Autoreferat do wniosku o nadanie stopnia naukowego doktora habilitowanego Osiągnięcia naukowe zgłoszone do postępowania habilitacyjnego stanowią cykl szesnastu publikacji wydanych po uzyskaniu stopnia naukowego doktora Tematem tego cyklu są: Oddziaływania międzycząsteczkowe w dwuwarstwach i monowarstwach lipidowych oraz oddziaływania dwuwarstw i monowarstw lipidowych ze środowiskiem 1. Imię i Nazwisko: Aneta Dorota Petelska 2. Posiadane dyplomy, stopnie naukowe/ artystyczne z podaniem nazwy, miejsca i roku ich uzyskania. 19.12.2001 stopień doktora nauk chemicznych na Wydziale Chemii Uniwersytetu Warszawskiego 25.06.1995 tytuł zawodowy magistra na Wydziale Matematyczno-Przyrodniczym, Filia Uniwersytetu Warszawskiego w Białymstoku; 3. Informacje o dotychczasowym zatrudnieniu w jednostkach naukowych/ artystycznych. od 01.12.2007 do chwili obecnej adiunkt w Zakładzie Elektrochemii Instytutu Chemii Uniwersytetu w Białymstoku. 01.02.2003 31.07.2003 staż naukowy University of California, Davis; 01.10.2000 30.11.2007 asystent w Zakładzie Elektrochemii Instytutu Chemii Uniwersytetu w Białymstoku; 1995 2000 stacjonarne indywidualne studia doktoranckie na Wydziale Chemii Uniwersytetu Warszawskiego; 4. Wskazanie osiągnięcia* wynikającego z art. 16 ust. 2 ustawy z dnia 14 marca 2003 r. o stopniach naukowych i tytule naukowym oraz o stopniach i tytule w zakresie sztuki (Dz. U. nr 65, poz. 595 ze zm.): a) 1. A. D. Petelska, Z. A. Figaszewski, Interfacial tension of bilayer lipid membrane formed from phosphatidylethanolamine, Biochimica et Biophysica Acta 1567 (2002) 79-86, IF 2002 3,011 (IF 2011 3,99) udział własny 80% - H1
2. A. D. Petelska, M. Naumowicz (10%), Z. A. Figaszewski (25%), The interfacial tension of the lipid membrane formed from lipid-cholesterol and lipid-lipid systems, Cell Biochemistry and Biophysics 44 (2006) 205-212, IF 2006 1,693 (IF 2011 3,743) - udział własny 65% - H2 3. A.D. Petelska, Z.A. Figaszewski, Interfacial tension of phosphatidylcholinepsosphatidylserine system in bilayer lipid membrane, Biophysical Chemistry 120 (2006) 199-206, IF 2006 1,784 (IF 2011 2,203) - udział własny 80% - H3 4. A.D. Petelska, M. Naumowicz (10%), Z.A. Figaszewski (20%), Interfacial tension of the lipid membrane formed from lipid-fatty acid and lipid-amine systems, Bioelectrochemistry 70 (2007) 28-32, IF 2007 2,99 (IF 2011-3,759) - udział własny 70% - H4 5. A.D. Petelska, M. Naumowicz (10%), Z.A. Figaszewski (20%), The equilibrium of phosphatidylcholine-sphingomyelin in a monolayer at the air/water interface, Polish Journal of Chemistry 82 (2008) 2323-2330, IF 2008 0,518 - udział własny 70% - H5 6. A.D. Petelska, M. Naumowicz (10%), Z.A. Figaszewski (15%), Complex formation equilibria in two-component bilayer lipid membrane: interfacial tension method, Journal of Membrane Biology 228 (2009) 71-77, IF 2009 2,189 (IF 2011 1,808)- udział własny 75% - H6 7. A.D. Petelska, Z.A. Figaszewski, The equilibria of phosphatidylethanolaminecholesterol and phosphatidylcholine phosphatidylethanolamine in monolayers at the air/water interface, Journal of Macromolecular Science, Part A Pure and Applied Chemistry 46 (2009) 607-614, IF 2009 0,792 (IF 2011 0,887) - udział własny 70% - H7 8. A.D. Petelska, Z.A. Figaszewski, ph effect of the sphingomyelin membrane interfacial tension, Journal of Membrane Biology 230 (2009) 11-19, IF 2009 2,189 (IF 2011 1,808) - udział własny 80% - H8 9. A.D. Petelska, Z.A. Figaszewski, The equilibria of phosphatidylcholine-fatty acid and phosphatidylcholine-amine in monolayers at the air/water interface, Colloids and Surfaces B: Biointerfaces 82 (2011) 340-344, IF 2011 3,456 - udział własny 75% - H9 10. A.D. Petelska, M. Naumowicz (10%), Z.A. Figaszewski (15%), The equilibrium of phosphatidylcholine-amino acid system in monolayer at the air/water interface, Cell 2
Biochemistry and Biophysics 60 (2011) 155-160, IF 2011 3,743 - udział własny 75% - H10 11. A.D. Petelska, Z.A. Figaszewski, Interfacial tension of the lipid membrane formed from phosphatidylcholine-decanoic acid and phosphatidylcholine-decylamine systems, Journal of Membrane Biology 241 (2011) 103-108, IF 2011 1,808 - udział własny 80% - H11 12. A.D. Petelska, M. Naumowicz (10%), Z.A. Figaszewski (15%), The interfacial tension of the lipid membrane formed from lipid-amino acid systems, Cell Biochemistry and Biophysics 61 (2011) 289-296, IF 2011 3,743 - udział własny 75% - H12 13. A.D. Petelska, Interfacial tension of bilayer lipid membrane, Central European Journal of Chemistry 10 (2012) 16-26, IF 2011 1,073 - udział własny 100% - H13 14. A.D. Petelska, M. Naumowicz (10%), Z.A. Figaszewski (15%), The influence of ph on sphingomyelin monolayer at the air/aqueous solution interface, Langmuir, 28 (2012) 13331 13335, IF 2011-4,186, udział własny 75% - H14 15. A.D. Petelska, Z.A. Figaszewski, The equilibria of sphingolipid-cholesterol and sphingolipid-sphingolipid in monolayers at the air/water interface, Journal of Membrane Biology 246 (2013) 13-19, IF 2011 1,808, udział własny 80% - H15 16. A.D. Petelska, M. Naumowicz (10%), Z.A. Figaszewski (15%), The influence of ph on phosphatidylethanolamine monolayer at the air/aqueous solution interface, Cell Biochemistry and Biophysics 65 (2013) 229-235, IF 2011 3,743 - udział własny 75% - H16 Sumaryczny impact factor dorobku naukowego będącego podstawa rozprawy habilitacyjnej IF = 38,726 (wg roku opublikowania) IF= 42,276 (wg IF 2011) b) omówienie celu naukowego/artystycznego ww. pracy/prac i osiągniętych wyników wraz z omówieniem ich ewentualnego wykorzystania. Oryginalne prace twórcze stanowiące podstawę przewodu habilitacyjnego dotyczą oddziaływań międzycząsteczkowych w dwuwarstwach i monowarstwach lipidowych oraz oddziaływań składników dwuwarstw i monowarstw lipidowych ze środowiskiem. Są to układy, które stosowane są jako modele błon biologicznych. Błona biologiczna każdej komórki stanowi o jej istnieniu, nie tylko ze względu na wyodrębnienie jej struktury spośród innych, lecz także przez szereg procesów biochemicznych i fizycznych zachodzących z jej udziałem. Błony biologiczne są 3
jednym z podstawowych elementów strukturalnych i funkcjonalnych wszystkich organizmów żywych. Błony biologiczne uczestniczą w prawie wszystkich przejawach aktywności komórek. Regulują one procesy transportu substancji (pożywienia, jonów, leków), ze środowiska zewnętrznego do wnętrza komórki i w stronę przeciwną (np. produktów rozkładu); decydują o powstawaniu elektrycznych napięć spoczynkowych i czynnościowych (i w konsekwencji o rozchodzeniu się impulsów nerwowych), biorą udział w przemianach energetycznych (np. skurcz mięśnia, fosforylacja oksydacyjna), wpływają na szybkość reakcji metabolicznych i na rozkład stężeń w przedziałach komórkowych, umożliwiają równocześnie zachodzenie konkurencyjnych reakcji chemicznych, są zaangażowane w przenoszeniu informacji, rozpoznawaniu się komórek i ich fuzji 1,2. Wszystkie te funkcje błon są związane ze strukturą błony i jej składem chemicznym (lipidy, białka, węglowodany i woda). Wszystkie błony biologiczne składają się głównie z dwuwarstwy cząsteczek lipidów i białek, które kontrolują procesy życiowe komórki. Ważnym składnikiem błon, choć występującym w małych ilościach, są witaminy, enzymy czy kwasy tłuszczowe. Poznanie fizjologicznej roli błon pomaga w zrozumieniu fizycznych praw, które rządzą organizacją błon, ponieważ struktura i funkcje błon są ze sobą powiązane 3. Głównym elementem błon biologicznych, obok lipidów, są białka błonowe. Mogą być one albo wbudowane w błonę, bądź zakotwiczone na jej powierzchni. Wnętrze dwuwarstwy lipidowej ma charakter hydrofobowy, wobec czego białka wbudowane w błonę (integralne) posiadają również hydrofobowe fragmenty mogące być zanurzone w dwuwarstwie zbudowanej z lipidów 4. Niektóre białka integralne przechodzą przez całą grubość dwuwarstwy są to białka transmembranowe (transbłonowe). Oprócz białek integralnych występują również białka peryferyjne (powierzchniowe), związane z powierzchnią błony. Zawartość białek w błonach biologicznych zależy od typu i pochodzenia błony. Białka 1 K. Dołowy, A. Szewczyk, S. Pikuła, Błony biologiczne, Wydawnictwo Naukowe Śląsk, Katowice Warszawa 2003 2 R.B. Gennis, Biomembranes: molecular structure and function, Springer-Verlag, New York, 1989 3 S. Przestalski, Błony biologiczne, Wiedza Powszechna, Warszawa 1983 4 B. Alberts, Podstawy biologii komórki. Wprowadzenie do biologii molekularnej, PWN, Warszawa 1999. 4
przewyższają swoją wielkością drobiny lipidów. Na jedną cząsteczkę białka przypada kilkadziesiąt cząsteczek lipidów. Budowa i funkcje błon biologicznych są szczególnie intensywnie analizowane przez biofizyków, biologów, chemików i biochemików. Oddziaływania pomiędzy lipidami błonowymi są ciągle badane ze względu na swe duże znaczenie dla biologii molekularnej, farmacji i medycyny. Pierwsze, w pełni biofizyczne doświadczenie, dzięki któremu udało się opisać strukturę warstwy lipidowej w błonie pochodzi od Gortera i Grendela 1-5. Dzięki ich badaniom przyjęto pogląd, że lipidy w błonie są zorganizowane w postaci dwuwarstwowej. Wkrótce potem Danielli i Dawson 1-5 zaproponowali znany lipidowo-białkowy model błony komórkowej, w którym dwuwarstwa lipidowa jest pokryta z obu stron powierzchniowymi białkami globularnymi; model ten nieco modyfikowany, przetrwał do początku lat siedemdziesiątych. W roku 1972 Singer i Nicolson zaproponowali nowy model błony, mianowicie model płynnej mozaiki 5, 6. W roku 1984 N. Unwin i R. Henderson zmodyfikowali model Singera i Nicolsona stwierdzając, że fragmenty hydrofobowe białek mają bardzo często strukturę α helisy 4. Znaczna liczba funkcji pełnionych przez błony komórkowe implikuje ich złożoność, dlatego w badaniach doświadczalnych stosowane są uproszczone modele błon biologicznych. W przypadku badań oddziaływań pomiędzy składnikami tworzącymi błonę oraz oddziaływań pomiędzy nimi a środowiskiem stosuje się błony modelowe, jak dwuwarstwy czy monowarstwy lipidowe. Zastosowanie błon zastępczych jest szczególnie korzystne ze względu na stosunkowo prosty model fizyczny służący do opisu tych oddziaływań. Zmiany w poglądach na strukturę błony nastąpiły dzięki zastosowaniu wielu nowoczesnych fizycznych technik badawczych. Należą do nich przede wszystkim metody atomów znaczonych, mikroskopia elektronowa, spektroskopia elektronowego rezonansu paramagnetycznego i magnetycznego rezonansu jądrowego, sondy fluorescencyjne, rentgenografia i inne 1-5. Celem lepszego zrozumienia właściwości błon naturalnych prowadzi się doświadczenia z prostymi ich modelami. Są to sztucznie otrzymywane błony fosfolipidowe zwane błonami modelowymi. Błony te są tak dobierane, aby mogły 5 S. Kalinowski Elektrochemia membran lipidowych, Wydawnictwo Uniwersytetu Warmińsko- Mazurskiego, Olsztyn 2004. 6 S.J. Singer, G.L. Nicolson, Science 175 (1972) 720-731 5
modelować pewne właściwości błon biologicznych. Skład i właściwości błony modelowej powinny być z jednej strony bardzo dobrze znane, a z drugiej jak najbardziej zbliżone do właściwości błony żywej komórki. Najczęściej używane są monowarstwy, dwuwarstwy płaskie, sferyczne lub w postaci pęcherzyków (liposomy). Moje badania w ramach rozprawy habilitacyjnej obejmują dwa zagadnienia: 1) rozwinięcie tematyki badań napięcia międzyfazowego dwuwarstwowych membran lipidowych jako kontynuacja wcześniejszych badań; 2) rozwinięcie badań monowarstw lipidowych na skonstruowanej i sprawdzonej przy moim udziale wanny Langmuira. Po uzyskaniu stopnia doktora pierwszym etapem mojej pracy, związanej z kontynuacją badań napięcia międzyfazowego membran lipidowych było ulepszenie aparatury pomiarowej. Aby wyniki tych badań były jeszcze bardziej dokładne zostało zaprojektowane i wykonane nowe naczynie pomiarowe z podświetleniem, dla lepszej wizualizacji tworzących się sferycznych dwuwarstw lipidowych. Kolejnym elementem, który został zastosowany w aparaturze do pomiaru napięcia międzyfazowego było wbudowanie kamery video, która pozwala na bardziej precyzyjny pomiar promienia krzywizny dwuwarstwowej membrany lipidowej, na monitorze komputera. Dzięki wprowadzonym przeze mnie ulepszeniom pomiar napięcia międzyfazowego membran lipidowych jest szybszy i jeszcze bardziej dokładny. Pierwszymi eksperymentami przeprowadzonymi na udoskonalonej aparaturze było zbadanie wpływu ph na napięcie międzyfazowe dwuwarstw lipidowych zbudowanych z fosfatydyloetanoloaminy 7, układu fosfatydylocholinafosfatydyloseryna 8 i sfingomieliny 9. Otrzymane przez mnie krzywe wykazują maksimum w punkcie izoelektrycznym przy ph około 4, natomiast w miarę oddalania się od tego punktu wartości napięcia międzyfazowego maleją, a następnie ustalają się. Proste zastosowanie równania Gibbsa opisuje przebieg tych krzywych jedynie w pobliżu punktu izoelektrycznego. W celu wyjaśnienia przebiegu krzywych w całym badanym zakresie ph zaproponowałam model uwzględniający istnienie równowag kwasowo-zasadowych pomiędzy różnymi formami lipidu a roztworem. Również 7 A.D. Petelska, Z.A. Figaszewski, Biochim. Biophys. Acta 1567 (2002) 79-86 H1 8 A.D. Petelska, Z.A. Figaszewski, Biophys. Chem. 120 (2006) 199-206 H3 9 A.D. Petelska, Z.A. Figaszewski, J. Membrane Biol. 230 (2009) 11-19 H8 6
uwzględnienie w równaniu Gibbsa pełnej definicji nadmiaru powierzchniowego pozwala na wyjaśnienie przebiegu krzywych doświadczalnych w całym badanym zakresie ph. Aby wyznaczyć położenie punktu izoelektrycznego błon lipidowych musiałam najpierw wyznaczyć stałe równowag kwasowo-zasadowych. Jednak wyznaczenie tych wielkości było utrudnione, ponieważ lipidy nie rozpuszczają się w wodzie. Dlatego też do określenia powyższych wielkości użyłam liposomów. W ten sposób zapewniłam równomierny rozkład grup kwasowych i zasadowych cząsteczek lipidu w roztworze, chociaż lipid jest nierozpuszczalny cząsteczkowo w wodzie. Stałe równowag kwasowo-zasadowych dla badanych lipidów wyznaczałam poprzez miareczkowanie uprzednio otrzymanych liposomów kwasem solnym lub wodorotlenkiem sodowym. Wyznaczenie przeze mnie wartości stałych kwasowozasadowych 6-9 lipidów błonowych to nowość w literaturze, do tej pory podawane były jedynie szacunkowe wartości tych stałych. Następnie wykonałam badania wpływu innych lipidów 10,11, kwasów tłuszczowych 10,11 oraz amin 12,13 o różnej długości łańcucha węglowodorowego oraz aminokwasów 14 na napięcie międzyfazowe dwuwarstwowych membran lipidowych zbudowanych z lecytyny. Otrzymane krzywe odbiegają od prostoliniowej zależności napięcia międzyfazowego od ułamka molowego składników błony, co sugeruje moim zdaniem tworzenie się w takich układach kompleksów. Do wyjaśnienia oddziaływań w badanych układach założyłam powstawanie kompleksów w stosunku 1:1 pomiędzy składnikami błony. Do obliczenia napięć międzyfazowych błon zbudowanych z tworzących się w tych układach kompleksów, ich powierzchni oraz stałych trwałości posłużyły mi założenia opisane w moich wcześniejszych pracach. Dzięki tym założeniom wyprowadziłam nowe zależności matematyczne, które są mniej skomplikowane i dokładnie opisują oddziaływania zachodzące w badanych układach. Wzory matematyczne opisujące oddziaływania w badanych układach zostały opisane w moich pracach 9-15. 10 A.D. Petelska, M. Naumowicz, Z.A. Figaszewski, Cell Biochem. Biophys. 44 (2006) 205-212 - H2 11 A.D. Petelska, M. Naumowicz, Z.A. Figaszewski, J. Membrane Biol. 228 (2009) 71-77- H6 12 A.D. Petelska, M. Naumowicz, Z.A. Figaszewski, Bioelectrochemistry 70 (2007) 28-32 - H4 13 A.D. Petelska, Z.A. Figaszewski, J. Membrane Biol. 241 (2011) 103-108 H11 14 A.D. Petelska, M. Naumowicz, Z.A. Figaszewski, Cell Biochem. Biophys. 61 (2011) 289-296 H12 15 A.D. Petelska, Cent. Eur. J. Chem. 10 (2012) 16-26 - H13 7
Dodatkowym parametrem, który został wprowadzony do opisu oddziaływań pomiędzy składnikami tworzących się dwuwarstw lipidowych jest energia wiązań (swobodna energia Gibbsa) pomiędzy składnikami tworzących się kompleksów 11-15. Należy wspomnieć, że w literaturze do tej pory brak było danych dotyczących stałych trwałości kompleksów fosfolipid-cholesterol, fosfolipid-fosfolipid, fosfolipidkwas tłuszczowy, fosfolipid-amina czy fosfolipid-aminokwas. Dzięki przeprowadzonym badaniom jako pierwsza wyznaczyłam te stałe i przedstawiłam w swoich pracach, co moim zdaniem jest także wkładem do dorobku dziedzin naukowych takich jak: chemia i biofizyka w kraju i na świecie. Ze względu na to, że w literaturze niewiele jest danych dotyczących badań napięcia międzyfazowego dwuwarstwowych membran lipidowych postanowiłam przedstawić wyniki swoich badań w jednoautorskim artykule przeglądowym, który ukazał się w lutym 2012 roku w czasopiśmie Central European Journal of Chemistry 15. Aby lepiej poznać oddziaływania zachodzące w błonach komórkowych postanowiłam rozszerzyć zakres swoich badań o monowarstwy Langmuira na granicy faz woda/powietrze. W tym celu przy moim współudziale została skonstruowana i wykonana wanna Langmuira w Zakładzie Elektrochemii Instytutu Chemii Uniwersytetu w Białymstoku. Zgodnie z sugestiami zawartymi w pracy doktorskiej Pani dr Izabeli Brzozowskiej 16, 17, 18, 19 opracowałam metodykę pomiaru napięcia powierzchniowego w funkcji stężenia powierzchniowego substancji amfifilowych. Wprowadzenie poniżej opisanych ulepszeń pozwala na otrzymywanie prawie idealnej powtarzalności krzywych eksperymentalnych. Wprowadzone modyfikacje zostały również przedyskutowane w pracy, która ukazała się w czasopiśmie Journal of Macromolecular Science, Part A 20. Ulepszenia wprowadzone do aparatury pozwalającej na badanie równowag w monowarstwach Langmuira na granicy faz woda/powietrze to: 1) modyfikacja barierki kompresującej monowarstwę - w swoich badaniach zastosowałam barierkę szklaną, zbudowaną z materiału hydrofilowego 16 I. Brzozowska, Badania równowag pomiędzy wybranymi lipidami błonowymi w monowarstwach na swobodnej powierzchni roztworu wodnego a innymi składnikami monowarstw lub roztworu, praca doktorska, Warszawa, 2003 17 I. Brzozowska, Z.A. Figaszewski, Biophys. Chem 95 (2002) 173-179 18 I. Brzozowska, Z.A. Figaszewski, Colloids Surf. B 23 (2002) 51-58 19 I. Brzozowska, Z.A. Figaszewski, Colloids Surf. B 27 (2003) 303-309 20 A.D. Petelska, Z.A. Figaszewski, J. Macromol. Sci., Part A 46 (2009) 607-614 H7 8
o znacznym ciężarze, co uniemożliwia przechodzenie monowarstwy pod barierką. W badaniach monowarstw Langmuira stosowane są najczęściej barierki zbudowane z hydrofobowego tworzywa sztucznego, przeważnie z teflonu, co moim zdaniem może przyczyniać się do błędnych wyników, przynajmniej w przypadku badań związanych w wyznaczaniem pola powierzchni zajmowanego przez pojedynczą cząsteczkę; 2) dobór kształtki mierzącej napięcie powierzchniowe ogólnie do pomiaru zmian napięcia powierzchniowego w metodzie Langmuira stosowana jest płytka Wilhelmy ego (zwykle platynowa czy z bibuły ilościowej), która pozwala w prosty sposób uzyskać bezwzględne wartości napięcia powierzchniowego. Zastosowana przeze mnie specjalnie wykonana kształtka ze szkiełka nakrywkowego poprawia powtarzalność wyników pomiarowych. Jest to rezultatem uzyskania stabilniejszej, bardziej powtarzalnej wartości kąta kontaktu kształtki z subfazą. Materiał, z jakiego wykonany jest czujnik napięcia międzyfazowego wymaga olbrzymiej czystości; co jest to zapewnione poprzez kilkuminutowe gotowanie płytki w chromiance, a następnie staranne wypłukanie jej w trójkrotnie destylowanej gorącej wodzie; 3) dobór rozpuszczalnika zgodnie z sugestią Pani dr Izabeli Brzozowskiej 15 zastosowałam 1-chloropropan, który po raz pierwszy został zastosowany w badaniach przez Nią prowadzonych. Substancja ta posiada odpowiednie parametry fizykochemiczne do otrzymywania powtarzalnych krzywych doświadczalnych, tj. odpowiednią lotność, gęstość oraz budowę, a dane otrzymane za jego pomocą są zgodne z wcześniejszymi danymi literaturowymi; 4) stosowanie wody 3-krotnie destylowanej jako subfazy subfaza powinna mieć maksymalną czystość, ponieważ nawet niewielkie zanieczyszczenia mogą mieć istotny wpływ na otrzymywane wyniki. Woda, którą wykorzystuję jako nośnika monowarswy jest oczyszczona w celu usunięcia materii organicznej (druga destylacja przeprowadzana jest w obecności KMnO 4 i KOH). Po wyborze szklanej barierki, szklanej płytki i sprawdzeniu przydatności 1 chloropropanu do tworzenia monowarstw wybranych związków przystąpiłam do badania powtarzalności otrzymywanych wyników, która okazała się niemal idealna. Lecytyna jest najczęściej używanym lipidem wykorzystywanym do modelowych badań błon biologicznych. A więc otrzymywanie powtarzalnych wyników 9
w przypadku badania monowarstw lecytynowych miało priorytetowe znaczenie dla przydatności danego układu pomiarowego do badań natury biologicznej. Badania oddziaływań lipidów błonowych w monowarstwach ukierunkowane były na poznanie ich właściwości na poziomie molekularnym. Przeprowadzane za pomocą wanny Langmuira eksperymenty miały na celu skonfrontowanie ich z wynikami otrzymywanymi metodą napięcia międzyfazowego dwuwarstwowych membran lipidowych oraz pogłębienie wiedzy o zjawiskach zachodzących, zarówno wewnątrz błon komórkowych, jak i na ich powierzchni. Zamierzeniem przeprowadzonych eksperymentów było również ilościowe opisanie zjawisk występujących na granicy faz monowarstwa/subfaza. Moje prace obejmują badania równowag pomiędzy składnikami monowarstw lipidowych na swobodnej powierzchni cieczy. Układy badane, to zarówno monowarstwy zbudowane z jednej substancji, jak i dwuskładnikowe monowarstwy mieszane, w których substancje oddziałują ze sobą tworząc kompleksy. Do badań użyłam lipidów występujących w błonach biologicznych i spełniających istotne funkcje w organizmach żywych. Są to: fosfatydylocholina, cholesterol, fosfatydyloetanoloamina, sfingomielina i ceramid 21,22, reprezentujące różne klasy lipidów. Do badań zastosowałam również kwasy tłuszczowe i aminy o różnej długości łańcuchów węglowodorowych 23 oraz aminokwasy 24. Uzyskane dane eksperymentalne opisałam za pomocą modelu oddziaływań występujących pomiędzy składnikami monowarstwy mieszanej. Równowagę tworzenia się kompleksu opisałam równaniami matematycznymi przedstawionymi w pracy 20, które można weryfikować doświadczalnie. Badania monowarstw dostarczają cennych informacji o stopniu upakowaniu molekuł i oddziaływaniach pomiędzy poszczególnymi składnikami mieszaniny lipidów błonowych. Dokonałam analizy stężenia powierzchniowego mieszanin przy założeniu addytywności udziałów składników układu. Wykonałam obliczenia uwzględniające istnienie w monowarstwie równowag między jej składnikami. W celu obliczenia stałych trwałości tworzących się kompleksów opracowałam model równowag pomiędzy składnikami monowarstwy. Wyprowadzone zależności opisujące tworzące się kompleksy, wyznaczenie pól powierzchni przypadających na cząsteczkę kompleksów, wartości stałych trwałości 21 A.D. Petelska, M. Naumowicz, Z.A. Figaszewski, Polish J. Chem. 82 (2008) 2323-2330 - H5 22 A.D. Petelska, Z.A. Figaszewski, J. Membrane Biol. 246 (2013) 13-19 - H15 23 A.D. Petelska, Z.A. Figaszewski, Colloids Surf. B 82 (2011) 340-344 - H9 24 A.D. Petelska, M. Naumowicz, Z.A. Figaszewski, Cell Biochem. Biophys. 60 (2011) 155-160 - H10 10
oraz energii wiązań badanych kompleksów zostały również przedstawione w pracach 20-24. Kolejnym etapem mojej pracy było zbadanie równowag kwasowo-zasadowych monowarstw zbudowanych z fosfatydyloetanoloaminy 25 i sfingomieliny 26. Wykonałam pomiary napięcia międzyfazowego wyżej wymienionych układów na granicy faz woda/subfaza wodna w funkcji ph. Jako subfazę zastosowałam bufory Brittona-Robinsona, które można komponować uzyskując wartości ph w szerokim zakresie. Następnie przedstawiono prosty model wpływu ph subfazy na monowarstwę lipidu (fosfatydyloetanoloamina, sfingomielina) granicy faz: powietrze/części hydrofobowe lipidu. Model ten określał równowagi kwasowozasadowe pomiędzy jonami wodorowymi i wodorotlenowymi znajdującymi się w subfazie a poszczególnymi formami lipidu. W zależności od ilości jonów H + lub OH -, lipid (L) występuje w następujących formach: LH +, LHOH, L, LOH -. Udziały addytywnych postaci lipidu (zarówno dla napięcia międzyfazowego, jak i pola cząsteczki) są zależne od ph subfazy. Szczegółowa dyskusja jakościowego modelu poparta została obliczeniami. Założony model został zweryfikowany eksperymentalnie 25,26. Podobnie jak w przypadku dwuwarstw lipidowych w literaturze do tej pory brak było danych dotyczących stałych trwałości kompleksów fosfolipid-cholesterol, fosfolipid-fosfolipid, fosfolipid-kwas tłuszczowy, fosfolipid-amina czy fosfolipidaminokwas. Wyniki moich badań pozwoliły mi, jako jednej z pierwszych, na wyznaczenie tych stałych i przedstawienie ich w moich pracach 20-24. Wyznaczone samodzielnie wartości powierzchni właściwych wybranych związków, jak również w postaci kompleksów mogą zostać wykorzystane do badań monowarstw i dwuwarstw lipidowych bardziej skomplikowanych układów modelowych błon biologicznych (np. poprzez wbudowywanie białek). Analizując otrzymane przez mnie wyniki dla monowarstw i dwuwarstw lipidowych można wysunąć następujące wnioski: 1) wyznaczone przeze mnie powierzchnie zajmowane przez pojedynczą cząsteczkę tworzącego się kompleksu mają wyższe wartości liczbowe w przypadku dwuwarstw lipidowych w porównaniu z identycznymi układami monowarstw 25 A.D. Petelska, M. Naumowicz, Z.A. Figaszewski, Langmuir 28 (2012) 13331 13335 - H14 26 A.D. Petelska, M. Naumowicz, Z.A. Figaszewski, Cell Biochem. Biophys. 65 (2013) 229-235 - H16 11
lipidowych. Spowodowane jest to prawdopodobnie ściślejszym upakowaniem składników monowarstwy. 2) wartości stałych trwałości kompleksów tworzących się w dwuwarstwach lipidowych zawierają się w granicach 10 5 (kompleks fosfolipid-amina) 10 10 (kompleks fosfolipid-cholesterol), w przypadku monowarstw wartości te mają niższe wartości w porównaniu z identycznymi układami w dwuwastwach lipidowych zawierają się w granicach 10 4 (kompleks fosfolipid-amina) 10 6 (kompleks fosfolipidcholesterol). Wysokie wartości stałych trwałości kompleksów potwierdzają dodatkowo, że dominującym kompleksem w dwuwarstwach i monowarstwach mieszanych jest kompleks o składzie 1:1. Porównując otrzymane wartości dla monowarstw z analogicznymi dla dwuwarstw należy podkreślić, że są one od jednego do czterech rzędów wielkości mniejsze. Te różnice można wytłumaczyć innym otoczeniem przestrzennym obu układów. W przypadku monowarstwy mamy do czynienia z układem dwuwymiarowym, płaszczyzną na granicy faz woda/powietrze. W dwuwarstwach układ zyskuje jeszcze jeden wymiar, tworząc układ trójwymiarowy, przestrzenny. Dodatkowe oddziaływania hydrofobowe pomiędzy łańcuchami węglowodorowymi stabilizują dwuwarstwę, czyniąc ją trwalszą. 3) wyznaczone energie wiązań (swobodna energia Gibbsa) w przypadku kompleksów tworzących się pomiędzy składnikami tworzącej się dwuwarstwy lipidowej mają wyższe wartości niż w przypadku kompleksów tworzących się w monowarstwach lipidowych i mieszczą się w granicach 35 kj/mol (układ fosfolipidamina) - 60 kj/mol (układ fosfolipid-cholesterol). Wartości energii wiązań identycznych układów w monowarstwach mieszczą się w granicach 27 kj/mol (układ fosfolipid-amina) 37 kj/mol (układ fosfolipid-cholesterol). Można tutaj wnioskować, że wyższe wartości energii wiązań są związane, podobnie jak w przypadku wyższych wartości stałych trwałości kompleksów tworzących się składnikami dwuwarstwowych membran lipidowych, ze względu na odmienność przestrzenną tych układów. Większa wartość stałych trwałości kompleksów dla badanych dwuwarstw, a co za tym idzie również wyższe wartości energii wiązań wynikają prawdopodobnie również z szorstkości pomiędzy warstwami hydrofobowymi w dwuwarstwie. Kompleksy występujący w dwuwarstwie są, więc dodatkowo wzmocnione oddziaływaniami pomiędzy dwiema warstwami dwuwarstwy. Pomiary wykonywane na monowarstwach zbudowanych tylko z jednej substancji, jak i mieszanych na granicy faz woda/powietrze są szeroko stosowane 12
jako fizyczny model do badania oddziaływań fosfolipid-fosfolipid, fosfolipid-kwas tłuszczowy, fosfolipid-amina czy fosfolipid-aminokwas. Moim zdaniem mogą one wnieść znaczący udział z biologicznego punktu widzenia. W niektórych przypadkach występuje stosunkowo podobne zachowanie się monowarstw i dwuwarstw lipidowych. Cholesterol zwiększa uporządkowanie w membranach lecytynowych, gdyż łańcuchy kwasów tłuszczowych stają się bardziej prostopadłe do płaszczyzny grup polarnych, zarówno w monowarstwach, jak i dwuwarstwach lipidowych. Jednak w dwuwarstwach mamy do czynienia z większym wpływem łańcucha bocznego sterolu na efekt kondensacyjny niż pierścień sterolowy, jak to jest w przypadku monowarstw. Oddziaływania badane między monowarstwami lipidowymi mogą moim zdaniem przybliżyć badaczy do lepszego poznania błon biologicznych. Ze względu na występowanie badanych przeze mnie substancji w błonach intensywne eksperymenty przeprowadza się właśnie za pomocą tych substancji jako doskonale tworzących monowarstwy na granicy faz: woda/powietrze. Również zależności pomiędzy monowarstwą, dwuwarstwą i błonami komórkowymi są istotne i rozważane w licznych publikacjach 27, 28, 29, 30, 31. Ważną cechą cholesterolu, niezależnie czy są to dwuwarstwy czy monowarstwy, jest uporządkowanie łańcuchów węglowodorowych fosfolipidów w modelowych błonach, co zostało ustalone za pomocą pomiarów NMR. Ponadto obecność cholesterolu wpływa, jak już wspomniano, na przepuszczalność membran, przejścia fazowe i morfologię membran 32. Model dwuwarstwy złożonej z dwóch monowarstw połączonych ze sobą, z zaniedbywanymi oddziaływaniami był badany przez Nagle a 33. Wskazywał on, że w przypadku monowarstwy na granicy faz woda/powietrze - otrzymuje się - w porównaniu do analogicznej dwuwarstwy - dodatkową granicę faz powietrze/części hydrofobowe molekuł. Jednakże ten sam autor wskazuje, że jest to uproszczenie, podobnie jak narzucająca się myśl, by porównywać właściwości połowy dwuwarstwy z właściwościami monowarstwy na granicy faz woda/olej 33. 27 J.J. Batenburg, H.P. Haagsman, Prog. Lipid Res.37 (1998) 235-276 28 G. Thakur, M. Micic, R.M. Leblanc, Colloids Surf. B 74 (2009) 436-456 29 F. Schmid, D. Düchs, O. Lenz, B. West, Comput. Phys. Commun. 177 (2007) 168-171 30 P. Vitovič, S. Kresák, R. Naumann, S.M. Schiller, R.N.A.H. Lewis, R.N. McElhaney, T. Hianik, Bioelectrochemistry 63 (2004) 169-176 31 F. Schmid, D. Düchs, O. Lenz, B. West, Comput. Phys. Commun. 177 (2007) 168-171 32 P.L. Yeagle, Biochim. Biophys. Acta 822 (1985) 267-287 33 J.F. Nagle, J. Membrane Biol. 27 (1976) 233-250 13
Dwuwarstwy lipidowe są bardziej wrażliwe na zmiany pola powierzchni niż dzieje się tak w przypadku monowarstw. Informacje otrzymane z symulacji komputerowych dwuwarstw sugerują, że prawdopodobnie siły dalekiego zasięgu są odpowiedzialne za rozbieżne wnioski z badań komputerowych i doświadczalnych. Zbadanie oddziaływań międzycząsteczkowych w dwuwarstwach i monowarstwach lipidowych oraz oddziaływań dwuwarstw i monowarstw lipidowych ze środowiskiem było moim zdaniem celowe poprzez zastosowanie kompleksów, jakie obserwujemy w błonach naturalnych, tj. w układach: fosfolipid-cholesterol, fosfolipid-fosfolipid, fosfolipid-kwas tłuszczowy, fosfolipid-amina oraz fosfolipidaminokwas. Wyznaczenie wartości charakteryzujących wyżej wymienione kompleksy, tj. napięcia międzyfazowego, stałych trwałości takich kompleksów, ich powierzchni oraz wartości energii powierzchniowych, a także wartości energii swobodnej Gibbsa pozwoliło na opisanie tych oddziaływań oraz wyjaśnienie natury wiązań występujących w cząsteczkach tworzących kompleksy w dwuwarstwach i monowarstwach lipidowych. Dodatkowym czynnikiem pozwalającym na opisanie oddziaływań pomiędzy składnikami błony a środowiskiem jest poznanie wpływu ph środowiska. Jego zmiana powoduje zmiany ładunku elektrycznego błony. Jest to spowodowane przesuwaniem się równowag grup kwasowo zasadowych występujących w membranach lipidowych. W zależności napięcia międzyfazowego dwuwarstwy fosfolipidowej od ph roztworu, przy pewnej wartości ph, napięcie ma maksymalną wartość, która odpowiada punktowi izoelektrycznemu błony lipidowej. Badania te pozwoliły na wyznaczenie wartości stałych kwasowo-zasadowych, punktów izoelektrycznych badanych lipidów oraz wartości energii wiązań pomiędzy grupami funkcyjnymi lipidów a jonami H + i OH - środowiska. Otrzymane w ten sposób wielkości, takie jak np. napięcie międzyfazowe, pole powierzchni cząsteczek, wartości energii swobodnej Gibbsa oraz energii powierzchniowej będą mogły być wykorzystane w opisie oddziaływań w błonach żywych komórek. Dokładne poznanie właściwości fizykochemicznych i elektrycznych błon komórkowych jest potrzebne do podjęcia bliższych badań mechanizmów transportu substancji i przekazywania informacji przez błony biologiczne. Opis wpływu różnych substancji (np. cholesterolu, kwasów tłuszczowych, aminokwasów) na parametry fizykochemiczne jest niezbędny do zrozumienia wielu procesów, w których uczestniczą błony komórkowe w organizmie. Uzyskane dane pomogą 14
charakteryzować ilościowo tworzenie np. połączeń kompleksowych w błonie oraz pomiędzy błoną a środowiskiem. Znajomość równowag kwasowo-zasadowych oraz równowag kompleksowych pomiędzy składnikami błony, czy pomiędzy składnikami błony a środowiskiem pozwala na zrozumienie procesów, które mają miejsce zarówno na jej powierzchni jak i w samej dwuwarstwie czy monowarstwie. Otrzymane przeze mnie wyniki mogą być stosowane w ilościowym opisie właściwości fizykochemicznych i elektrycznych błon biologicznych. Moje badania są kontynuowane i rozszerzane o coraz to nowe problemy naukowe. Nowa dziedzina nauki zajmująca się ilościowymi badaniami zjawisk zachodzących w błonach komórkowych, z wykorzystaniem ich modeli, w której otwarciu i rozwoju uczestniczę od początku, dostarcza bardzo ważnych i niezbędnych informacji dla zrozumienia zjawisk zachodzących w błonach komórkowych. Rozwój tej dziedziny jest potrzebny moim zdaniem dla biologii, biofizyki czy nauk medycznych, np. farmacji, a w szczególności poznania mechanizmów oddziaływań w błonach komórkowych. Jestem członkiem zespołu naukowego, którego głównym tematem badań od kilkunastu lat są fizykochemiczne i elektrochemiczne właściwości monowarstw i dwuwarstw lipidowych oraz błon naturalnych. Rozwijane są przez nas badania równowag pomiędzy składnikami błon komórkowych i pomiędzy składnikami błony a roztworem otaczającym. Badamy zjawiska takie jak napięcie powierzchniowe, opór elektryczny, pojemność elektryczną i zmiany ładunku na powierzchni błon. Osiągnięciem w naszych badaniach jest rozwinięcie badań kompleksów w błonach i pomiędzy błonami a roztworem. Następnie poprzez teoretyczne opisy procesów tworzenia kompleksów możemy weryfikować dane eksperymentalne z wartościami teoretycznymi, określonymi przez równania matematyczne. Umożliwia to ilościowe wyznaczenie parametrów tworzących się kompleksów, tj. wartości napięcia międzyfazowego, ciśnienia powierzchniowego, wielkości stałych trwałości kompleksów, powierzchni zajmowanych przez tworzące się kompleksy oraz energii tworzenia tych kompleksów. Porównanie zgodności wyników eksperymentalnych z teoretycznymi jest podstawą oceny istnienia danego kompleksu. Takie ilościowe podejście poprzez opisy równaniami stanowi nasz oryginalny wkład do badań błon komórkowych, a nawet jest to naszym zdaniem wytyczenie nowej dziedziny badań. 15
Badania prowadzone przeze mnie w ramach zespołu należą do fundamentalnych zagadnień współczesnej nauki i uczestniczę w tych badaniach od początku. Zespół nasz współpracuje naukowo z kilkoma jednostkami medycznymi zajmującymi się zarówno aspektami naukowymi, jak i praktyką kliniczną. Współpraca ta dostarcza nam przesłanek odnośnie znaczenia aplikacyjnego naszych badań, jak i wyboru konkretnych zadań naukowych. Rozwiązanie każdego, nawet na pozór drobnego problemu związanego z błonami komórkowymi być może pomoże w rozwiązaniu dotąd niewyjaśnionych zagadnień dotyczących procesów związanych z naszym istnieniem. 3. Omówienie pozostałych osiągnięć naukowo - badawczych (artystycznych). Działalność naukowa przed uzyskaniem stopnia doktora W 1995 roku zakończyłam studia chemiczne i uzyskałam tytuł magistra na Wydziale Matematyczno-Przyrodniczym Filii Uniwersytetu Warszawskiego w Białymstoku. Pracę dyplomową wykonywałam w Zakładzie Elektrochemii kierowanym przez prof. dr hab. Zbigniewa Figaszewskiego, który był również kierownikiem mojej pracy. Moje badania dotyczyły hydrofilowania membran polipropylenowych alkoholami o różnej długości łańcucha węglowego. Celem mojej pracy magisterskiej było zbadanie wpływu długości łańcucha alkilowego alkoholi na zmiany hydrofobowości membran polipropylenowych. Cel ten osiągnęłam badając przepuszczalność jonów K + i Cl - przez hydrofobowe membrany polipropylenowe poddawane hydrofilowaniu różnymi alkoholami: metylowym, etylowym, n-propylowym i n-butylowym o wzrastającym stężeniu. Do badań stosowałam metodę spektroskopii impedancyjnej. Zmiany właściwości transportowych badanych membran określałam na podstawie pomiarów oporu elektrolitu, oporu i pojemności elektrycznej membrany oraz współczynnika odpowiadającego za dyfuzję wewnątrz membrany zgodnie z przyjętym modelem. Stwierdziłam, że membrany hydrofobowe z polipropylenu ulegają hydrofilowaniu wszystkimi badanymi alkoholami. Badania wykazały, że lepsze wyniki hydrofilowania membran uzyskuje się przy zastosowaniu alkoholi o krótszym łańcuchu węglowym tj. metanolu, etanolu i n-propanolu. Zastosowanie alkoholu o dłuższym łańcuchu, np. n-butanolu powoduje, że efektywność procesu hydrofilowania jest mniejsza, co jest 16
związane z utrudnionym wnikaniem tego alkoholu do wnętrza poru hydrofobowej membrany 34. Praca doktorska W październiku 1995 roku rozpoczęłam studia doktoranckie na Wydziale Chemii Uniwersytetu Warszawskiego. Temat pracy doktorskiej brzmiał Napięcie międzyfazowe dwuwarstwowych membran lipidowych. Promotorem mojej pracy doktorskiej był prof. dr hab. Zbigniew Figaszewski, a recenzentami prof. dr hab. Stanisław Przestalski i prof. dr hab. Paweł Krysiński. Celem mojej pracy doktorskiej było poznanie wpływu różnych czynników: ph środowiska, obecności cholesterolu, jonoforów czy substancji tworzących pory w membranach na ich napięcie międzyfazowe. Technika pomiarowa oparta była na równaniu Younga i Laplace a 35, które opisuje związek pomiędzy różnicą ciśnień po obu stronach membrany a promieniem krzywizny i jej napięciem międzyfazowym. Skonstruowana w tym celu przeze mnie aparatura zawierała układ do przykładania i pomiaru różnicy ciśnień po obu stronach membrany oraz układ optyczny do pomiaru krzywizny dwuwarstwy. Membrany były tworzone w naczyniu pomiarowym, które zostało specjalnie wykonane, aby tworzyć w nim sferyczne dwuwarstwy. Tego typu membrany mają większą powierzchnię w stosunku do membran płaskich i dzięki tej właściwości mają zastosowanie do badań powierzchniowych, w tym do badań napięcia międzyfazowego dwuwarstw lipidowych, przez co pomiary są dokładniejsze. Należy również podkreślić, że konstrukcja zestawu do pomiaru napięcia międzyfazowego to nowość w literaturze; do tej pory stosowano inne rozwiązania. Wykonałam badania zależności napięcia międzyfazowego od składu mieszaniny lecytyna-cholesterol w całym zakresie stężeń. Otrzymane wyniki ujawniają odchylenia od prostoliniowości zależności napięcia międzyfazowego od ułamka molowego. Do wyjaśnienia tej zależności, zgodnie z sugestiami w literaturze, postulowałam tworzenie się kompleksu lecytyna-cholesterol (1:1). Wyprowadziłam odpowiednie zależności uwzględniające istnienie tej równowagi w dwuwarstwie. Otrzymane wartości są zgodne z wynikami doświadczalnymi. Oszacowałam 34 H. Molisak-Tołwińska, A. Wencel, Z. Figaszewski, J. Macromol. Sci. Part A 35 (1998) 857-865 35 A. W. Adamson, Physical Chemistry of Surfaces, Interscience Publishers, New York, Inc., 1960 17
powierzchnię zajmowaną przez jedną cząsteczkę kompleksu lecytyna-cholesterol oraz jego stałą trwałości 36. Kolejnym etapem mojej pracy było zbadanie wpływu ph na napięcie międzyfazowe dwuwarstwy zbudowanej z fosfatydylocholiny (lecytyny) oraz fosfatydyloseryny. Jako roztworu elektrolitu używałam buforu według Brittona i Robinsona 37. Wybrałam ten roztwór ze względu na szeroki zakres ph 2-12 oraz z uwagi na to, że jest on używany w badaniach biologii komórki. Otrzymane krzywe wykazały maksimum w punkcie izoelektrycznym przy ph około 4, natomiast w miarę oddalania się od tego punktu wartości napięcia międzyfazowego malały, a następnie ustalały się. Proste zastosowanie równania Gibbsa pozwoliło na opisanie przebiegu tej krzywej jedynie w pobliżu punktu izoelektrycznego 38. W celu wyjaśnienia przebiegu krzywej w całym badanym zakresie ph zaproponowałam model uwzględniający istnienie równowag kwasowo-zasadowych pomiędzy różnymi formami lecytyny a roztworem. Wykazałam, że uwzględnienie tych równowag wyjaśniło przebieg krzywych, przyjmując addytywny udział każdej z nich 39. Również uwzględnienie w równaniu Gibbsa pełnej definicji nadmiaru powierzchniowego pozwoliło na teoretyczny opis przebiegu krzywej doświadczalnej w całym badanym zakresie ph 40,41. Wykonałam również badania wpływu obecności jonoforów oraz substancji tworzących w błonie lecytynowej tzw. kanały jonowe, na jej napięcie międzyfazowe. Do badań wybrałam walinomycynę i gramicydynę D, ze względu na odmienne właściwości. Walinomycyna jest jonoforem, który tworzy kompleks z jonami K +, które docierają w drodze dyfuzji do powierzchni błony. Następnie cząsteczka kompleksu walinomycyna-jon obdarzona ładunkiem elektrycznym, dyfunduje w poprzek błony. Po osiągnięciu drugiej powierzchni błony zachodzi reakcja odwrotna dekompleksowanie, a następnie przechodzenie jonu do fazy wodnej. Gramicydyna D wbudowuje się w błonę tworząc tzw. kanały jonowe, przez które mogą przenikać jony. Dwie cząsteczki gramicydyny łączą się ze sobą tak, że tworzą kanał łączący 36 A.D. Petelska, Z.A. Figaszewski, Bioelectrochem. Bioenerg. 46 (1998) 199-204. 37 H.T.S. Britton, R.A. Robinson, CXCVIII.-Universal buffer solutions and the dissociation constant of veronal. Journal of the Chemical Society (1931) 1456-1462 38 A.D. Petelska, Z.A. Figaszewski, Biophys. J. 78 (2000) 812-817 39 A.D. Petelska, Z.A. Figaszewski, Biochim. Biophys. Acta 1561 (2002) 135-146 40 A.D. Petelska, Z.A. Figaszewski, Biophys. Chem. 104 (2003) 13-19 41 A.D. Petelska, Z.A. Figaszewski, Biophys. Chem. 104 (2003) 5-11 18
obie powierzchnie błony, co ułatwia transport elektrolitów przez dwuwarstwowe błony lipidowe. Wyjaśniłam wpływ obecności walinomycyny i gramicydyny w dwuwarstwie lecytynowej na jej napięcie międzyfazowe 42,43. Na uwagę zasługuje całkowicie odmienny wpływ obecności gramicydyny od wpływu walinomycyny w dwuwarstwie lecytynowej. Wzrost analitycznego stężenia gramicydyny powoduje, bowiem obniżenie napięcia międzyfazowego przy stałym stężeniu jonów K +. Rozprawę doktorską obroniłam i uzyskałam tytuł doktora w grudniu 2001 roku. Praca była częściowo sponsorowana przez grant promotorski KBN 3T09A 006 15. Wyniki zostały opublikowane w siedmiu artykułach, z których pięć ukazało się już po obronie pracy doktorskiej 39-43. Od października 2000 roku zostałam zatrudniona na stanowisko asystenta w Instytucie Chemii Uniwersytetu w Białymstoku. Od tego czasu pracuję w Pracowni Elektrochemii kierowanej przez prof. dr hab. Zbigniewa Figaszewskiego (od grudnia 2007 roku na stanowisku adiunkta). W lutym 2003 roku rozpoczęłam 6-miesięczny staż postdoktorski na Uniwersytecie California w Davis (USA) pod kierunkiem Profesora R. Fawcetta. W czasie stażu zajmowałam się pomiarami impedancji samoorganizujących się monowarstw tworzonych na złotych ultramikroelektrodach. Działalność naukowa po uzyskaniu stopnia doktora Po uzyskaniu tytułu doktora moja aktywność naukowa dotyczyła kilku zagadnień: 1. Napięcie międzyfazowe dwuwarstwowych membran lipidowych. 2. Badania monowarstw lipidowych. 3. Wpływ jonów o różnej wartościowości na równowagi zachodzące pomiędzy monowarstwą Langmuira a subfazą. 4. Analiza impedancyjna dwuwarstw lipidowych. 5. Badania wpływu różnych czynników na ładunek powierzchniowy błon erytrocytów i trombocytów. 6. Elektrochemia cieczowych granic fazowych. 42 A.D. Petelska, M. Naumowicz, Z.A. Figaszewsk, Bioelectrochemistry 65 (2005) 143-148 43 A.D. Petelska, M. Naumowicz, Z.A. Figaszewski, Colloids Surf. B 44 (2005) 158-162 19
Badania napięcia międzyfazowego dwuwarstwowych membran lipidowych dotyczyły głównie poznanie wpływu różnych czynników: obecności innego fosfolipidu, kwasów tłuszczowych czy amin o różnej długości łańcucha węglowodorowego, aminokwasów czy ph środowiska i zostały szczegółowo opisane w części dotyczącej rozprawy habilitacyjnej 44,45. Wyniki tych badań zostały zebrane i opisane przeze mnie w artykule przeglądowych zatytułowanym Interfacial tension of bilayer lipid membrane opublikowanym w lutym 2012 roku. Badania związane z monowarstwami Langmuira dotyczyły skonstruowania, wykonania i sprawdzenia przy moim współudziale i pod moim nadzorem aparatury pomiarowej 46. Szczegóły dotyczące badań równowag zachodzących w monowarstwach Langmuira na granicy faz woda/powietrze zostały opisane w części dotyczącej rozprawy habilitacyjnej. Znajomość równowag kwasowo-zasadowych oraz równowag kompleksowych pomiędzy składnikami błony, czy pomiędzy składnikami błony a środowiskiem pozwala na zrozumienie procesów, które mają miejsce zarówno na jej powierzchni oraz w samej dwuwarstwie, czy monowarstwie. Otrzymane przeze mnie wyniki mogą być stosowane w ilościowym opisie właściwości fizykochemicznych i elektrycznych błon biologicznych. Badania te stanowią podstawę przewodu habilitacyjnego. Zbadałam również wpływ jonów K +, Ca 2+ i Mg 2+ na monowarstwę zbudowaną z lecytyny na granicy faz woda/powietrze z wykorzystaniem wanny Langmuira 47, 48, 49. Wybrałam do badań te pierwiastki, które mają ogromne znaczenie w poprawnym funkcjonowaniu organizmu człowieka. Jony Ca 2+ biorą udział w rozprzestrzenianiu się pobudzenia w mięśniu sercowym, w procesach odpornościowych i regeneracyjnych wapń wpływa na ruchliwość makrofagów, syntezę i uwalnianie przeciwciał oraz na syntezę białek budulcowych i regulatorowych. Jony Ca 2+ również wpływają na zapoczątkowanie i przebieg procesu krzepnięcia krwi. Magnez jest niezbędny w organizmie człowieka do działania ponad 300 reakcji enzymatycznych oraz niezbędny do prawidłowego przebiegu wielu procesów fizjologicznych, takich 44 A.D. Petelska, M. Naumowicz, Z.A. Figaszewski: "Physicochemical insights into equilibria in bilayer lipid membranes in Advances in Planar Lipid Bilayers and Liposomes (H.T. Tien, A. Ottova Eds.), Elsevier, Amsterdam, vol. 3, Chapter 5, 2006, pp.125-187 45 A.D. Petelska, Cent. Eur. J. Chem. 10 (2012) 16-26 46 A.D. Petelska, Z.A. Figaszewski, J. Macromol. Sci., Part A 46 (2009) 607-614 47 A.D. Petelska, Z.A. Figaszewski, J.Membrane Biol. 244 (2011) 61-66 48 A.D. Petelska, A. Niemcunowicz-Janica, M. Szeremeta, Z.A. Figaszewski, Langmuir 26 (2010) 13359-13363 49 A.D. Petelska, Z.A. Figaszewski, Cent. Eur. J. Chem. 11 (2013) 424-429 20