IDENTYFIKACJA SUBSTANCJI W CHROMATOGRAFII CIECZOWEJ Prof. dr hab. inż. Agata Kot-Wasik, prof. zw. PG agawasik@pg.gda.pl 11
Rozdzielenie + detekcja 22
Anality ZNANE Co oznaczamy? Anality NOWE NIEZNANE WWA Farmaceutyki Pestycydy Metabolity farmaceutyków POP s Związki perfluorowane Polimery Związki endokrynne Substancje słodzące Produkty degradacji POP s Witaminy Dopalacze Białka Kwasy tłuszczowe 3
ANALIZA CELOWANA ZNANE ANALITY analiza porównawcza IDENTYFIKACJA ANALIZA POŚREDNIA ZNANE ANALITY analiza bez wzorców ANALIZA NIECELOWANA NIEZNANE ANALITY identyfikacja analitów 4
IDENTYFIKACJA ANALIZA CELOWANA ZNANE ANALITY analiza porównawcza 5
IDENTYFIKACJA 1. Przygotować roztwór wzorcowy analitu Mcz, wzór sumaryczny, wzór strukturalny, rozpuszczalność, widma UV, IR, MS 6
IDENTYFIKACJA 1. Przygotować roztwór wzorcowy analitu 2. Analiza HPLC: wyznaczenie czasu retencji 7
IDENTYFIKACJA 1. Przygotować roztwór wzorcowy analitu 2. Analiza HPLC: wyznaczenie czasu retencji 3. Analiza HPLC (próbka) 4. Analiza HPLC (próbka)? 5. Porównanie czasu retencji 6. Identyfikacja na podstawie czasu retencji 8
IDENTYFIKACJA 9
IDENTYFIKACJA 10
Przykład Analiza HPLC: Wzorzec 25B-NBOMe IS 4-CMC Analiza HPLC: Próbka IS 25B-NBOMe 4-CMC 11
Przykład próbka wzorzec 445,4 410,4 445,4 410,4 445,4 427,3 445,4 427,3 12
Przykład próbka wzorzec 445,4 410,4 445,4 410,4 445,4 427,3 ttet = 5,82min 445,4 427,3 ttet = 5,81min 13
Przykład próbka wzorzec Czas retencji t r 2*t 0 445,4 410,4 445,4 410,4 Względny (skorygowany) czas retencji: trrt in GC ± 0.5%; trrt in LC ±2.5% (Commision Decision 2002/657/EC) 445,4 427,3 445,4 427,3 Kryterium: 2% or 0.10 min dla LC i GC WADA Executive Committee WADA TD2010IDCR World Anti-Doping Agency - WADA 14
KRYTERIA IDENTYFIKACJI Czas retencji t r 2*t 0 Względny (skorygowany) czas retencji: trrt in GC ± 0.5%; trrt in LC ±2.5% (Commision Decision 2002/657/EC) Kryterium: 2% or 0.10 min dla LC i GC WADA Executive Committee WADA TD2010IDCR 15
STABILNY CZAS RETENCJI 16
STABILNY CZAS RETENCJI 17
STABILNY CZAS RETENCJI Wymagane stabilizowanie temperatury kolumny chromatograficznej 18
Identyfikacja próbka Sa mp le 1 Sa mp le Sa 1 mp le 1 Analiza chromatograficzna 19
Identyfikacja próbka Sa mp le 1 Sa mp le Sa 1 mp le 1 Analiza chromatograficzna 20
Przykład? Czas [min] 21
WIDMO ABSORPCYJNE Chromofor Analiza jakościowa (identyfikacja) 200 250 300 350 400 450 Długość fali [nm] 22
Absorpcja światła IDENTYFIKACJA 23
Widma absorpcyjne 24
Absorpcja światła stewiozyd 25
Absorpcja światła 26
Absorpcja światła 27
Absorpcja światła 28
WIDMO FLUORESCENCYJNE 29
WIDMO FLUORESCENCYJNE 30
KOELUCJA? 31
32
CHROMATOGRAM 3D 33
IDENTYFIKACJA ANALIZA POŚREDNIA ZNANE ANALITY analiza bez wzorców 34
IDENTYFIKACJA ANALIZA POŚREDNIA ZNANE ANALITY analiza bez wzorców ANALIZA NIECELOWANA NIEZNANE ANALITY identyfikacja analitów 35
IDENTYFIKACJA ANALIZA POŚREDNIA ZNANE ANALITY analiza bez wzorców ANALIZA NIECELOWANA NIEZNANE ANALITY identyfikacja analitów 36
WIDMA MS 37
Jednowymiarowa spektrometria mas 38
IDENTYFIKACJA ZWIĄZKU WIDMO MS dla Diklofenaku C14H11Cl2NO2 Mw = 295,0167 39
IDENTYFIKACJA ZWIĄZKU WIDMO MS dla Diklofenaku C14H11Cl2NO2 Mw = 295,0167 Jony fragmentacyjne Jon molekularny 40
Tandemowa spektrometria mas 41
Tandemowa spektrometria mas 42
Analizator czas przelotu Q TOF 43
KRYTERIA IDENTYFIKACJI minimum 3 punkty identyfikacyjne (ang. identification points IP) Commision Decision 2002/657/E L 221/8 Official Journal of the European Communities 17.8.2002 (2002/657/EC) 44
KRYTERIA IDENTYFIKACJI Technika IP LC-MS 1 SIM 1 LC-MS/MS 1 za jon 1.5 za przejście SRM (1 jon prekursor 1 jon produkt fragmentacji) 2.5 2 SRM (1 jon prekursor 2 jony produkty fragmentacji) 4 2 1 ion in full SCAN 2 2 za jon 2.5 za przejście MS/MS (1 jon prekursor 1 jon produkt fragmentacji) 4.5 MS/MS (1 jon prekursor 2 jony produkt fragmentacji) 7.5 LC-Q TOF MS IP uzyskane 45
Chromatogram EIC: 25B-NBOMe (C18H22BrNO3): UPLC QTOF-MS Ascentis Express C18 (10 cm x 4,6 mm, dp = 2,7 μm) mobile phase: water with 0,01% FA and ACN with 0,01% FA, gradient column temperature: 40 C; mobile phase flow rate: 0.3 ml/min ESI 120V masa zmierzona: 380.0851 m/z; masa teoretyczna [M + H]: 380.0856 m/z 46
KRYTERIA IDENTYFIKACJI Dokładność wyznaczenia masy min. 4 miejsca po przecinku Błąd wyznaczenia masy < 2 (7) ppm Rozdzielczość w MS > 20 000 FWHM 47
MS/MS dla m/z = 380 48
MS/MS dla m/z = 380 25B-NBOMe 380,0 121,2 i 380,00 91,10 49
MS/MS dla m/z = 380 25B-NBOMe 380,0 121,2 i 380,00 91,10 Analiza ilościowa Potwierdzenie identyfikacji 50
Przykład: identyfikacja tetracykliny Przejście w MRM: 445,4 410,4; 427,3 Standard Jakościowa analiza 445,4 410,4 Ilościowa analiza 445,4 427,3 51
Stosunek intensywności dla wybranych jonów m/z (MS) lub dla wybranych przejść (MS/MS) musi być stały i w zakresie do 20% 445,4 427,3 Wzorzec Próbka 445,4 427,3 445,4 410,4 445,4 410,4 MRM dla tetracykliny (wzorzec): 1,28 MRM dla tetracykliny w próbce: 1,26 52
KRYTERIA IDENTYFIKACJI Dokładność wyznaczenia masy min. 4 miejsca po przecinku Błąd wyznaczenia masy < 2 (7) ppm Rozdzielczość w MS ALE: Q-TOF MS m/z=329,0001 Q-TOF MS/MS 328,5 329,5 (okno detekcji ~ 1Da) > 20 000 FWHM 53
Dokładność 54
PROFIL IZOTOPOWY 25B-NBOMe CH3 H3C O O NH Br O CH3 55
ANALITYCZNE WYZWANIA Wyniki tzw. FAŁSZYWIE POZYTYWNE False positive result (niewystarczająca selektywność problem chromatograficzny) Wyniki tzw. FAŁSZYWIE NEGATYWNE False negative result (tłumienie jonizacji problem detekcji MS) 56 56
WYNIKI FAŁSZYWIE POZYTYWNE Identyfikacja związku: ANALIZA JAKOŚCIOWA 1. Zgodność czasu retencji 2. Wykluczenie koelucji 3. Dokładność wyznaczenia masy / Rozdzielczość MS 57 57
Porównanie widm Widmo MS dla roztworu wzorca Widmo MS dla próbki 58
Przykład trudności w identyfikacji Metabolit kokainy Atropina C16H19NO4 C17H23NO3 Mw = 289.13141 Mw = 289.16771 [M+H]+= 290.13867 [M+H]+= 290.17505 59
WYKLUCZENIE KOELUCJI Czystość piku: zgodność widm MS Wzorzec Próbka A B C 60
WYKLUCZENIE KOELUCJI Czystość piku: zgodność widm MS Wzorzec Próbka A B C 61
WYNIKI FAŁSZYWIE NEGATYWNE 20% 22% 50% 55% M.D. Hernandoa et all J.Chromatogr.A., 1046, (2004) 133 140 62 62
TŁUMIENIE SYGNAŁU MS 20% 22% 50% 55% M.D. Hernandoa et all J.Chromatogr.A., 1046, (2004) 133 140 63 63
EFEKTY MATRYCOWE Stosowanie wzorców wewnętrznych (deuterowanych lub znaczonych izotopowo) Krzywa kalibracyjna z odwzorowaniem matrycy 64
Co dalej? Prof. dr hab. inż. Agata Kot-Wasik, prof. zw. PG agawasik@pg.gda.pl 65 65