RAPORT ROCZNY ZA ROK 2... z realizacji Projektu w ramach Programu LIDER ZA OKRES OD R. DO R.

Transkrypt

1 Podać numer roku sprawozdawczego RAPORT ROCZNY ZA ROK 2... z realizacji Projektu w ramach Programu LIDER ZA OKRES OD R. DO R. 1.DANE O PROJEKCIE Tytuł projektu Nowy algorytm identyfikacji zakażeń Mycobacterium kansasii Nr umowy Data rozpoczęcia realizacji Projektu (zgodnie z umową) Słowa kluczowe Klasyfikacja wg OECD LIDER/044/457/L-4/12/NCBR/ r. 2. DANE KONTAKTOWE KIEROWNIKA PROJEKTU I JEDNOSTKI Data zakończenia realizacji Projektu (zgodnie z umową) r. Mycobacterium kansasii; typowanie genetyczne; molekularna diagnostyka bakteriologiczna; algorytm identyfikacji; epidemiologia Nauki medyczne i nauki o zdrowiu Biotechnologia medyczna Imię i nazwisko Kierownika Projektu Dr n. med. Tomasz JAGIELSKI Telefon (0) t.jagielski@biol.uw.edu.pl Nazwa Jednostki Uniwersytet Warszawski Adres Warszawa; Krakowskie Przedmieście 26/28 Dane osoby odpowiedzialnej ze strony Jednostki za kontakty z NCBR /podać imię i nazwisko osoby, stanowisko służbowe i nazwa komórki organizacyjnej/ Dr n. med. Tomasz JAGIELSKI Telefon (0) Fax (0) t.jagielski@biol.uw.edu.pl Strona 1 z 15

2 Nr zadania* Program LIDER IV konkurs 3. ZADANIA BADAWCZE ZAAWANSOWANIE PRAC /od początku realizacji projektu/ Nazwa zadania* Status zadania (nie rozpoczęte/trwa/z akończone) Planowana realizacja zadania - wg harmonogramu umowy * Rzeczywista realizacja zadania Termin rozpoczęcia realizacji zadania Termin zakończenia realizacji zadania Planowany koszt zadania (w zł) Data rozpoczęcia realizacji zadania Data zakończenia realizacji zadania Poniesiony koszt realizacji zadania (w zł) ** 1 Przygotowanie materiału badawczego; wybór szczepów M. kansasii i ich rewitalizacja na pożywkach hodowlanych; zebranie i opracowanie wywiadu epidemiologicznego, w tym zebranie wywiadu o chorych, od których izolowano szczepy; analiza dokumentacji medycznej i laboratoryjnej; izolacja DNA chromosomowego ze szczepów M. kansasii; typowanie genetyczne szczepów M. kansasii (analiza sekwencyjna część I.) 2 Identyfikacja gatunkowa; weryfikacja przynależności szczepów do gatunku M. kansasii (testy biochemiczne, HPLC, analiza PCR-RFLP); typowanie genetyczne szczepów M. kansasii (analiza sekwencyjna część II); analiza profilów lekooporności (metoda mikrorozcieńczeń) ZAKOŃCZONE ,31 ZAKOŃCZONE ,22 Strona 2 z 15

3 3 Typowanie genetyczne szczepów M. kansasii (m. in. analiza PFGE, AFLP, MST, PCR-RFLP, analiza sekwencyjna część III); opracowanie nowej metody genotypowania (analiza bioinformatyczna); analizy komparatystyczne i filogenetyczne; określenie pokrewieństw genetycznych między szczepami M. kansasii; wykreślenie struktury genetycznej badanej populacji M. kansasii 4 Analiza profilów lekooporności (metoda pasków E-test); poszukiwanie genów związanych z wirulencją M. kansasii (analiza bioinformatyczna) i identyfikacja takich genów wśród szczepów M. kansasii (PCR sequencing) 5 Integracja i opracowanie danych; analiza statystyczna; propozycja algorytmu identyfikacji szczepów M. kansasii o szczególnym znaczeniu epidemiologiczny i klinicznym jako zasady nowego testu diagnostycznego TRWA NIE DOTYCZY ,81 TRWA NIE DOTYCZY ,28 NIE ROZPOCZĘTE NIE DOTYCZY NIE DOTYCZY NIE DOTYCZY Razem ,00 zł Razem ,62 Wypełnić dla wszystkich zadań od początku realizacji Projektu. * Wypełnić zgodnie z harmonogramem stanowiącym załącznik nr 2 do umowy. ** Koszt poniesiony suma kosztów kwalifikowanych w poprzednich latach budżetowych oraz wydatków poniesionych w bieżącym okresie sprawozdawczym. Strona 3 z 15

4 4. ZESTAWIENIE KOSZTÓW STOPIEŃ WYKORZYSTANIA BUDŻETU W bieżącym roku sprawozdawczym Koszty Planowane * (wg kosztorysu) (w zł) Koszty Poniesione ** (w zł) Koszty Planowane * (w zł) Od początku realizacji projektu Koszty Poniesione *** (w zł) 1. Wynagrodzenia z pochodnymi , ,19 2. Aparatura , , ,29 3. Inne koszty bezpośrednie , , ,87 4. Koszty ogólne , ,27 Całkowity koszt realizacji Projektu = suma poz , ,62 * ** zgodnie z kosztorysem stanowiącym załącznik nr 3 do umowy Suma wydatków poniesionych w bieżącym okresie sprawozdawczym *** Suma kosztów kwalifikowanych w poprzednich latach budżetowych oraz wydatków poniesionych w bieżącym okresie sprawozdawczym Strona 4 z 15

5 5. OPIS PRAC REALIZOWANYCH W BIEŻĄCYM OKRESIE SPRAWOZDAWCZYM Zadanie*: nr 2 Nazwa zadania: Identyfikacja gatunkowa; weryfikacja przynależności szczepów do gatunku M. kansasii (testy biochemiczne, HPLC, analiza PCR-RFLP); typowanie genetyczne szczepów M. kansasii (analiza sekwencyjna część II); analiza profilów lekooporności (metoda mikrorozcieńczeń) Wykonawcy zadania (imię i nazwisko, pełniona funkcja osób w zespole badawczym biorących udział w realizacji zadania): 1. Dr Tomasz Jagielski a). Analiza sekwencyjna fragmentu 16S rdna w szczepach Mycobacterium kansasii; b). Nadzór merytoryczny nad wszystkimi etapami eksperymentalnymi projektu uruchomionymi i realizowanymi w ramach zadania nr 2; c). Organizacja i prowadzenie spotkań roboczych członków zespołu badawczego; d). Współautorstwo publikacji i doniesień zjazdowych 2. Mgr Zofia Bakuła a). Analiza sekwencyjna regionu ITS w szczepach Mycobacterium kansasii; b). Współautorstwo publikacji i doniesień zjazdowych 3. Mgr Izabela Szulc a). Typowanie genetyczne szczepów Mycobacterium kansasii w oparciu o sekwencje repetytywne MKAN-MIRU1-18 i MKAN-MIRU23; b). Współautorstwo doniesień zjazdowych 4. Mgr Małgorzata Proboszcz a). Oznaczanie wrażliwości szczepów Mycobacterium kansasii na wybrane leki p/prątkowe; b). Współautorstwo doniesień zjazdowych 5. Dr Aleksandra Safianowska a). Konsultacja przy oznaczaniu lekowrażliwości szczepów Mycobacterium kansasii; b). Współautorstwo publikacji i doniesień zjazdowych Opis realizowanych prac**: W ramach zadania nr 2, zgodnie z Harmonogramem projektu, rozpoczętego dn r. i zakończonego dn r. przeprowadzono typowanie genetyczne szczepów M. kansasii, w oparciu o dwa markery, tj. fragment genu 16S rrna oraz niekodujący region ITS (ang. internal transcribed spacer) w obrębie operonu rrna. Na podstawie wytypowanych wcześniej (patrz Raport roczny za rok I) sekwencji repetytywnych w genomie M. kansasii (MKAN-MIRU1-18 i MKAN-MIRU23) przeprowadzono typowanie genetyczne wybranej kolekcji szczepów M. kansasii. Ponadto, w ramach zadania nr 2, zgodnie z Harmonogramem projektu, rozpoczęto oznaczanie profilów lekowrażliwości szczepów M. kansasii, wg metody mikrorozcieńczeń. Zadanie*: nr 3 Nazwa zadania: Typowanie genetyczne szczepów M. kansasii (m. in. analiza PFGE, AFLP, MST, PCR-RFLP, analiza sekwencyjna część III); opracowanie nowej metody genotypowania (analiza bioinformatyczna); analizy komparatystyczne i filogenetyczne; określenie pokrewieństw genetycznych między szczepami M. kansasii; wykreślenie struktury genetycznej badanej populacji M. kansasii Wykonawcy zadania (imię i nazwisko, pełniona funkcja osób w zespole badawczym biorących udział w realizacji zadania): 1. Dr Tomasz Jagielski a). Analiza sekwencyjna fragmentu genu tuf w wybranych szczepach Mycobacterium kansasii; b). Optymalizacja typowania genetycznego prątków Mycobacterium kansasii metodą PFGE; c). Nadzór merytoryczny nad wszystkimi etapami eksperymentalnymi projektu uruchomionymi i realizowanymi w ramach zadania nr 3; d). Organizacja i prowadzenie spotkań roboczych członków zespołu badawczego; d). Współautorstwo publikacji i doniesień zjazdowych 2. Mgr Zofia Bakuła a). Typowanie testem GenoType Mycobacterium CM/AS szczepów klinicznych Mycobacterium kansasii izolowanych od polskich chorych; b). Współautorstwo publikacji i doniesień zjazdowych 3. Mgr Izabela Szulc a). Typowanie genetyczne szczepów Mycobacterium kansasii w oparciu o nowo zaprojektowane sekwencje starterowe MKAN-MIRU1-18 i MKAN-MIRU23; b). analizy bioinformatyczne sekwencji typu shotgun ; c). Współautorstwo doniesień zjazdowych 4. Mgr Katarzyna Roeske a). Typowanie testem GenoType Mycobacterium CM/AS szczepów klinicznych Mycobacterium kansasii otrzymanych z zagranicznych kolekcji kultur; b). Wykrywanie plazmid pmk12478 w szczepach Mycobacterium kansasii 5. Mgr Małgorzata Proboszcz a). Oznaczanie wrażliwości szczepów Mycobacterium kansasii na wybrane leki p/prątkowe; b). Współautorstwo doniesień zjazdowych 6. Dr Aleksandra Safianowska a). Konsultacja przy oznaczaniu lekowrażliwości szczepów Mycobacterium kansasii; b). Współautorstwo publikacji i doniesień zjazdowych Strona 5 z 15

6 Opis realizowanych prac**: W ramach zadania nr 3, zgodnie z Harmonogramem projektu, rozpoczętego dn r. i realizowanego do chwili obecnej, wykonano uzupełniające i końcowe typowanie genetyczne szczepów M. kansasii przy użyciu komercyjnego zestawu GenoType Mycobacterium CM/AS (Hain Lifescience). Kontynuowano też próby różnicowania w obrębie typów genetycznych M. kansasii za pomocą lokalizowania sekwencji repetytywnych MKAN-MIRU1-18 i MKAN-MIRU23. Ponadto, przeprowadzono analizę sekwencyjną fragmentu genu tuf dla wybranych szczepów M. kansasii i na podstawie otrzymanych wyników zaprojektowano nową metodę (PCR-RFLP) identyfikacji typów genetycznych w obrębie gatunku. Podjęto też badania w zakresie pozyskania sekwencji typu shotgun wybranych szczepów M. kansasii z użyciem metody sekwencjonowania nowej generacji (platforma Illumina). Uzyskano sekwencje dla 18 szczepów M. kansasii, reprezentujących różne typy genetyczne i na podstawie tych sekwencji wykonano analizę zmienności genów konserwowanych w celu wykrycia potencjalnych markerów zróżnicowania w obrębie typów genetycznych M. kansasii. Poszukując determinantów zmienności w szczepach klinicznych M. kansasii, przeprowadzono też analizę obecności plazmidu pmk W trakcie realizacji zadania nr 3, ukończono także oznaczenie profilów lekowrażliwości szczepów M. kansasii, wg metody mikrorozcieńczeń. W końcu, w ramach omawianego zadania rozpoczęto typowanie genetyczne szczepów M. kansasii metodą PFGE (przy użyciu nowo zakupionego zestawu do PFGE - Mapper XA Chiller System, 240V (Bio-Rad)). Zadanie*: nr 4 Nazwa zadania: Analiza profilów lekooporności (metoda pasków E-test); poszukiwanie genów związanych z wirulencją M. kansasii (analiza bioinformatyczna) i identyfikacja takich genów wśród szczepów M. kansasii (PCR sequencing) Wykonawcy zadania (imię i nazwisko, pełniona funkcja osób w zespole badawczym biorących udział w realizacji zadania): 1. Dr Tomasz Jagielski a). Nadzór merytoryczny nad wszystkimi etapami eksperymentalnymi projektu uruchomionymi i realizowanymi w ramach zadania nr 4; b). Organizacja i prowadzenie spotkań roboczych członków zespołu badawczego; c). Współautorstwo publikacji i doniesień zjazdowych 2. Mgr Zofia Bakuła a). Określanie wartości MIC wybranych leków p/prątkowych dla szczepów Mycobacterium kansasii metodą E-test; b). Współautorstwo publikacji i doniesień zjazdowych 3. Dr Aleksandra Safianowska a). Konsultacja przy oznaczaniu lekowrażliwości szczepów Mycobacterium kansasii; b). Współautorstwo publikacji i doniesień zjazdowych Opis realizowanych prac**: W ramach zadania nr 4, rozpoczętego dn r., tj. z 3-miesięcznym wyprzedzeniem w stosunku do Harmonogramu projektu ( r.) i realizowanego do chwili obecnej, wykonano pierwsze oznaczenia profilów lekowrażliwości szczepów M. kansasii, wg metody gradientowo-dyfuzyjnej (paski E-test). W ostatnich dniach sprawozdawanego okresu uruchomiono też analizy bioinformatycznej w celu wykrycia genów związanych z wirulencją prątków M. kansasii. Podsumowując, zadanie nr 2 zostało zakończone zgodnie z Harmonogramem projektu. Podobnie, zgodnie z Harmonogramem projektu, przebiega realizacja prac badawczych ujętych w zadaniach nr 3 i 4. Przy tym, zadanie nr 4 rozpoczęto 3 miesiące wcześniej niż pierwotnie zakładał to Harmonogram projektu. Poza tym, niewielkim odstępstwem od przyjętego na początku planu realizacji projektu jest zamknięcie identyfikacji gatunkowej przy użyciu komercyjnego zestawu GenoType Mycobacterium CM/AS (Hain Lifescience), a także oznaczeń profilów lekowrażliwości M. kansasii, wg metody mikrorozcieńczeń, w ramach zadania nr 3 (a nie zadnia nr 2, jak na to wskazuje Harmonogram projektu). Na chwilę obecną nie ma zagrożenia dla terminowego ukończenia projektu (tj. do dn r.). Tabelę należy wypełnić tylko dla zadań wykonywanych w bieżącym okresie sprawozdawczym. *Nr i nazwa zadania zgodne z harmonogramem stanowiącym załącznik nr 2 do umowy. ** Opis rezultatów osiągniętych w okresie sprawozdawczym lub działań wykonanych w tym okresie w przypadku zadań, które nie zostały jeszcze zakończone. Strona 6 z 15

7 6. SPRAWOZDANIE MERYTORYCZNE PODSUMOWANIE OSIĄGNIĘTYCH WYNIKÓW (nie więcej niż 10 str. A4) 6.1 Sumaryczny opis rezultatów osiągniętych w Projekcie (w podziale na zadania) od początku realizacji Projektu ZADANIE NR 2 Nazwa zadania: Identyfikacja gatunkowa; weryfikacja przynależności szczepów do gatunku M. kansasii (testy biochemiczne, HPLC, analiza PCR-RFLP); typowanie genetyczne szczepów M. kansasii (analiza sekwencyjna część II); analiza profilów lekooporności (metoda mikrorozcieńczeń) Status zadania: zakończone/w trakcie realizacji (wybrać właściwe) Opis rezultatów: 1. TYPOWANIE GENETYCZNE SZCZEPÓW M. KANSASII (ANALIZA SEKWENCYJNA CZĘŚĆ II) W poprzednim okresie sprawozdawczym ( r.) przeprowadzono analizę sekwencyjną fragmentu genu hsp65 (644 pz), fragmentu genu rpob (342 pz) oraz niekodującego regionu ITS (ang. internal transcribed spacer), w obrębie operonu rrna (436 pz) dla wybranych 15 szczepów M. kansasii reprezentujących różne typy genetyczne i pochodzących z kolekcji Radboud University Nijmegen Medical Centre (patrz Raport roczny za rok I Sprawozdanie merytoryczne Zadanie nr 2 pkt 2 Tabela IV). W okresie podlegającym niniejszemu sprawozdaniu analizą sekwencyjną w/w genetycznych loci postanowiono objąć pozostałe szczepy M. kansasii, pochodzące od pojedynczych pacjentów (104). Wyniki analizy regionu ITS dla takich szczepów przedstawiono w Tab. I. Tabela I. Wyniki analizy sekwencyjnej regionu ITS dla 104 szczepów M. kansasii izolowanych od pojedynczych pacjentów. Liczba szczepów Podobieństwo [%] sekwencji * % 1 ** 95% 3 <50% 3 brak produktu * Oceniane względem sekwencji regionu ITS szczepu ATCC (szczep referencyjny M. kansasii genotyp I); ** Szczep reprezentujący genotyp II; wszystkie pozostałe szczepy (103) zostały wcześniej oznaczone jako genotyp I. Wszystkie szczepy M. kansasii genotypu I, dla których otrzymano produkt PCR (97/104; 93,3%), miały identyczną sekwencję ITS. Wyjątek stanowiły 3 szczepy, dla których analiza sekwencyjna regionu ITS wykluczyła przynależność do gatunku M. kansasii (wynik ten wskazuje na kontaminację próbek). Nie zidentyfikowano występowania typów pośrednich M. kansasii (możliwość taką daje właśnie analiza sekwencyjna regionu ITS [1]). Dla 15 szczepów M. kansasii genotypu I wykonano analizę sekwencyjną fragmentu genu rpob i fragmentu genu 16S rrna. Podobnie jak w wypadku regionu ITS, nie zaobserwowano żadnej zmienności sekwencyjnej w obu badanych loci. Na tej podstawie uznano, że nie będą one miały zastosowania jako markery zróżnicowania genetycznego w obrębie typów M. kansasii i zaniechano dalszej analizy (dla pozostałych 89 szczepów). Wysokie (99%) podobieństwo sekwencji fragmentu genu 16S rrna między poszczególnymi genotypami M. kansasii, wykluczyło użycie tego regionu również jako markera do identyfikacji do poziomu genotypów. Różnice w sekwencjach regionu ITS między różnymi genotypami M. kansasii starano się wykorzystać dla zaproponowania nowej metody wykrywania genotypów, podobnej do PCR-RFLP dla genów hsp65 i rpob. W tym celu, korzystając z oprogramowania insilico.ehu.es ( [2]) poszukiwano w sekwencjach ITS miejsc restrykcyjnych charakterystycznych dla poszczególnych typów genetycznych. Bez powodzenia. Strategia ta okazała się skuteczna dopiero w wypadku fragmentu genu tuf (patrz Zadanie nr 3 pkt 1). 2. ANALIZA PROFILÓW LEKOOPORNOŚCI (METODA MIKROROZCIEŃCZEŃ) Oznaczenia lekowrażliwości przeprowadzono dla 66 (37,9%) spośród 174 szczepów M. kansasii wytypowanych do badań, gdyż tylko taką liczbę (66) szczepów udało się rewitalizować. Szczepy te pochodziły od 47 (45,2%) pacjentów objętych badaniem (por. Raport roczny za rok I Sprawozdanie merytoryczne Zadanie nr 1 pkt 1). Wyniki oznaczeń lekowrażliwości, wg metody mikrorozcieńczeń, omówiono razem z wynikami lekowrażliwości, wg metody gradientowo-dyfuzyjnej (paski E-test) (patrz Zadanie nr 4 pkt 1). Strona 7 z 15

8 ZADANIE NR 3 Nazwa zadania: Typowanie genetyczne szczepów M. kansasii (m. in. analiza PFGE, AFLP, MST, PCR-RFLP, analiza sekwencyjna część III); opracowanie nowej metody genotypowania (analiza bioinformatyczna); analizy komparatystyczne i filogenetyczne; określenie pokrewieństw genetycznych między szczepami M. kansasii; wykreślenie struktury genetycznej badanej populacji M. kansasii Status zadania: zakończone/w trakcie realizacji (wybrać właściwe) Opis rezultatów: 1. TYPOWANIE GENETYCZNE SZCZEPÓW M. KANSASII (ANALIZA SEKWENCYJNA CZĘŚĆ III) Poszukując nowych markerów zróżnicowania genetycznego M. kansasii, wytypowano, w toku analiz bioinformatycznych i przeglądu piśmiennictwa gen tuf, kodujący czynnik elongacji translacji EF-Tu. Badania innych autorów wskazywały na przydatność analizy sekwencyjnej tego genu w identyfikacji różnych gatunków prątków [3]. Do amplifikacji fragmentu genu tuf (740 pz) wykorzystano startery T1/T2 i protokół PCR wcześniej opisane [3]. W pierwszej kolejności, analizie sekwencyjnej poddano 15 szczepów M. kansasii prezentujących różne typy genetyczne (por. Zadanie nr 2 pkt 1). Analizy bioinformatyczne wykazały istotną zmienność sekwencji fragmentu genu tuf między różnymi typami genetycznymi, przy jednoczesnej pełnej homologii w obrębie tych samych typów genetycznych. Liczba różnic między sekwencjami genu tuf dla różnych typów genetycznych wahała się od 14 (typ II versus typ IV) do 46 (typ III versus typ VI) zmian nukleotydowych, przekładając się, odpowiednio, na 98% i 93% podobieństwa sekwencji. Odległości genetyczne między poszczególnymi typami genetycznymi M. kansasii (I-VI), na podstawie analizy sekwencyjnej fragmentu genu tuf zilustrowano na drzewie filogenetycznym (Ryc. 1). Ryc. 1. Dendrogram ilustrujący odległości genetyczne między badanymi szczepami M. kansasii należącymi do różnych typów genetycznych (I-VI), wyprowadzony na podstawie sekwencji fragmentu genu tuf. Na podstawie wyników analizy sekwencyjnej fragmentu genu tuf, zaprojektowano nową metodę typowania genetycznego M. kansasii. W metodzie tej, produkt amplifikacji (PCR) poddaje się analizie restrykcyjnej przy użyciu pojedynczego enzymu MvaI. Enzym ten został wybrany spośród kilkuset innych, w toku symulowanych in silico restrykcji fragmentu genu tuf od różnych typów genetycznych M. kansasii. Użycie enzymu MvaI dawało najbardziej dyskryminatywne (charakterystyczne i łatwo identyfikowane dla poszczególnych typów genetycznych M. kansasii) wzory restrykcyjne (Tab. II). Tabela II. Profile restrykcyjne dla genotypów I-VI M. kansasii, na podstawie PCR-RFLP dla fragmentu genu tuf (MvaI). Typ Długość fragmentów restrykcyjnych (MvaI) [pz] generowanych w analizie in silico oczekiwanych w żelu agarozowym I 321, 87, 84, 70, 69, 59, , 90, 70, 60, 50 II 321, 121, 87, 84, 69, , 120, 90, 70, 60 III 321, 171, 71, 69, 58, , 170, 70, 60, 50 IV 492, 72, 63, 58, 51, 6 490, 70, 60, 50 V 390, 171, 71, 57, , 170, 70, 60, 50 VI 408, 120, 84, 72, , 120, 80, 70, 60 Strona 8 z 15

9 Zaprojektowaną reakcję PCR-RFLP przeprowadzono dla pojedynczych szczepów M. kansasii reprezentujących poszczególne genotypy (I-VI) (Ryc. 2), a dalej także dla 80 szczepów klinicznych, wyizolowanych od pojedynczych pacjentów. Wyniki genotypowania były całkowicie zbieżne z wynikami typowania metodą PCR-RFLP dla genów hsp65 i rpob oraz metodą analizy sekwencyjnej regionu ITS uzyskanymi wcześniej (Tabela III). Ryc. 2. Wyniki restrykcji enzymem MvaI sekwencji fragmentu genu tuf otrzymanych w wyniku amplifikacji (PCR) ze szczepów M. kansasii typu: I (ATCC12478), II (B ), III ( ), IV ( ), V ( ), VI (NLA ); wzorzec wielkości GeneRuler LowRange DNA Ladder. Tabela III. Porównanie metod dotychczas stosowanych w genotypowaniu M. kansasii i nowo zaprojektowanej metody PCR-RFLP dla genu tuf. Oznaczenie szczepu Liczba szczepów * Typ genetyczny ustalony metodą: PCR-RFLP sekwencjonowanie hsp65 rpob tuf ITS ATCC12478; ATCC25221; NLA ; NLA ; NLA ; ; POL1-9; POL I I I I B ; B NLA ; ; POL10 5 II II II II III III III III IV IV IV IV ; V V V V NLA VI VI VI VI * Ogółem 95 szczepów; w puli tej 15 szczepów udostępnionych przez Radboud University Nijmegen Medical Centre i 80 szczepów wyizolowanych od pacjentów z Polski. 2. TYPOWANIE GENETYCZNE SZCZEPÓW M. KANSASII (ANALIZA SEKWENCYJNA CZĘŚĆ III) NEXT GENERATION SEQUENCING (NGS) W ramach zadania nr 3 rozpoczęto badania w zakresie pozyskania sekwencji typu shotgun dla wybranych szczepów M. kansasii przy użyciu metody sekwencjonowania nowej generacji (platforma Illumina). Uzyskano sekwencje 18 szczepów M. kansasii, reprezentujących różne typy genetyczne (I-VI). W oparciu o zebrane dane sekwencyjne wykonano analizę zmienności genów konserwowanych (AroC, ArgH, cya, dnan, thra, suca, rpob, purh, pure, pta, murc, hisd, hemd). Przeprowadzono analizę drzew filogenetycznych z wykorzystaniem algorytmu Neighbor Joining. Wytypowano szczególnie interesujące geny (np. ArgH) do dalszych analiz, mogące spełniać funkcję markerów zróżnicowania genetycznego w obrębie poszczególnych genotypów M. kansasii. 3. TYPOWANIE GENETYCZNE SZCZEPÓW M. KANSASII (ANALIZA SEKWENCYJNA CZĘŚĆ III) DETEKCJA PLAZMIDU pmk12478 W związku z doniesieniami o związku obecności plazmidu pmk12478 w szczepach M. kansasii z ich wirulencją [4,5], korzystając z wcześniej opracowanego protokołu [5], zbadano występowanie tego plazmidu we wszystkich szczepach objętych badaniem (174), a także 15 szczepów pochodzących z kolekcji Radboud University Nijmegen Medical Centre. Wyniki pokazano w Tabeli IV. Spośród 174 badanych szczepów, plazmid pmk12478 wykryto w 34 (19,5%) szczepach, wyizolowanych od 25 (24%) pacjentów. Strona 9 z 15

10 ATCC Program LIDER IV konkurs Tabela IV. Obecność plazmidu pmk12478 w szczepach M. kansasii. Nr szczepu Genotyp pmk12478 Oznaczenie szczepu Genotyp pmk12478 ATCC12478 I II + NLA I III + ATCC25221 I IV - NLA I V - NLA I V I - NLA VI - B II + POL1,8-10,20-6,31,40-3,46,51-2,60-3,130,145,155,160-2,164-5,170,172-3 I + B II - POL2-7,11-9,27-30,32-9,44-5,47-50,53-9,64-129,131-44,146-54,156-9,163,166-9,171,174 I - NLA II + POL10 II - 4. TYPOWANIE GENETYCZNE SZCZEPÓW M. KANSASII ANALIZA W OPARCIU O SEKWENCJE REPETYTYWNE MKAN-MIRU Na podstawie opracowanych uprzednio warunków amplifikacji krótkich tandemowych sekwencji powtórzonych zidentyfikowanych w genomie M. kansasii (MKAN-MIRU1-18, MKAN-MIRU23), zbadano ich obecność wśród wybranych 12 szczepów M. kansasii (w tej liczbie 7 szczepów genotypu I oraz 5 szczepów genotypu II). Wyniki typowania w oparciu o sekwencje MKAN-MIRU1-18,23 dla 7 szczepów M. kansasii genotypu I przedstawiono w Tab. V. Tabela V. Wyniki amplifikacji sekwencji MKAN-MIRU1-18 i MKAN-MIRU23 dla 7 szczepów M. kansasii (genotyp I). MKAN- MIRU Wielkość produktu dla szczepu wzorc. [pz] Jednostka powtórzona [pz] Liczba powtórzeń Sekwencja flankująca [pz] , , , , , brak , , , ca. 850 ca. 850 ca. 850 ca. 850 ca. 850 ca. 850 ca , , ,3 632 ca. 550 brak brak brak brak brak brak ca , , , , , Ogólnie, wykazano niewielki potencjał różnicujący sekwencji MKAN-MIRU1, 5, 7, 12, 13 i 16 pomiędzy szczepami M. kansasii należącymi do I typu genetycznego i podobnie nieznaczną zdolność dyskryminatywną sekwencji MKAN-MIRU2, 7, 11, 13 i 16 wobec szczepów M. kansasii reprezentujących II typ genetyczny. Obecnie trwają poszukiwania kolejnych sekwencji repetytywnych, o większej sile różnicującej w obrębie poszczególnych genotypów M. kansasii. 5. TYPOWANIE GENETYCZNE SZCZEPÓW M. KANSASII ANALIZA PFGE Ważnym etapem badawczym podjętym w ramach zadania nr 3 było włączenie analizy PFGE (elektroforeza pulsacyjna w zmiennym polu elektrycznym; ang. pulsed-field gel electrophoresis) dla oceny zróżnicowania wewnątrzgatunkowego (na poziomie genotypów i szczepów) M. kansasii. Jak dowiedziono wcześniej, metoda ta pozwala różnicować szczepy M. kansasii w obrębie poszczególnych typów genetycznych [6,7]. Dotychczas udało się opracować i wdrożyć protokół analizy PFGE, a także zoptymalizować większość warunków eksperymentalnych (m.in. otrzymanie hodowli szczepów M. kansasii o właściwej gęstości optycznej, izolacja DNA w bloczkach agarozowych). Obecnie, procedura PFGE testowana jest dla różnych grup szczepów M. kansasii. Istotnym elementem Strona 10 z 15

11 będzie zapewnienie powtarzalności wyników analizy. 6. TYPOWANIE GENETYCZNE SZCZEPÓW M. KANSASII ANALIZA AFLP Z uwagi na znacząco wyższy, wobec pierwotnej oferty handlowej, koszt aparatury do PFGE i podrożenie odczynników, postanowiono wycofać z zadań badawczych analizę AFLP, której koszty odczynnikowe są także wysokie (optymalizacja i wdrożenie tej metody zwykle są czasochłonne, przez co koszty materiałowe mogłyby istotnie nadwyrężyć budżet projektu). ZADANIE NR 4 Nazwa zadania: Analiza profilów lekooporności (metoda pasków E-test); poszukiwanie genów związanych z wirulencją M. kansasii (analiza bioinformatyczna) i identyfikacja takich genów wśród szczepów M. kansasii (PCR sequencing) Status zadania: zakończone/w trakcie realizacji (wybrać właściwe) Opis rezultatów: 1. ANALIZA PROFILÓW LEKOOPORNOŚCI (METODA PASKÓW E-TEST) Kolejnym zadaniem badawczym projektu realizowanym w sprawozdawanym okresie było oznaczenie profilów wrażliwości szczepów M. kansasii na leki stosowane w terapii zakażeń prątkowych, w tym zakażeń wywołanych prątkami M. kansasii. Ustalenie profilów lekowrażliwości M. kansasii prowadzono dwiema metodami metodą rozcieńczeniową (tzw. metodą proporcji), a także metodą gradientowo-dyfuzyjną, przy użyciu komercyjnie dostępnych, tzw. pasków E-test (Biomérieux). Plan doświadczalny projektu zakładał użycie następujących leków: ryfampicyny (RMP), izoniazydu (INH), etambutolu (EMB), streptomycyny (SM) tzw. leki I. rzutu, a także etionamidu (ETH), amikacyny (AMK), klarytromycyny (CLR), ryfabutyny (RFB), ciprofloksacyny (CFX), klofazyminy (CFZ) i cykloseryny (CS) tzw. leki II. rzutu. Z uwagi na wysokie koszty i ograniczoną dostępność niektórych leków, a też chcąc zapewnić maksymalną powtarzalność wyników oznaczeń i ujednolicenie metodyki oznaczeń zdecydowano się wykonać je przede wszystkim przy użyciu komercyjnie dostępnych pasków E-test (Biomérieux). (Zaletą pasków E-test jest także możliwość ustalenia wartości minimalnego stężenia hamującego (MIC, ang. minimal inhibitory concentration) leku w trakcie jednego pasażu, bez konieczności nastawiania szeregu stężeń, jak w metodzie rozcieńczeń). Użycie metody rozcieńczeniowej (proporcji) ograniczono jedynie do zbadania wrażliwości na dwa główne leki p/prątkowe, tj. RMP i INH. Ponadto, ze względu na utrudnioną dostępność RFB, CFX, CFZ i CS postanowiono pominąć je w oznaczeniach, a w ich miejsce włączyć moksyfloksacynę (MFX) i preparat złożony, tj. trimetoprim/sulfametoksazol (TMP/SMX). Ogółem, do badania lekowrażliwości M. kansasii, włączono 66 szczepów (z ogólnej puli 174 szczepów), bo tyle zachowało żywotność po procesie rewitalizacji (por. Raport roczny za rok I Sprawozdanie merytoryczne Zadanie nr 1 pkt 1). Badanie lekowrażliwości metodą rozcieńczeń (proporcji) wykonywano wg wytycznych Clinical and Laboratory Stadards Institute (CLSI) [8], zaś stosując metodę pasków E-test, postępowano ściśle wg zaleceń producenta. Jako szczepów kontrolnych używano szczepu M. tuberculosis H37Rv (metoda rozcieńczeń) i szczepu M. kansasii ATCC12478 (metoda E-test). W sprawozdawanym okresie wykonano oznaczenia wrażliwości 66 szczepów M. kansasii na INH i RMP metodą rozcieńczeń oraz oznaczenia wrażliwości 42 szczepów M. kansasii na 5 leków (RMP, SM, CLM, MOX, TMP/SMX) metodą pasków E-test. Wyniki zestawiono w Tabeli VI. Tabela VI. Wrażliwość szczepów M. kansasii na wybrane leki p/prątkowe w metodzie rozcieńczeń i pasków E-test. Lek Wartość krytyczna [mg/l] * Liczba szczepów opornych (%) Liczba szczepów wrażliwych (%) Średnia wartość MIC MIC 50 MIC 90 E-test RMP 1 0 (0%) 42 (100%) 0,011 ± 0,009 0,008 0,023 SM 10 0 (0%) 42 (100%) 2,095 ± 1,5 1,5 4 CLM 16 0 (0%) 42 (100%) 0,075 ± 0,08 0,064 0,094 MOX 2 0 (0%) 42 (100%) <0,002 ± 0,00015 <0,002 <0,002 TMP/SMX 2/38 43 (100%) 0 (0%) >32/608 >32/608 >32/608 Metoda rozcieńczeń (proporcji) INH 1 66 (100%) 0 (0%) nie dotyczy RMP 40 0 (0%) 66 (100%) nie dotyczy * Stężenia krytyczne leków w metodzie pasków E-test określone zostały wg wytycznych CLSI lub danych literaturowych [8-10]; stężenia krytyczne leków w metodzie proporcji były zgodne z wytycznymi CLSI [8]. Wszystkie szczepy M. kansasii (66) były wrażliwe na RMP i oporne na INH w metodzie rozcieńczeń (proporcji). W metodzie E-test, wszystkie badane szczepy (43) były wrażliwe na cztery leki (RMP, SM, CLM, MOX), przy jednoczesnej oporności na TMP/SMX. Strona 11 z 15

12 Postęp przy realizacji projektu przedstawiono graficznie na Ryc. 3. RYC. 3. SCHEMAT ILUSTRUJĄCY KLUCZOWE ETAPY PROJEKTU POSTĘP PRAC Strona 12 z 15

13 PIŚMIENNICTWO: 1. Iwamoto T., Saito H. Comparative study of two typing methods hsp65 PRA and ITS sequencing revealed a possible evolutionary link between Mycobacterium kansasii type I and II isolates. FEMS Microbiol. Lett. 254, (2005) 2. San Millán RM, et al. Online exercise for the design and simulation of PCR and PCR-RFLP experiments. BMC Res. Notes 6, 513 (2003) 3. Mignard S, Flandrois JP. Identification of Mycobacterium using the EF-Tu encoding (tuf) gene and the tmrna encoding (ssra) gene. J. Med. Microbiol. 56, (2007) 4. Wang J, et al. Insights on the emergence of Mycobacterium tuberculosis from the analysis of Mycobacterium kansasii. Genome Biol. Evol. 7, (2015) 5. Ummels R, et al. Identification of a novel conjugative plasmid in mycobacteria that requires both type IV and type VII secretion. MBio. 5, (2014) 6. Wallace RJ, et al. DNA large restriction fragment pattern of sporadic and epidemic nosocomial strains of Mycobacterium chelonae and Mycobacterium abscessus. J. Clin. Microbiol. 31, (1993) 7. Kwenda G, et al. Molecular characterization of clinical and environmental isolates of Mycobacterium kansasii isolates from South African gold mines. J. Water Health. 3, (2015) 8. National Committee for Clinical Laboratory Standards. Susceptibility testing of Mycobacteria, Nocardiae, and other aerobic Actinomycetes: Approved Standard Second Edition. M24-2A (2011) 9. Gitti Z, et al. Clinical significance and antibiotic susceptibilities of nontuberculous mycobacteria from patients in Crete, Greece. Future Microbiol. 6, (2011) 10. Nie W, et al. Species identification and clarithromycin susceptibility testing of 278 clinical nontuberculosis mycobacteria isolates. Biomed Res. Int. 2015, (2015) 6.2 Spis publikacji powstałych w ramach Projektu (tytuł, autorzy, wydawnictwo nazwa, tom, rok) Prace oryginalne: 1. Bakuła, Z., Modrzejewska, M., Safianowska, A., van Ingen, J., Proboszcz, M., Bielecki, J., Jagielski, T. Proposal of a new method for subtyping of Mycobacterium kansasii based upon PCR-restriction enzyme analysis of the tuf gene. Diagn. Microbiol. Infect. Dis., doi: /j.diagmicrobio /Impact Factor 2014 = 2,457/. 2. Bakuła, Z., Safianowska, A., Nowacka-Mazurek, M., Bielecki, J., Jagielski, T. Subtyping of Mycobacterium kansasii by PCR- Restriction Enzyme Analysis of the hsp65 gene. Biomed Res. Int., 2013, 2013: /Impact Factor 2014 = 1,579/. Prace poglądowe: 1. Jagielski, T., Minias, A., van Ingen, J., Rastogi, N., Brzostek, A., Żaczek, A., Dziadek, J. Molecular epidemiology of Mycobacterium tuberculosis and other mycobacteria: methodological and clinical aspects. Clin. Microbiol. Rev., 2016, 29(2), /Impact Factor 2014 = 17,406/. Manuskrypt publikacji przyjęty do pisma dn r. 6.3 Inne formy upowszechniania wyników badań (np. udział w konferencjach, sympozjach, wdrożenia), rok Udział w konferencjach: 1. Bakuła, Z., Modrzejewska, M., Safianowska, A., Bielecki, J., Jagielski, T. Proposal of a new method for subtyping of Mycobacterium kansasii based upon PCR-restriction enzyme analysis of the tuf gene. Materiały XVI. Konferencji pt.: «Molecular biology in diagnostics of infectious diseases and biotechnology in memory of Professor Władysław J.H. Kunicki-Goldfinger», Warszawa, S.G.G.W., 2015, str Żaczek, A., Parniewski, P., Brzostek, A., Szulc-Kiełbik, I., Struś, K., Pociask, A., Jagielski, T., Dziadek, J. MIRU-VNTR typing in epidemiological study of Mycobacterium kansasii. VII.P.18. Materiały VI. Konferencji Weigl a, Uniwersytet Gdański, Gdańsk, 2015, str Bakuła, Z., Safianowska, A., Proboszcz, M., Nowacka-Mazurek, M., Bielecki, J., Jagielski, T. Comparison of three PCR-based methods with high-pressure liquid chromatography (HPLC) analysis for the identification of Mycobacterium kansasii clinical isolates. Proceedings of the 25th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, Copenhagen, 2015, P Informacja o patentach, zgłoszeniach patentowych, licencjach, czy wdrożeniach będących wynikiem projektu, rok Brak Strona 13 z 15

14 6.5 Informacja o działaniach promocyjnych zgodnie z umową na wykonanie projektu (dotyczy: informowania opinii publicznej o tym, że realizacja Projektu została sfinansowana przez Centrum podać datę i miejsce zamieszczenia informacji, sposób informowania) Informacja na stronie Zakładu Mikrobiologii Stosowanej, Wydział Biologii, Uniwersytet Warszawski: Witryna internetowa dedykowana projektowi: We wszystkich publikacjach, doniesieniach konferencyjnych, plakatach i innych materiałach drukowanych, przedstawiających wyniki badań realizowanych w ramach projektu «LIDER» zawarta została stosowana informacja o finansowaniu projektu przez NCBiR. 7. ZGODNOŚĆ POSTĘPÓW W REALIZACJI PROJEKTU Z OPISEM PROJEKTU, HARMONOGRAMEM I KOSZTORYSEM PRAC, STANOWIĄCYMI ZAŁĄCZNIKI DO UMOWY Czy postęp i zakres prac są zgodne z umową? Jeśli zaznaczono NIE, tzn. w ciągu okresu sprawozdawczego nastąpiły odstępstwa od ustaleń rzeczowych/czasowych/finansowych zawartych w umowie, należy poniżej wskazać, jakie są to odstępstwa (i jakich zadań dotyczą), podać ich przyczyny, wymienić podjęte lub planowane działania naprawcze, określić wpływ na dalsze prowadzenie projektu i osiągnięcie planowanych rezultatów. Zadanie nr Nazwa zadania. Odstępstwo:. Przyczyna:. Działania naprawcze:.. Wpływ na rezultaty Projektu:. Zadanie nr... TAK NIE 8. CZY DALSZE PROWADZENIE PRAC PROWADZI DO OSIĄGNIĘCIA ZAKŁADANYCH WYNIKÓW? Tak Nie 9. PODPISY I PIECZĘCIE Data i podpis Kierownika Projektu Podpis i pieczęć służbowa osoby odpowiedzialnej ze strony Jednostki za część finansową raportu Pieczęć Jednostki Strona 14 z 15

15 10. POTWIERDZENIE ZŁOŻENIA RAPORTU - wypełnia NCBR Data złożenia raportu Imię i nazwisko pracownika NCBR Podpis Strona 15 z 15