JOANNA MIEDZIANKA WŁAŚCIWOŚCI FUNKCJONALNE BIAŁKA ZIEMNIACZANEGO PODDANEGO MODYFIKACJI CHEMICZNEJ Praca doktorska wykonana pod kierunkiem dr hab. Anny Pęksy, prof. UP w Katedrze Technologii Rolnej i Przechowalnictwa Wydziału Nauk o Żywności Uniwersytetu Przyrodniczego we Wrocławiu WROCŁAW 2011
Myślę, że nie ma naprawdę takiej rzeczy, którą nazywamy nauką. Jest tylko wiedza [ ], to atman, który jest w tobie i we mnie i w każdym istnieniu. I dochodzę do przekonania, że największym wrogiem tej wiedzy jest wola wiedzy, że najgorsze, co możemy zrobić, aby ją posiąść, to uczyć się. Hermann Hesse (Siddhartha) Pani dr hab. Annie Pęksie, prof. UP Składam serdeczne podziękowania za życzliwość, Wszechstronną pomoc i opiekę naukową Przy wykonywaniu niniejszej pracy Pracę dedykuję Swoim wspaniałym Rodzicom, Za trud wychowania i bezgraniczną pomoc oraz mojemu Mężowi za cierpliwość i wsparcie Dziękuję
STRESZCZENIE Celem badań było określenie wpływu technologii otrzymywania preparatu białka ziemniaczanego oraz warunków jego modyfikacji chemicznej za pomocą bezwodnika kwasu octowego (acetylacji) na skład chemiczny i wybrane właściwości funkcjonalne uzyskanych modyfikatów. Podjęte badania przeprowadzono w czterech etapach. W pierwszym otrzymano izolat zawierający termicznie skoagulowane białko ziemniaczane, a w drugim koncentrat zawierający białko w formie naturalnej stosując kolejno technikę adsorpcji na żywicy jonowymiennej i dializy za pomocą membran celulozowych. W trakcie trzeciego etapu badań prowadzono acetylację białka w otrzymanym izolacie, w zawiesinach o stężeniu 1%, różnymi dawkami bezwodnika kwasu octowego. Kolejne badania polegały na prowadzeniu acetylacji białka zawartego w koncentracie, poddanego koagulacji termicznej z zastosowanie różnych temperatur w roztworach o 1% stężeniu białka, różnymi dawkami bezwodnika kwasu octowego. W otrzymanych preparatach białka ziemniaczanego niemodyfikowanego i modyfikowanego oznaczono skład chemiczny (zawartość suchej substancji, białka właściwego i ogółem, aminokwasów, popiołu całkowitego, składników mineralnych i glikoalkaloidów) oraz wybrane właściwości funkcjonalne, takie jak: wodochłonność, olejochłonność, rozpuszczalność w wodzie destylowanej i w buforach o różnym ph, właściwości emulgujące i pianotwórcze oraz barwę. Ponadto, w preparatach niemodyfikowanych wyznaczono charakterystykę przemian fazowych, a w preparatach acetylowanych oznaczono stopień acetylacji. W koncentracie oraz w izolacie oznaczono frakcje białek ziemniaka stosując elektroforezę w żelu poliakryloamidowym w obecności SDS. Na podstawie wyników przeprowadzonych badań stwierdzono, że skład chemiczny oraz właściwości funkcjonalne i odżywcze acetylowanego białka ziemniaczanego zależały od rodzaju preparatu użytego do modyfikacji, a także od ilości zastosowanego bezwodnika kwasu octowego. Natomiast właściwości modyfikatów otrzymanych z koncentratu zależały również od temperatury koagulacji białka poprzedzającej acetylację. We wszystkich acetylowanych preparatach, zarówno w izolacie, jak i w koncentracie, udział białka właściwego w białku ogółem znacznie przewyższał 90% i wzrastał wraz ze wzrostem dawki odczynnika modyfikującego. Acetylacja izolatu dawkami większymi niż 0,4 cm 3 /g 3
powodowała zmniejszanie się sumy aminokwasów otrzymanych modyfikatów, natomiast preparaty otrzymane z koncentratu charakteryzowały się dużą zawartością, zarówno egzo- jak i endogennych aminokwasów w białku oraz wysoką wartością wskaźnika aminokwasu ograniczającego, niezależnie od dawki. Temperatura koagulacji białka w koncentracie w istotny sposób wpływała na skład chemiczny i właściwości funkcjonalne acetylowanych preparatów, niezależnie od ilości użytego bezwodnika. Większy wpływ na zawartość i udział białka w preparatach, a także na ich skład aminokwasowy miała temperatura koagulacji niż zastosowana dawka bezwodnika. Proces acetylacji w niewielkim stopniu zmieniał te wartości przyczyniając się do nieznacznego zwiększenia udziału białka w preparacie. Acetylowane preparaty białka ziemniaczanego otrzymane w wyniku modyfikacji koncentratu wykazywały korzystniejsze właściwości funkcjonalne, w tym olejochłonność, wodochłonność, rozpuszczalność w wodzie i właściwości emulgujące niż acetylowany izolat. Szczególnie korzystnymi właściwościami charakteryzowały się preparaty otrzymane z koncentratu białka ziemniaczanego koagulowanego przed acetylacją w temperaturze 60 C i acetylowane dawką bezwodnika kwasu octowego w ilości 0,4 cm 3 /g lub 1,0 cm 3 /g. 4
SPIS TREŚCI Streszczenie Spis treści 1. Wstęp 7 1.1. Charakterystyka białka ziemniaczanego 8 1.2 Właściwości funkcjonalne białek 10 1.3 Wykorzystanie preparatów białkowych w produktach żywnościowych 17 1.4 Właściwości funkcjonalne i odżywcze białka ziemniaczanego 18 1.5 Rodzaje i cele modyfikacji białek roślinnych 23 2. Geneza i cel badań 28 3. Metodyka badań 30 3.1 Surowiec 30 3.2 Przebieg doświadczenia 30 3.2.1 Etap I. Otrzymanie izolatu białka ziemniaczanego 30 3.2.2 Etap II. Otrzymanie koncentratu białka ziemniaczanego 33 3.2.3 Etap III. Otrzymanie modyfikowanego izolatu białka ziemniaczanego 35 3.2.4 Etap IV. Otrzymanie modyfikowanego koncentratu białka ziemniaczanego 37 3.3 Metody analiz 39 3.3.1 Oznaczenie zawartości suchej substancji 39 3.3.2 Oznaczenie zawartości azotu ogółem 39 3.3.3 Oznaczenie zawartości białka ogółem 39 3.3.4 Oznaczenie zawartości azotu białkowego 39 3.3.5 Oznaczenie zawartości białka właściwego 39 3.3.6 Obliczenie zawartości białka właściwego w białku ogółem 40 3.3.7 Oznaczenie zawartości popiołu całkowitego 40 3.3.8 Oznaczenie zawartości makro- i mikroelementów 40 3.3.9 Oznaczenie zawartości aminokwasów 40 3.3.10 Oznaczenie zawartości glikoalkaloidów 41 3.3.11 Oznaczenie charakterystyki przemian fazowych 41 5
3.3.12 Elektroforeza w żelu poliakryloamidowym w obecności SDS i β- merkaptoetanolu 42 3.3.13 Oznaczenie zawartości wodochłonności 42 3.3.14 Oznaczenie zawartości olejochłonności 42 3.3.15 Oznaczenie wskaźnika rozpuszczalności substancji azotowych 43 3.3.16 Oznaczenie aktywności emulgowania 43 3.3.17 Oznaczenie trwałości emulsji 44 3.3.18 Oznaczenie wydajności pienienia i trwałości piany 44 3.3.19 Oznaczenie barwy metodą obiektywną 45 3.3.20 Oznaczenie stopnia acetylacji 45 3.3.21 Wyznaczenie wydajności modyfikatów 45 3.4 Sposób przedstawienia wyników 46 4. Omówienie wyników 47 4.1 Charakterystyka surowców użytych do badań 47 4.2 Właściwości preparatów acetylowanego białka ziemniaczanego otrzymanych z izolatu 49 4.3 Właściwości preparatów acetylowanego białka ziemniaczanego otrzymanych z koncentratu 53 4.3.1 Wpływ dawki bezwodnika kwasu octowego na właściwości preparatów otrzymanych z koncentratu 53 4.3.2 Wpływ temperatury koagulacji białka ziemniaczanego w koncentracie przed acetylacją na właściwości otrzymanych preparatów 57 5. Dyskusja wyników 62 5.1 Charakterystyka preparatów białka ziemniaczanego użytych do modyfikacji chemicznej 62 5.2 Właściwości acetylowanych preparatów białka ziemniaczanego 69 6. Wnioski 81 7. Literatura 83 Spis tabel 96 Spis rysunków 99 Aneks I 6
1. WSTĘP Nierozcieńczony sok ziemniaczany zawierający około 5% s.s., będący produktem odpadowym w przemyśle krochmalniczym, zawiera cenne pod względem żywieniowym białko w ilościach uzasadniających jego izolację (około 30% s.s. soku). Uzyskiwane w przemyśle krochmalniczym suche białko paszowe, zawierające około 80% zdenaturowanego białka, ze względu na korzystny skład chemiczny i aminokwasowy stanowi poszukiwany składnik pasz. Odzyskiwane z odpadu produkcyjnego, jakim jest sok ziemniaczany, w warunkach gwarantujących maksymalną wydajność przy minimalnych kosztach, wykazuje niekorzystne właściwości funkcjonalne z powodu daleko posuniętej denaturacji. Dlatego też jedynym kierunkiem jego zużytkowania jest przeznaczenie do produkcji pasz. Roczna produkcja takiego preparatu w Polsce sięga 10 tys. ton. Stosowane w przemyśle spożywczym preparaty białkowe charakteryzują się odpowiednią funkcjonalnością, tj. nadają produktom spożywczym produkowanym z ich udziałem korzystne cechy fizykochemiczne i organoleptyczne. Pomimo znacznych kosztów uzyskania preparatów białka ziemniaczanego o takich cechach, związanych z wykorzystaniem drogich technik koncentracji czy też energii cieplej niezbędnej, tak w procesie izolacji, jak i suszenia, podejmowane są przez niektóre firmy prace badawcze i wdrożeniowe, których efektem jest wprowadzenie na rynek preparatów białka ziemniaczanego, takich jak np. Beverisch 303L określanego jako dobry aminokwas dla sportowców oraz DarinQ zastępujący białka mleka w lodach. Na podstawie decyzji komisji Parlamentu Europejskiego preparaty te stanowią nowy składnik produktów spożywczych [23]. Modyfikacja chemiczna preparatów białka ziemniaczanego, podobnie jak wielu innych białek roślinnych może znacznie poszerzyć spektrum ich wykorzystania zarówno w produkcji żywności, jak i do celów niespożywczych. 7
1.1 Charakterystyka białka ziemniaczanego Ziemniak zawiera około 2% związków azotowych, z czego 35-65% stanowią azotowe związki białkowe określane mianem białka właściwego, tj. białka ulegającego strąceniu pod wpływem różnych czynników denaturujących, m.in. kwasu trichlorooctowego. Do pozostałych związków azotowych zalicza się: wolne aminokwasy (15%), azot amidowy połączony z asparaginą i glutaminą (23%) i azot niebiałkowy połączony z glikoalkaloidami, α - solaniną i α - chakoniną oraz drugorzędnymi metabolitami, takimi jak np.: acetylocholina, adenina, kadaweryna czy guanina (12%) [31, 85, 109, 111]. Białko otrzymywane w przemyśle krochmalniczym z soku ziemniaczanego jest wartościowym składnikiem pasz ze względu na zawarte w nim aminokwasy egzogenne, w tym z rozgałęzionymi łańcuchami bocznymi, jak: izoleucyna, leucyny i walina oraz aromatycznymi, jak fenyloalanina i tyrozyna [130, 154]. Aminokwasy występujące w białku ziemniaka posiadają korzystne, jak i niekorzystne oddziaływanie fizjologiczne. Do korzystnych aminokwasów zalicza się np.: argininę, glutaminę, histydynę, lizynę, tyrozynę i tryptofan [66]. Białko ziemniaka jest dobrym źródłem lizyny, kwasu asparaginowego i glutaminowego, leucyny oraz treoniny. Ze względu na wysoką zawartość lizyny białko ziemniaczane może być dobrym dodatkiem do produktów zbożowych ubogich w ten aminokwas [111, 154]. Badania różnych autorów [18, 52, 60, 85, 91, 97, 111] wykazały, że białko ziemniaczane zawiera wszystkie aminokwasy egzogenne i jako jedno z nielicznych białek roślinnych swą wartością biologiczną odpowiada wartości białka zwierzęcego. Wartość biologiczna większości frakcji białka ziemniaka jest porównywalna ze standardem FAO [129], za wyjątkiem prolamin obecnych w ziemniaku w śladowych ilościach [31, 52, 60, 91, 131]. Za aminokwasy ograniczające uważane są przez niektórych autorów [31, 52, 89, 131, 154] aminokwasy siarkowe: metionina i cysteina, oraz izoleucyna. Białko ziemniaka składa się z wielu frakcji różniących się masą cząsteczkową, strukturą, cechami fizycznymi, jak np. rozpuszczalnością, oraz właściwościami biologicznymi. Nierozpuszczalne frakcje stanowiące około 25% białek ziemniaka są obecne w ścianach komórkowych, a także w postaci krystalicznej, w soku komórkowych. W ich składzie oprócz białka znajdują się śladowe ilości (5-10%) kwasu rybonukleinowego i jonów żelaza [18, 109, 138]. 8
Rozpuszczalne frakcje białek ziemniaka stanowią około 75-80%. W ich skład wchodzą głównie białka globularne (40%). W zależności od rozpuszczalności w różnych rozpuszczalnikach wśród tych białek wyróżniono: albuminy rozpuszczalne w wodzie i rozcieńczonych roztworach soli występujące w ilościach 50-60%, globuliny rozpuszczalne w rozcieńczonych roztworach soli stanowiące 25-16% białek rozpuszczalnych, prolaminy - frakcje białek występujące w ilościach 2-4% rozpuszczalne w alkoholach oraz gluteliny rozpuszczalne w rozcieńczonych zasadach występujące w ilości około 9%. Pozostałe 9% rozpuszczalnych białek ziemniaka stanowią frakcje o zróżnicowanym składzie chemicznym, budowie i oddziaływaniu fizjologicznym, określane jako białka resztkowe (residue proteins) [5, 52, 86, 109, 111, 127, 128]. Mieszanina albumin i globulin stanowi główną grupę rozpuszczalnych białek globularnych, i określana jest mianem patatyna (tuberyna). Jej masa cząsteczkowa wynosi około 44 kda [52, 121, 124, 127]. Pierwszymi naukowcami, którzy wprowadzili nazwę tuberyna dla frakcji białek ziemniaka rozpuszczalnych w wodzie i roztworach soli byli Osborne i Campbell (1896) [31]. Wyizolowali oni tuberynę z koncentratu otrzymanego po 14 dniach dializowania soku ziemniaczanego w wodzie [124]. Natomiast nazwę patatyna wprowadzili Racusen i in. [124, 125] od hiszpańskiego słowa patata jako określenie białka rozpuszczalnego w 10% roztworze chlorku sodowego, z którego może być ono wytrącone zarówno dużym stężeniem soli kuchennej (poprzez wysolenie), jak i przez oddzielenie soli z roztworu białka drogą dializy (odsolenie), jak również poprzez ogrzewanie roztworu do temperatury 60-80 C [147]. Patatyna (tuberyna) często występuje pod postacią dimerów o masie cząsteczkowej 88 kda, które mogą być zdysocjowane do monomerów o masie cząsteczkowej 44 kda, za pomocą soli sodowej siarczanu dodecylu. Białka te są białkami zapasowymi, które w stanie naturalnym wykazują aktywność enzymatyczną (aktywność acylohydrolazy i esterazy w stosunku do różnych związków lipidowych oraz aktywność ß - 1,3 - glukanazy) [111, 121, 122, 127, 139]. Wyizolowana patatyna posiada dobre właściwości emulsyjne i pianotwórcze [33]. Wykazuje ponadto właściwości alergizujące zanikające pod wpływem ogrzewania. Według Ralet i Guéguen [127] około 30-40% rozpuszczalnych białek ziemniaka stanowią białka o masie cząsteczkowej 22 kda. Pozostałą część stanowią frakcje o masie cząsteczkowej od 5 kda do 25 kda, z których większość to inhibitory enzymów proteolitycznych [121, 156]. Wyodrębniono wśród nich siedem grup: inhibitory ziemniaka I (PI-1), inhibitory ziemniaka II (PI-2), inhibitory proteaz: cystatyna ziemniaka (PCPI), 9
aspartaza ziemniaka (PAPI), karboksypeptydaza ziemniaka (PCI) i inne serynowe inhibitory proteaz. Inhibitory proteaz białka ziemniaczanego wykazują szerokie spektrum inhibicji enzymów. Wszystkie grupy (za wyjątkiem PCI) hamują działanie trypsyny i/lub chymotrypsyny [80]. Niektóre z nich są odporne na działanie wysokiej temperatury, dzięki czemu mogą hamować proteolizę białek, ograniczając ich wykorzystanie w organizmie. Ponadto są niedegradowane i inaktywowane przez pepsynę [111]. Ze względu na różnice w budowie i właściwościach białka te są stosowane do identyfikacji, i klasyfikacji nowych odmian ziemniaka [107]. Inhibitory proteaz mogą być używane w przemyśle farmaceutycznym jako lek przeciw otyłości oraz jako składnik kosmetyków [33]. Biorąc pod uwagę rozpuszczalność białek ziemniaka w kwasach można je podzielić na białka: rozpuszczalne w ph=3 - o niskiej masie cząsteczkowej (<25 kda), wytrącalne w niskim ph - o wysokiej masie cząsteczkowej (32-87 kda) [89]. Oba rodzaje tych białek różnią się pod względem powinowactwa do katody i anody (elektroujemności), a tym samym dzieli się je na kwaśne, obojętne i zasadowe. Taki podział białek ma znaczenie praktyczne, ponieważ umożliwia rozdział frakcji wykazujących znaczne zróżnicowanie, a tym samym otrzymanie preparatów o określonych właściwościach. 1.2 Właściwości funkcjonalne białek Właściwości funkcjonalne to zespół czynników fizykochemicznych, biochemicznych oraz mechanicznych oddziałujących na produkt w procesie technologicznym, kształtujących jego stan finalny [53, 55, 168]. Sikorski [142] definiuje właściwości funkcjonalne białek jako te, dzięki którym w produkcie żywnościowym zawierającym białka w odpowiednich ilościach, poddanym obróbce przy optymalnych parametrach, wytwarzają się pożądane cechy sensoryczne. Jednak ze względu na różnorodność funkcji jakie pełnią, jedną definicją nie można opisać wszystkich właściwości funkcjonalnych. Pojęcie to najczęściej odnosi się do biopolimerów (tj. polipeptydów, cukrowców, tłuszczowców) oraz układów mieszanin, a także uwzględnia interakcje zachodzące pomiędzy nimi [152]. Właściwości funkcjonalne wynikają z oddziaływań: białko - białko, białko - sacharydy, białko - tłuszcze i białko - granica faz. Są one odzwierciedleniem naturalnych cech cząsteczki białka [82]. Według Damodaran i wsp. [26] na właściwości funkcjonalne białek mają wpływ rozmiar i kształt cząsteczek, skład i sekwencja aminokwasów, rozmieszczenie ładunków, hydrofobowość, hydrofilowość, 10
struktura (drugorzędowa, trzeciorzędowa i czwartorzędowa) oraz interakcje białek z innymi składnikami żywności (węglowodanami i tłuszczami) [26, 99]. Właściwości funkcjonalne preparatów białkowych zależą przede wszystkim od pochodzenia białka oraz warunków procesu jego otrzymywania wpływających na stopień denaturacji tj. ph, temperatury, siły jonowej i potencjału oksydoredukcyjnego środowiska [168]. Badania różnych autorów [65, 99] wykazały, iż konformacja cząsteczki i jej zdolność do hydratacji, żelifikacji, rozpuszczania i denaturacji zależy od ilości aminokwasów niepolarnych, tj. leucyny, waliny, izoleucyny, alaniny, proliny, fenyloalaniny, tryptofanu, tyrozyny i metioniny. Białka o dużej zawartości aminokwasów hydrofobowych charakteryzują się dobrymi właściwościami funkcjonalnymi (np. białko jaja kurzego). Na strukturę i funkcjonalność białek wpływają także aminokwasy siarkowe (cystyna i cysteina) poprzez interakcję grup sulfhydrylowych i disiarczkowych, jak np. w glutenie. Grupy tiolowe ulegając utlenieniu tworzą wewnątrz- i międzycząsteczkowe mostki disiarczkowe zmieniające strukturę i funkcję pełnione przez białko [28]. Według różnych autorów [28, 57, 82, 99, 102] skład aminokwasowy białek determinuje również właściwości organoleptyczne i antyoksydacyjne produktów gotowych do spożycia, a metody przetwarzania surowców, jak i technologie otrzymywania preparatów białkowych stanowią dodatkową grupę czynników wpływających na właściwości funkcjonalne tych naturalnych polimerów w żywności. Wśród czynników technologicznych największe znaczenie mają rodzaj rozpuszczalnika, intensywność ogrzewania, kwasowość środowiska oraz obecność jonów. Z literatury przedmiotu wynika, że właściwości funkcjonalne białek w preparatach białkowych są ściśle związane ze stopniem ich denaturacji oraz zdolnością do hydratacji [56, 99]. Do istotnych właściwości funkcjonalnych preparatów białkowych należą: rozpuszczalność, wiązanie i zatrzymywanie wody (tzw. wodochłonność), olejochłonność, żelowanie, zdolność do tworzenia i stabilizacji emulsji oraz pian [26, 99, 168]. Preparaty białkowe charakteryzujące się odpowiednimi właściwościami funkcjonalnymi mogą korzystnie modyfikować takie cechy żywności, jak: tekstura, barwa i aromat. Spośród wszystkich właściwości funkcjonalnych preparatów białkowych rozpuszczalność jest najważniejsza, ze względu na jej wpływ na ich wartość biologiczną, aktywność enzymatyczną i zdolność strukturotwórczą [55, 164]. Rozpuszczalność definiuje się jako zdolność danej substancji do tworzenia z innymi substancjami mieszanin jednorodnych pod względem zarówno fizycznym, jak i chemicznym. W przypadku 11
biopolimerów, rozpuszczalność dotyczy wzajemnych interakcji polimer - rozpuszczalnik, którym w produktach żywnościowych jest woda [27]. Zachowanie się cząsteczki białka wobec rozpuszczalnika determinuje hydrofobowość powierzchniowa oraz wypadkowy ładunek elektryczny. Hydrofobowość powierzchniowa jest charakteryzowana przez potencjał elektrostatyczny różnych fragmentów cząsteczki białka, które decydują o jego przestrzennym kształcie oraz zachowaniu wobec polarnych i niepolarnych rozpuszczalników [28]. Białka o dużym ładunku elektrycznym i małej hydrofobowości łatwo rozpuszczają się w wodzie, natomiast bogate w hydrofobowe reszty aminokwasów są rozpuszczalne w fazie organicznej [65]. Na rozpuszczalność preparatów białkowych wpływają: stężenie białka, siła jonowa, temperatura, ph oraz metoda otrzymania preparatu [14, 112]. Białka posiadają najmniejszą rozpuszczalność w obszarze punktu izoelektrycznego, który jest różny zależnie od pochodzenia białek i mieści się w zakresie ph od 4 do 6. W obszarze tym siły elektrostatyczne posiadają minimum energii i mniej wody reaguje z cząsteczkami białka, dochodzi do ich agregacji i wytrącenia z roztworu [43, 112]. W środowisku bardzo kwaśnym lub alkalicznym może dojść do rozfałdowania cząsteczek białkowych i większej ekspozycji grup hydrofobowych, a więc i zmiany rozpuszczalności białek. Ważnym czynnikiem wpływającym na rozpuszczalność białka jest temperatura. Generalnie, rozpuszczalność wzrasta wraz ze wzrostem temperatury pomiędzy 40 C a 50 C. Wyższa temperatura prowadzi do denaturacji molekuł białkowych i zmniejszenia efektu rozpuszczalności poprzez rozwinięcie łańcucha polipeptydowego i licznych interakcji zachodzących między grupami hydrofobowymi aminokwasów [112]. Rozpuszczalność produktów białkowych oznacza się za pomocą wielu metod, w których uwzględnia się: wielkość i wstępne przygotowanie próbki, proporcje masy próbki i rozpuszczalnika, odczyn i siłę jonową rozpuszczalnika, wielokrotność ekstrakcji, możliwość denaturacji powierzchniowej wskutek powstawania piany w czasie homogenizowania próbki, temperaturę i czas ekstrakcji oraz oddziaływanie materiału niebiałkowego [141]. Białka o dobrej rozpuszczalności stosowane w produkcji przetworów mięsnych poprawiają stabilność emulsji, w produkcji pieczywa wpływają niekorzystnie na właściwości glutenu [134]. Wodochłonność, określana jako zdolność białka do zatrzymania wody w sposób fizyczny lub fizykochemiczny bez względu na siły grawitacji czy ogrzewania, jest wspólną właściwością wszystkich białek i produktów białkowych [142]. Właściwość ta jest zależna od składu aminokwasowego, hydrofobowości, ph, temperatury i siły jonowej [26, 99, 132, 134, 12
143]. Natomiast wszystkie czynniki denaturujące strukturę białek zmniejszają wodochłonność, co tłumaczy fakt najmniejszej absorpcji wody w obszarze bliskim punktowi izoelektrycznemu [141]. Białka wykazują zdolność wiązania stosunkowo dużych ilości wody, zależnie od wodorowego wiązania cząsteczek wody z grupami polarnymi łańcuchów białkowych (karboksylowymi, aminowymi, imidazolowymi, karbonylowymi, sulfhydrylowymi i hydroksylowymi). Natomiast wiązanie wody zmniejsza się w wyniku zablokowania grup polarnych np. na skutek amidacji grup karboksylowych [134]. Wodochłonność jest przydatną właściwością hydratacyjną uwodnionych i rozproszonych białek koloidalnych do utrzymywania tekstury oraz struktury lepkich, żelowych i ciastowatych produktów [56]. Zdolność do wiązania wody jest związana z pęcznieniem składników żywnościowych w fazie wodnej, co przyczynia się do interakcji między wodą, białkami, węglowodanami i lipidami. W wyniku uwadniania roślinnych preparatów białkowych porowata struktura produktu białkowego nabiera konsystencji miękkiej, soczystej, podobnej do mięsa. W przypadku niepełnego uwodnienia następuje stwardnienie białka, co nadaje produktowi strukturę ziarnistą [134]. Wodochłonność ma duże znaczenie w przetwórstwie mięsa, ryb i produktów roślinnych, ponieważ zwiększa ich soczystość, poprawia właściwości reologiczne oraz zmniejsza ubytek masy podczas ogrzewania [141]. Zarówno olejochłonność, jak i wodochłonność białek, są podstawowymi właściwościami funkcjonalnymi nadającymi gotowym produktom mięsnym soczystość, teksturę, strukturę i wygląd oraz wpływającymi na ich wydajność [134]. Na absorpcję oleju przez preparat białkowy mają wpływ: koncentracja białka w preparacie, rozmiar i porowatość cząsteczek, dostępność hydrofobowych grup aminokwasowych oraz interakcje białko tłuszcz - węglowodany [56, 134]. Kinsella [56] wyjaśnił mechanizm absorpcji oleju jako fizyczne uwięzienie cząsteczek tłuszczowych. Według niektórych autorów [88, 143, 167] preparaty białkowe charakteryzujące się dobrą zdolnością wiązania oleju zawierają więcej niepolarnych łańcuchów bocznych, dzięki czemu utrzymują tłuszcz przez wiązania asocjacyjne. Olejochłonność jest zazwyczaj wiązana z właściwościami emulgowania tłuszczu, ze względu na jej wpływ na teksturę, jak i inne cechy jakościowe produktów spożywczych, w tym m.in. wiązanie tłuszczu w mięsie czy absorpcję zapachów. Jest ważna zarówno dla podkreślenia smakowitości, jak i wyglądu artykułów spożywczych [134]. Naturalne lub chemicznie modyfikowane kompleksy białkowo 13
- tłuszczowe są funkcjonalnymi składnikami żółtka jaja, mięsa, mleka, zabielaczy do kawy i ciast [167]. Żelowanie roztworów polega na uporządkowaniu agregacji białek, które mogą, ale nie muszą być zdenaturowane. W ten sposób tworzy się struktura trójwymiarowa. Żele są formami pośrednimi pomiędzy cieczą a ciałem stałym. Podczas tworzenia się żelu powstaje matryca białkowa w wyniku zrównoważenia interakcji polimer - polimer i polimer - rozpuszczalnik oraz sił przyciągania i odpychania. Trójwymiarowa matryca pozwala na unieruchomienie w strukturze żelu wody, innych substancji w niej rozpuszczonych i ewentualnie tłuszczów. Istotną rolę w żelowaniu odgrywa strukturalna budowa cząsteczek, a także siły międzycząsteczkowe determinujące interakcje pomiędzy polimerami, stabilizowane wiązaniami wodorowymi. Makromolekuły w procesie żelowania ulegają rozwinięciu, a następnie zmianie konformacji przestrzennej, tworząc usieciowanie. Fragmenty lub grupy niepolarne (hydrofobowe) białek otaczane są uporządkowaną warstwą cząsteczek wody. Kiedy grupy niepolarne zbliżają się do siebie następuje zmniejszenie liczby dostępnych reszt hydrofilowych i w konsekwencji następują zmiany konformacyjne dostarczające termodynamicznej siły napędowej do interakcji hydrofobowych [141, 168]. Uważa się, że przebieg procesu żelowania jest uwarunkowany takimi czynnikami, jak temperatura i czas jej działania, odczyn środowiska, stężenie białka, siła jonowa układu, modyfikacje chemiczne białek oraz ich wzajemne powiązanie [3, 99, 102]. Żelowanie białek ma duże znaczenie w technologii żywności. Żele decydują o profilu tekstury i cechach sensorycznych produktu finalnego, np. żelatyn, jogurtów, rozdrobnionych produktów mięsnych, tofu i ciasta chlebowego [43]. Emulsje to układy dyspersyjne dwóch niemieszających się cieczy, z których najczęściej jedna jest wodą, a druga substancją organiczną. Wyodrębnia się dwa rodzaje dyspersji: olej w wodzie, gdzie fazą ciągłą jest woda, a fazą rozproszoną olej oraz wodę w oleju, w której fazą ciągłą jest olej, a fazą rozproszoną woda. Oba typy emulsji mogą ulegać wzajemnej konwersji w zależności od stopnia zdyspergowania i stosunku proporcjonalnego zdyspergowanych cieczy oraz obecności substancji powierzchniowo czynnych (surfaktantów) decydujących o charakterze fazy rozproszonej. Uzyskanie metastabilnej emulsji z dużą ilością małych kropel fazy zdyspergowanej z dwóch niemieszających się cieczy wymaga dostarczenia do układu znacznej ilości energii (najczęściej mechanicznej). Ze względu na zależność pomiędzy hydrofobowością białka a jego właściwościami emulsyjnymi, 14
powierzchnia błonki międzyfazowej, skierowana ku fazie olejowej powinna wskazywać jak najwyższą hydrofobowość, natomiast od strony skierowanej ku fazie ciągłej - hydrofilność i jonowość [82]. Powierzchniowa niestabilność pomiędzy fazą hydrofobową i hydrofilową prowadzi do agregacji i separacji emulsji. Uzyskanie stabilnej emulsji wymaga dodania do układu stabilizatora - emulgatora [149]. Białka są skuteczne szczególnie w tworzeniu emulsji olej w wodzie [43, 149]. Podczas emulgowania cząsteczki białka są szybko adsorbowane na nowopowstałych powierzchniach kropel powodując zmniejszenie napięcia powierzchniowego i tworząc powłokę ochronną. W konsekwencji białka ułatwiają tworzenie się kropli tłuszczu poprawiając stabilność emulsji i właściwości fizykochemiczne emulsji typu olej w wodzie. Na jakość emulsji wpływają: stężenie i rodzaj białka, w tym skład aminokwasowy i konfiguracja molekuł białkowych, metoda wytworzenia emulsji, rodzaj oleju, temperatura procesu, ph, siła jonowa oraz zasolenie [25, 134, 149]. Ocena emulsji i ich charakterystyka fizykochemiczna oraz technologiczna uwzględnia dwa pojęciach: zdolność do tworzenia emulsji oraz jej stabilizacji. Emulsyjność jest określana jako zdolność roztworu białkowego lub zawiesiny do emulgowania oleju. Stabilność emulsji to zdolność do pozostania w stanie niezmienionym w przedziale czasu [168]. Absorpcja wody i tłuszczu nie wykazuje związku z wydajnością emulgowania. Zależność taką zaobserwowano w obrębie współczynnika rozpuszczalności [88, 134]. Wyniki badań modelowych prowadzonych przez różnych autorów [46, 55] potwierdzają konieczność aktywności preparatów białkowych w tworzeniu i stabilizacji emulsji w produkcji wielu wyrobów spożywczych. Zdolność preparatów białkowych do tworzenia i stabilizowania emulsji ma zasadnicze znaczenie przy wyrobie produktów z drobno rozdrobnionego mięsa, zabielaczy do kawy, mleka, majonezów i sosów majonezowych oraz mrożonych deserów [25, 43, 134, 162]. Piany są dwufazowymi zdyspergowanymi układami koloidalnymi, w których fazę rozproszoną stanowi gaz, a fazę ciągłą ciecz [15]. Są obecne w wielu układach koloidalnych przemysłu spożywczego oraz kosmetycznego [37]. Do utworzenia stabilnej piany, oprócz powietrza i cieczy, niezbędne jest dostarczenie energii surfaktantu tworzącego napięcie międzypowierzchniowe i stabilizującego nowopowstałe pęcherzyki powietrza. Niskocząsteczkowe surfaktanty (np. fosfolipidy, mono- i diglicerydy) są bardziej skuteczne niż wielkocząsteczkowe surfaktanty (np. białka). Pomimo tego, emulsje i piany stabilizowane białkami są bardziej trwałe [26, 99]. Dodatek białka przyczynia się do wzrostu lepkości fazy wodnej i zwiększenia trwałości filmu międzyfazowego oraz wytworzenia stabilnej piany [37, 15
157]. Do czynników wpływających na tworzenie się pian zalicza się: ph roztworu, stężenie białka, ilość dostarczonej energii jak i obecność soli, cukrów oraz tłuszczy [43]. Z badań Holm i Eriksen [46] wynika, iż na rodzaj utworzonej piany wpływa prędkość i czas ubijania, a objętość piany wzrasta stopniowo ze wzrostem szybkości ubijania (2000-3000 rpm). Dłuższe ubijanie piany niż 100 s powoduje spadek szybkości jej tworzenia [157]. Ocena właściwości pian, ich charakterystyka fizykochemiczna i technologiczna uwzględnia dwa pojęcia: pienistość jako zdolność do tworzenia pian oraz ich stabilizację. Zdolność do tworzenia pian (pienistość) określa się na podstawie przyrostu objętości piany w wyniku ubijania i wyraża najczęściej w procentach. Intensywność tworzenia się pęcherzyków powietrza jest uzależniona od: hydrodynamiki układu, lepkości, właściwości powierzchniowych ośrodka wpienianego, rodzaju surfaktantu, jego stężenia i rozpuszczalności oraz od podatności białka na denaturację powierzchniową. W pobliżu punktu izoelektrycznego roztwory białek cechują się największą pienistością. Czynnikiem dodatkowo zwiększającym objętość piany może być chlorek sodu, którego zastosowanie hamuje denaturację powierzchniową białek [76, 102, 126]. Według wielu autorów [27, 46, 127] polepszenie pienistości osiąga się poprzez krótkotrwałe ogrzewanie, kiedy następuje wzrost ilości grup hydrofobowych i zwiększa się zdolność białka do tworzenia agregatów. Zdolność do tworzenia piany ma znaczenie w powstawaniu pożądanych właściwości sensorycznych, np. tekstury chleba, pieczywa cukierniczego, bitej śmietany i lodów [141]. Stabilność pian to wyróżnik określający zdolność utrzymywania maksymalnej objętości w danym przedziale czasu. Rozwinięte łańcuchy polipeptydowe gromadząc się na granicy faz: woda/powietrze współuczestniczą w tworzeniu się stabilnej piany. Obniżają napięcie powierzchniowe, a mając tendencję do koncentrowania się na powierzchni między powietrzem a płynem, stabilizują przestrzeń międzyfazową i zapobiegają w ten sposób pękaniu pęcherzyków powietrza utworzonych w procesie wypienienia [15]. Stabilne piany są zwykle tworzone przy ph bliskiemu punktowi izoelektrycznemu białka, kiedy siły oddziaływań elektrostatycznych są najmniejsze [28]. Wysoka stabilność pian jest wymagana podczas produkcji m.in. bez, ciast i nugatów [39]. 16
1.3 Wykorzystanie preparatów białkowych w produktach żywnościowych Preparaty białkowe o różnym pochodzeniu i właściwościach fizykochemicznych znajdują zastosowanie w produkcji różnorodnych wyrobów spożywczych, a szczególnie w produkcji przetworów mięsnych i garmażeryjnych [134]. Od kilku lat zwiększa się zainteresowanie producentów roślinnymi preparatami białkowymi jako źródłem składników odżywczych kształtujących właściwości funkcjonalne żywności. Preparaty białkowe uzyskuje się z wielu surowców, stanowiących źródło tradycyjne (produkty z nasion soi i innych roślin strączkowych, produkty z mleka, produkty z ryb, gluten pszenny, białka jaja, itp.) oraz z surowców niekonwencjonalnych (organizmy jednokomórkowe, liście, niejadalne części roślin oraz niejadalne produkty poubojowe). Wśród preparatów białkowych wyróżnia się: produkty wysokobiałkowe zawierające około 50% białka (np. grys, mąka sojowa, grochowa, itp.), koncentraty - ponad 65% białka (koncentraty sojowe w proszku, koncentraty serwatkowe, gluten pszenny, itp.) oraz izolaty - ponad 90% białka (izolaty sojowe, izolaty wszystkich białek mleka, białka jaja, itp.) [151]. Po raz pierwszy roślinne preparaty białkowe zastosowano do wyrobu produktów mięsopodobnych w 1907 roku w Stanach Zjednoczonych. Z glutenu pszennego otrzymano produkty przypominające w swym składzie mięso wołowe, cielęce oraz wieprzowe [134]. Roślinne preparaty białkowe są ważne w przemyśle spożywczym ze względu na stosunkowo niską cenę i wysoką zawartość białka. Coraz częściej przedmiotem zainteresowań producentów żywności staje się wykorzystanie produktów odpadowych przemysłu spożywczego do otrzymania m.in. preparatów białkowych. Przetwarzanie odpadów produkcyjnych przyczynia się nie tylko do znacznego zmniejszenia ilości produkowanych ścieków, ale i wpływa korzystnie na właściwości wytwarzanych z ich udziałem produktów [110]. Wszechstronne zastosowanie roślinnych preparatów białkowych zawdzięcza swoją popularność ich zróżnicowanym właściwościom funkcjonalnym [74, 132]. W światowej produkcji roślinnych preparatów białkowych przeważają produkty sojowe (tofu, twaróg sojowy, tempeh, pasta miso, sosy sojowe i mleko sojowe) [151]. Przydatność surowca roślinnego do produkcji preparatów białkowych zależy m.in. od: wartości odżywczej białek, zawartości białka w surowcu, wielkości plonu, łatwości pozyskiwania białka, jak i od uwarunkowań technicznych, ekonomicznych i konsumenckich. Preparaty białkowe mogą być 17
stosowane jako składniki żywności zwiększające udział białka w produkcie, poprawiające jakość i skład wyrobów spożywczych, zmniejszające wartość energetyczną oraz zawartość tłuszczów nasyconych i cholesterolu, a także mogą wpływać na cechy sensoryczne oraz fizykochemiczne produktów [134]. Zarówno koncentraty, jak i izolaty powinny charakteryzować się: łatwą zwilżalnością, tworzeniem przezroczystego roztworu w szerokim zakresie ph, możliwością reagowania z innymi koloidami, tworzeniem żelu, kontrolowanym stopniem absorpcji wody i łatwością jej utrzymania, dobrymi właściwościami emulgującymi, prawidłowym gęstnieniem, odpowiednią plastycznością, adhezyjnością, kohezyjnością i zdolnością tworzenia piany [82]. Preparaty białkowe mogą być dodawane do żywności dzięki funkcjonalnym, odżywczym i ekonomicznym korzyściom. Ich dodatek do produktów spożywczych poprawia emulsyjność, powoduje wzrost lepkości, poprawę wyglądu, smaku i tekstury oraz zdolność wiązania oleju i wody. Za ich stosowaniem w produktach żywnościowych przemawiają również takie cechy jak: obniżenie kaloryczności produktów, wzrost zawartości białka i poprawa składu aminokwasowego [43, 66]. Jednak zastosowanie preparatów białkowych w przemyśle spożywczym jest ograniczone ze względu na ich niestabilność podczas np. ogrzewania [126]. 1.4 Właściwości funkcjonalne i odżywcze białka ziemniaczanego Roślinne preparaty białkowe stosowane w produkcji żywności powinny charakteryzować się nie tylko korzystnym składem chemicznym, ale i dużą wartością odżywczą oraz optymalnymi właściwościami funkcjonalnymi. Badania poświęcone wartości odżywczej białek ziemniaka rozpoczęto już pod koniec lat 50. [31, 32, 47, 52, 96, 131, 154], natomiast właściwościom funkcjonalnym na przełomie lat 70. i 80. XX wieku [46, 52, 60, 61, 62, 63, 72, 93, 97, 155, 156, 159, 169]. Wyniki tych badań wskazują, że białko ziemniaczane zawiera wszystkie aminokwasy egzogenne i jego wartość biologiczna, jako jednego z nielicznych białek roślinnych, jest porównywalna z wartością biologiczną białka zwierzęcego. Właściwości funkcjonalne białek ziemniaka badano określając wpływ metod zastosowanych do jego izolacji z soku ziemniaczanego oraz sposobów utrwalenia preparatów białkowych. Określano takie właściwości funkcjonalne, jak wodochłonność, olejochłonność, rozpuszczalność, emulsyjność oraz pianotwórczość. 18
Zastosowanie podwyższonej temperatury w procesie koagulacji białka wpływa na zmianę właściwości funkcjonalnych tak otrzymanych preparatów. Preparaty białka ziemniaczanego uzyskane przez Knorra oraz Knorra i wsp. [62, 63] w warunkach wysokiej temperatury (około 98 C) i niskiego ph (3-5), charakteryzowały się większą zawartością białka, lepszą olejochłonnością i mniejszą zawartością składników popielnych, ale gorszą rozpuszczalnością w porównaniu do preparatów uzyskanych w temperaturze pokojowej. Niekorzystnymi właściwościami funkcjonalnymi charakteryzowały się także koncentraty białka ziemniaczanego otrzymane przez różnych autorów [49, 61, 62, 63, 121, 127, 147, 156, 159] metodami koagulacji kwasowej oraz kwasowo - termicznej z wykorzystaniem jako substancji denaturujących HCl, H 2 SO 4, FeCl 3, Al 2 (SO 4 ) i C 6 H 8 O 7 oraz temperatury ponad 90 C. Autorzy ci stwierdzili, że daleko posunięta denaturacja białek roślinnych w wyniku zastosowania wyżej wymienionych czynników przyczynia się do pogorszenia rozpuszczalności, wodochłonności i olejochłonności preparatów białkowych. Zauważyli jednak, że pomimo niekorzystnych właściwości funkcjonalnych, otrzymane preparaty białka ziemniaczanego charakteryzowały się dużą zawartością białka ogółem (powyżej 80%), małą ilością popiołu (1,5-3%) i jasną barwą. Jak wynika z ich badań, właściwości funkcjonalne preparatów białkowych, za wyjątkiem pianotwórczości, zależą od metod izolacji białka z soku ziemniaczanego. Zaobserwowali, że przeprowadzenie koagulacji białka ziemniaczanego w temperaturze pokojowej z udziałem soli metali ciężkich przyczynia się do poprawy rozpuszczalności w zakresie od 40% do 80%, ale i do znacznego zwiększenia zawartości popiołu (20-38%), pociemnienia barwy, pogorszenia zapachu oraz obniżenia strawności, w zależności od zastosowanych substancji koagulujących lub denaturujących. Ponadto preparaty białka ziemniaczanego otrzymane w takich warunkach charakteryzowały się mniejszą zawartością aminokwasów, za wyjątkiem kwasu asparaginowego i glutaminowego oraz cysteiny, w porównaniu do preparatu uzyskanego metodą koagulacji kwasowo - termicznej (z udziałem HCl) [62, 63]. Podobnie Wojnowska i wsp. [160] otrzymując preparat białka ziemniaczanego za pomocą różnych procesów membranowych (ultrafiltracji, polielektrolitów i kriokoncentracji) i poddając otrzymane białko ogrzewaniu w temperaturze 100 C przez 15 min., stwierdzili, że zastosowanie tej temperatury powoduje zmniejszenie się zawartości aminokwasów w preparatach. Analizując skład aminokwasowy preparatów koagulowanych metodą termiczno - kwasową, Knorr [62] oraz Knorr i wsp. [63]. stwierdzili, że koncentraty białka 19
ziemniaczanego zawierają duże ilości wszystkich aminokwasów, za wyjątkiem argininy, kwasu glutaminowego i asparaginowego. Także w pracy Reftsie i Tiekstra [130] można znaleźć informacje, że preparat białka ziemniaczanego uzyskiwany w przemyśle metodą koagulacji termicznej jest dobrym źródłem aminokwasów z hydrofobowymi grupami funkcjonalnymi (zawiera szczególnie dużo izoleucyny, leucyny i waliny) oraz z aromatycznymi łańcuchami bocznymi bogatymi w fenyloalaninę i tyrozynę. Znaczną zawartość lizyny w preparatach białka ziemniaczanego stwierdzili Van Gelder i Vonk [154] analizując skład aminokwasowy białka z 34 odmian ziemniaków oraz Pęksa [110] koagulując termicznie białko ziemniaczane przy udziale różnych soli. Badania niektórych autorów [52, 131] wykazały, że odmiany ziemniaka różnią się zawartością aminokwasów. Rexen [131] w swoich badaniach w 1976 roku zanotował, że aminokwasem ograniczającym w białku ziemniaka jest metionina lub izoleucyna, natomiast według Pęksy [110] aminokwasem tym jest tryptofan. Ponadto według Rexen [131], w bulwach ziemniaków występuje więcej metioniny i lizyny w porównaniu do innych białek roślinnych. Potwierdzona badaniami wysoka zawartość lizyny w białku ziemniaczanym była jedną z przyczyn wzbogacania produktów zbożowych ubogich w ten aminokwas [154]. Pęksa [110] stosując około 0,1% dodatek różnych soli: NaCl, CaCl 2 oraz NH 4 Cl w procesie termicznej koagulacji białka ziemniaczanego otrzymała preparaty wykazujące dobrą wodochłonność (2-3 krotnie większą niż koncentraty białka uzyskane przez Knorra i wsp. [63]) oraz lepszą olejochłonność, ale i mniejszą aktywność emulgowania, bez względu na rodzaj użytej soli. Zastosowanie CaCl 2 do soku ziemniaczanego umożliwiło oddzielenie ponad 80% białek już w temperaturze około 60 C, a otrzymany osad białkowy składał się w ponad 80% z dużych, łatwych do oddzielenia agregatów o wielkości 30 100 μm. Zastosowanie CaCl 2 wpłynęło więc nie tylko na wielkość powstających agregatów białkowych, ale i na ilość wydzielonego z soku białka oraz na obniżenie temperatury koagulacji białka. Otrzymywane przez różnych autorów [60, 61] preparaty białka ziemniaczanego charakteryzowały się zróżnicowaną rozpuszczalnością, zależnie od metody koagulacji i suszenia białka. Wahała się ona w przedziale od 10% (białko zdenaturowane metodą kwasowo termiczną) do 70 80% (preparaty otrzymywane w środowisku silnie kwaśnym w temperaturze pokojowej z wykorzystaniem kwasu cytrynowego). Według Jackman i Yadav [49] rozpuszczalność białek ziemniaka jest ściśle skorelowana z właściwościami emulsyjnymi, pienistością oraz podatnością na termiczną koagulację 20
preparatów białkowych. W swoich badaniach stwierdzili, że właściwości funkcjonalne białek ziemniaka można polepszyć poprzez łączenie ich z preparatami białek serwatkowych. Obecnie wiele krochmalni, również w Polsce, produkuje suszony preparat białka paszowego [119] o znacznej czystości (około 80% białka w suchej masie) i niskiej popiołowości (2-3%), jednakże nie wykazujący korzystnych właściwości funkcjonalnych. Według Wojnowskiej i wsp. [160] jest to spowodowane stosowaniem wysokiej temperatury (około 90 C) w procesie technologicznym, powodującej denaturację białka. Według różnych autorów [63, 160, 169] możliwe jest otrzymanie preparatu białka ziemniaczanego o jasnej barwie, słabo wyczuwalnym ziemniaczanym zapachu, smaku i korzystnych właściwościach funkcjonalnych, ale wymaga to dużych nakładów finansowych związanych z zastosowaniem zabiegów umożliwiających oddzielenie glikoalkaloidów, związków fenolowych oraz usunięcie lub inaktywację antyodżywczych składników. Korzystnymi właściwościami funkcjonalnymi [46, 89, 127, 128, 159, 160, 169] charakteryzują się białka izolowane z soku ziemniaczanego w formie niezdenaturowanej za pomocą procesów membranowych (ultrafiltracji i odwróconej osmozy poprzez zastosowanie membran polimerowych i ceramicznych), chromatografii jonowymiennej [93] oraz kompleksowania karboksymetylocelulozą [106] lub bentonitem [90] jako substancji powodującej wytrącenie białka w temperaturze pokojowej. Głównie tacy autorzy, jak: Holm i Erisken [46], Wojnowska i wsp. [159, 160] oraz Partsia i Kiosseoglou [106] podkreślają, że preparat zawierający białko w formie niezdenaturowanej charakteryzuje się bardzo dobrą rozpuszczalnością, choć słabą wodochłonnością oraz dobrymi właściwościami emulsyjnymi (głównie stabilizując emulsje) i pianotwórczymi, w szerokim zakresie ph (od 4 do 8). Według tych autorów właściwości emulsyjne i pianotwórcze naturalnych preparatów białka ziemniaczanego otrzymanych poprzez dializę, czy też z wykorzystaniem karboksymetylocelulozy lub metodą ultrafiltracji, są lepsze lub porównywalne z handlowymi preparatami białka sojowego oraz liofilizowanym białkiem jaja. Otrzymane w wyniku ultrafiltracji preparaty białkowe zawierają więcej substancji azotowych w porównaniu z preparatami otrzymanymi w wyniku koagulacji termicznej. Takie preparaty mogą być zastosowane w przemyśle spożywczym, np. jako emulgatory tłuszczu lub czynniki zwiększające pienistość w przemyśle piekarskim [15, 79, 160]. Uzyskany przez Ralet i Guéguen [127, 128] przy użyciu procesów membranowych preparat białka ziemniaczanego charakteryzował się niekorzystnymi właściwościami 21
emulsyjnymi, w przeciwieństwie do preparatów zawierających wybrane jego frakcje, jak np. patatynę lub rodzinę białek o masie cząsteczkowej mniejszej niż 25 kda. Autorzy ci stwierdzili, że obie frakcje były dobrze rozpuszczalne, jednak frakcja 16-25 kda niezależnie od odczynu środowiska, a patatyna tylko poza punktem izoelektrycznym budujących ją białek. Frakcja białek o niższej masie cząsteczkowej wykazywała lepszą aktywność i trwałość utworzonych emulsji, niż patatyna. Autorzy wykazali ponadto, że wyodrębniona frakcja (16-25 kda) charakteryzowała się słabymi właściwościami pianotwórczymi, w przeciwieństwie do patatyny, której zdolności do tworzenia pian określali jako lepsze niż białka jaja. Inni autorzy [124], badając właściwości białek ziemniaka stwierdzili, że ich rozpuszczalność w ph>5 jest skorelowana z siłą jonową roztworu i stopniem denaturacji tuberyny. Według Koningsveld i wsp. [155, 156] ogrzewanie białek ziemniaka w roztworze o zwiększonej sile jonowej prowadzi, wraz z obniżeniem się ph, do znacznego zmniejszenia rozpuszczalności preparatów. Ze względu na znaczną termostabilność białek inhibitorów proteaz w białku ziemniaka z wykorzystaniem jego preparatów w żywności wiąże się konieczność stosowania wysokiej temperatury, zapewniającej inaktywację inhibitorów, co znacznie ogranicza zakres potencjalnych zastosowań preparatów białka ziemniaczanego. Preparaty zawierające białko w formie niezdenaturowanej nie tylko charakteryzują się obiecującymi właściwościami funkcjonalnymi (emulsyjnością i pianotwórczością) [46, 49, 127, 139, 160], ale i mają wysoką wartość odżywczą [52, 139]. Desborough i Weiser [32] oraz Markakis [96] i Desborough [31] oznaczając skład aminokwasowy preparatów białka ziemniaczanego otrzymanych metodą dializy stwierdzili, że w białku ziemniaka ponad 90% stanowią aminokwasy endogenne, w tym głównie: kwas glutaminowy i asparaginowy oraz tyrozyna, a z aminokwasów egzogennych najwięcej jest treoniny, leucyny, fenyloalaniny i lizyny. Na przestrzeni ostatnich trzydziestu lat pojawiły się liczne prace, w których badano właściwości funkcjonalne i wartość odżywczą białka ziemniaczanego nie tylko całości, ale również głównych jego frakcji. Kapoor i wsp. [52] oraz Seibles [138] wydzielili frakcje białek ziemniaka, w których oznaczyli skład aminokwasowy. Stwierdzili, że albuminy i globuliny charakteryzują się podobnym składem aminokwasowym, chociaż frakcja globulin zawiera nieznacznie więcej metioniny i waliny, natomiast we frakcji prolamin stwierdzono najmniej aminokwasów egzogennych. We wszystkich badanych frakcjach zanotowali dużą zawartość 22
lizyny i leucyny. Wyniki badań prowadzone przez tych autorów potwierdzają, że wartość biologiczna frakcji białek ziemniaka jest porównywalna ze standardem FAO [129], za wyjątkiem prolamin obecnych w ziemniaku w śladowych ilościach (2-4%) [52, 72, 97, 131]. 1.5 Rodzaje i cele modyfikacji białek roślinnych Większość naturalnych białek roślinnych nie wykazuje właściwości funkcjonalnych przydatnych w przemyśle spożywczym, dlatego są one poddawane różnego rodzaju modyfikacjom. Według Moure a i wsp. [99] modyfikacje białek roślinnych są możliwe poprzez zmiany składu lub rozmiaru cząsteczek. W wyniku tych procesów dochodzi do zwiększenia udziału zawartości białka w produkcie, nadania mu korzystnych właściwości funkcjonalnych, odpowiedniej wartości odżywczej oraz zredukowania poziomu substancji antyżywieniowych i szkodliwych dla zdrowia. Ponadto, modyfikacje wykorzystywane są do zablokowania reaktywnych grup funkcyjnych aminokwasów w celu uniemożliwienia im udziału w niepożądanych reakcjach zachodzących podczas procesów technologicznych [42, 66, 99]. W celu otrzymania białek o zróżnicowanych i optymalnych dla środków spożywczych cechach najczęściej przeprowadza się fizyczne [94, 110] i enzymatyczne modyfikacje [2, 4, 104], ale coraz częściej również chemiczne [3, 13, 58] i genetyczne [24]. Zastosowanie obróbki termicznej prowadzące do zmian właściwości białek zalicza się do modyfikacji fizycznej. Ogrzewanie jest metodą wykorzystywaną w produkcji wielu wyrobów spożywczych do tworzenia żeli, nadawania odpowiedniej struktury produktom, np. jogurtom, kiełbasom oraz wypiekom piekarniczym, jak i do modyfikowania właściwości białkowych składników żywności. Zastosowana temperatura (najczęściej 60 C - 90 C) i czas procesu mogą oddziaływać korzystnie lub niekorzystnie na wartość odżywczą białek oraz wpływać na ich właściwości funkcjonalne, jak np. wodochłonność czy emulsyjność oraz zmieniać ich rozpuszczalność [43, 66], zależnie od innych parametrów procesu, w tym obecności soli oraz ph. Korzystne oddziaływanie temperatury wiąże się ze zwiększeniem strawności białek poprzez inaktywację inhibitorów enzymów proteolitycznych występujących licznie w materiale roślinnym. Niekorzystne oddziaływanie podwyższonej temperatury może być związane ze zmniejszeniem się ilości dostępnej lizyny, której reszty aminowe reagujące z grupami hydroksylowymi cukrów redukujących biorą udział w tzw. reakcji Maillard a lub 23
nieenzymatycznego brązowienia, a także ze zmianą aktywności w nadawaniu cech funkcjonalnych produktom żywnościowym. Przykładem modyfikacji fizycznej jest również ekstruzja. W procesie tym, substancje białkowe poddawane są połączonemu działaniu wody, ciśnienia, ciepła oraz sił mechanicznych. W efekcie następuje rozkład łańcuchów białkowych na podjednostki, które następnie odtwarzają nowe międzycząsteczkowe wiązania peptydowe, wodorowe i disulfidowe. Podczas ekstruzji białka łączą sie w agregaty, głównie w wyniku interakcji hydrofobowych i tworzenia międzycząsteczkowych wiązań disulfidowych. Według Korhonen i wsp. [66] ekstrudowane białka charakteryzują się znacznie lepszą lepkością i zdolnością do żelowania oraz stabilizacji pian niż białka naturalne. Ten rodzaj modyfikacji fizycznej jest najczęściej stosowany do teksturyzacji białek roślinnych, w wyniku której otrzymuje się produkty o wysokiej jakości, lepszej strawności oraz poprawionych właściwościach funkcjonalnych [42], jak np. modyfikowane białka sojowe. Zmianę właściwości funkcjonalnych białek, zwiększenie wydajności procesu otrzymywania produktów wysokobiałkowych oraz poprawę ich wartości odżywczej uzyskuje się w wyniku modyfikacji enzymatycznej. Dzięki wykorzystaniu tej metody modyfikacji białek roślinnych powstaje wiele produktów białkowych o zwiększonej aktywności biologicznej, zmniejszonej alergenności i znacznie większemu spektrum potencjalnych zastosowań w produkcji żywności, w tym też żywności funkcjonalnej i o projektowanej jakości. Modyfikacje z użyciem enzymów znajdują zastosowanie do otrzymania między innymi, hydrolizatów białkowych. Spośród enzymów, najczęściej wykorzystuje się pepsynę, trypsynę, chymotrypsynę, papainę czy ficynę [38]. Do najczęściej modyfikowanych należą białka: soi [1, 2, 104, 153], grochu [68], soczewicy [67, 68, 69], wyki [67, 68] i rzepaku [166]. Dzięki prowadzonym modyfikacjom autorzy otrzymali preparaty charakteryzujące się zwiększoną rozpuszczalnością i polepszoną pienistością, emulsyjnością, właściwościami żelującymi oraz zwiększoną aktywnością biologiczną, w tym właściwościami przeciwutleniającymi powstałych peptydów. Hydrolizaty białkowe są powszechnie stosowane w przemyśle spożywczym jako stymulatory smakowo zapachowe, dodatki zwiększające wartość odżywczą, polepszające właściwości teksturalne produktów, bądź opóźniające ich degradację [64]. Na rynku amerykańskim dostępne jest białko ziemniaczane pod postacią suplementu diety wysokokalorycznej, o nazwie Satise, zawierający inhibitor białek 24