jako matrycę, poprzez powielenie części DNA kodującej pożądaną sekwencję aminokwasową, spośród wyżej wspomnianych sekwencji, metodą PCR, przy czym para starterów jest swoista dla obu końców, i następnie poprzez powielenie kombinacji DNA kodującej część łącznikową peptydu i pary starterowej, definiującej to, że oba końce tego DNA mają być połączone, odpowiednio, z łańcuchem H i łańcuchem L. Po wytworzeniu odcinków DNA kodujących scfv można konwencjonalnymi sposobami wytworzyć wektor ekspresyjny je zawierający oraz organizm gospodarza transformowany tym wektorem ekspresyjnym; można również konwencjonalnym sposobem wytworzyć scfv wykorzystując uzyskany organizm gospodarza. Te fragmenty przeciwciał można wytwarzać poprzez wytworzenie ich genu w sposób podobny do opisanego powyżej i poprzez umożliwienie ich ekspresji w organizmie gospodarza. Przeciwciało" w rozumieniu niniejszego opisu obejmuje takie zmodyfikowane przeciwciała. Jako przeciwciała modyfikowane można wykorzystywać przeciwciała związane z różnymi cząsteczkami, np. glikolem polietylenowym (PEG). Przeciwciało" w rozumieniu niniejszego opisu obejmuje takie zmodyfikowane przeciwciała. Takie zmodyfikowane przeciwciała można wytwarzać poprzez chemiczną modyfikację tak wytworzonych przeciwciał. Sposoby te znane są już ze stanu techniki. Przeciwciała, które uległy ekspresji i zostały wytworzone w sposób opisany powyżej, można oddzielać od wnętrza lub zewnętrznej części komórki lub organizmu gospodarza, i następnie oczyszczać