Zakład Mikrobiologii Krajowe Referencyjne Laboratorium Prątka Cruźlicy. Kierownik Prof. dr hab. n. med.. Ewa Augustynowicz-Kopeć

Transkrypt

1 / INSTYTUT GRUŹLICY I CHORÓB PŁUC Zakład Mikrobiologii Krajowe Referencyjne Laboratorium Prątka Cruźlicy Kierownik Prof. dr hab. n. med.. Ewa Augustynowicz-Kopeć Warszawa ul..plocka 26 Teł.! fax , c- mail: ~<i)i!!i,'hp cd,l,l".ł1! Prof. dr hab.n.med Ewa Augustynowicz-Kopeć Instytut Gruźlicy i Chorób Płuc Zakład Mikrobiologii Recenzja pracy doktorskiej lekarza Jerzego Zientka "Transmisja gruźlicy wśród ludzi zamieszkujących tereny przygraniczne Polski, Czech i Słowacji" Przedstawiona mi do oceny praca doktorska dotyczy bardzo istotnego problemu zdrowia publicznego i epidemiologicznego, jakim jest śledzenie dróg transmisji gruźlicy w środowisku człowieka z zastosowaniem nowoczesnych metod biologii molekularnej. Gruźlica jest chorobą przenoszoną głównie drogą kropelkową, co determinuje łatwość jej rozprzestrzeniania się. Wieloletnie badania nad transmisją gruźlicy w otoczeniu chorego wykazują, że ryzyko zakażenia osoby pozostającej w bliskim kontakcie jest bardzo wysokie. Ryzyko transmisji gruźlicy pomiędzy ludźmi zależy od stopnia zakaźności źródła infekcji, czasu trwania ekspozycji, bliskości kontaktu i czynników środowiskowych, Badania populacyjne opisują przypadki chorych zakażonych tymi samymi szczepami Mycobacterium tuberculosis, co przemawia za ich bieżącą transmisją. W programach walki z gruźlicą istotną rolę odgrywa prawidłowa diagnostyka mikrobiologiczna pozwalająca na szybkie zidentyfikowanie chorego, włączenie terapii zgodnej z antybiogramem oraz ułatwiająca kontrolę nad rozprzestrzenianiem się choroby. Na nadzór i zapobieganie transmisji chorób infekcyjnych składa się wiele działań medycznych i administracyjnych, Obecnie kluczową rolę w dochodzeniach do źródła zakażenia i śledzenia łańcucha transmisji zakażeń odgrywa laboratorium mikrobiologiczne, dostarczając poprzez badania genetyczne niezbitych dowodów pokrewieństwa molekularnego szczepów bakterii, Stosowanie technik epidemiologij molekularnej jest możliwe dzięki poznaniu genomów, wskaźnikowych genów i elementów insercyjnych, które udaje się wykorzystać jako swoiste sondy genetyczne. Badania 1

2 molekularne dostarczają wielu informacji o rozprzestrzenianiu się choroby oraz identyfikują ogniska epidemiczne. W dochodzeniach do źródła zakażenia badania molekularne sąjedynym sposobem na uzyskanie wiarygodnych wyników. Stopień ryzyka zakażenia gruźlicą determinują czynniki środowiskowe - stężenie cząstek infekcyjnych, czas trwania ekspozycji i brak wentylacji powietrza. Wielu ekspertów uważa, że 4-8 godzinny kontakt jest już wystarczający do transmisji prątków. Badania dróg transmisji Mycobacterium tuberculosis są niezwykle trudne, wymagają oszacowania stopnia ryzyka możliwości zakażania się gruźlicą w konkretnej populacji. Osiąga się to poprzez systematyczne śledzenie kontaktów zawodowych, rodzinnych i w bliskim otoczeniu chorego człowieka, określenia czasu trwania ekspozycji, i innych parametrów. Wymagana jest również znajomość epidemiologii gruźlicy w najbliższych krajach sąsiednich, częstości zarobkowego i turystycznego podróżowania ludzi, poziomu i kosztów diagnostyki pulmonologicznej i mikrobiologicznej w danym kraju. Programy walki z gruźlicą mają w wielu krajach priorytet wśród innych chorób zakaźnych, a narodowe programy rezerwują pieniądze na wykrywanie, leczenie i zapobieganie szerzeniu się zachorowań. W Polsce brak jest jednak takiego programu. Do krajów europejskich przybywają imigranci z regionów i kontynentów o wysokich wskaźnikach zapadalności na gruźlicę, w tym również na gruźlicę lekooporną. Szczególnie niebezpieczną grupę stanowią uchodźcy, tak legalni jak i nielegalni oraz osoby przemieszczające się w ramach tranzytu. Stwarza to duże niebezpieczeństwo niekontrolowanego importu ogniska choroby i praktycznego braku możliwości kontroli jej rozprzestrzeniania się. Jest to szczególnie niebezpieczne w przypadku gruźlicy z rodziny molekularnej Beijing. Gruźlica typu Beijing jest obecnie pod szczególnym, światowym nadzorem klinicystów, epidemiologów i mikrobiologów. W wielu krajach podjęto więc próby uszczelnienia granic i tworzenia filtrów epidemiologicznych. Doktorant podjął Się w pracy przeprowadzenia molekularnej analizy Mycobacterium tuberculosis complex wyizolowanych od chorych na szczepów gruźlicę zamieszkujących tereny przygraniczne trzech państw: Polski, Czech i Słowacji. Niezwykle ciekawy wydaje się wybór obszarów zamieszkania chorych na gruźlicę, pochodzących z trzech, wyżej wymienionych krajów. Jak argumentuje to Doktorant: "Od dawna było to naturalne przejście graniczne i komunikacyjne pomiędzy Polską, Czechami i 2

3 Słowacją, które wynikało z naturalnego ukształtowania terenu będącego dorzeczami Odry i Wisły prowadząc do Morza Bałtyckiego oraz innych rzek zmierzających do Morza Czarnego. W tym miejscu przebiegały od czasów prehistorycznych najważniejsze trakty handlowe z południa Europy nad Morze Bałtyckie przez tzw. Bramę Morawską, w tym również szlaki handlowe i komunikacyjne z Polski do Czech i na Słowację". Spowodowało to dynamiczny rozwój na tym terenie sieci kolejowej i drogowej, które ułatwiły przemieszczanie się ludności w tym regionie. Poza tym łatwość komunikacji w przygranicznych regionach w ostatnim czasie znacznie zwiększyła potencjalne kontakty międzyludzkie i możliwość transmisji gruźlicy. Celem podjętej przez Doktoranta pracy doktorskiej była odpowiedź na pytanie: 1. Czy w badanej populacji chorych na gruźlicę zamieszkujących tereny przygraniczne Polski, Czech i Słowacji miała miejsce transmisja gruźlicy? 2. Czy zjawisko to ograniczało się do poszczególnych krajów czy obserwowano je również pomiędzy chorymi różnych narodowości? 3. Jaka część populacji szczepów prątków gruźlicy izolowanych od chorych w danym kraju reprezentowała "narodowe typy molekularne", a jaki odsetek to szczepy "z importu" spoza granic kraju? Cele cząstkowe realizowano poprzez: 1. Analizę demograficzną chorych (wiek, płeć, stopień pokrewieństwa, adres zamieszkania, datę rejestracji w CRG), 2. Charakterystykę mikrobiologiczną szczepów (identyfikację, lekooporność), 3. Analizę genetyczną szczepów, ustalenie ich wzorów molekularnych oraz zbadanie pokrewieństwa molekularnego pomiędzy szczepami. Cele pracy zostały sformułowane w sposób przejrzysty prowadzenia badań. Jasno wytyczają kierunek W rozdziale " Materiały i Metody" Doktorant zapoznaje czytelnika z zastosowaną metodologią badań. Doktorant w szczegółowy i jasny sposób opisuje metody zbierania danych epidemiologicznych o chorych i danych mikrobiologicznych o wyizolowanych od tych chorych szczepach prątków gruźlicy, które Doktorant zbierał na podstawie opracowanej, 3

4 / własnej ankiety. W rozdziale tym opisane są również metody hodowli, identyfikacji i wykonywania testów lekooporności prątków. W przejrzysty sposób zostały opisane metody molekularne zastosowane w dochodzeniach epidemiologicznych. Rozdział pracy dotyczący metodyki badań jest także opisany przejrzyście i zrozumiale. Badaniami objęto 144 chorych na gruźlicę potwierdzoną bakteriologicznie, którzy w latach byli diagnozowani i leczeni w placówkach opieki zdrowotnej na terenach przygranicznych Polski, Republiki Czech i Republiki Słowacji. W badanej populacji chorych było: 31 mieszkańców Czeskiej Republiki, 57 mieszkańców Republiki Słowacji i 56 mieszkańców Polski, w tym 99 mężczyzn i 45 kobiet w przedziale wieku od 2 do 96 lat. Czym zdaniem Doktoranta można wytłumaczyć fakt, że dominujące grupy wiekowe stanowili chorzy w wieku od 45 do > 65 roku życia? Czy w grupie chorych na gruźlicę dzieci (O - 14) młodych dorosłych (15-19) stwierdzono zachorowania wśród członków ich rodzin? W ramach przeprowadzonej analizy molekularnej szczepów Mtbc wyizolowanych od 144 chorych zidentyfikowano 57 spoligotypów, z których 38 było zarejestrowanych w międzynarodowej bazie SpoIDB4. Najliczniej reprezentowany był spoligotyp T1 53 (28 chorych), jeden chory wydalał szczep prątków należący do rodziny molekularnej Beijing. Przeprowadzona analiza wykazała, że 105 szczepów tworzyło 18 rodzin molekularnych liczących od 2 do 28 chorych, wydalających szczepy o takim samym spoligotypie. Szczepy te zakwalifikowano do kolejnego etapu analizy molekularnej metodą IS61 l O-Mtb 1-Mtb2 PCR. W metodzie tej pokrewieństwo genetyczne szczepów w obrębie rodzin badano, analizując wielkość produktów PCR uzyskanych w dwóch niezależnych reakcjach. Identyczność profili DNA porównywanych szczepów w obu reakcjach decydowała o ich przynależności do jednej rodziny molekularnej. W wyniku badań molekularnych metodą IS6JJO-Mtb1-Mtb2 PCR zidentyfikowano 20 rodzin genetycznych utworzonych przez 72 szczepy. Około pięćdziesiąt procent szczepów wydalanych przez 144 chorych z gruźlicą mieszkających na pograniczu Polski, Czech oraz Słowacji na podstawie genotypów zostało zgrupowane w rodziny molekularne, co świadczy o wysokim stopniu ich klasteryzacji. Krajem o najwyższym odsetku chorych wydalających szczepy zgrupowane w klastery była Słowacja (54,4%), następnie Polska - 50%. Znacznie niższy odsetek klasteryzacji 4

5 wykazywały szczepy prątków gruźlicy wyizolowane od chorych zamieszkujących teren przygraniczny Słowacji - 22,6%. Czym można według Doktoranta wytłumaczyć wysoki wskaźnik klasteryzacji szczepów M. tbe z terenu Polski i Słowacji? Wśród chorych zamieszkujących tereny przygraniczne zidentyfikowano 6 klastrów, w których chorzy wydający szczepy Mtbe o takich samych wzorach molekularnych (30 szczepów stanowiących 20,8% badanej puli szczepów) zamieszkiwali tereny przygraniczne trzech sąsiadujący ze sobą krajów. Czy na sytuację epidemiologiczną gruźlicy na terenach przygranicznych ma wpływ sytuacja kraju o większej zapadalności? Czy udział chorych na gruźlicę z obszaru o większej zapadalności był znacząco wyższy w "klastrach międzynarodowych"? W swoich badaniach Doktorant stwierdził, że w analizowanej populacji chorych na gruźlicę zamieszkujących tereny przygraniczne Polski, Czech i Słowacji miała miejsce transmisja gruźlicy. Czy na podstawie przeprowadzonej analizy danych epidemiologicznych i badań molekularnych w tak zwanych "klasterach międzynarodowych" udało się Doktorantowi ustalić źródło zakażenia gruźlicą w tych grupach chorych? Ważnym wnioskiem płynącym z przeprowadzonych badań jest stwierdzenie, że wysoki wskaźnik klasteryzacji w puli analizowanych szczepów wydalanych przez 144 chorych na gruźlicę może wskazywać na niepowodzenie w przerywaniu łańcucha transmisji i wymaga poprawy krajowych i lokalnych działań w zakresie kontroli nad gruźlicą w danym kraju. Czy Doktorant mógłby wskazać, jakie według Niego działania w tym zakresie wymagają poprawy na poziomie lokalnym i krajowym? Praca ma charakter nowatorski. Po raz pierwszy w Polsce została dokonana molekularna analiza epidemiologiczna szczepów prątków gruźlicy wydalanych przez chorych zamieszkujący tereny przygraniczne trzech państw - Polski, Czech i Słowacji. Doktorant w oparciu o uzyskane dane kliniczne o chorych przeprowadził niezwykle wnikliwe dochodzenie 5

6 epidemiologiczne, podejmując SIę w każdym przypadku określenia prawdopodobieństwa transmisji choroby oraz starał się ustalić źródło zakażenia. Praca napisana jest i podzielona na rozdziały w sposób typowy, poprawnym, zrozumiałym językiem. We wstępie Autor opisuje historię gruźlicy jako chorobę towarzyszącą człowiekowi od początków istnienia ludzkości, poprzez historię odkryć mających zdecydowany wpływ na rozwój wiedzy dotyczący tej choroby zakaźnej. Wymienia czynniki sprzyjające transmisji gruźlicy w środowisku człowieka. Następnie omawia metody konwencjonalne i genetyczne stosowane aktualnie w dochodzeniach epidemiologicznych. Kolejno omawia sytuację epidemiologiczną gruźlicy w sąsiadujących krajach - Polski, Czech i Słowacji. Praca jest ilustrowana starannie wykonanymi 29 wykresami i 8 tabelami. W aneksie zawarte są wyniki wszystkich danych źródłowych przedstawionych w pracy. W omówieniu wyników, Doktorant na 25 stronach w sposób swobodny, wskazujący na doświadczenie naukowe, przyrównuje swoje wyniki do wyników innych autorów zagranicznych i polskich z wykorzystaniem 85 pozycji piśmiennictwa. Jest to nowe, wartościowe dobrze wybrane piśmiennictwo, pochodzące głównie z ostatnich lat. Cele pracy zostały zrealizowane i podsumowane w 5 dobrze zredagowanych wnioskach. Na koniec mojej recenzji chcę podkreślić dużą staranność w przygotowaniu pracy, która napisana jest poprawnym językiem, wszystkie detale wyszczególnione sąjasno, a wiadomości zawarte we wstępie i dyskusji mogą służyć studentom, młodym lekarzom i osobom przystępującym do specjalizacji jako materiały edukacyjne dotyczące metod stosowanych w epidemiologii gruźlicy i śledzenia dróg transmisji choroby w środowisku człowieka. Przed przygotowaniem przez Doktoranta pracy do druku proponuję wprowadzenie kilku zmian merytorycznych i redakcyjnych oraz proszę Autora o uzupełnienie wyników badań o wymienione dane: Brak tabeli zbiorczej dotyczącej identyfikacji wszystkich 144 szczepów Mtbc, ponieważ nie wszystkie szczepy należały do gatunku Mycobacterium tuberculosis. Brak tabeli zbiorczej dotyczącej fenotypu lekooporności analizowanych szczepów, a dane te były analizowane w przeprowadzonych dochodzeniach epidemiologicznych chorych na gruźlicę. Brak komentarza do tabeli w rozdziale

7 Proponuję zrezygnować z Tabeli VIII zawierającej " średnią wielkość klastra", ponieważ wartość ta nic nie wnosi do przeprowadzonej analizy molekularnej szczepów. Moje bardzo drobne uwagi nie umniejszają w niczym wysokiej wartości pracy, którą oceniam bardzo dobrze. Zwracam się do Wysokiej Rady Wydziału Lekarskiego z Oddziałem Lekarsko Dentystycznym w Zabrzu Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Katowicach o dopuszczenie lekarza Jerzego Zientka do dalszych etapów przewodu doktorskiego i wnioskuje o wyróżnienie pracy. 7