RAPORT ROCZNY ZA ROK 1... z realizacji Projektu w ramach Programu LIDER ZA OKRES OD 01. 04. 2014 R. DO 31. 12. 2014 R. Podaćnumer roku sprawozdawczego 1.DANE O PROJEKCIE Tytułprojektu Nr umowy Data rozpoczęcia realizacji Projektu (zgodnie z umową) Słowa kluczowe Klasyfikacja wg OECD Nowy algorytm identyfikacji zakażeń Mycobacterium kansasii LIDER/044/457/L 4/12/NCBR/2013 01. 04. 2014 r. Data zakończenia realizacji Projektu (zgodnie z umową) 31. 04. 2017 r. Mycobacterium kansasii ; typowanie genetyczne; molekularna diagnostyka bakteriologiczna; algorytm identyfikacji; epidemiologia Nauki medyczne i nauki o zdrowiu Biotechnologia medyczna 2. DANE KONTAKTOWE KIEROWNIKA PROJEKTU I JEDNOSTKI Imięi nazwisko Kierownika Projektu Dr n. med. Tomasz JAGIELSKI Telefon (0) 22 55 41 312 e mail t.jagielski@biol.uw.edu.pl Nazwa Jednostki Uniwersytet Warszawski Adres 00 927 Warszawa; Krakowskie Przedmieście 26/28 Dane osoby odpowiedzialnej ze strony Jednostki za kontakty z NCBR /podaćimięi nazwisko osoby, stanowisko służbowe i nazwa komórki organizacyjnej/ Dr n. med. Tomasz JAGIELSKI Telefon (0) 22 55 41 312 Fax (0) 22 55 41 402 e mail t.jagielski@biol.uw.edu.pl Strona 1 z 13
3. ZADANIA BADAWCZE ZAAWANSOWANIE PRAC /od początku realizacji projektu/ N r z a d a n i a * Nazwa zadania* Status zadania (nie rozpoczęte/trwa/z akończone) Planowana realizacja zadania wg harmonogramu umowy * Termin rozpoczęcia realizacji zadania Termin zakończenia realizacji zadania Planowany koszt zadania (w zł) Data rozpoczęcia realizacji zadania 1 Przygotowanie materiału badawczego; wybór szczepów M. kansasii i ich rewitalizacja na pożywkach hodowlanych; zebranie i opracowanie wywiadu epidemiologicznego, w tym zebranie wywiadu o chorych, od których izolowano szczepy; analiza dokumentacji medycznej i laboratoryjnej; izolacja DNA chromosomowego ze szczepów M. kansasii ; typowanie genetyczne szczepów M. kansasii (analiza sekwencyjna częśći.) 2 Identyfikacja gatunkowa; weryfikacja przynależności szczepów do gatunku M. kansasii (testy biochemiczne, HPLC, analiza PCR RFLP); typowanie genetyczne szczepów M. kansasii (analiza sekwencyjna częśćii); analiza profilów lekooporności (metoda mikrorozcieńczeń) 3 Typowanie genetyczne szczepów M. kansasii (m. in. analiza PFGE, AFLP, MST, PCR RFLP, analiza sekwencyjna częśćiii); opracowanie nowej metody genotypowania (analiza bioinformatyczna); analizy komparatystyczne i filogenetyczne; określenie pokrewieństw genetycznych między szczepami M. kansasii ; wykreślenie struktury genetycznej badanej populacji M. kansasii ZAKOŃCZONE 2014 04 01 2014 09 30 148 800 2014 04 01 TRWA 2014 10 01 2015 03 31 200 400 2014 10 01 NIE ROZPOCZĘTE 2015 04 01 2016 09 30 493 200 NIE DOTYCZY Strona 2 z 13
4 Analiza profilów lekooporności (metoda pasków E test); poszukiwanie genów związanych z wirulencją M. kansasii (analiza bioinformatyczna) i identyfikacja takich genów wśród szczepów M. kansasii (PCR sequencing) 5 Integracja i opracowanie danych; analiza statystyczna; propozycja algorytmu identyfikacji szczepów M. kansasii o szczególnym znaczeniu epidemiologiczny i klinicznym jako zasady nowego testu diagnostycznego NIE ROZPOCZĘTE 2015 12 01 2016 11 30 236 400 NIE DOTYCZY NIE ROZPOCZĘTE 2016 12 01 2017 03 31 121 200 NIE DOTYCZY Razem 1 200 000,00 zł Razem Wypełnićdla wszystkich zadańod początku realizacji Projektu. * Wypełnićzgodnie z harmonogramem stanowiącym załącznik nr 2 do umowy. ** Koszt poniesiony suma kosztów kwalifikowanych w poprzednich latach budżetowych oraz wydatków poniesionych w bieżącym okresie sprawozdawczym. Strona 3 z 13
4. ZESTAWIENIE KOSZTÓW STOPIEŃWYKORZYSTANIA BUDŻETU W bieżącym roku sprawozdawczym Koszty Planowane * (wg kosztorysu) (w zł) Koszty Poniesione ** (w zł) Koszty Planowane * (w zł) Od po 1. Wynagrodzenia z pochodnymi 439 800 100 264,64 439 800 2. Aparatura 90 000 0,00 90 000 3. Inne koszty bezpośrednie 470 200 117 529,39 470 200 4. Koszty ogólne 200 000 43 558,80 200 000 Całkowity koszt realizacji Projektu = suma poz. 1 4 1 200 000 261 352,83 1 200 000 * zgodnie z kosztorysem stanowiącym załącznik nr 3 do umowy ** Suma wydatków poniesionych w bieżącym okresie sprawozdawczym *** Suma kosztów kwalifikowanych w poprzednich latach budżetowych oraz wydatków poniesionych w bieżącym okresie sprawozdawczym Strona 4 z 13
5. OPIS PRAC REALIZOWANYCH W BIEŻĄCYM OKRESIE SPRAWOZDAWCZYM Zadanie * nr 1 Nazwa zadania: Przygotowanie materiału badawczego; wybór szczepów M. kansasii i ich rewitalizacja na pożywkach hodowlanych; zebranie i opracowanie wywiadu epidemiologicznego, w tym zebranie wywiadu o chorych, od których izolowano szczepy; analiza dokumentacji medycznej i laboratoryjnej; izolacja DNA chromosomowego ze szczepów M. kansasii ; typowanie genetyczne szczepów M. kansasii (analiza sekwencyjna częśći.) Wykonawcy zadania (imięi nazwisko, pełniona funkcja osób w zespole badawczym biorących udziałw realizacji zadania): 1. Dr Tomasz Jagielski a). Wybór i wstępna charakterystyka epidemiologiczna szczepów Mycobacterium kansasii izolowanych w latach 2000 2013; b). Typowanie genetyczne ( rpob typing) szczepów M. kansasii izolowanych w latach 2000 2013; c). Nadzór merytoryczny nad wszystkimi etapami eksperymentalnymi projektu uruchomionymi i realizowanymi w okresie sprawozdawczym; d). Organizacja i prowadzenie spotkańroboczych członków zespołu badawczego; e). Współautorstwo publikacji i doniesieńzjazdowych 2. Mgr Zofia Bakuła a). Rewitalizacja i hodowla szczepów M. kansasii izolowanych w latach 2000 2009; b). Typowanie genetyczne ( hsp65 typing) szczepów M. kansasii izolowanych w latach 2000 2009; c). Współautorstwo publikacji i doniesieńzjazdowych 3. Mgr Izabela Szulc a). Optymalizacja metody izolacji i izolacja chromosomowego DNA ze szczepów Mycobacterium kansasii 4. Mgr Katarzyna Roeske a). Typowanie genetyczne ( hsp65 typing) szczepów M. kansasii izolowanych w latach 2010 2013 5. Mgr Małgorzata Proboszcz a). Rewitalizacja i hodowla szczepów M. kansasii izolowanych w latach 2010 2013 6. Dr Magdalena Nowacka Mazurek a). Zebranie i opracowanie danych klinicznych chorych, od których izolowano szczepy M. kansasii ; b). Współautorstwo publikacji i doniesieńzjazdowych 7. Dr Aleksandra Safianowska a). Konsultacja w przygotowaniu materiału badawczego (szczepów M. kansasii ); b). Współautorstwo publikacji i doniesieńzjazdowych Opis realizowanych prac**: W ramach zadania nr 1, zgodnie z Harmonogramem projektu, przygotowano materiałbadawczy. Na podstawie przeglądu dokumentacji laboratoryjnej i mikrobiologicznej (z lat 2000 2013) Katedry Chorób Wewnętrznych, Pneumonologii i Alergologii Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego (WUM), dokonano wyboru szczepów M. kansasii jako próby badanej do dalszych zadańbadawczych projektu. Szczepy rewitalizowano na pożywkach hodowlanych i izolowano z nich chromosomowy DNA (po optymalizacji protokółu izolacji). Rozpoczęto teżprace z zakresu typowania genetycznego szczepów M. kansasii ; w badaniu tym wykorzystano dwa genetyczne loci, tj. fragmenty genów hsp65 i rpob. Genotypowanie przy użyciu obu markerów genetycznych ( hsp65 rpob typing) było kontynuowane w ramach zadania nr 2 (por. niżej). Od początku realizacji zadania nr 1, zbierano i analizowano dokumentacjęmedycznąchorych, od których izolowano wybrane szczepy M. kansasii. Ze względu na wyjątkowy charakter tej pracy (m.in. konieczność dotarcia do archiwów medycznych, dociekanie brakujących danych, śledzenie historii choroby w różnych placówkach medycznych, itp.), nie udało sięjej zakończyć, jak planowano w harmonogramie projektu, w czasie przeznaczonym na realizacjęzadania nr 1 (tj. do 30. 09. 2014 r.). Przegląd dokumentacji medycznej chorych stanowi zatem jedyny fragment zadania nr 1, który nie zostałw pełni zamknięty i jest kontynuowany w ramach zadania nr 2 (por. niżej). Strona 5 z 13
Zadanie nr 2 Nazwa zadania: Identyfikacja gatunkowa; weryfikacja przynależności szczepów do gatunku M. kansasii (testy biochemiczne, HPLC, analiza PCR RFLP); typowanie genetyczne szczepów M. kansasii (analiza sekwencyjna częśćii); analiza profilów lekooporności (metoda mikrorozcieńczeń) Wykonawcy zadania (imięi nazwisko, pełniona funkcja osób w zespole badawczym biorących udziałw realizacji zadania): 1. Dr Tomasz Jagielski a). Typowanie genetyczne ( rpob typing) szczepów Mycobacterium kansasii izolowanych w latach 2000 2013; b). Optymalizacja warunków amplifikacji fragmentu 16S rdna w szczepach Mycobacterium kansasii ; c). Nadzór merytoryczny nad wszystkimi etapami eksperymentalnymi projektu uruchomionymi i realizowanymi w okresie sprawozdawczym; d). Organizacja i prowadzenie spotkańroboczych członków zespołu badawczego; e). Współautorstwo publikacji i doniesieńzjazdowych 2. Mgr Zofia Bakuła a). Typowanie genetyczne ( hsp65 typing) szczepów Mycobacterium kansasii izolowanych w latach 2000 2009; b). Współautorstwo publikacji i doniesieńzjazdowych 3. Mgr Izabela Szulc a). Opracowanie warunków amplifikacji dla sekwencji repetytywnych VNTR Mycobacterium kansasii : MKAN MIRU13 i MKAN MIRU14 4. Mgr Katarzyna Roeske a). Typowanie genetyczne ( hsp65 typing) szczepów Mycobacterium kansasii izolowanych w latach 2010 2013 5. Mgr Małgorzata Proboszcz a). Identyfikacja szczepów Mycobacterium kansasii metodą HPLC; b). Współautorstwo doniesieńzjazdowych 6. Dr Magdalena Nowacka Mazurek a). Zebranie i opracowanie danych klinicznych chorych, od których izolowano szczepy Mycobacterium kansasii ; b). Współautorstwo publikacji i doniesieńzjazdowych 7. Dr Aleksandra Safianowska a). Konsultacja przy identyfikacji gatunkowej szczepów Mycobacterium kansasii ; b). współautorstwo w publikacjach i doniesieniach zjazdowych 8. Dr Anna Brzostek a). Konsultacja przy optymalizacji typowania genetycznego szczepów Mycobacterium kansasii technikąanalizy sekwencyjnej wybranych genetycznych loci ( hsp65, rpob ) Opis realizowanych prac**: W ramach zadania nr 2, rozpoczętego, zgodnie z Harmonogramem projektu, 1. 10. 2014 r. i realizowanego do chwili obecnej, ukończono prace z zakresu identyfikacji gatunkowej, polegające na weryfikacji przynależności wybranych szczepów do gatunku M. kansasii, przy pomocy testów biochemicznych, analizy HPLC oraz analiz PCR RFLP. Ponadto, kontynuowano badania dotyczące typowania genetycznego szczepów M. kansasii, w oparciu o dwa markery genetyczne, tj. fragmenty genów hsp65 i rpob. Wytypowano równieżsekwencje repetytywne w genomie M. kansasii (o potencjalnym znaczeniu jako markery genetyczne w identyfikacji/różnicowaniu prątków między i wewnątrzgatunkowym) oraz opracowano protokółich amplifikacji. W trakcie realizacji zadania nr 2 kontynuowano także zbieranie i analizowanie dokumentacji medycznej chorych. W końcu, w ramach rozpoczętego zadania nr 2, zgodnie z Harmonogramem projektu, przystąpiono do oznaczeńprofilów lekowrażliwości szczepów M. kansasii metodą mikrorozcieńczeń(zadanie to jest w trakcie realizacji). Podsumowując, realizacja wszystkich prac badawczych ujętych w zadaniach nr 1 i 2 przebiega zgodnie z Harmonogramem projektu. Niewielkim odstępstwem jest kontynuacja jednego z zadańszczegółowych, wymienionych w ramach zadania nr 1, w czasie przeznaczonym na realizacjęzadania nr 2. To wydłużenie czasowe jednego z zadań szczegółowych nie zaburza struktury Kosztorysu projektu, gdyżnie niesie kosztów materiałowych. Jednocześnie przewiduję, że zadanie to zostanie ukończone razem z zakończeniem całego zadania nr 2. Termin 31. 03. 2015 r., tj. jak przewidziano w Harmonogramie projektu, wydaje sięniezagrożony. Tabelęnależy wypełnićtylko dla zadańwykonywanych w bieżącym okresie sprawozdawczym. *Nr i nazwa zadania zgodne z harmonogramem stanowiącym załącznik nr 2 do umowy. ** Opis rezultatów osiągniętych w okresie sprawozdawczym lub działańwykonanych w tym okresie w przypadku zadań, które nie zostały jeszcze zakończone. Strona 6 z 13
6. SPRAWOZDANIE MERYTORYCZNE PODSUMOWANIE OSIĄGNIĘTYCH WYNIKÓW (nie więcej niż10 str. A4) 6.1 Sumaryczny opis rezultatów osiągniętych w Projekcie (w podziale na zadania) od początku realizacji Projektu ZADANIE NR 1 Nazwa zadania: Przygotowanie materiału badawczego; wybór szczepów M. kansasii i ich rewitalizacja na pożywkach hodowlanych; zebranie i opracowanie wywiadu epidemiologicznego, w tym zebranie wywiadu o chorych, od których izolowano szczepy; analiza dokumentacji medycznej i laboratoryjnej; izolacja DNA chromosomowego ze szczepów M. kansasii ; typowanie genetyczne szczepów M. kansasii (analiza sekwencyjna częśći.) Status zadania: zakończone / w trakcie realizacji (wybraćwłaściwe) Opis rezultatów: 1. PRZYGOTOWANIE MATERIAŁU BADAWCZEGO; WYBÓR SZCZEPÓW M. KANSASII I ICH REWITALIZACJA NA POŻYWKACH HODOWLANYCH Pierwszy etap realizacji projektu obejmowałstaranne przeszukanie kolekcji szczepów należącej do Katedry Chorób Wewnętrznych, Pneumonologii i Alergologii Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego (WUM), w celu wyboru tylko takich szczepów, które wcześniej zostały zidentyfikowane jako M. kansasii, przy użyciu metod hodowlanych i chromatograficznych, względnie testu GenoType Mycobacterium CM/AS (HAIN Lifescience, Niemcy) w latach 2000 2013. Chodziło przy tym o wybór takich szczepów, które były izolowane od chorych, dla których dostępna była dokumentacja medyczna i laboratoryjna. W ten sposób wytypowano do badańgrupę174 szczepów pochodzących od 104 pacjentów (przypadki kliniczne z lat 2000 2013). Przy sporządzaniu wykazu szczepów wytypowanych do badań, uwzględniono podstawowe informacje socjo demograficzne i kliniczne dotyczące pacjentów, informacje dotyczące materiału klinicznego, z którego izolowano szczepy, a także dane na temat wszystkich badańdiagnostycznych wykonanych w celu identyfikacji prątków M. kansasii. Badanąkolekcjęuzupełniono dodatkowo o szczepy M. kansasii reprezentujące różne typy genetyczne. W tym celu zakupiono szczep referencyjny M. kansasii Hauduroy ATCC 12478 (I typ genetyczny). Poza tym, dzięki uprzejmości Radboud University Nijmegen Medical Centre (i współpracującego w ramach projektu dr. J. van Ingen) pozyskano szczep M. kansasii Hauduroy ATCC 25221 (I typ genetyczny) a także 3 inne szczepy należące do typu I (NLA001000927; NLA001000449; 1010001454), 5 szczepów reprezentujących II typ genetyczny (B11073207; NLA00100521; B11063838; NLA001001128; 1010001458) i po jednym szczepie reprezentującym III (1010001468), IIIb (1010001469), IV (1010001493), V (1010001495) oraz III/V (NLA001001166) typ genetyczny. Kolejnym etapem projektu była rewitalizacja szczepów na pożywce Löwenstein a Jensen a. Chodziło tu o wyprowadzenie żywych kultur ze starych szczepów, przechowywanych na pożywkach hodowlanych w chłodni (temp. 4 o C) lub w stanie zamrożenia (temp. 80 o C). (Żywych szczepów prątków wymagająbadania lekowrażliwości.) Ponieważprątki M. kansasii należądo bakterii wolnorosnących (kolonie pojawiająsięw hodowli zwykle po upływie ok. 2 tygodni; niekiedy hodowlę uzyskuje siędopiero przy drugiej lub trzeciej próbie rewitalizacji ze stanu zamrożenia), etap rewitalizacji szczepów był bardzo czasochłonny. Ostatecznie udało sięrewitalizować66 (37,9%) szczepów, pochodzących od 47 (45.2%) pacjentów. 2. IZOLACJA DNA CHROMOSOMOWEGO ZE SZCZEPÓW M. KANSASII Izolacjęgenomowego DNA przeprowadzono dla wszystkich badanych szczepów (174). Wykorzystano w tym celu zestaw AMPLICOR Respiratory Specimen Preparation Kit (Roche Diagnostics, Szwajcaria) i protokółproducenta z własnymi modyfikacjami. (Proces izolacji DNA prątków byłspecjalnie optymalizowany). Dla wszystkich 174 badanych szczepów uzyskano DNA w stężeniach wystarczających do dalszych molekularnych analiz. 3. TYPOWANIE GENETYCZNE SZCZEPÓW M. KANSASII (ANALIZA SEKWENCYJNA CZĘŚĆI.) W ramach zadania nr 1 rozpoczęto badania w zakresie typowania genetycznego szczepów M. kansasii. Przeprowadzono, analizęsekwencyjnąfragmentu genu hsp65 (644 pz) dla 104 szczepów, pochodzących od różnych pacjentów. Dodatkowo, wykonano analizęsekwencyjnąfragmentu genu rpob (342 pz) dla wybranych (15) szczepów M. kansasii, reprezentujących Strona 7 z 13
różne typy genetyczne (por. zad. nr 2 p. 2). Stosowano metodępcr sequencing, wg protokółów publikowanych wcześniej [2,6], zawierających własne modyfikacje. Podobieństwo [%] sekwencji oceniano względem sekwencji odpowiednich loci szczepu ATCC 12478 (szczep referencyjny należący do I typu genetycznego M. kansasii ), zdeponowanych w bazie GenBank (NCBI). Wyniki analizy hsp65 typing przedstawiono w Tabeli I. Tabela I. Wyniki analizy sekwencyjnej genu hsp65 dla 104 szczepów M. kansasii izolowanych od pojedynczych pacjentów. Liczba szczepów Analiza sekwencyjna genu hsp65 99 100% 2 99% 2 brak produktu 1 97% (typ II) Wśród badanych szczepów, dla 101 (97,1%) sekwencja fragmentu genu hsp65 była identyczna lub niemal identyczna (99% podobieństwa) z odpowiadającąsekwencjąw szczepie referencyjnym ATCC 12478 (typ I). Szczepy te uznano jako prezentujące genotyp I. Jeden szczep, którego sekwencja genu hsp65 wykazywała 97% podobieństwa z odpowiadającą sekwencjąw szczepie referencyjnym ATCC 12478 (typ I) został, w toku dalszych analiz, rozpoznany jako prezentujący II typ genetyczny. 4. ZEBRANIE I OPRACOWANIE WYWIADU EPIDEMIOLOGICZNEGO, W TYM ZEBRANIE WYWIADU O CHORYCH, OD KTÓRYCH IZOLOWANO SZCZEPY. ANALIZA DOKUMENTACJI MEDYCZNEJ I LABORATORYJNEJ Bardzo ważnym etapem podjętym w ramach zadania nr 1 była szczegółowa analiza retrospektywna danych o pacjentach, od których izolowano szczepy M. kansasii. Analiza uwzględniała możliwie pełnącharakterystykędemograficznąi kliniczną pacjentów. Kwalifikacjęprzypadku mykobakteriozy rozpatrywano na podstawie kryteriów klinicznych (i), radiologicznych (ii) i bakteriologicznych (iii), zdefiniowanych przez American Thoracic Society (ATS) [1]. Z uwagi na specyficzny charakter tej części projektu, wymagającej dotarcia do archiwów medycznych, współpracy z różnymi klinicystami, nierzadko z różnych ośrodków, czas przeznaczony na jej realizacjęzostałprzedłużony o czas trwania kolejnego zadania (nr 2). Na podstawie analizy danych laboratoryjnych, przeprowadzonej przy wyborze próby badanej (por. p. 1), ustalono, że wśród 104 pacjentów, wydalających prątki wytypowane do badań, było 61 kobiet i 43 mężczyzn. Wiek ustalono dla 97 (93,3%) pacjentów (zakres, 21 92 lata; średnia wieku, 63,8 ± 17,8 lat (64 ± 17,9 lat dla kobiet, 64 ± 17,2 lat dla mężczyzn)). W okresie objętym sprawozdaniem, szczegółowąanalizędokumentacji medycznej przeprowadzono dla 46 (44,2%) spośród 104 pacjentów zakwalifikowanych w pierwszym etapie zadania nr 1. W liczbie 46 prześledzonych przypadków, 17 (36,9%) stanowiły przypadki potwierdzonej mykobakteriozy (spełnione wszystkie trzy kryteria, wg ATS). Prawdopodobną mykobakteriozę(spełnione dwa z trzech kryteriów, wg ATS) rozpoznano u 13 (28,3%) pacjentów. U pozostałych 16 (34,8%) pacjentów wykazano kolonizacjęprątkami M. kansasii (spełniony tylko jeden lub niespełnione kryteria, wg ATS). ZADANIE NR 2 Nazwa zadania: Identyfikacja gatunkowa; weryfikacja przynależności szczepów do gatunku M. kansasii (testy biochemiczne, HPLC, analiza PCR RFLP); typowanie genetyczne szczepów M. kansasii (analiza sekwencyjna częśćii); analiza profilów lekooporności (metoda mikrorozcieńczeń) Status zadania: zakończone / w trakcie realizacji (wybraćwłaściwe) Opis rezultatów: 1. IDENTYFIKACJA GATUNKOWA. WERYFIKACJA PRZYNALEŻNOŚCI SZCZEPÓW DO GATUNKU M. KANSASII (TESTY BIOCHEMICZNE, HPLC, ANALIZA PCR RFLP) Na tym etapie realizacji projektu weryfikowano przynależnośćgatunkowąbadanych szczepów. Dla wszystkich 174 wytypowanych szczepów przeprowadzono uzupełniającąidentyfikacjęgatunkowąprzy użyciu techniki HPLC [4], a także analizy PCR RFLP dla genów hsp65 i rpob, wg wcześniej opublikowanych protokółów [5,6]. Dla 104 szczepów, izolowanych od różnych pacjentów, przeprowadzone zostało typowanie testem GenoType Mycobacterium CM/AS (Hain, Niemcy). Strona 8 z 13
Dodatkowo, test GenoType Mycobacterium CM/AS wykonano dla szczepów, dla których uzyskano niejednoznaczne wyniki identyfikacji przy użyciu pozostałych metod. Łącznie test GenoType Mycobacterium CM/AS wykonano dla 118 szczepów. Ważnym celem tej części projektu było porównanie 4 różnych metod stosowanych w identyfikacji prątków M. kansasii, tj.: techniki HPLC (i), komercyjnego testu GenoType Mycobacterium CM/AS (ii) oraz analizy PCR RFLP dwóch genetycznych loci ( hsp65, rpob ) (iii; iv). Podobna analiza porównawcza nigdy wcześniej nie była przeprowadzona. Do analizy włączono tylko szczepy pochodzące od różnych pacjentów (104). Wyniki przedstawiono w Tabeli II. Tabela II. Wyniki analizy porównawczej metod stosowanych w identyfikacji gatunkowej prątków M. kansasii. Liczba szczepó w Metoda stosowana w identyfikacji gatunkowej: HPLC GenoType Mycobacterium CM/AS PCR RFLP hsp65 PCR RFLP rpob 97 M. kansasii M. kansasii M. kansasii M. kansasii 2 M. kansasii M. kansasii M. kansasii brak produktu 2 M. kansasii M. kansasii brak produktu brak produktu 1 M. kansasii brak DNA brak produktu M. kansasii 1 M. kansasii M. kansasii M. kansasii M. xenopii 1 M. kansasii bakterie inne niż Mycobacterium sp. M. kansasii M. kansasii Odsetek szczepów zidentyfikowanych jako M. kansasii wyniósł100% (104/104 szczepy) dla techniki HPLC, 98% (102/104) dla testu GenoType Mycobacterium CM/AS, 97% (101/104) dla metody PCR RFLP hsp65 oraz 95% (99/104) dla metody PCR RFLP rpob. Zbieżne wyniki we wszystkich 4 metodach uzyskano dla 97 (93,3%) szczepów. 2. TYPOWANIE GENETYCZNE SZCZEPÓW M. KANSASII (ANALIZA SEKWENCYJNA CZĘŚĆII). Wyniki identyfikacji gatunkowej przeprowadzonej przy użyciu metody PCR RFLP dla genów hsp65 i rpob (por. p. 1) wykorzystano także do określenia typów genetycznych M. kansasii. Oznaczenie typów genetycznych wymagało przeprowadzenia uzupełniających reakcji restrykcji dla produktów amplifikacji otrzymanych w procedurze PCR RFLP. Wyniki oznaczeńdla wszystkich 174 badanych szczepów M. kansasii przedstawiono w Tabeli III. Ogółem, na podstawie połączonych wyników analizy PCR RFLP hsp65 i rpob, 168 (96,5%) szczepów zidentyfikowano jako I typ genetyczny, a jeden (0,6%) szczep jako II typ genetyczny. Liczba szczepów Tabela III. Ocena przynależności badanych szczepów do podgatunku. Metoda stosowana w typowaniu genetycznym: PCR RFLP hsp65 PCR RFLP rpob 159 M. kansasii I M. kansasii I 5 M. kansasii I brak produktu 2 M. kansasii I M. xenopii 1 M. kansasii II M. kansasii II 2 brak produktu M. kansasii I 3 brak produktu brak produktu 1 M. xenopii M. xenopii 1 M. fortuitum brak produktu W ramach omawianej części projektu przeprowadzono teżuzupełniające analizy typowania dla wybranych (15) szczepów M. kansasii reprezentujących różne typy genetyczne (kontynuacja zadania nr 1 p. 3). Ogólnie, dla wszystkich tych szczepów wykonano identyfikacjęprzy użyciu testu GenoType Mycobacterium CM/AS, typowanie metodąpcr RFLP dla genów hsp65 i rpob oraz analizy sekwencyjne dla fragmentu genu hsp65 (644 pz), rpob (342 pz) oraz niekodującego regionu ITS (436 pz) [3]. Wyniki analiz zestawiono w Tabeli IV i V. Uzyskane wyniki wykazały, że test GenoType Mycobacterium CM/AS, często stosowany do wykrywania prątków atypowych (włączając M. kansasii ), nie pozwala na identyfikacjętypów genetycznych M. kansasii. Różnice w profilach hybrydyzacyjnych testu sąniepowiązane z przynależnościąszczepu do określonego typu genetycznego. Strona 9 z 13
Z kolei analiza sekwencyjna genów hsp65, rpob i ITS wykazała homogennośćgenetycznąw obrębie genotypu I M. kansasii (podobieństwo sekwencji we wszystkich trzech loci: 99 100%) oraz pewne zróżnicowanie genetyczne w obrębie genotypu II M. kansasii (np. podobieństwo sekwencji w regionie ITS: 91 100%). Tabela IV. Wyniki analiz przeprowadzonych dla wybranych szczepów M. kansasii prezentujących różne typy genetyczne. * L.p. Numer szczepu Typ ** Typ wg HAIN PCR RFLP Analiza sekwencyjna genu/regionu: hsp65 rpob hsp65 rpob ITS 1. ATCC12478 I III I I 100% 100% 100% 2. B11073207 II III II II 97% 95% 95% 3. NLA00100521 II III I I BD *** 99% 95% 4. ATCC25221 I III I I 100% 99% 100% 5. NLA001001166 III V III IV IV 96% 92% 91% 6. B11063838 II III II II 96% 95% 95% 7. NLA001000927 I III I I 100% 99% 100% 8. NLA001001128 II III II II 96% 95% 96% 9. NLA001000449 I III I I 100% 99% 100% 10. 1010001468 III I III III BD 96% 91% 11. 1010001454 V IV V V 95% 96% 92% 12. 1010001458 II IV IV IV 97% 93% 93% 13. 1010001493 IV IV V V 95% 97% 93% 14. 1010001495 I III I I 100% 99% 100% 15. 1010001469 IIIb III II II 97% 95% 95% * Szczepy zakupione w kolekcjach kultur lub udostępnione przez Radboud University Nijmegen Medical Centre (poza pulą174 szczepów wytypowanych do badań); ** Oznaczenie typu genetycznego wg specyfikacji dołączonej do przesłanego szczepu; *** BD, brak danych Tabela V. Podobieństwo sekwencji w trzech różnych loci w obrębie wyróżnionych typów genetycznych I i II M. kansasii. * Analiza sekwencyjna genu/regionu:* Typ Liczba Liczba Liczba hsp65 rpob szczepów szczepów szczepów ITS I 5 100% 5 99 100% 5 100% II 4 96 100% 5 94 100% 5 91 100% * Szczepy zakupione w kolekcjach kultur lub udostępnione przez Radboud University Nijmegen Medical Centre (poza pulą174 szczepów wytypowanych do badań) W okresie podlegającym sprawozdaniu rozpoczęto analizęsekwencyjnąregionu ITS, fragmentu genu rpob (342 pz) oraz fragmentu genu 16S rrna dla wszystkich pozostałych szczepów M. kansasii (innych niżwymienionych w Tab. III) wytypowanych do badańw projekcie. W okresie sprawozdawczym, w ramach zadania nr 2, podjęto teżposzukiwania sekwencji repetytywnych w genomie M. kansasii, mogących byćużytymi w funkcji markerów genetycznych w identyfikacji/różnicowaniu prątków M. kansasii (szczepów i typów genetycznych). W tym celu przeprowadzono analizęsekwencji genomu szczepu M. kansasii ATCC 12478, dostępnąw bazie GenBank (NCBI Ref. Seq.: NC_022663.1) przy użyciu programu NTI Vector. Zidentyfikowano 19 potencjalnych loci zawierających sekwencje powtórzone. Zaprojektowano 19 par starterów dla amplifikacji wytypowanych sekwencji. Obecnie zoptymalizowany protokółamplifikacji sekwencji MIRU1 18 i MIRU23 jest testowany na wybranej puli szczepów M. kansasii. 3. ANALIZA PROFILÓW LEKOOPORNOŚCI (METODA MIKROROZCIEŃCZEŃ) Pod koniec sprawozdawanego okresu (12. 2014 r.) rozpoczęto kolejnym etap projektu (obecnie w trakcie realizacji) zaplanowany w ramach zadania nr 2 Harmonogramu projektu, tj. oznaczanie wrażliwości szczepów M. kansasii na panel leków p/prątkowych. Stosowana jest metoda mikrorozcieńczeń, wg wytycznych Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) [8]. Wśród testowanych leków sąleki tzw. pierwszego rzutu: streptomycyna (SM), izoniazyd (INH), etambutol (EMB) Strona 10 z 13
i ryfampicyna (RMP), a także leki tzw. drugiego rzutu, tj. ryfabutyna (RFB), amikacyna (AMK), ciprofloksacyna (CFX), klofazymina (CFZ), klarytromycyna (CLR) i etionamid (ETH). PIŚMIENNICTWO: 1. Griffith D.E., Winthrop K. i wsp.: ATS Mycobacterial Diseases Subcommittee; American Thoracic Society; Infectious Disease Society of America. An official ATS/IDSA statement: diagnosis, treatment, and prevention of nontuberculous mycobacterial diseases. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 175, 367 416 (2007) 2. Hong K., Sun Hyun K., Tae Sun S., Mi na K., Gill Han B., Young Gil P., Sueng Hyun L., Chang Yong C., Yoon Hoh K., Bum Joon K. PCR restriction fragment length polymorphism analysis (PRA) algorithm targeting 644 bp Heat Shock Protein 65 ( hsp65 ) gene for differentiation of Mycobacterium spp. J. Microb. Met. 62, 199 209 (2005) 3. Iwamoto T. I Saito H. Comparative study of two typing methods hsp65 PRA and ITS sequencing revealed a possible evolutionary link between Mycobacterium kansasii type I and II isolates. FEMS Microbiol. Lett. 254, 129 133 (2005) 4. Butler, W. R. i Kilburn J. O. Identification of major slowly growing pathogenic mycobacteria and Mycobacterium gordonae by high performance liquid chromatography of their mycolic acids. J. Clin. Microbiol. 30, 2402 2407 (1988) 5. Telenti A., F. Marchesi, M. Balz, F. Bally, E. C. Böttger, Bodmer T. Rapid identification of mycobacteria to the species level by polymerase chain reaction and restriction enzyme analysis. J. Clin. Microbiol. 31, 175 178 (1993) 6. Kim B. J., K. H. Lee, B. N. Park, S. J. Kim, G. H. Bal, S. J. Kim, Kook Y. H. Differentiation of mycobacterial species by PCR restriction analysis of DNA (343 base pairs) of the RNA polymerase gene ( rpob ). J. Clin. Microbiol. 39, 2102 2109 (2001) 7. Universal Bacterial Identification by PCR and DNA Sequencing of 16S rrna Gene. PCR for Clinical Microbiology, 2010, Part 3, 209 214. 8. National Committee for Clinical Laboratory Standards. 2003. Susceptibility Testing of Mycobacteria, Nocardiae, and Other Aerobic Actinomycetes : Approved Standard M24 A. NCCLS, Wayne, USA. 6.2 Spis publikacji powstałych w ramach Projektu (tytuł, autorzy, wydawnictwo nazwa, tom, rok) 1. Bakuła, Z., Safianowska, A., Nowacka Mazurek, M., Bielecki, J., Jagielski, T. Mycobacterium kansasii : biologia patogenu oraz cechy kliniczne I epidemiologiczne zakażeń. Post. Mikrobiol., 2014, 53(3), 241 254. /Impact Factor 2013 = 0,271/. 6.3 Inne formy upowszechniania wyników badań(np. udziałw konferencjach, sympozjach, wdrożenia), rok 1. Jagielski, T., Modrzejewska, M., Bakuła, Z., Safianowska, A., Nowacka Mazurek, M., Bielecki, J. Typowanie genetyczne szczepów klinicznych Mycobacterium kansasii metodąpcr RFLP dla genów hsp65 i rpoβ. (XXXII. Zjazd Polskiego Towarzystwa Chorób Płuc, Wisła, 2012). R013. (Streszczenie nagrodzone stypendium Polskiego Towarzystwa Chorób Płuc) 2. Bakuła, Z., Safianowska, A., Nowacka Mazurek, M., Bielecki, J., Jagielski, T. The predominance of subtype I among Mycobacterium kansasii clinical isolates from Poland, as evidenced by PCR restriction enzyme analysis of the hsp65 gene. Proceedings of the 24 th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, Barcelona, 2014, p. 184. (In: Mycobacterial susceptibility and molecular epidemiology. P0933). 3. Bakuła, Z., Safianowska, A., Proboszcz, M., Nowacka Mazurek, M., Bielecki, J., Jagielski, T. Comparison of three PCR based methods with high pressure liquid chromatography (HPLC) analysis for the identification of Mycobacterium kansasii clinical isolates. Proceedings of the 25 th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, Copenhagen, 2015, Pxxxx. /Praca przyjęta na zjazd; nagrodzona stypendium przez European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases (ECCMID 2015 Travel Grant)/ 6.4 Informacja o patentach, zgłoszeniach patentowych, licencjach, czy wdrożeniach będących wynikiem projektu, rok Strona 11 z 13
Brak 6.5 Informacja o działaniach promocyjnych zgodnie z umowąna wykonanie projektu (dotyczy: informowania opinii publicznej o tym, że realizacja Projektu została sfinansowana przez Centrum podać datęi miejsce zamieszczenia informacji, sposób informowania) Informacja na stronie Zakładu Mikrobiologii Stosowanej, WydziałBiologii, Uniwersytet Warszawski: http://zms.biol.uw.edu.pl/projekty badawcze/ Witryna internetowa dedykowana projektowi jest obecnie w trakcie realizacji. Jej uruchomienie przewiduje sięna wiosnę 2015 r. 7. ZGODNOŚĆPOSTĘPÓW W REALIZACJI PROJEKTU Z OPISEM PROJEKTU, HARMONOGRAMEM I KOSZTORYSEM PRAC, STANOWIĄCYMI ZAŁĄCZNIKI DO UMOWY Czy postęp i zakres prac sązgodne z umową? TAK NIE Jeśli zaznaczono NIE, tzn. w ciągu okresu sprawozdawczego nastąpiły odstępstwa od ustaleń rzeczowych/czasowych/finansowych zawartych w umowie, należy poniżej wskazać, jakie sąto odstępstwa (i jakich zadańdotyczą), podaćich przyczyny, wymienić podjęte lub planowane działania naprawcze, określićwpływ na dalsze prowadzenie projektu i osiągnięcie planowanych rezultatów. Zadanie nr Nazwa zadania. Odstępstwo:. Przyczyna:. Działania naprawcze:.. Wpływ na rezultaty Projektu:. Zadanie nr... 8. CZY DALSZE PROWADZENIE PRAC PROWADZI DO OSIĄGNIĘCIA ZAKŁADANYCH WYNIKÓW? Tak Nie 9. PODPISY I PIECZĘCIE Data i podpis Kierownika Projektu Podpis i pieczęćsłużbowa osoby odpowiedzialnej ze strony Jednostki za częśćfinansowąraportu PieczęćJednostki 10. POTWIERDZENIE ZŁOŻENIA RAPORTU wypełnia NCBR Data złożenia raportu Imięi nazwisko pracownika NCBR Strona 12 z 13
Podpis Strona 13 z 13