(12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego , PCT/US91/02225

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA PO LSKA U rząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (21 ) Numer zgłoszenia (22) Data zgłoszenia (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego , PCT/US91/02225 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego , WO91/15771, PCT Gazette nr 24/91 (13) B1 (51) Int.Cl.6 C12P 21/00 C12N 15/51 G01N 33/576 (54) Sposób tworzenia kombinacji antygenów wirusowego zapalenia wątroby typu C (HCV) i sposób wykrywania przeciwciał przeciw wirusowemu zapaleniu wątroby typu C (HCV) ( 30) Pierwszeństwo: ,US,07/ (73)U praw niony z patentu: Chiron Corporation, Emeryville, US (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 13/93 (72) Tw órcy w ynalazku: Michael Houghton, Danville, US Qui-Lim Choo, El Cerrito, US George Kuo, San Francisco, US (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 08/97 (74) Pełnom ocnik: Ponikiewski Andrzej, POLSERVICE PL B1 (57) 1 Sposób tworzenia kombinacji antygenów wirusowego zapalenia wątroby typu C (HCV), wytworzonych przez syntezę chemiczną lub ekspresję rekombinanta, przydatnej w próbach immunologicznych na obecność przeciwciał przeciw HCV, znamienny tym, że łączy się sekwencję epitopu pierwszego polipeptydu z domeny C pohprotemy HCV z co najmniej jedną sekwencją epitopu dodatkowego polipeptydu z innej domeny poliproteiny HCV, wybranej z grupy obejmującej domenę NS3 poliproteiny HCV, domenę S poliproteiny HCV, domenę NS4 poliproteiny HCV i domenę NS5 poli proteiny HCV 6 Sposób tworzenia kombinacji antygenów wirusowego zapalenia wątroby typu C (HCV), wytworzonych przez syntezę chemiczną lub ekspresję rekombinanta, przydatnej w próbach immunologicznych na obecność przeciwciał przeciw HCV, znamienny tym, że łączy się sekwencję epitopu pierwszego polipeptydu z domeny C poliproteiny HCV z sekwencją epitopu dodatkowego polipeptydu z innej domeny pohprotemy HCV, wybraną z grupy obejmującej domenę NS3 poliproteiny HCV, domenę S poliproteiny HCV, domenę NS4 poliproteiny HCV, domenę NS5 poliproteiny HCV, i z trzecią dodatkową sekwencją epitopu polipeptydu z innej domeny poliprotei ny HCV wybranej z grupy obejmującej domenę NS3 poliproteiny HCV, domenę S poliproteiny HCV, domenę NS4 poliproteiny HCV, domenę NS5 poliproteiny HCV, przy czymta trzecia domena jest inna niż domena druga, z wyłączeniem kombinacji peptydu pl z C100-3, peptydu p35 z C100-3 lub peptydu p99 z C Sposób tworzenia kombinacji antygenów wirusowego zapalenia wątroby typu C (HCV), wytworzonych przez syntezę chemiczną lub ekspresje rekombinanta, przydatnej w próbach immunologicznych na obecność przeciwciał przeciw HCV, znamienny tym, że łączy się sekwencję epitopu pierwszego polipeptydu składającą się zasadniczo z domeny C poliproteiny HCV z drugą sekwencją epitopu polipeptydu z domeny NS3 poliproteiny HCV FIG. 2

2 Sposób tworzenia kombinacji antygenów wirusowego zapalenia wątroby typu C (HCV) i sposób wykrywania przeciwciał przeciw wirusowemu zapaleniu wątroby typu C (HCV) Zastrzeżenia patentowe 1. Sposób tworzenia kombinacji antygenów wirusowego zapalenia wątroby typu C (HCV), wytworzonych przez syntezę chemiczną lub ekspresję rekombinanta, przydatnej w próbach immunologicznych na obecność przeciwciał przeciw HCV, znamienny tym, że łączy się sekwencję epitopu pierwszego polipeptydu z domeny C poliproteiny HCV z co najmniej jedną sekwencją epitopu dodatkowego polipeptydu z innej domeny poliproteiny HCV, wybranej z grupy obejmującej domenę NS3 poliproteiny HCV, domenę S poliproteiny HCV, domenę NS4 poliproteiny HCV i domenę NS5 poliproteiny HCV. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że tworzy się kombinację przez fuzję polipeptydów. 3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że tworzy się kombinację wiążąc indywidualnie sekwencję epitopu pierwszego polipeptydu i dodatkową sekwencję lub dodatkowe sekwencje epitopu polipeptydu ze wspólnym stałym podłożem. 4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że jako stałe podłoże stosuje się powierzchnię zagłębienia płytki do mikromianowania, perełkę albo pręcikowy wskaźnik zanurzeniowy. 5. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że tworzy się kombinację w postaci mieszaniny sekwencji epitopu pierwszego polipeptydu z sekwencją lub sekwencjami epitopu dodatkowego polipeptydu. 6. Sposób tworzenia kombinacji antygenów wirusowego zapalenia wątroby typu C (HCV), wytworzonych przez syntezę chemiczną lub ekspresję rekombinanta, przydatnej w próbach immunologicznych na obecność przeciwciał przeciw HCV, znamienny tym, że łączy się sekwencję epitopu pierwszego polipeptydu z domeny C poliproteiny HCV z sekwencją epitopu dodatkowego polipeptydu z innej domeny poliproteiny HCV, wybraną z grupy obejmującej domenę NS3 poliproteiny HCV, domenę S poliproteiny HCV, domenę NS4 poliproteiny HCV, domenę NS5 poliproteiny HCV, i z trzecią dodatkową sekwencją epitopu polipeptydu z innej domeny poliproteiny HCV wybranej z grupy obejmującej domenę NS3 poliproteiny HCV, domenę S poliproteiny HCV, domenę NS4 poliproteiny HCV, domenę NS5 poliproteiny HCV, przy czym ta trzecia domena jest inna niż domena druga, z wyłączeniem kombinacji peptydu pl z C 100-3, peptydu p35 z C100-3 lub peptydu p99 z C Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że jako trzecią dodatkową sekwencję epitopu polipeptydu stosuje się sekwencję z domeny S. 8. Sposób według zastrz. 6 albo 7, znamienny tym, że tworzy się kombinację przez fuzję polipeptydów. 9. Sposób według zastrz. 6 albo 7, znamienny tym, że tworzy się kombinację wiążąc indywidualnie sekwencję epitopu pierwszego polipeptydu i dodatkową sekwencję lub dodatkowe sekwencje epitopu polipeptydu ze wspólnym stałym podłożem. 10. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że jako stałe podłoże stosuje się powierzchnię zagłębienia płytki do mikromianowania, perełkę albo pręcikowy wskaźnik zanurzeniowy. 11. Sposób według zastrz. 6 albo 7, znamienny tym, że tworzy się kombinację w postaci mieszaniny sekwencji epitopu pierwszego polipeptydu z sekw encją lub sekwencjami epitopu dodatkowego polipeptydu. 12. Sposób tworzenia kombinacji antygenów wirusowego zapalenia wątroby typu C (HCV), wytworzonych przez syntezę chemiczną lub ekspresje rekombinanta, przydatnej w próbach immunologicznych na obecność przeciwciał przeciw HCV, znamienny tym, że łączy się

3 sekwencję epitopu pierwszego polipeptydu składającą się zasadniczo z domeny C poliproteiny HCV z drugą sekwencją epitopu polipeptydu z domeny NS3 poliproteiny HCV. 13. Sposób według zastrz. 12, znamienny tym, że jako sekwencję epitopu pierwszego polipeptydu stosuje się sekwencję C22, a jako drugą sekwencję epitopu polipeptydu stosuje się sekwencję C33c. 14. Sposób według zastrz. 12 albo 13, znamienny tym, że tworzy się kombinację przez fuzję polipeptydów. 15. Sposób według zastrz. 12 albo 13, znamienny tym, że tworzy się kombinację wiążąc indywidualnie sekwencję epitopu pierwszego polipeptydu i dodatkową sekwencję lub dodatkowe sekwencje epitopu polipeptydu ze wspólnym podłożem. 16. Sposób według zastrz. 15, znamienny tym, że jako stałe podłoże stosuje się powierzchnię zagłębienia płytki do mikromianowania, perełkę albo pręcikowy wskaźnik zanurzeniowy. 17. Sposób według zastrz. 12 albo 13, znamienny tym, że tworzy się kombinację w postaci mieszaniny sekwencji epitopu pierwszego polipeptyduz sekwencjąlub sekwencjami epitopu dodatkowego polipeptydu. 18. Sposób tworzenia kombinacji antygenów wirusowego zapalenia wątroby typu C (HCV), wytworzonych przez syntezę chemiczną lub ekspresje rekombinanta, przydatnej w próbach immunologicznych na obecność przeciwciał przeciw HCV, znamienny tym, że łączy się sekwencje epitopu pierwszego polipeptydu składającą się zasadniczo z domeny C poliproteiny HCV, z drugą sekwencją epitopu polipeptydu z domeny NS4 poliproteiny HCV. 19. Sposób według zastrz. 18, znamienny tym, że jako sekwencję epitopu pierwszego polipeptydu stosuje się sekwencję C22, a jako drugą sekwencję epitopu polipeptydu stosuje się sekwencję C Sposób według zastrz. 18, znamienny tym, że dodatkowo przyłącza się sekwencję epitopu trzeciego polipeptydu z domeny NS Sposób według zastrz. 18 albo 19 albo 20, znamienny tym, że tworzy się kombinację przez fuzję polipeptydów. 22. Sposób według zastrz. 18 albo 19 albo 20, znamienny tym, że tworzy się kombinację wiążąc indywidualnie sekwencję epitopu pierwszego polipeptydu i dodatkową sekwencją lub dodatkowe sekwencje epitopu polipeptydu ze wspólnym stałym podłożem. 23. Sposób według zastrz. 22, znamienny tym, że jako stałe podłoże stosuje się powierzchnię zagłębienia płytki do mikromianowania, perełkę albo pręcikowy wskaźnik zanurzeniowy. 24. Sposób według zastrz. 18 albo 19 albo 20, znamienny tym, że tworzy się kombinację w postaci mieszaniny sekwencji epitopu pierwszego polipeptydu z sekwencją lub sekwencjami epitopu dodatkowego polipeptydu. 25. Sposób tworzenia kombinacji antygenów wirusowego zapalenia wątroby typu C (HCV), wytworzonych przez syntezę chemiczną lub ekspresję rekombinanta, przydatnej w próbach immunologicznych na obecność przeciwciał przeciw HCV, znamienny tym, że łączy się sekwencję epitopu pierwszego polipeptydu składającą się zasadniczo z domeny C poliproteiny HCV, z drugą sekwencją epitopu polipeptydu z domeny NS5 poliproteiny HCV. 26. Sposób według zastrz. 25, znamienny tym, że dodatkowo przyłącza się sekwencję epitopu trzeciego polipeptydu z domeny NS Sposób według zastrz. 25 albo 26, znamienny tym, że tworzy się kombinację przez fuzję polipeptydów. 28. Sposób według zastrz. 25 albo 26, znamienny tym, że tworzy się kombinację wiążąc indywidualnie sekwencję epitopu pierwszego polipeptydu i dodatkową sekwencję lub dodatkowe sekwencje epitopu polipeptydu ze stałym wspólnym podłożem. 29. Sposób według zastrz. 28, znamienny tym, że jako stałe podłoże stosuje się powierzchnię zagłębienia płytki do mikromianowania, perełkę albo pręcikowy wskaźnik zanurzeniowy. 30. Sposób według zastrz. 25 albo 26, znamienny tym, że tworzy się kombinację w postaci mieszaniny sekwencji epitopu pierwszego polipeptydu z sekwencją lub sekwencjami epitopu dodatkowego polipeptydu.

4 Sposób wykrywania przeciwciał przeciw wirusowemu zapaleniu wątroby typu C (HCV) w składniku ciała ssaka podejrzanego o posiadanie tych przeciwciał, znamienny tym, że kontaktuje się ten składnik ciała z kombinacją antygenów wirusowego zapalenia wątroby typu C (HCV), wytworzoną przez syntezę chemiczną lub ekspresję rekombinantu, stanow iącą połącze nie sekwencji epitopu pierwszego polipeptydu z domeny C poliproteiny HCV z co najmniej jedną sekwencją epitopu dodatkowego polipeptydu z innej domeny poliproteiny HCV wybranej z grupy obejmującej domenę NS3 poliproteiny HCV, domenę S poliproteiny HCV, domenę NS4 poliproteiny HCV i domenę NS5 poliproteiny HCV, w warunkach pozwalających na zajście reakcji antygen-przeciwciało i wykrycie obecności kompleksów immunologicznych tych przeciwciał z sekwencjami epitopów polipeptydów. 32. Sposób według zastrz. 31, znamienny tym, że kontaktuje się składnik ciała z kombinacją antygenów wirusowego zapalenia wątroby typu C, utworzoną przez fuzję polipeptydów. 33. Sposób według zastrz. 31 albo 32, znamienny tym, że kontaktuje się składnik ciała z kombinacją antygenów stanowiącą połączenie indywidualnych sekwencji epitopu pierwszego polipeptydu z dodatkową sekwencją lub dodatkowymi sekwencjami epitopu polipeptydu ze wspólnym stałym podłożem. 34. Sposób według zastrz. 33, znamienny tym, że jako stałe podłoże stosuje się powierzchnię zagłębienia płytki do mikromianowania, perełkę albo pręcikowy wskaźnik zanurzeniowy. 35. Sposób wytwarzania przeciwciał przeciw wirusowemu zapaleniu wątroby typu C (HCV) w składniku ciała ssaka podejrzanego o posiadanie tych przeciwciał, znamienny tym, że kontaktuje się ten składnik ciała z kombinacją antygenów wirusowego zapalenia wątroby typu C, wytworzoną przez syntezę chemiczną lub ekspresję rekombinantu, stanowiącą połączenie sekwencji epitopu pierwszego polipeptydu z domeny C poliproteiny HCV z sekwencją epitopu dodatkowego polipeptydu z innej domeny poliproteiny HCV, wybraną z grupy obejmującej domenę NS3 poliproteiny HCV, domenę S poliproteiny HCV, domenę NS4 poliproteiny HCV, domenę NS5 poliproteiny HCV, i z trzecią dodatkową sekwencją epitopu polipeptydu z innej domeny poliproteiny HCV wybranej z grupy obejmującej domenę NS3 poliproteiny HCV, domenę S poliproteiny HCV, domenę NS4 poliproteiny HCV, domenę NS5 poliproteiny HCV, przy czym ta trzecia domena jest inna niż domena druga, z wyłączeniem kombinacji peptydu pl z C100-3, peptydup35 zc100-3 lub peptydu p99 z C100-3, w warunkach pozwalających na zajście reakcji antygen-przeciwciało i wykrycie obecności kompleksów immunologicznych tych przeciwciał z sekwencjami epitopów polipeptydów. 36. Sposób według zastrz. 35, znamienny tym, że kontaktuje się składnik ciała z kombinacją antygenów wirusowego zapalenia wątroby typu C w której trzecią dodatkową sekwencję epitopu polipeptydu stanowi sekwencja z domeny S. 37. Sposób według zastrz. 35 albo 36, znamienny tym, że kontaktuje się ten składnik ciała z kombinacją antygenów wirusowego zapalenia wątroby typu C, utworzoną przez fuzję polipeptydów. 38. Sposób według zastrz. 35 albo 36, znamienny tym, że kontaktuje się składnik ciała z kombinacją antygenów stanowiącą połączenie indywidualnych sekwencji epitopu pierwszego polipeptydu z dodatkową sekwencją lub dodatkowymi sekwencjami epitopu polipeptydu ze wspólnym stałym podłożem. 39. Sposób według zastrz. 38, znamienny tym, że jako stałe podłoże stosuj e się powierzchnię zagłębienia płytki do mikromianowania, perełkę albo pręcikowy wskaźnik zanurzeniowy. 40. Sposób wykrywania przeciwciał przeciw wirusowemu zapaleniu wątroby typu C (HCV) w składniku ciała ssaka podejrzanego o posiadanie tych przeciwciał, znamienny tym, że kontaktuje się ten składnik ciała z kombinacją antygenów wirusowego zapalenia wątroby typu C (HCV), wytworzoną przez syntezę chemiczną lub ekspresję rekombinantu, stanowiącą połączenie sekwencji epitopu pierwszego polipeptydu składającej się zasadniczo z domeny C poliprotei ny HCV z drugą sekwencją epitopu polipeptydu z domeny NS3 poliproteiny HCV, w warunkach pozwalających na zajście reakcji antygen-przeciwciało i wykrycie obecności kompleksów immunologicznych tych przeciwciał z sekwencjami epitopów polipeptydów.

5 Sposób według zastrz. 40, znamienny tym, że kontaktuje się składnik ciała z kombinacją antygenów wirusowego zapalenia wątroby typu C, w której sekwencję epitopu pierwszego polipeptydu stanowi sekwencja C22, a drugą sekwencję epitopu polipeptydu stanowi sekwencja C33c. 42. Sposób według zastrz. 40 albo 41, znamienny tym, że kontaktuje się składnik ciała z kombinacją antygenów wirusowego zapalenia wątroby typu C, wytworzoną przez fuzję polipeptydów. 43. Sposób według zastrz. 40 albo 41, znamienny tym, że kontaktuje się składnik ciała z kombinacją antygenów wirusowego zapalenia wątroby typu C stanowi połączenie indywidualnych sekwencji epitopu pierwszego polipeptydu z dodatkową sekwencją lub dodatkowymi sekwencjami epitopu polipeptydu ze wspólnym stałym podłożem. 44. Sposób według zastrz. 43, znamienny tym, że jako stałe podłoże stosuje się powierzchnię zagłębienia płytki do mikromianowania, perełkę albo pręcikowy wskaźnik zanurzeniowy. 45. Sposób wykrywania przeciwciał przeciw wirusowemu zapaleniu wątroby typu C (HCV) w składniku ciała ssaka podejrzanego o posiadanie tych przeciwciał, znamienny tym, że kontaktuje się ten składnik ciała z kombinacją antygenów wirusowego zapalenia wątroby typu C stanowią połączenie sekwencji epitopu pierwszego polipeptydu składającej się zasadniczo z domeny C poliproteiny HCV, z drugą sekwencją epitopu polipeptydu z domeny NS4 poliproteiny HCV, w warunkach pozwalających na zajście reakcji antygen-przeciwciało i wykrycie obecności kompleksów immunologicznych tych przeciwciał z sekwencjami epitopów polipeptydów. 46. Sposób według zastrz. 45, znamienny tym, że kontaktuje się składnik ciała z kombinacją antygenów wirusowego zapalenia wątroby typu C, w której sekwencję epitopu pierwszego polipeptydu stanowi sekwencja C22, a drugą sekwencję epitopu polipeptydu stanowi sekwencja C Sposób według zastrz. 45, znamienny tym, że kontaktuje się składnik ciała z kombinacją antygenów wirusowego zapalenia wątroby typu C, stanowiącą połączenie z dodatkową sekwencją epitopu trzeciego polipeptydu z domeny NS Sposób według zastrz. 45 albo 46 albo 47, znamienny tym, że kontaktuje się składnik ciała z kombinacją antygenów wirusowego zapalenia wątroby typu C utworzoną przez fuzję polipeptydów. 49. Sposób według zastrz. 45 albo 46 albo 47, znamienny tym, że kontaktuje się składnik ciała z kombinacją antygenów wirusowego zapalenia wątroby typu C stanowiącą połączenie indywidualnych sekwencji epitopu pierwszego polipeptydu z dodatkową sekwencją lub dodatkowymi sekwencjami epitopu polipeptydu ze wspólnym stałym podłożem. 50. Sposób według zastrz. 49, znamienny tym, że jako stałe podłoże stosuje się powierzchnię zagłębienia płytki do mikromianowania, perełkę albo pręcikowy wskaźnik zanurzeniowy. 51. Sposób wykrywania przeciwciał przeciw wirusowemu zapaleniu wątroby typu C (HCV) w składniku ciała ssaka podejrzanego o posiadanie tych przeciwciał, znamienny tym, że kontaktuje się ten składnik ciała z kombinacją antygenów wirusowego zapalenia wątroby typu C (HCV), stanowiącą połączenie sekwencji epitopu pierwszego polipeptydu składającej się zasadniczo z domeny C poliproteiny HCV, z drugą sekwencją epitopu polipeptydu z domeny NS5 poliproteiny HCV, w warunkach pozwalających na zajście reakcji antygen-przeciwciało i wykrycie obecności kompleksów immunologicznych tych przeciwciał z sekwencjami epitopów polipeptydów. 52. Sposób według zastrz. 51, znamienny tym, że kontaktuje się składnik ciała z kombi nacją antygenów wirusowego zapalenia wątroby typu C, stanowiącą połączenie z dodatkową se kwencją epitopu trzeciego polipeptydu z domeny NS Sposób według zastrz. 51 albo 52, znamienny tym, że kontaktuje się składnik ciała z kombinacją antygenów HCV, wirusowego zapalenia wątroby typu C, utworzoną przez fuzję polipeptydów. 54. Sposób według zastrz. 51 albo 52, znamienny tym, że kontaktuje się składnik ciała z kombinacją antygenów wirusowego zapalenia wątroby typu C, stanowiącą połączenie indy-

6 widualnych sekwencji epitopu pierwszego polipeptydu z dodatkową sekwencją lub dodatkowymi sekwencjami epitopu polipeptydu ze stałym wspólnym podłożem. 55. Sposób według zastrz. 54, znam ienny tym, że jako stałe podłoże stosuje się powierzchnię zagłębienia płytki do mikromianowania, perełkę albo pręcikowy wskaźnik zanurzeniowy. 56. Sposób według zastrz. 51 albo 52, znamienny tym, że kontaktuje się ten składnik ciała z kombinacją antygenów wirusowego zapalenia wątroby typu C, w której kombinację antygenów stanowi kombinacja w postaci mieszaniny sekwencji epitopu pierwszego polipeptydu z sekwencją lub sekwencjami epitopu dodatkowego polipeptydu. * * * Przedmiotem wynalazku jest sposób tworzenia kombinacji antygenów wirusowego zapalenia wątroby C (HCV) i sposób wykrywania przeciwciał przeciw wirusowemu zapaleniu wątroby C. Wytwarzana kombinacja antygenów HCV, pozwala na prowadzenie wielu różnych testów immunologicznych dla przeciwciał anty-hcv. Choroba, znana wcześniej jako wirusowe zapalenie wątroby typu nie-a i nie-b (NANBH), uważana jest za chorobę zakaźną lub grupę chorób wywoływanych przez wirusy i można j ą odró żnić od innych związanych z wirusami chorób wątroby włącznie z wywołanymi przez znane wirusy zapalenia wątroby, np. wirus zapalenia wątroby typu A (HAV, wirus zapalenia wątroby typu B (HBV), wirus zapalenia wątroby typu delta (HDV), a także od zapalenia wątroby wywołanego przez cytomegalowirusy (CMV) lub wirus Epsteina-Barra (EBV). Po raz pierwszy NANBH stwierdzono u osobników poddanych transfuzji. Zakażenie szympansa od człowieka i seryjne pasaże w szympansach wykazały, że etiologia NANBH zależy od jednego lub kilku zakaźnych czynników infekcyjnych. Dane epidemiologiczne wskazują, że mogą istnieć trzy typy NANBH: typ epidemiczny rozprzestrzeniający się drogą wodną, typ rozprzestrzeniający się przez krew lub drogą pozajelitową i rzadko występujący typ (nabyty we wspólnocie). Jednakże do niedawna nie zidentyfikowano żadnego czynnika zakaźnego odpowiedzialnego za NANBH, a identyfikację i diagnozę kliniczną prowadzono głównie na podstawie wykluczenia innych markerów wirusowych. Do wykrywania przypuszczalnych antygenów NANBH i przeciwciał używa się dyfuzji w żelu agarowym, immunoelektroforezy przeciwbieżnej, mikroskopii immunofluorescencyjnej, immunologicznej mikroskopii elektronowej, testów immunosorpcyjnych. Jednakże żaden z tych testów nie jest wystarczająco wrażliwy, specyficzny i powtarzalny, żeby go użyć jako testu diagnostycznego dla NANBH. W 1987 roku, naukowcy z Chiron Corportion (właściciela obecnego zgłoszenia) zidentyfikowali pierwszy kwas nukleinowy nierozerwalnie związany z NANBH rozprzestrzeniającym się przez krew. Patrz, na przykład Publikacja EPO Nr , Hughton i wsp., Science 244:359 (1989). Publikacje te opisują klonowanie izolatu wirusowego nowej klasy, wirusa zapalenia wą troby typu C (HCV), pierwotny izolat tam opisany nazwano HCV1". HCV jest wirusem typu Flavi, zawierającym RNA. Zgłoszenie patentowe Stanów Zjednoczonych Nr (Houghton i wsp.), które je st tu włączone przez cytowanie, opisuje przygotowanie różnych zrekombinowanych polipeptydów HCV przez ekspresję cdna HCV i zbadanie tych polipeptydów pod kątem aktywności immunologicznej z surowicą od pacjentów z HCV. Takie ograniczone badanie wykazało, że przynajmniej pięć testowanych polipeptydów było bardzo immunogennych i zostały one oznaczone jako 5-1-1, C100, C33c, CA279a i CA29- Oa. Z tych pięciu polipeptydów, zlokalizowany jest przypuszczalnie w domenie NS4, C100 rozciąga się przypuszczalnie w domenach NS3 i NS4, C33c zlokalizowany jest przypuszczalnie w domenie NS3, a CA279a i CA290a są zlokalizowane przypuszczalnie w domenie C. Badanie wykazało także, że żaden pojedynczy testowany polipeptyd nie był aktywny immunologicznie ze wszystkimi badanymi surowicami. Tak więc, pożądane są testy, które reagują ze wszystkimi lub z większością próbek od osobników HCV dodatnich.

7 Wynalazcy przeprowadzili dodatkowe badania serologiczne nad antygenami HCV, które potwierdziły, że do tej pory nie zidentyfikowano żadnego pojedynczego polipeptydu, który reagowałby immunologicznie ze wszystkimi surowicami. Taki brak pojedynczego polipeptydu, który uniwersalnie reagowałby immunologicznie ze wszystkimi surowicami od osobników z HCV może wynikać, między innymi, z różnic w epitopach HCV pomiędzy szczepami, zmienności odpowiedzi humoralnej pomiędzy osobnikami i/lub zmienności serologicznej w poszczególnych stanach chorobowych. Dodatkowe badania pozwoliły także wynalazcom zidentyfikować kombinacje antygenów HCV, która umożliwia bardziej efektowne wykrywanie przeciwciał przeciw HCV, niż każdy z pojedynczych polipeptydów HCV. Sposób tworzenia kombinacji antygenów wirusowego zapalenia wątroby typu C (HCV), wytworzonych przez syntezę chemiczną lub ekspresję rekombinanta, przydatnej w próbach immunologicznych na obecność przeciwciał przeciw HCV, według wynalazku, polega na tym, że łączy się sekwencję epitopu pierwszego polipeptydu z domeny C poliprotemy HCV z co najmniej jedną sekwencją epitopu dodatkowego polipeptydu z innej domeny poliproteiny HCV, wybranej z grupy obejmującej domenę NS3 poliproteiny HCV, domenę S poliproteiny HCV, domenę NS4 poliproteiny HCV i domenę NS5 poliprotemy HCV. Korzystnie kombinację antygenów tworzy się przez fuzję polipeptydów lub bardziej korzystnie wiążąc indywidualnie sekwencję epitopu pierwszego polipeptydu i dodatkową sekwencję lub dodatkowe sekwencje epitopu polipeptydu ze wspólnym stałym podłożem. Jako stałe podłoże korzystnie stosuje się powierzchnię zagłębienia płytki do mikromianowania, perełkę albo pręcikowy wskaźnik zanurzeniowy. W korzystnej odmianie tego sposobu według wynalazku tworzy się kombinację w postaci mieszaniny sekwencji epitopu pierwszego polipeptydu z sekwencją lub sekwencjami epitopu dodatkowego polipeptydu. W wariancie wynalazku sposób tworzenia kombinacji antygenów wirusowego zapalenia wątroby typu C (HCV) polega na tym, że łączy się sekwencję epitopu pierwszego polipeptydu z domeny C poliproteiny HCV z sekwencją epitopu dodatkowego polipeptydu z innej domeny poliprotemy HCV, w ybraną z grupy obejmującej domenę NS3 poliproteiny HCV, domenę S poliproteiny HCV, domenę NS4 poliprotemy HCV, domenę NS5 poliproteiny HCV, i z trzecią dodatkową sekwencją epitopu polipeptydu z innej domeny poliproteiny HCV wybranej z grupy obejmującej domenę NS3 poliproteiny HCV, domenę S poliproteiny HCV, domenę NS4 poliproteiny HCV, domenę NS5 poliproteiny HCV, przy czym ta trzecia domena jest inna niż domena druga, z wyłączeniem kombinacji peptydu pl z C 100-3, peptydu p35 z C lub peptydu p99 z C Korzystnie jako trzecią dodatkową sekwencję epitopu polipeptydu stosuje się sekwencję z domeny S. W dodatkowych rozwiązaniach w sposobie według wynalazku tworzy się kombinację przez fuzję polipeptydów lub wiążąc indywidualnie sekwencję epitopu pierwszego polipeptydu i dodatkową sekwencję lub dodatkowe sekwencje epitopu polipeptydu ze wspólnym stałym podłożem. W sposobie tym korzystnie jako stałe podłoże stosuje się powierzchnię zagłębienia płytki do mikromianowania, perełkę albo pręcikowy wskaźnik zanurzeniowy. Kombinację antygenów można korzystnie tworzyć również w postaci mieszaniny sekwencji epitopu pierwszego polipeptydu z sekwencją lub sekwencjami epitopu dodatkowego polipeptydu. Kolejny wariant sposobu tworzenia kombinacji polega na tym, że łączy się sekwencję epitopu pierwszego polipeptydu składającą się zasadniczo z domeny C poliproteiny HCV z drugą sekwencją epitopu polipeptydu z domeny NS3 poliproteiny HCV. Korzystnie, jako sekwencję epitopu pierwszego polipeptydu, stosuje się sekwencję C22, a jako drugą sekwencję epitopu polipeptydu stosuje się sekwencję C33c. Kombinację taką tworzy się przez fuzję polipeptydów lub także wiążąc indywidualnie sekwencję epitopu pierwszego polipeptydu i dodatkową sekwencję lub dodatkowe sekwencje epitopu polipeptydu ze wspólnym podłożem. Jako stałe podłoże korzystnie stosuje się powierzchnię zagłębienia płytki do mikromianowania, perełkę albo pręcikowy wskaźnik zanurzeniowy. Kombinację tworzy się również w postaci mieszaniny sekwencji epitopu pierwszego polipeptydu z sekwencją lub sekwencjami epitopu dodatkowego polipeptydu.

8 W następnym wariancie rozwiązania sposób tworzenia kombinacji antygenów wirusowego zapalenia wątroby typu C (HCV) polega na tym, że łączy się sekwencje epitopu pierwszego polipeptydu składającą się zasadniczo z domeny C poliproteiny HCV, z drugą sekwencją epitopu polipeptydu z domeny NS4 poliproteiny HCV. Korzystnie jako sekwencję epitopu pierwszego polipeptydu stosuje się sekwencję C22, a jako drugą sekwencję epitopu polipeptydu stosuje się sekwencję C100. Korzystnie do sekwencji tych dodatkowo przyłącza się sekwencję epitopu trzeciego polipeptydu z domeny NS3 a także tworzy się kombinacje przez fuzję polipeptydów. W następnej korzystnej odmianie sposobu tworzy się kombinację wiążąc indywidualnie sekwencję epitopu pierwszego polipeptydu i dodatkową sekwencję lub dodatkowe sekwencje epitopu polipeptydu ze wspólnym stałym podłożem, a jako stałe podłoże korzystnie stosuje się powierzchnię zagłębienia płytki do mikromianowania, perełkę albo pręcikowy wskaźnik zanurzeniowy. Jeszcze bardziej korzystnie tworzy się kombinację w postaci mieszaniny sekwencji epitopu pierwszego polipeptydu z sekwencją lub sekwencjami epitopu dodatkowego polipeptydu. W kolejnym wariancie sposób tworzenia kombinacji antygenów wirusowego zapalenia wątroby typu C (HCV) polega na tym, że łączy się sekwencję epitopu pierwszego polipeptydu składającą się zasadniczo z domeny C poliproteiny HCV, z drugą sekwencją epitopu polipeptydu z domeny NS5 poliproteiny HCV. W korzystnej odmianie tego wariantu sposobu do sekwencji tych dodatkowo przyłącza się sekwencję epitopu trzeciego polipeptydu z domeny NS3. Korzystnie tworzy się tą kombinację przez fuzję polipeptydów. W innej korzystnej odmianie tworzy się kombinację wiążąc indywidualnie sekwencję epitopu pierwszego polipeptydu i dodatkową sekwencję lub dodatkowe sekwencje epitopu polipeptydu ze stałym wspólnym podłożem a jako stałe podłoże stosuje się powierzchnię zagłębienia płytki do mikromianowania, perełkę albo pręcikowy wskaźnik zanurzeniowy. Jeszcze bardziej korzystnie, kombinację tworzy się w postaci mieszaniny sekwencji epitopu pierwszego polipeptydu z sekwencją lub sekwencjami epitopu dodatkowego polipeptydu. Przedmiotem wynalazku jest także sposób wykrywania przeciwciał przeciw wirusowemu zapaleniu wątroby typu C (HCV) w składniku ciała ssaka podejrzanego o posiadanie tych przeciwciał, polegający na tym, że kontaktuje się ten składnik ciała z kombinacją antygenów wirusowego zapalenia wątroby typu C (HCV), wytworzoną przez syntezę chemiczną lub ekspresję rekombinantu, stanowiącą połączenie sekwencji epitopu pierwszego polipeptydu z domeny C poliproteiny HCV z co najmniej jedną sekwencją epitopu dodatkowego polipeptydu z mnej domeny poliproteiny HCV wybranej z grupy obejmującej domenę NS3 poliproteiny HCV, domenę S poliproteiny HCV, domenę NS4 poliproteiny HCV i domenę NS5 poliproteiny HCV, w warunkach pozwalających na zajście reakcji antygen-przeciwciało i wykrycie obecności kompleksów immunologicznych tych przeciwciał z sekwencjami epitopów polipeptydów. Wykrywanie przeciwciał prowadzi się również w ten sposób, że kontaktuje się składnik ciała z kombinacją antygenów wirusowego zapalenia wątroby typu C, utworzoną przez fuzję polipeptydów lub w innym korzystnym wykonaniu, kontaktując ten składnik ciała z kombinacją antygenów stanowiącą połączenie indywidualnych sekwencji epitopu pierwszego polipeptydu z dodatkową sekwencją lub dodatkowymi sekwencjami epitopu polipeptydu ze wspólnym stałym podłożem. Korzystnie jako stałe podłoże stosuje się powierzchnię zagłębienia płytki do mikromianowania, perełkę albo pręcikowy wskaźnik zanurzeniowy. W następnej odmianie, sposób wykrywania przeciwciał przeciw wirusowemu zapaleniu wątroby typu C (HCV) w składniku ciała ssaka podejrzanego o posiadanie tych przeciwciał, polega na tym, że kontaktuje się ten składnik ciała z kombinacją antygenów wirusowego zapalenia wątroby typu C, wytworzoną przez syntezę chemiczną lub ekspresję rekombinantu, stanowiącą połączenie sekwencji epitopu pierwszego polipeptydu z domeny C poliproteiny HCV z sekwencją epitopu dodatkowego polipeptydu z innej domeny poliproteiny HCV, wybraną z grupy obejmującej domenę NS3 poliproteiny HCV, domenę S poliproteiny HCV, domenę NS4 poliproteiny HCV, domenęns5 poliproteiny HCV, i z trzecią dodatkową sekwencją epitopu polipeptydu z innej domeny poliproteiny HCV wybranej z grupy obejmującej domenę NS3 poliproteiny HCV, domenę S poliproteiny HCV, domenę NS4 poliproteiny HCV, domenę NS5 poliproteiny

9 HCV, przy czym ta trzecia domena jest inna niż domena druga, z wyłączeniem kombinacji peptydu pl z C 100-3, peptydu p35 z C lub peptydu p99 z C 100-3, w warunkach pozwalających na zajście reakcji antygen-przeciwciało i wykrycie obecności kompleksów immunologicznych tych przeciwciał z sekwencjami epitopów polipeptydów. Korzystnie, kontaktuje się ten składnik ciała z kombinacją antygenów wirusowego zapalenia wątroby typu C, w której trzecią dodatkową sekwencją epitopu polipeptydu stanowi sekwencja z domeny S, a jeszcze bardziej korzystnie, kontaktuje się ten składnik ciała z kombinacją antygenów wirusowego zapalenia wątroby typu C utworzoną przez fuzję polipeptydów. Ta kombinacja antygenów może stanowić połączenie indywidualnych sekwencji epitopu pierwszego polipeptydu z dodatkową sekwencją lub dodatkowymi sekwencjami epitopu polipeptydu ze wspólnym stałym podłożem a jako stałe podłoże w sposobie tym korzystnie stosuje się powierzchnię zagłębienia płytki do mikromianowania, perełkę albo pręcikowy wskaźnik zanurzeniowy. W następnym wariancie sposób wykrywania przeciwciał przeciw wirusowemu zapaleniu wątroby typu C (HCV) w składniku ciała ssaka podejrzanego o posiadanie tych przeciwciał, polega na tym, że kontaktuje się ten składnik ciała z kombinacją antygenów wirusowego zapalenia wątroby typu C (HCV), wytworzoną przez syntezę chemiczną lub ekspresję rekombinantu, stanowiącą połączenie sekwencji epitopu pierwszego polipeptydu składającej się zasadniczo z domeny C poliproteiny HCV z drugą sekwencją epitopu polipeptydu z domeny NS3 poliproteiny HCV, w warunkach pozwalających na zajście reakcji antygen-przeciwciało i wykrycie obecności kompleksów immunologicznych tych przeciwciał z sekwencjami epitopów polipeptydów. Korzystnie kontaktuje się ten składnik ciała z kombinacją antygenów wirusowego zapalenia wątroby typu C, w której sekwencję epitopu pierwszego polipeptydu stanowi sekwencja C22, a drugą sekwencję epitopu polipeptydu stanowi sekwencja C33c i jeszcze bardziej korzystnie, kontaktuje się składnik ciała z kombmacją antygenów wirusowego zapalenia wątroby typu C, wytworzoną przez fuzję polipeptydów. W kolejnym korzystniejszym rozwiązaniu ta kombinacja antygenów wirusowego zapalenia wątroby typu C stanowi połączenie indywidualnych sekwencji epitopu pierwszego polipeptydu z dodatkową sekwencją lub dodatkowymi sekwencjami epitopu polipeptydu ze wspólnym stałym podłożem, jako stałe podłoże stosuje się korzystnie powierzchnię zagłębienia płytki do mikromianowania, perełkę albo pręcikowy wskaźnik zanurzeniowy. W następnej odmianie sposób wykrywania przeciwciał przeciw wirusowemu zapaleniu wątroby typu C (HCV) w składniku ciała ssaka podejrzanego o posiadanie tych przeciwciał, polega na tym, że kontaktuje się ten składnik ciała z kombinacją antygenów wirusowego zapalenia wątroby typu C stanowiącą połączenie sekwencji epitopu pierwszego polipeptydu składającej się zasadniczo z domeny C poliproteiny HCV, z drugą sekwencją epitopu polipeptydu z domeny NS4 poliproteiny HCV, w warunkach pozwalających na zajście reakcji antygen-przeciwciało i wykrycie obecności kompleksów immunologicznych tych przeciwciał z sekwencjami epitopów polipeptydu. W korzystnej odmianie kontaktuje się składnik ciała z kombinacją antygenów wirusowego zapalenia wątroby typu C, w której sekwencję epitopu pierwszego polipeptydu stanowi sekwencja C22, a drugą sekwencję epitopu polipeptydu stanowi sekwencja C100. Jeszcze bardziej korzystnie, kontaktuje się składnik ciała z kombinacją antygenów wirusowego zapalenia wątroby typu C, która stanowi połączenie z dodatkową sekwencją epitopu trzeciego polipeptydu z domeny N S3. W sposobie według wynalazku można także kontaktować składnik ciała z kombinacją antygenów wirusowego zapalenia wątroby typu C utworzoną przez fuzję polipeptydów lub stanowiącą połączenie indywidualnych sekwencji epitopu pierwszego polipeptydu z dodatkową sekwencją lub dodatkowymi sekwencjami epitopu polipeptydu ze wspólnym stałym podłożem. Korzystnie jako stałe podłoże stosuje się wtedy powierzchnię zagłębienia płytki do mikromianowania, perełkę albo pręcikowy wskaźnik zanurzeniowy. W kolejnym wariancie sposób wykrywania przeciwciał przeciw wirusowemu zapaleniu wątroby typu C (HCV) w składniku ciała ssaka podejrzanego o posiadanie tych przeciwciał, polega na tym, że kontaktuje się ten składnik ciała z kombinacją antygenów wirusowego zapalenia wątroby typu C (HCV), stanowiącą połączenie sekwencji epitopu pierwszego polipeptydu składającej się zasadniczo z domeny C poliproteiny HCV, z drugą sekwencją epitopu polipeptydu z domeny NS5 poliproteiny HCV, w

10 warunkach pozwalających na zajście reakcji antygen-przeciwciało i wykrycie obecności kompleksów immunologicznych tych przeciwciał z sekwencjami epitopów polipeptydów. Korzystnie kombinacja antygenów wirusowego zapalenia wątroby typu C może stanowić połączenie z dodatkową sekwencją epitopu trzeciego polipeptydu z domeny NS3 a jeszcze bardziej korzystnie kombinacja antygenów HCV, wirusowego zapalenia wątroby typu C, może być utworzona przez fuzję polipeptydów lub jeszcze bardziej korzystnie stanowić połączenie indywidualnych sekwencji epitopu pierwszego polipeptydu z dodatkową sekwencją lub dodatkowymi sekwencjami epitopu polipeptydu ze stałym wspólnym podłożem. Jako stałe podłoże w sposobie według wynalazku korzystnie stosuje się powierzchnię zagłębienia płytki do mikromianowania, perełkę albo pręcikowy wskaźnik zanurzeniowy. Również korzystnie w sposobie tym kombinację antygenów wirusowego zapalenia wątroby typu C, stanowi kombinacja w postaci mieszaniny sekwencji epitopu pierwszego polipeptydu z sekwencją lub sekwencjami epitopu dodatkowego polipeptydu. Rysunek 1 przedstawia sekwencję nukleotydową cdna, nici sensownej i anty-sensownej poliproteiny HCV i sekwencję aminokwasową kodowaną przez nić sensowną(sekw. nr ident. 9 i sekw. nr ident. 10). Rysunek 2 przedstawia schemat sekwencji aminokwasowej z rysunku 1 pokazujący przypuszczalne domeny polipeptydu HCV. Definicje Antygen HCV oznacza polipeptyd złożony przynajmniej z około 5 aminokwasów, przeważnie złożony z około 8 do 10 aminokwasów, który określa epitop znaleziony w izolacie HCV. Jeżeli antygen oznaczono kodem alfanumerycznym, epitop pochodzi z domeny HCV oznaczonej tym kodem. Syntetyczny, jeżeli użyty do określenia antygenu, oznacza, że antygen HCV został wyizolowany z naturalnego źródła lub wytworzony przez człowieka na drodze syntezy chemicznej lub rekombinacji. Domena oznacza taki segment poliproteiny HCV, pokazany na rysunku 2, który ogólnie odpowiada przypuszczalnemu strukturalnemu lub niestrukturalnemu białku HCV. Oznaczenia domen ogólnie odpowiadają ustaleniom dotyczącym nazewnictwa białek Flaviwirusów. Lokalizacja domen przedstawiona na rysunku 2 jest tylko przybliżona. Oznaczenie NS określa białka niestrukturalne, a S oznacza białka otoczki, a C oznacza domenę białka nukleokapsydu lub rdzenia. Polipeptyd połączony oznacza polipeptyd, w którym antygen/y/ HCV stanowią część pojedynczego, ciągłego łańcucha aminokwasów, łańcucha który nie występuje w naturze. Antygeny HCV mogą być połączone bezpośrednio jeden z drugim wiązaniem peptydowym, lub rozdzielone przez aminokwasowe sekwencje rozdzielające. Polipeptyd połączony może zawierać także sekwencje aminokwasowe egzogenne dla HCV. Wspólne stałe podłoże' oznacza ciało stałe, z którym pojedynczy antygen HCV lub polipeptyd połączony, złożony z antygenów HCV, są związane kowalencyjnie lub w sposób mekowalencyjny, taki jak, adsorpcja hydrofobowa. Składnik ciała ssaków oznacza płyn lub tkankę ssaka (na przykład człowieka), który zawiera przeciwciała wytwarzane przez tego ssaka. Składniki takie znane są biegłym w sztuce i obejmują, bez ograniczania, krew, plazmę, surowicę, płyn rdzeniowy, limfę, wydzielmy układu oddechowego, trawiennego lub moczowo-płciowego, łzy, ślinę, mleko, białe ciałka krwi i komórki szpiku. Reaktywny immunologicznie oznacza, że brany pod uwagę antygen reaguje swoiście z przeciwciałem anty-hcv, powszechnie obecnym w znaczącej porcji surowicy od osobnika zainfekowanego HCV. Kompleks immunologiczny oznacza kombinację lub agregat powstający, gdy przeciwciało wiąże się z epitopem antygenu. Kombinacja antygenów HCV Rysunek 2 przedstawia przypuszczalne domeny poliproteiny HCV. Antygeny używane w kombinacji pochodzą z domen: C, S (lub E), NS3, NS4 i NS5. Uważa się, że domena C koduje

11 białko nukleokapsydu HCV. Rozciąga się ona od N-końca poliproteiny do około aminokwasu 120 z rysunku 1. Uważa się, że domena S koduje białko otoczki wirusa, a możliwe, że i białko podstawowe, rozciąga się od około aminokwasu 120 do aminokwasu 400, na rysunku 1. Domena NS3 rozciąga się od około aminokwasu 1050 do aminokwasu 1640 i uważa się, że koduje wirusową proteazę. Domena NS4 rozciąga się od końca domeny NS3 do około aminokwasu Funkcja białka NS4 nie jest na razie znana. Wreszcie, domena NS5 rozciąga się od około aminokwasu 2000 do końca poliproteiny i uważa się, że koduje wirusową polimerazę. Na rysunku 1 pokazano sekwencję izolatu HCV. Wydaje się, że sekwencje innych szczepów HCV rozprzestrzeniających się przez krew mogą różnić się od sekwencji z rysunku 1, szczególnie w domenach otoczki (S) i nukleokapsydu (C). Przyjmuje się, że użycie antygenów HCV mających inną sekwencję wchodzi w zakres obecnego wynalazku, pod warunkiem, że różnice te nie obniżają znacząco reaktywności immunologicznej antygenu w stosunku do surowicy osób zainfekowanych HCV. Ogólnie, antygeny HCV zawierają całkowite lub częściowe domeny, fragmenty domen i mogą być łatwo badane pod kątem antygenowości przez biegłych w sztuce. Pojedynczy antygen HCV używany w kombinacji korzystnie zawiera determinantę (to znaczy, część pierwotnie odpowiedzialną za reaktywność immunologiczną polipeptydu) określonej domeny. W przypadku domeny C, korzystnie jest, gdy antygen domeny C zawiera większość całkowitej sekwencji domeny. Antygen oznaczony C22 (patrz przykład 4) jest szczególnie korzystny. Antygen domeny S, korzystnie zawiera hydrofobową subdomenę położoną na N-końcu domeny. Ta hydrofobowa subdomena rozciąga się od około aminokwasu 199 do aminokwasu 328, na rysunku 1. Antygen HCV oznaczony S2 (patrz przykład 3) jest szczególnie korzystny. Jeśli jest to pożądane, w antygen domeny S może także być włączona sekwencja w kierunku transkrypcji tej hydrofobowej subdomeny. Korzystnym antygenem domeny NS3 jest antygen oznaczony C33c. Ten antygen obejmuje aminokwasy od 1192 do 1457 na rysunku 1. Korzystnym antygenem NS4 jest C 100 i zawiera aminokwasy od 1569 do 1931 na rysunku 1. Korzystny antygen NS5 zawiera aminokwasy od 2054 do 2464 na rysunku 1. Antygen HCV może występować w postaci polipeptydu złożonego z kompletnej sekwencji aminokwasowej HCV lub może zawierać sekwencje egzogenne (to znaczy, może występować w postaci białka połączonego, zawierającego sekwencje egzogenne). W przypadku antygenów HCV wytworzonych drogą rekombinacji, wytworzenie antygenu jako białka połączonego na przykład z SOD, czynnikiem alfa lub ubikwityną (patrz Dokument patentowy Stanów Zjednoczonych AP Nr Dokument patentowy Stanów Zjednoczonych AP Nr Zgłoszenie patentowe Stanów Zjednoczonych N r , złożone 7 sierpnia 1989, które są tu włączone, a opisują ekspresję białek połączonych z SOD, czynnikiem alfa i ubikwityną) może zwiększyć poziom ekspresji i/lub zwiększyć rozpuszczalność antygenu w wodzie. Białka połączone, takie jak, połączone z czynnikiem alfa i ubikwityną są przerabiane przez szczep gospodarza, w celu usunięcia sekwencji heterogenicznej. Czynnik alfa jest systemem sekrecyjnym, a białka połączone z ubikwityną pozostają w cytoplazmie. Tak więc, kombinacja antygenów może być wytwarzana jako białka połączone. Na przykład, można wytworzyć ciągły fragment DNA kodujący C22 i C33c, klonować go do wektora ekspresyjnego i użyć do wytworzenia białka połączonego C22 i C33c. W podobny sposób można wytworzyć białka połączone antygenów C22 i C100, C22 i S2, C22 i NS5, C22, C33c i S2, C22, C100 i S2 i C22, C33c, C100 i S2. Można także użyć innych fragmentów wymienionych domen. Przygotowanie antygenów HCV Sposobem według wynalazku antygeny HCV korzystnie wytwarza się drogą rekombinacji lub drogą znanej syntezy chemicznej fazy stałej. Jednakże można także wyizolować je ze zdysocjowanych HCV lub cząstek HCV przy użyciu technik chromatografii powinowactwa z wykorzystaniem przeciwciał do izolacji antygenów. Do wytwarzania antygenów drogą rekombinacji wykorzystuje się standardowe techniki konstruowania DNA kodującego antygen, klonowanie tego DNA wektorów ekspresyjnych,

12 transformowanie komórek gospodarza, takich jak, bakterie, drożdże, owady lub komórki ssaków i ekspresję takiego DNA do wytwarzania antygenów. Jak wykazano wcześniej, może być pożądana ekspresja antygenu jako białka połączonego w celu zwiększenia poziomu ekspresji, ułatwienia oczyszczania, lub zwiększenie rozpuszczalności. Przykładem specyficznego sposobu wytwarzania przykładowych antygenów HCV opisano w następujących przykładach i macierzystym zgłoszeniu nr Przygotowanie antygenów do użycia w testach immunologicznych Antygeny HCV m ogą być kombinowane przez wytwarzanie ich w postaci białek połączonych, złożonych z dwóch lub więcej antygenów, przez immobilizowanie ich pojedynczo na popularnych stałych podłożach lub przez ich fizyczne zmieszanie. Białka połączone antygenów można immobilizować (wiązać) z podłożem stałym. Metody i sposoby kowalencyjnego i niekowalencyjnego wiązania białek z podłożem stałym są znane w sztuce. Faktura stałej powierzchni zmienia się w zależności od postaci testu. Dla testów prowadzonych w mikropłytkach, powierzchnią stałą będzie ścianka studzienki lub naczynka. Dla testów, w których używa się perełek, powierzchnią stałą będzie powierzchnia perełki. Dla testów, w których używa się wskaźnika (to znaczy, ciała stałego wykonanego z materiału porowatego lub włóknistego, takiego jak, tkanina lub papier) powierzchnią stałą będzie powierzchnia materiału z jakiego wskaźnik jest wykonany. W testach aglutynacji powierzchnią stałą będzie powierzchnia cząstek lateksu lub żelatyny. Jeżeli ze stałym podłożem związane są pojedyncze antygeny, m ogą być na powierzchni rozłożone ho mogennie lub we wzór, taki jak paski, tak że wzór wiązania antygenu można rozróżnić. Proste mieszaniny antygenów zawierają antygen w jakimkolwiek odpowiednim rozpuszczalniku lub podłożu dyspersyjnym. Postacie testów przy użyciu kombinacji antygenów Antygeny HCV można wykorzystać w każdym teście, który wykorzystuje znany antygen do wykrywania przeciwciał. Powszechną własnością wszystkich takich testów jest to, że doprowadza się do kontaktu antygen ze składnikiem ciała podejrzanym o zawieranie przeciwciał anty- HCV w warunkach, które pozwalają antygenowi związać się z jakimkolwiek takim przeciwciałem obecnym w składniku ciała. Typowo takie warunki, to fizjologiczna temperatura, ph i siła jonowa oraz użycie nadmiaru antygenu. Po inkubacji antygenu z próbką wykrywa się kompleksy immunologiczne zawierające antygen. Zaprojektowanie testu immunologicznego stwarza duże możliwości zmian i wiele form testu jest znane w sztuce. Na przykład, w protokołach wykonania używa się stałych nośników lub immunoprecypitacji. Większość testów wymaga użycia znacznych przeciwciał lub polipeptydów, znaczyć można, na przykład enzymatycznie, fluorescencyjnie, chemiluminescencyjnie lub radioaktywnie lub cząsteczkami barwnika. Znane są także testy, w których sygnał od kompleksu immunologicznego jest zwielokrotniony, przykładem są testy, w których używa się biotyny lub avidyny i testy immunologiczne z wykorzystaniem enzymów, takie jak ELISA. Test immunologiczny może występować, bez ograniczeń w postaci heterogenicznej i homogenicznej i typu standardowego lub kompetencyjnego. W postaci heterogenicznej polipeptyd typowo jest wiązany ze stałym podłożem lub podłożem ułatwiającym oddzielenie próbki od polipeptydu po inkubacji. Przykładem stałego podłoża, którego można używać, jest nitroceluloza (na przykład, w postaci błon lub studzienek mikropłytek), chlorek poliwinylowy (na przykład, w postaci arkuszy lub studzienek mikropłytek), lateks polistyrenowy (na przykład, w postaci perełek lub studzienek mikropłytek), fluorek poliwinilidyny (znany jako Immulon ), papier dwuazowany, błony nylonowe, perełki aktywowane i perełki opłaszczone białkiem A. Na przykład, w heterogenicznej postaci testu można użyć mikropłytek lub perełek polistyrenowych o średnicy 6,5 mm (Precyzyjne plastikowe kuleczki) wykonanych z Immulonu 1" lub Immulonu 2" firmy Dynatech. Stały nośnik zawierający polipeptydy antygeniczne typowo przemywa się po oddzieleniu ich od próbki badanej a przed wykrywaniem związanych przeciwciał. W sztuce znana jest zarówno standardowa i kompetencyjna postać testu.

13 W homogenicznej postaci testu badaną próbkę inkubuje się z roztworem kombinacji antygenów. Na przykład, prowadzi się to w warunkach, w których precypituje każdy powstający kompleks antygen-przeciwciało. W sztuce jest zarówno standardowa i kompetencyjna postać testu. W standardowej postaci testu ilość przeciwciał anty-hcv tworzących kompleksy antygen-przeciwciało mierzy się bezpośrednio. Można to uzyskać przez określenie, czy znaczone przeciwciała anty-ksenogemczne (na przykład, anty-ludzkie), które rozpoznają epitop przeciwciał anty-hcv, będą się wiązały z wytworzeniem kompleksu. W kompetencyjnej postaci testu ilość przeciwciał anty-hcv w próbce wnioskuje się ze zbadania efektów kompetencyjnych wiązania znanej ilości znaczonego przeciwciała (lub innego kompetencyjnego ligandu) w kompleksach. Tworzące się kompleksy zawierające przeciwciała anty-hcv (lub w przypadku testów kompetencyjnych ilość przeciwciała kompetencyjnego) wykrywa się jakąkolwiek znaną techniką, w zależności od postaci testu. Na przykład, nieznakowane przeciwciała anty-hcv w kompleksach można wykryć przy użyciu koniugatów antyksenogenicznych Ig skompleksowanych ze znacznikiem (na przykład, ze znacznikiem enzymatycznym). W testach immunoprecypitacji lub aglutynacji reakcja pomiędzy antygenem HCV i przeciwciałem tworzy siatkę, która precypituje z roztworu lub zawiesiny i powstaje widoczna warstwa lub błonka precypitatu. Jeśli osobnik nie posiada żadnych przeciwciał anty-hcv nie powstaje widoczny precypitat. Antygeny HCV typowo pakuje się w postaci zestawu do użycia w takim teście immunologicznym. Normalnie zestaw zawiera oddzielne pojemniki z kombinacją antygenów (od razu związanych ze stałym podłożem lub oddzielonych, z odczynnikami do wiązania ich z podłożem), przeciwciała kontrolne (dodatnie i/lub negatywne), przeciwciała znaczone, jeżeli postać testu tego wymaga i odczynniki wytwarzające sygnał (na przykład, substrat dla enzymu) Je ż e li znacznik sam nie wytwarza sygnału. Zwykle zestaw zawiera także instrukcję wykonania (na przykład, pisaną, taśmę, VCR, CD-ROM i tym podobne). Następujące przykłady zamieszczono w celu zilustrowania wynalazku i nie ograniczają one wynalazku w żaden sposób. Przykład I. Synteza antygenu C33a HCV Antygen C33c HCV zawiera sekwencję domeny NS3. Szczegółowo obejmuje aminokwasy od 1192 do 1457na rysunku 1. Antygen ten wytwarza się w bakteriach jako białko połączone z ludzką dysmutazą ponadtlenkową (SOD) w sposób następujący. Wektor psodcfl (Steiner i wsp., (1986), J. Virol. 58:9) trawi się całkowicie restryktazą EcoRI i BamHI, a powstające fragmenty EcRI i BamHI łączy się w następujący linkier do wytworzenia p cf1ef: GATC CTG GAA TTC TGA TAA (sekw. nr ident. 1) GAC CTT AAG ACT ATT TTA A (sekw. nr ident. 2) Klon cdna kodujący aminokwasy i mający końce EcoRI włącza się w psf1ef do wytworzenia pcflef/c33c. Taką konstrukcję ekspresyjną transformuje się do komórek D1210 E. coli. Transformantów używa się do ekspresji białka połączonego zawierającego na N-końcu SOD, a na C-końcu, zgodnie z ramką odczytu antygen C33a HCV. ekspresję uzyskuje się przez inokulację 15 ml całonocnej hodowli transformanta do 1500 ml podłoża Luria zawierającego ampicylinę (100 mikrogramów/ml). Komórki hoduje się do O.D. równego 0,3, dodaje się IPTG do stężenia końcowego 2 mm i kontynuuje się hodowlę do gęstości O.D. równej 1, następnie komórki odwirowuje się przez 20 minut przy 3000 x g w temperaturze 4 C. Upakowane komórki można przechowywać w temperaturze -80 C przez kilka miesięcy. W celu oczyszczenia polipeptydu SOD-C33c, komórki bakterii, wytwarzające ten polipe tyd, poddaje się szokowi osmotycznemu i mechanicznemu rozbiciu, a frakcję nierozpuszczalną zawierającą SOD-C33c izoluje się i poddaje ekstrakcji różnicującej w zasadowym roztworze NaCl. Wyekstrahowane białko połączone oczyszcza się przez chromatografię kolumnowa na S- Sepharozie i Q-Sepharozie.

14 Surowy ekstrakt powstający po szoku osomotycznym i mechanicznym rozbiciu przygotowuje się według następującej procedury. Jeden gram upakowanych komórek zawiesza się w 10 ml roztworu zawierającego 0,02 M Tris HCl, ph 7,5,10 mm EDTA, 20% sacharozy i inkubuje się przez 10 minut w lodzie. Komórki zbiera się przez wirowanie przez 15 minut przy 4000 x g w temperaturze 4 C. Po usunięciu klarownego supernatantu (frakcja peryplazmatyczna I) komórki powtórnie zawiesza się w 10 ml buforu A l (0,01 M Tris HCl, ph 7,5,1 mm EDTA, 14 mm betamerkaptoetanol (BME) i inkubuje się przez 10 minut w lodzie. Komórki powtórnie zbiera się przez wirowanie przez 15 minut przy 4000 x g w temperaturze 4 C. Po usunięciu klarownego supernatantu (frakcja peryplazmatyczna II) komórki zawiesza się 5 ml buforu A2 (0,02 M Tris HC1, ph 7,5,1 mm EDTA, 14 mm BME, 1 mmpmsf). W celu rozbicia komórek, w probówce Falco na umieszcza się 7,5 ml przemytych kwasem perełek Dyno-mill ze szkła bezołowiowego (o średnicy 0,1-0,15 mm) z firmy Glen-Mills, Inc.) i 5 ml zawiesiny komórek, wytrząsa się z maksymalną szybkością przez dwie minuty i oziębia przez co najmniej 2 minuty na lodzie, procedurę wytrząsania i oziębiania powtarza się cztery razy. Po wytrząsaniu, osad filtruje się przez lejek ze szkła spiekanego pod lekko obniżonym ciśnieniem. Szklane perełki przemywa się dwukrotnie buforem A2 i łączy przesącz i płyn po przemywaniu. Frakcję nierozpuszczalną surowego ekstraktu zbiera się przez wirowanie przy x g przez 15 minut w temperaturze 4 C, przemywa dwukrotnie 10 ml ml buforu A2 i zawiesza w 5 ml wody MILLI-Q. Frakcję zawierającą SOD-C33c izoluje się materiału nierozpuszczalnego przez dodanie do zawiesiny roztworu NaOH (2 M) i NaCl (2 M) do stężenia końcowego 20 mm każdego ze związków, wytrząsanie mieszaniny przez 1 minutę, odwirowanie przy x g przez 20 minut w temperaturze 4 C i zatrzymanie supernatantu. W celu oczyszczenia SOD-C33c na S-Sepharozie, supematant doprowadza się do stężenia końcowego 6M roztworu mocznika, 0,05 M Tris HCl, ph 7,5,1 mm EDTA, 14 mm BME. Frakcję nakłada się na kolumnę S-Sepharose Fast Flow (1,5 x 10 cm) zrównoważoną buforem B (0,05 M Treis HCl, ph 7,5 1 mm EDTA, 14 mm BME). Po nałożeniu próbki, kolumnę przemywa się dwoma objętościami buforu B. Zbiera się frakcje przepływające i wypływające. Prędkość przepływu próbki i buforu do przemywania wynosi 1 ml/minutę, zbiera się frakcję 1 ml. W celu zidentyfikowania frakcji zawierającej SOD-C33c frakcje analizuje się przez elektroforezę na 10% żelu poliakrylamidowym zawierającym SDS i barwienie błękitem Coomassie. Frakcje można także analizować techniką Western blotting przy użyciu przeciwciał anty-sod. Frakcje zawierające SOD-C33c zbiera się. Dalsze oczyszczanie SOD-C33c prowadzi się na kolumnie Q-Sepharose (1,5 x 10 cm) zrównoważonej buforem B. Frakcje zawierające SOD-C33c zebrane po chromatografii na S-Sepharozie nakłada się na kolumnę. Następnie kolumnę przemywa się buforem B i rozwija 60 ml gradientu 0,0 do 0,4 M NaCl w buforze B. Prędkość przepływu dla nakładania, przemywania i rozwijania wynosi 1 ml/minutę, zbiera się frakcje 1 ml. Wszystkie frakcje z kolumny Q-Sepharose bada się tak, jak opisano to dla kolumny S-Sepharose. Pik SOD-C33c wymywa się z kolumny przy stężeniu NaCl około 0,2 M. Z kolumny Q-Sepharose otrzymuje się SOD-C33c o czystości większej niż 90%, określonej przez analizę na żelu poliakrylamidowym i techniką immunoblottingu przy użyciu przeciwciał monoklonalnych anty-ludzka-sod. Przykład II. Synteza antygenu C 100 HCV Antygen C 100 HCV zawiera sekwencję domeny NS3 i NS4. Szczegółowo, obejmuje aminokwasy od 1569 do 1931 na rysunku 1. Antygen ten wytwarza się w drożdżach. Wytwarza się cdna wielkości 1270 bp kodujący powyższe aminokwasy i mający końce EcoRI. Konstrukcję drożdżowego wektora ekspresyjnego, w którym ten fragment jest bezpośrednio włączony w promotor ADH2/GAP S. cerevisiae uzyskuje się według procedury obejmującej amplifikację sekwencji C 100 przy użyciu techniki PCR, włączenie namnożonej sekwencji w wektor do klonowania. Po klonowaniu sekwencję C 100 wycina się i razem z sekwencją zawierającą promotor ADH2/GAP włącza do dużego fragmentu wektora drożdżowego w celu otrzymania

15 drożdżowego wektora ekspresyjnego. Amplikacja C 100 techniką PCR prowadzi się przy użyciu jako matrycy wektora ps3-56cl10m., który trawiono restryktazą Sali w celu linearyzacji. ps3-56, który jest pochodnym pbr322, zawiera blok ekspresyjny złożony z hybrydowego promotora drożdży dadh2/gapdh powyżej genu ludzkiej dysmutazy ponadtlenkowej w kierunku transkrypcji i poniżej w kierunku transkrypcji terminator transkrypcji czynnika alfa. Primery oligonukleotydowe używane do amplikacji zaprojektowano dla ułatwienia klonowania do wektora ekspresyjnego i wprowadzenia kodonu terminatora transkrypcji. Szczegółowo, przy użyciu oligonukleotydów z PCR wprowadzono nowe miejsce 5' i 3' rozpoznawane odpowiednio przez restryktazy HindIII i SalI. Oligonukleotydy kodujące miejsca rozpoznawane przez restryktazę Sali kodują także dwa kodony terminalne, TAA i TGA. Oligonukleotydy kodujące miejsce rozpoznawane przez restryktazę HindIII kodują także nieulegającą translacji sekwencję lidera genu pga63, znajdującą się powyżej kodonu AUG zgodnie z kierunkiem transkrypcji. Gen prco63gapdh jest opisany przez Hollanda i Hollanda (1980) i Kniskerna i wsp. (1986). Sekwencja primerów PCR używanych do bezpośredniej ekspresji C100m była następująca: 5' GAG TGC TCA AGC TTC AAA ACA AAA TGG CTC ACT TTC TAT CCC AGA CAA AGC AGA GT 3' (sekw. nr ident. 3) i 5' GAG TGC TCG TCG ACT CAT TAG GGG GAA ACA TGG TTC CCC CGG GAG GCG AA 3' (sekw. nr ident. 4) Amplikację techniką PCR prowadzi się według instrukcji producenta przy użyciu prim er ów i matrycy z zestawu PCR firmy Cetus-Perkin-Elmer. Warunki PCR były następujące 29 cykli 94 C przez minutę, 37 C przez 2 minuty, 72 C przez 3 minuty i końcowa inkubacja w 72 C przez 10 minut. DNA przechowywano przez noc w temperaturze 4 C lub -20 C. Po amplifikacji produkty PCR trawi się restryktazami H indlll i Sali. Główny produkt wielkości 1,1 kb oczyszcza się przez elektroforezę na żelu, a oczyszczony fragment łączy się z dużym fragmentem SalI-HindIII plazmidu pbr322. W celu wyizolowania właściwego fragmentu, kompetentne komórki HB101 transformuje się zrekombinowanym wektorem, a po klonowaniu pożądany rekombinant identyfikuje się na podstawie znanej wielkości wyciętych z klonów fragmentów HindIII-SalI. Klon zawierający fragment HindIII-SalI o właściwej wielkości nazwano pbr322/c100-d. Bezpośrednia analiza sekwencji fragmentu HindIII-SalI potwierdziła, że ten klon zawiera namnożony C 100. Wektor ekspresyjny zawierający C100 otrzymano przez połączenie fragmentu HindIII-SalI z pbr322/c 100-d z 13,1 kb fragmentem BamHI-SalI plazmidu pbs24,1 i 1369 bp fragmentem BamHI-HindIII zawierającym promotor ADH2/GAP. (Drugi fragment opisany jest w EPO ). Wektor pbs24.1 opisany je s t w U.S.S.N złożonym 19 lipca Fragment pro motorowy ADH2/GAP uzyskano przez trawienie wektora ppgap/ag/hindiii restryktazami HindIII i BamHI, a następnie oczyszczenie na żelu fragmentu 1369 bp. Kompetentne komórki HB101 transformuje się zrekombinowanym wektorem, a właściwe rekombinanty identyfikuje się przez trawienie klonowanych wektorów restryktazami BamHI i Sali na fragmenty 2464 bp i 13,2 kb. Jeden z właściwe klonowanych zrekombinowanych wektorów nazwano pc100-d#3. W celu otrzymania C 100, kompetentne komórki Saccharomyces cerevisiae szczep AB 122 (MATA leu2 ura3-53 prb pep4-3 prcl-407[cir-0]) transformuje się wektorem ekspresyjnym pc 100-d#3. Transformowane komórki wysiewa się na URA-sorbitol, a pojedyncze transfo rmanty pasażuje na płytki Leu'. Pojedyncze klony hoduje się w podłożu Leu-, ura- z dodatkiem 2% glukozy w temperaturze 30 C przez godzin. Następnie, jeden litr Yeast Extract Peptone Medium (YEP) zawierający 2% glukozy inkuluje się 10 ml całonocnej hodowli, a powstałą hodowlę hoduje się przez 48 godzin w temperaturze 30 C z wytrząsaniem z szybkością400 obrotów/minutę i współczynnikiem natlenienia 1 litr powietrza na 1 litr hodowli na minutę (to znaczy, 1 w m ). ph hodowli nie kontrolowano. Hodowlę prowadzono w fermentorze BioFlo II wykonanym przez firmę New Brunswick Science Corp. Po fermentacji, komórki izolowano i testowano pod kątem ekspresji C 100.

16 Analizę wytworzonych przez transformowane komórki polipeptydów C 100 prowadzono na pełnym lizacie drożdży i surowym ekstrakcie z pojedynczej kolonii drożdży, otrzymanej z płytki Lue-. Lizaty komórkowe i surowy ekstrakt badano elektroforetycznie na SDS żelu poliakrylamidowym i techniką Western blotting. Jako sondy w Western blotting używa się poliklonal nych przeciwciał królika przeciw polipeptydowi SOD-C100, wytworzonemu przez drożdże. Przewidywana wielkość polipeptydu C 100 wynosi 364 aminokwasy. Z analizy na żelu wynika, że wytworzony polipeptyd ma wielkość MWr 39,9 K. Obie metody analizy wykazały, że wytworzony polipeptyd C 100 jest obecny w pełnym lizacie drożdży, ale nie ma go w surowym ekstrakcie. Wyniki te wskazują, że wytworzony polipeptyd C 100 może być nierozpuszczalny. Przykład III. Ekspresja antygenu S2 HCV Antygen S2 HCV zawiera sekwencję z hydrofobowego N-końca domeny S. Obejmuje ona aminokwasy od 199 do 328 na rysunku 1. Procedura otrzymywania wektora ekspresyjnego kodującego polipeptyd S2 i jego ekspresji w drożdżach jest analogiczna do użytej do ekspresji polipeptydu C100 i opisanej w przykładzie 2. Matrycą reakcji PCR był wektor pbr322/pi 14a, który trawiono restryktazą HindIII w celu linearyzacji. P i14a jest klonem cdna kodującym aminokwasy Sekwencja oligonukleotydów użytych jako primery do amplifikacji sekwencji kodującej S2 techniką PCR była następująca. Dla regionu-5' sekwencji S2. 5' GAG TGC TCA AGC TTC AAA ACA AAA TGG GGC TCT ACC ACG TCA CCA ATG ATT GCC CTA AC 3' dla regionu-3' sekwencji S2. 5' GAG TGC TCG TCG ACT CAT TAA GGG GAC CAG TTC ATC ATC ATA TCC CAT GCC AT 3'. Primer dla regionu-5' wprowadza do zwielokrotnionego produktu miejsce rozpoznawane przez restryktazę HindIII i kodon startowy ATG. Primer dla regionu-3' wprowadza do zwielokrotnionego produktu miejsce rozpoznawane przez restryktazę Sali i kodon terminacji transkrypcji. Warunki PCR były następujące 29 cykli 94 C przez minutę, 37 C przez 2 minuty, 72 C przez 3 minuty i końcowa inkubacja w 72 C przez 10 minut. Głównym produktem reakcji PCR był fragment wielkości 413 bp, który oczyszczono na żelu. Oczyszczony fragment łączy się z dużym fragmentem SalI-HindIII, otrzymanym przez trawienie plazmidu pbr322 i otrzymuje plazmid pbr322/s2d. Połączenie fragmentu HindIII-SalI S2 wielkości 413 bp z dużym fragmentem BamHI-SalI plazmidu pbs24.1 i 1.36 kp fragmentem BamHI-HindIII zawierającym promotor ADH2/GAP daje zrekombinowany wektor, który się klonuje. Właściwe zrekombinowane wektory identyfikuje się dzięki obecności 1,77 kb fragmentu po trawieniu restryktazami BamHI i SalI. Wektor ekspresyjny złożony ze zwielokrotnionej sekwencji, zawierający sekwencję kodującą S2 połączoną bezpośrednio z promotorem ADH2/GAP nazwano ps2d#9. Przykład IV. Synteza antygenu C HCV Antygen C HCV zawiera sekwencję domeny C. Obejmuje ona aminokwasy na rysunku 1. Procedura otrzymywania wektora ekspresyjnego kodującego polipeptyd C i jego ekspresję w drożdżach jest analogiczna do użytej ekspresji polipeptydu C 100 i opisanej poprzednio, oprócz następującego. Matrycą reakcji PCR był wektor pbr322/ap30a, który trawiono restryktazą HindIII w celu linearyzacji. Ag30a jest klonem cdna kodującym aminokwasy Sekwencja oligonukleotydów użytych jako primiery do amplifikacji sekwencji kodującej C techniką PCR była następująca. Dla regionu 5' sekwencji C: 5' GAG TGC AGC TTC AAA ACA AAA TGA GCA CGA ATA CTA AAC CTC AAA AAA AAA AC 3' (sekw. nr ident. 7) dla regionu-3' sekwencji C:

17 ' GAG TGC TCG TCG ACT CAT TAA CCC AAA TTG CGC GAC CTA CGC CGG GGG TCT GT 3' (sekw. nr ident. 8). Primer dla regionu-5' wprowadza do zwielokrotnionego produktu miejsce rozpoznawane przez restryktazę HindIII, a primer dla regionu-3' wprowadza miejsce rozpoznawane przez re stryktazę SalI i kondon terminacji translacji. Warunki PCR były następujące 29 cykli 94 C przez minutę, 37 C przez 2 minuty, 72 C przez 3 minuty i końcowa inkubacja w 72 C przez 10 minut. Głównym produktem reakcji PCR był fragment wielkości 381 bp. Połączenie tego fragmentu z dużym fragmentem SalI-HmdIII plazmidu pbr322, daje plazmid pbr322/c2. Połączenie fragmentu HindIII-SalI C wielkości 381 bp. kodującego fragment wycięty z pbr322/c2, z dużym fragmentem BamHI-SalI plazmidu pbs24.1 i 1.36 kp fragmentem BamHI-HindIII zawierającym promotor ADH2/GAP daje zrekombinowany wektor, który się klonuje. Właściwe zrekombinowane wektory identyfikuje się dzięki obecności 1,74 kb fragmentu po trawieniu restryktazami BamHI i SalI. Wektor ekspresyjny złożony ze zwielokrotnionej sekwencji, zawierający sekwencję kodującą C połączoną bezpośrednio z promotorem ADH2/GAP nazwano pc22. Analizę wytworzonych przez transformowane komórki polipeptydów C prowadzono na pełnym lizacie drożdży i surowym ekstrakcie z pojedynczej kolonii drożdży, otrzymanej z płytki Lue-. Lizaty komórkowe i surowy ekstrakt badano elektroforetycznie na SDS żelu poliakrylamidowym. Przewidywana wielkość polipeptydu C wynosi 122 aminokwasy a z analizy na żelu wynika, że wytworzony polipeptyd ma wielkość MW około 13,6 Kd. Przykład V. Synteza polipeptydu NS5 Ten polipeptyd zawiera sekwencję z N-końca domeny NS5. Szczegółowo, obejmuje ona aminokwasy od 2054 do 2464 na rysunku 1. Procedura otrzymywania wektora ekspresyjnego kodującego polipeptydns5 i jego ekspresji w drożdżach jest analogiczna do użytej do ekspresji polipeptydu C33c (patrz przykład 1). Przykład VI. Test radioimmunologiczny (RIA) dla przeciwciał przeciw HCV Antygeny HCV z przykładów 1-5 badano w teście postaci RIA pod kątem ich zdolności do wykrywania przeciwciał przeciw HCV w surowicy pacjentów, u których w surowicy stwierdzono klinicznie obecność HCV (nie-a i nie-b) i w surowicy krwi od płatnych dawców krwi. Test RIA oparto na procesurze opisanej przez Tsu i Herzenberga (1980) w SELECTED METHODS IN CELLULAR IMMUNOLOGY (W.H. Freeman & CO.), strony Ogólnie, mikropłytki (Immulon 2, Removawell Strips) opłaszcza się oczyszczonym antygenem HCV. Opłaszczone płytki inkubuje się z próbkami surowicy i odpowiednimi kontrolami. W czasie inkubacji przeciwciała, jeśli są obecne, wiążą się immunologicznie z antygenem na nośniku. Po usunięciu niezwiązanego materiału i przemyciu mikropłytek, kompleksy ludzkie przeciwciałantygen NANBV wykrywa się przez inkubację ze znacznymi I 125 przeciwciałami anty-człowiek owcy. Niezwiązane znaczone przeciwciała usuwa się przez wysysanie, a płytki przemywa. Następnie określa się radioaktywność pojedynczych studzienek, ilość związanych ludzkich przeciwciał anty-hcv jest proporcjonalna do radioaktywności studzienek. Szczegółowo, do stu studzienek (Immulon 2, Removawell Strips) dodaje się mikrolitrowe próbki zawierające od 0,1 dp 0,5 mikrogramów antygenu HCV w 0,125 M buforze boranowym, ph 8,3, 0,075 M NaCl (BBS). Płytki inkubuje się przez noc w temperaturze 4 C w termostacie o stałej wilgotności, a następnie roztwór antygenu usuwa się, a mikropłytki trzy razy przemywa BBS zawierającym 0,02% Triton X-100 (BBST). Aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu przeciwciał, studzienki opłaszcza się albuminą surowicy bydlęcej (BSA) przez dodanie 100 mikrolitrów 5 mg/ml roztworu BSA w BBS i inkubację przez 1 godzinę, po inkubacji roztwór BSA usuwa się. Reakcję antygenów w opłaszczonych studzienkach prowadzi się przez dodanie 100 mikrolitrów próbki surowicy rozcieńczonej 1:100 0,01 M buforem fosforanowym, ph 7,2 0,15 M NaCl (PBS) zawierającym 10 mg/ml BSA i inkubację studzienek zawierających surowicę przez 1 godzinę, w temperaturze 37 C. Po inkubacji próbki surowicy usuwa się przez odsysanie, a studzienki 5 razy przemywa BBST. Ilość związanych z antygenem przeciwciał określa się przez wiązanie z opłasz czonymi studzienkami znaczonych I125 F (ab)2 anty-człowiek IgG owcy. Do każdej studzienki dodaje się 100 mikrolitrów znaczonej sondy (aktywność właściwa 5-20 mikrocurie/mikrogram),

18 płytki inkubuje się przez 1 godzinę w temperaturze 37 C, następnie usuwa nadmiar sondy przez wysysanie i przemywa 5 razy BBST. Radioaktywność każdej studzienki określa się w liczniku zliczającym radioaktywność gamma. Tabela 1 przedstawia wyniki testów na surowicy pacjentów, u których stwierdzono HCV. Tabela 1 Pacjent Antygen S2 C22 C100 C33c NS C V H IVDA P P P(+++) P P C V H IVDA P P P(+) P P CVH IVDA P P P(+) P P CVH NOS P P P P P AVH NOS HS N N N N N AVH NOS HS P N N N N AVH NOS HS P N N N N AVH NOS HS P/N N N N N A VH PTVH N N N P/N N AVH NOS HS N N N N N AVH NOS N N N N P A V H PTVH N N N N N AVH IVDA N P N P P AVH PTVH P P/N N N P AVH NOS N P N N N AVH IVDA N P N P P AVH NOS HS P/N N N N N AVH PTVH N N N N N C V H IVDA P P P P P CVH IVDA P P P P P AVH NOS HS N N N N N CVH PTVH P P N N N AVH PTVH P N P(+) P(+++) N CVH PTVH N P P P P CVH NOS HS P P P P N AVH NOS N P P/N P P CVH IVDA N N N P N AVH IVDA P P P P P AVH IVDA P P P P P CVH IVDA P P P P P AVH IVDA P/N P N P P

19 AVH IVDA N P P P N CVH NOS N N N N N CVH NOS N N N N N CVH IVDA P P P P P AVH IVDA P P P P P CVH PTVH P P P P P A V H P TVH N P P P P AVH IVDA N P N P N AVH NOS N N N N N AVH NOS N N N N N CVH NOS N P N N P CVH NOS P P N N N CVH NOS HS P P P P P C V H PTVH P P N P P AVH pielęgniarka P P N N N AVH IVDA P P P P N AVH IVDA N P P(+) P(+++) N AVH pielęgniarka P/N P N N N A V H PTHV P/N P P N P AVH NOS N P/N N N P AVH NOS N P N P N A V H PTHV P P/N N N N AVH PTHV N P N P P AVH PTHV P P P P P AVH PTHV N P N N P C V H PTHV P/N P P(+) P(+++) N A V H PTHV N P/N P(+) P(+++) P AVH PTHV P (?) P N P CVH PTHV N P N P P CVH PTHV N P P P P CVH PTHV N N N N N AVH NOS N N N N N AVH pielęgniarka P P N N N CVH PTHV N P N N P AVH IVDA N P N P/N N CVH PTHV P P P(+) P(+++) P AVH NOS P P N N N AVH NOS P/N P N N P

20 AVH PTHV P/N P P P P AVH NOS N P P P P/N AVH IVDA N P N N P AVH NOS N P/N N N N AVH NOS P P N N P AVH PTHV N P P P P krypto P P P P P CVH NOS N P P P P CVH NOS N N N N N AVH PTHV N P P(+) P(++) N AVH PTHV N P/N P(+) P(++) P AVH PTHV N P/N P(+) P(++) P CVH IVDA P P P P P CVH IVDA P P P P P CVH IVDA P P P P P CVH IVDA P P P P P AVH NOS N P N N N CVH IVDA P P P P P/N AVH IVDA P P P P N AVH NOS P P N N N AVH NOS P P N N N CVH PTHV P P N N P/N AVH PTHV N P N P P AVH NOS N N N N N AVH NOS N P N N N AVH NOS P N N N N CVH NOS N N N N N AVH NOS N P/N N N N AVH IVDA N P P P P krypto N P N N P/N krypto P P P/N P P AVH IVDA N N P P N AVH IVDA N P P P N AVH NOS N N N N N AVH NOS N N N N N C V H IVDA P P P P P CVH PTHV N N N N N CVH PTHV P P P(+) P(+++) P