Pozyskiwanie i ulepszanie szczepów produkcyjnych ; mutageneza, fuzja protoplastów, inżynieria genetyczna

Transkrypt

1 Pozyskiwanie i ulepszanie szczepów produkcyjnych ; mutageneza, fuzja protoplastów, inżynieria genetyczna

2

3

4 Pełna analiza struktury i screening aktywności

5 Drobnoustroje jako biologiczne źródło nowych substancji czynnych Procentowy rozkład aktywności (n = 268) w przypadku ekstraktów z morskich promieniowców z rodzaju Streptomyces. (wg O Kayser)

6 Ważne dla patentowania prace i wynalazki Wg Kayser I Muller

7

8 Przechowywanie szczepów -banki kultur matecznych Kultury komórkowe suszy się w stanie zamrożenia np. zawiesinę komórek w sterylnym odtłuszczonym mleku poddaje się liofilizacji a następnie topi pod próżnią lub w obecności azotu. Przechowuje się w ciekłym azocie. Hodowle bakteryjne można zamrażać w postaci zawiesiny i przechowywać w 10-20% glicerynie lub w DMSO, w ciekłym azocie.

9 Organizmy sporulujące (grzyby strzępkowe, laseczki, promieniowce) przechowuje się jako hodowle glebowe: zaschnięte hodowle na glinie leczniczej - tworzą formy przetrwalnikowe przechowywane w temp. 0 o C.

10 W biotechnologii istnieją dwie metody optymalizacji procesu biosyntezy metabolitów wtórnych (np. podwyższania produktywności szczepu) 1. Optymalizacja warunków procesu 2. Modyfikacja szczepu produkcyjnego Ad 1. Ustawicznie prowadzona optymalizacja warunków wzrostu, składu podłoża hodowlanego, poszukiwanie prekursorów biosyntezy i promotorów wzrostu

11 Ad. 2. Metody ulepszania szczepów metody nieukierunkowanych zmian genetycznych, jak mutageneza z użyciem środków chemicznych i fizycznych wytwarzanie, fuzja i odnawianie protoplastów komórek zdolnych do namnażania się

12 aby uniknąć produktów ubocznych oraz przedwczesnego przerwania biosyntezy, do zwiększenia wydajności używa się dziś również - w bardziej lub mniej ukierunkowany sposóbmetod i strategii inżynierii genetycznej

13 Mutageneza Najczęściej stosowane czynniki mutagenne UV nm Związki chemiczne - alkilujące

14 Kierunki i skutki zmian genotypu w wyniku mutagenezy Niemutagenne (2) Mechanizmy naprawcze Fotoreaktywacja aktywowany światłem enzym rozszczepiający dimery tyminy Wycinanie uszkodzonych fragmentów DNA Resynteza DNA Mutagenne (3) Mechanizm SOS indukowany po zatrzymaniu replikacji Inhibitory mechanizmów naprawczych: Kofeina, metylopuryny, chinony KHSO 3

15 Metody selekcji szczepów produkujących substancje czynne biologicznie Wg A. Chmiel

16 Metoda płytek gradientowych selekcji mutantów opornych na toksyczną substancje ST - stężenie substancji toksycznej, A - płytka z podłożem zawierającym ST, B - płytka zalana drugą warstwą podłoża (bez ST), C - w wyniku dyfuzji powstaje gradient stężenia ST D - rozmieszczenie kolonii na płytce gradientowej Wg A. Chmiel

17 Fuzja protoplastów 1. Hydroliza ściany komórkowej ( w roztworze hipertonicznym!) dla bakterii G+, w tym promieniowców - lizozym dla bakterii G- - lizozym i EDTA dla drożdży i grzybów - sok żołądkowy ślimaka Helix pomatia 2. Wirowanie protoplastów 3. Agregacja 30% PEG, sole Ca2+, ph=9 elektrofuzja 4. Heterokarion 5. Rekombinacja 6. Haploidyzacja i segregacja genotypów

18 Fuzja komórek roślinnych

19 Uproszczony zarys technologii rekombinowanego DNA

20 Wektory plazmidowe Plazmidy - autonomiczne, pozachromosalne elementy genetyczne występujące u wielu organizmów prokariotycznych i niektórych eukariotów, zdolne do autonomicznej replikacji. Mogą być przekazywane pomiędzy komórkami poprzez horyzontalny transfer genów np. w procesie koniugacji, transdukcji i transformacji. Kosmidy sztucznie wytworzone wektory poprzez połączenie plazmidu z sekwencją cos bakteriofaga.

21

22

23 Transformacja roślin i grzybów za pomocą bakterii z rodzaju Agrobacterium bakterie fitopatogenne, odpowiadają za horyzontalny transfer genów mają zdolność do przekazania gospodarzowi plazmidu, który ingeruje w jego genom. Agrobacterium tumefaciens - zakażenie rośliny objawia się powstawaniem guzowatych narośli Agrobacterium rhizogenes - w miejscu infekcji powstają korzenie włośnikowe Kamil Maciąg

24 Proces transgenezy z wykorzystaniem Agrobacterium : - Wprowadzenie odpowiedniego fragmentu DNA do wektora binarnego, - Transformacja komórek bakteryjnych oraz namnożenie odpowiedniej ilości transgenicznych bakterii - Zainfekowanie komórek roślinnych poprzez bakterie i przekazanie zmodyfikowanego fragmentu T-DNA. - Eliminacja Agrobacterium np. poprzez wykorzystanie antybiotyków - Wyselekcjonowanie pozytywnych mutantów

25 Transformacja grzybów - przykład Agaricus bisporus Lentinula edodes Pleurotus ostreatus Flammulina velutipes Pleurotus nebrodensis Agrobacterium tumefaciens transfer genów do roślin, drożdży, grzybów grzyby transgeniczne ables/mashroom/gene.transfer.techn

26

27 Przykładowe cele stosowania technologii rekombinowanego DNA z zakresu biotechnologii farmaceutycznej przeniesienie całego procesu biosyntezy do lepiej przystosowanego do niej heterologicznego organizmu produkcyjnego. amplifikacja genów biosyntezy całego szlaku lub jego części zwiększenie oporności na antybiotyki przez manipulacje na genach oporności zwiększenie wydzielania produktu przez manipulacje na genach odpowiedzialnych za specyficzne, związane z błoną systemy wydzielania

28 manipulacja na genach regulatorów ogólnych lub specyficznych dla szlaku celowe usunięcie etapów limitujących szybkość metabolizmu, wyłączenie genów, które prowadzą do niepożądanych produktów ubocznych hydroliza in vivo b-laktamów do wytwarzanych dotychczas chemicznie produktów wyjściowych w celu dalszego poszukiwania półsyntetycznych aktywnych farmaceutyków

29 Rekombinowane leki białkowe

30 Pierwsze wprowadzone na rynek światowy leki produkowane metodami inżynierii genetycznej ( ) Rok Substancja czynna Firma Wskazanie Ludzka insulina Ludzki hormon wzrostu Eli Lilly Genentech Cukrzyca Karłowatość Interferon a-2a Interferon a-2b t-pa Erytropoetyna Interleukina 2 Hoffmann-La Roche Schering-Plough Genentech Amgen Chiron/Cetus Białaczka Miesak Kaposiego Zawał serca Anemia Nowotwór nerek Interferon y Biogen Reumatoidalne zapalenie stawów 1989 Antygen hepatitis B Merck/SK, Beecham Profilaktyka

31 Rok Substancja czynna Firma Wskazania Interferon a-3 Interferon y-1 Interferon Science Genentech Brodawczak narządów płciowych Ziarnica przewlekła 1990 Czynnik IX Alpha Therapeutics Hemofilia B G-CSF GM-CSF Czynnik VIII Amgen Irnmunex Baxter/Genetics Neutropenia, leczenie raka Autologiczna transplantacja szpiku kostnego Hemofilia A 1992 Glukagon Inst. Novo Nordisc Hipoglikemia

32 Szczepy i linie komórkowe Modyfikowane szczepy E. coli Modyfikowane szczepy S. cerevisiae Komórki linii CHO (chinese hamster ovary cell line) linia komórkowa z jajnika chomika chińskiego Komórki linii BHK (baby hamster kidney) linia komórkowa z noworodka chomika hybrydy

33 Przeciwciała monoklonalne MAbs

34 Produkcja przeciwciał monoklonalnych Milstein i Kohler metoda hybrydomowa Główne obszary zastosowania *środki diagnostyczne (in vivo i in vitro), *w terapii nowotworów, *w profilaktyce kardiologicznej, *w terapii immunologicznej.

35 chimeryczne przeciwciała monoklonalne (zawierające 10-30% sekwencji aminokwasowych mysich). Modyfikacja genetyczna, dzięki której na poziomie DNA dochodzi do zastąpienia regionu stałego łańcucha lekkiego i ciężkiego przeciwciała mysiego analogicznymi fragmentami przeciwciała pochodzenia ludzkiego humanizowane przeciwciała monoklonalne (zawierające do 10% sekwencji aminokwasowych mysich), metoda polega na pozostawieniu w cząsteczce przeciwciała obcogatunkowego wyłącznie regionów wiążących antygen (hiperzmiennych). w pełni ludzkie przeciwciała monoklonalne (zawierające wyłącznie ludzką sekwencję aminokwasową).

36

37 Nazewnictwo Dla wszystkich przeciwciał monoklonalnych używana jest wspólna końcówka -mab. W przypadku przeciwciała mysiego dodaje się literę o (np. ang. Edrecolomab =Panorex), Chimerowego xi (np. ang. Cetuximab=Erbitux), Humanizowanego u (np. ang. Trastuzumab= Hrceptyna, Bevacizumab=Avastin).

38 Czy istnieją przeciwciała monoklonalne ludzkie? Jak je można otrzymać? W roku 1980 w Wistar Institute of Anatomy and Biology w Filadelfii otrzymano stabilne hybrydomy produkujące monoklonalne przeciwciała ludzkie. Fuzji poddane były limfocyty B izolowane od pacjenta chorego na raka (myeloma) z peryferyjnymi limfocytami chorego na przewlekłe pancephalitis. Otrzymane komórki hybrydowe wydzielały ludzką immunoglobulinę M specyficzną w stosunku do wirusa odry. Jednak wykorzystanie tej metody do otrzymywania np. leków przeciwnowotworowych nie jest możliwe z kilku przyczyn, do których należy brak odpowiednich ludzkich linii szpiczakowych oraz na względy etyczne. W metodzie tej konieczna byłaby bowiem immunizacja ludzi celem otrzymania uczulonych limfocytów B, poddawanych następnie fuzji.

39 Jedną z alternatywnych metod jest wykorzystanie techniki prezentacji białek regionu wiążącego antygen na powierzchni bakteriofagów (ang. Phage Display). Inna metoda wytwarzania ludzkich MAbs polega na immunizacji odpowiednim antygenem myszy cierpiących niedobór odporności, których układ immunologiczny uprzednio rekonstruuje się poprzez podanie limfocytów z krwi obwodowej człowieka. Podobnie jak poprzednio opisanych metodach uczulone limfocyty B są następnie izolowane i łączone z komórkami szpiczaka. Alternatywną metodą produkcji ludzkich MAbs polega na wykorzystaniu myszy transgenicznych, u których mysie geny kodujące immunoglobuliny zostały zastąpione ludzkimi. Zmodyfikowane genetycznie myszy poddaje się następnie immunizacji antygenem.

40 Zarejestrowane są pierwsze w pełni ludzkie przeciwciała monoklonalne, do których należy Adalimumab - stosowany w leczeniu reumatoidalnego zapalenia stawów Denosumab (Lek Prolia) - zarejestrowany w leczeniu osteoporozy u kobiet po menopauzie Oftamumab (Arzerra) - wskazany w przewlekłej białaczce limfocytowej

41 Opracowane zostały rozliczne sposoby zwiększania efektywności terapeutycznej MAbs poprzez jest łączenie z różnymi aktywnymi biologicznie cząsteczkami takimi jak: toksyny, cytokiny, leki przeciwnowotworowe, radioizotopy, czy enzymy aktywujące leki.

42 Toxins2011, 3(7), ; doi: /toxins

43 Preparaty insulinowe wytwarzane metodami technologii genowej Stosowne procesy: 1. Ekspresja genów obu łańcuchów (A i B) w dwóch szczepach E. coli i przetwarzanie chemiczne 2. Wytwarzanie metodami technologii genowej w E. coli ( Berlin-Chemie, Hoechst, Lilly) w S. cerevisiae (Nowo Nordisk) poprzez proinsulinę mini-proinsulin

44

45 Muteiny modyfikacje w łańcuchach A i B