ANALIZA MOCZU FIZJOLOGICZNEGO I PATOLOGICZNEGO Wymagane zagadnienia teoretyczne 1. Równowaga kwasowo-zasadowa organizmu. 2. Funkcje nerek. 3. Mechanizm wytwarzania moczu. 4. Skład moczu fizjologicznego. 5. Substancje progowe i bezprogowe. 6. Rola nerek w utrzymaniu równowagi wodno-elektrolitowej organizmu. 7. Rola nerek w utrzymaniu równowagi kwasowo-zasadowej organizmu. 8. Współczynnik oczyszczania (klirens). 9. Patologiczne składniki moczu. I. WYKRYWANIE NAJWAŻNIEJSZYCH SKŁADNIKÓW NIEORGANICZNYCH I ORGANICZNYCH MOCZU PRAWIDŁOWEGO. 1. Wykrywanie jonu wapniowego Do 1 ml moczu dodać 3 4 krople CH 3 COOH i ok. 0,5 ml szczawianu amonu, wymieszać. Pojawia się biały osad szczawianu wapnia. 2. Wykrywanie jonu amonowego Około 1 ml moczu zalkalizować dodając kilka kropli 30 % NaOH (wobec papierka wskaźnikowego). Probówkę ogrzewać łagodnie w łaźni wodnej, umieszczając u jej wylotu papierek wskaźnikowy zwilżony wodą. Zmiana barwy papierka wskaźnikowego zachodzi na skutek ulatniającego się amoniaku. 3. Wykrywanie jonu chlorkowego 1 ml moczu zakwasić kilkoma kroplami 2 N HNO 3 i dodać kilka kropli AgNO 3. Powstaje zmętnienie lub biały osad chlorku srebra. 4. Wykrywanie jonów fosforanowych Do 1 ml moczu dodać 1 ml stężonego HNO 3 i 2 ml molibdenianu amonu. Próbę zagotować we wrzącej łaźni wodnej. Powstaje żółty osad fosforomolibdenianu amonu. 5. Wykrywanie mocznika Do 1 ml moczu dodać 1 ml podbrominu sodu i 1 ml 2 N NaOH. Na skutek rozkładu mocznika wydzielają się pęcherzyki azotu. 6. Wykrywanie kwasu moczowego (próba Folina Denisa) Do 1 ml moczu dodać 1 ml 2 N NaOH i 1 ml kwasu fosforowolframowego (odczynnik Folina-Denisa). Pojawia się niebieskie zabarwienie na skutek redukcji kwasu fosforowolframowego do tlenków wolframu. Podczas reakcji obecny w moczu kwas moczowy utlenia się do allantoiny. 7. Wykrywanie kreatyniny a) próba Jaffego Do 1 ml moczu dodać 1 ml nasyconego kwasu pikrynowego i 0,5 ml 2 N NaOH. Pojawia się czerwone zabarwienie. Kreatynina ma właściwości redukujące. Pod jej wpływem kwas pikrynowy redukuje się do kwasu pikraminowego, który w środowisku alkalicznym ma zabarwienie czerwone. b) próba Weyla Do 1 ml moczu dodać 1 kroplę nitroprusydku sodu, a następnie kroplami dodawać 2 N NaOH do wystąpienia barwy czerwonej. Po dodaniu stężonego kwasu octowego próba odbarwia się.
8. Wykrywanie urobilinogenu ( próba Ehrlicha ) (Uwaga! Próbę wykonywać tylko na świeżo oddanym moczu) Do 2 ml moczu dodać 0,5 ml odczynnika Ehrlicha (2% p-dwumetyloaminobenzaldehyd) Próbę ogrzewać w łaźni wodnej do pojawienia się czerwonego zabarwienia. Pojawienie się barwy czerwonej po ogrzaniu świadczy o prawidłowej zawartości urobilinogenu, natomiast przy jego zmniejszonej zawartości próba jest ujemna. Pojawienie się barwy w temperaturze pokojowej świadczy o zwiększonej zawartości urobilinogenu w moczu. Ponieważ pod wpływem powietrza urobilinogen utlenia się do urobiliny, mocz użyty do badania powinien być świeży. II. WYKRYWANIE NIEKTÓRYCH SKŁADNIKÓW PATOLOGICZNYCH MOCZU 1) Wykazanie obecności białka: a) próba z kwasem sulfosalicylowym Do 1 ml moczu dodać 2 3 krople 10 % kwasu sulfosalicylowego. Powstaje biały osad zdenaturowanego białka. Czułość próby jest bardzo duża a kwas sulfosalicylowy jest rutynowo stosowanym odczynnikiem strącającym białko b) próba Hellera ze stężonym kwasem azotowym Ok. 1 ml moczu podwarstwić dodając 1 ml stężonego HNO 3, nie mieszać. Na granicy płynów powstaje biały pierścień zdenaturowanego białka. c) próba koagulacyjna Do 5 ml klarownego moczu dodać 0,5 ml buforu octanowego o ph 4,7. Próbę ogrzewać do wrzenia w łaźni wodnej. Pojawia się biały osad zdenaturowanego białka Białko w moczu wykrywamy zwykle metodami strąceniowymi np. koagulacji cieplnej lub z kwasami (sulfosalicylowym, azotowym czy trójchlorooctowym-tca). Natomiast jego ilościowe oznaczanie można przeprowadzić metodą kolorymetryczną. 2) Wykrywanie cukru (glukozy): Próba Nylandera Do 1 ml moczu dodać 0,5 ml odczynnika Nylandera (zasadowy azotan bizmutu). Próbę ogrzewać ok. 5 minut we wrzącej łaźni wodnej. W obecności cukru powstaje czarny osad metalicznego bizmutu. Do wykazania obecności glukozy w moczu używamy metod redukcyjnych np. próba Nylandera, Fehlinga, Benedicta. Nie są to jednak odczyny swoiste dla glukozy bowiem dają je także inne cukry redukujące które mogą występować w moczu (fruktoza, galaktoza, pentozy, laktoza). Słabą redukcję dają także niektóre składniki moczu jak kwas moczowy, kreatynina, kwas glukuronowy, kwas askorbinowy). Ilościowe oznaczenie glukozy można wykonać metodą polarymetryczną, redukcyjną czy enzymatyczną. 3) Wykrywanie ciał ketonowych: Próba Legala Do 1 ml moczu dodać 1 2 kropli nitroprusydku sodu a następnie 0,5 ml 2 N NaOH. Powstaje czerwone zabarwienie. Po dodaniu 0,5ml stężonego CH 3 COOH barwa pogłębia się do wiśniowo-czerwonej. Próbą Legala wykrywamy aceton i acetooctan. Związki te z nitroprusydkiem sodu dają w środowisku alkalicznym czerwone zabarwienie, które pogłębia się jeszcze po dodaniu kwasu octowego. Posługując się reakcją z nitroprusydkiem sodu można wykazać także obecność kreatyniny stałego składnika moczu. Jednak w tym przypadku, po zakwaszeniu kwasem octowym barwa związana z obecnością kreatyniny znika. 4) Wykrywanie bilirubiny: a) próba Gmelina 2 ml moczu podwarstwić dodając 1 ml stężonego HNO 3. Na granicy płynów powstają kolorowe pierścienie pochodzące od powstających produktów utlenienia bilirubiny.
b) próba Rosina 2 ml moczu delikatnie nawarstwić dodając ok. 1 ml 0,05 % roztworu J 2. W miejscu zetknięcia się obu płynów w wyniku utlenienia się bilirubiny powstaje szarozielone zabarwienie. Bilirubina bardzo łatwo utlenia się do kilku barwnych pochodnych z których najbardziej charakterystyczna jest zielono zabarwiona biliwerdyna. Oprócz oznaczania bilirubiny znaczenie diagnostyczne ma także oznaczanie urobilinogenu. W żółtaczkach mechanicznych w moczu obecna jest bilirubina ale brak jest urobilinogenu. Natomiast w żółtaczkach hemolitycznych stwierdza się w moczu wzrost urobilinogenu bez wzrostu bilirubiny. 5) Wykrywanie kwasów żółciowych: Próba Haya Na powierzchnię badanego moczu nasypać niewielką ilość kwiatu siarczanego (sublimowanej siarki). Siarka opada na dno probówki. W obecności kwasów żółciowych napięcie powierzchniowe moczu jest znacznie obniżone zatem siarka łatwo opada, natomiast w moczu nie zawierającym kwasów żółciowych kwiat siarczany utrzymuje się na powierzchni. III. OZNACZANIE KWAŚNOŚCI MIARECZKOWEJ MOCZU Dobowe wydalanie jonów wodorowych z moczem zależy od ilości wytwarzanych w organizmie kwasów. Jony wodorowe wydalane są po związaniu ich z obecnymi w moczu zasadami (amoniakiem i dwuzasadowymi fosforanami) w postaci jonów amonowych i fosforanów jednozasadowych. Suma wydalanych jonów NH + - 4 i H 2 PO 4 odzwierciedla ilość nielotnych kwasów wytworzonych w organizmie. Zasada oznaczenia: Kwaśność miareczkowa jest to ilość jonów wodorowych wydalanych z moczem w postaci H 2 PO - 4 lub innych słabych kwasów. Oznacza się ją przez miareczkowanie dobowej ilości moczu za pomocą 0,01 M NaOH do ph 7,4. Wartość prawidłowa kwaśności miareczkowej wynosi 10-30 mmol/24 h Wykonanie: 1. Przygotować próbę kontrolną (wzorzec). W tym celu do kolbki stożkowej odmierzyć 2,5 ml - 0,1 M buforu fosforanowego o ph 7,4 oraz 10 ml wody destylowanej. Dodać 0,5 ml - 0,01% roztworu czerwieni fenolowej. 2. Przygotować próbę badaną. W tym celu do drugiej kolbki odmierzyć 2,5 ml moczu i 10 ml wody destylowanej oraz 0,5 ml - 0,01% czerwieni fenolowej. Roztwór zawierający mocz (próba badana) miareczkować - 0,01 M NaOH do pojawienia się zabarwienia identycznego z wzorcem (próba kontrolna). Obliczyć kwaśność miareczkową badanej próbki moczu wg. wzoru. Uwaga! Podczas miareczkowania 0,01M NaOH odczynnik dodawać powoli, ciągle mieszając gdyż zmiana barwy następuje bardzo szybko. Obliczenia: kwaśność miareczkowa [mmol/24 h] = V NaOH C NaOH V DM V mocz V NaOH objętość 0,01 M NaOH zużytego podczas miareczkowania C NaOH stężenie NaOH (0,01 mol/l) V DM objętość dobowej zbiórki moczu (1500 ml) V mocz objętość próbki moczu użytej do miareczkowania (2,5 ml)
BIOCHEMIA Imię i Nazwisko Grupa: Data: I. Wykrywanie podstawowych składników chemicznych moczu prawidłowego:................ Wnioski: II. Wykrywanie patologicznych składników w moczu (zadanie) :..... Wnioski:
III. Oznaczanie kwaśności miareczkowej moczu Obliczenie i interpretacja wyniku:...... Wniosek końcowy:...... Umiejętności: zaliczono nie zaliczono Kompetencje: ocena pozytywna ocena negatywna.. Data i podpis prowadzącego