Załącznik nr 2 AUTOREFERAT PRZEDSTAWIAJĄCY OPIS DOROBKU I OSIĄGNIĘĆ NAUKOWYCH

Załącznik nr 2 AUTOREFERAT PRZEDSTAWIAJĄCY OPIS DOROBKU I OSIĄGNIĘĆ NAUKOWYCH dr Maciej Ostrowski Uniwersytet Mikołaja Kopernika Wydział Biologii i Ochrony Środowiska Zakład Biochemii ul. Lwowska 1, 87-100 Toruń Toruń 2017 1

1. Imię i nazwisko: Maciej Karol Ostrowski 2. Posiadane dyplomy, stopnie naukowe 2009 - dyplom doktora nauk biologicznych Wydział Biologii i Nauk o Ziemi, Uniwersytet Mikołaja Kopernika, Toruń; tytuł rozprawy doktorskiej: Syntetaza indolilo-3-acetyloasparaginianu - enzym katalizujący biosyntezę koniugatów amidowych auksyn w tkankach grochu (Pisum sativum L.). Promotor: Dr hab. Anna Jakubowska (Zakład Biochemii, Wydział Biologii i Nauk o Ziemi, UMK w Toruniu) Recenzenci: Prof. dr hab. Jan Kopcewicz (Zakład Fizjologii i Biologii Molekularnej Roślin, Wydział Biologii i Nauk o Ziemi, UMK w Toruniu Prof. dr hab. Barbara Zagdańska (Katedra Biochemii, Wydział Rolnictwa i Biologii, Szkoła Główna Gospodarstwa Wiejskiego w Warszawie) 2004 - dyplom magistra biologii o specjalności biologia molekularna Wydział Biologii i Nauk o Ziemi, Uniwersytet Mikołaja Kopernika w Toruniu, tytuł pracy magisterskiej: Błony otoczek jąder komórkowych łożyska ludzkiego oznaczanie aktywności sterolosulfohydrolazy siarczanu estronu z użyciem HPLC. Promotor: Prof. dr hab. Jadwiga Gniot-Szulżycka (Zakład Biochemii, Wydział Biologii i Nauk o Ziemi, Uniwersytet Mikołaja Kopernika w Toruniu) Recenzent: Prof. dr hab. Eugenia Tęgowska (Zakład Fizjologii Zwierząt, Wydział Biologii i Nauk o Ziemi, Uniwersytet Mikołaja Kopernika w Toruniu). 2

3. Informacje o dotychczasowym zatrudnieniu w jednostkach naukowych 2011- obecnie: adiunkt, Zakład Biochemii, Wydział Biologii i Ochrony Środowiska, Uniwersytet Mikołaja Kopernika, Toruń 2006-2010: asystent, Zakład Biochemii, Instytut Biologii Ogólnej i Molekularnej, Wydział Biologii i Nauk o Ziemi, UMK w Toruniu 2005-2009: studia doktoranckie, Studium Doktoranckie Biologii, Wydział Biologii i Nauk o Ziemi, UMK, Toruń 2005: asystent (1/2 etatu) Katedra i Zakład Histologii i Embriologii, Wydział Lekarski, Collegium Medicum w Bydgoszczy, Uniwersytet Mikołaja Kopernika 4. Wskazanie osiągnięcia naukowego wynikającego z art.16 ust.2 ustawy z dnia 14 marca 2003 o stopniach naukowych i tytule naukowym oraz o stopniach i tytule w zakresie sztuki (Dz.U. 2016 r. poz. 882 zezm. w Dz. U. 2016 r. poz. 1311.) a) tytuł osiągnięcia naukowego: Biochemiczne i molekularne podstawy koniugacji auksyn w tkankach grochu (Pisum sativum L.) b) publikacje wchodzące w zakres zgłaszanego osiągnięcia naukowego: Łączny impact factor prac wchodzących w skład osiągnięcia naukowego wynosi 15,3 (zgodnie z rokiem opublikowania), natomiast suma punktów MNiSW wynosi 215 (zgodnie z rokiem opublikowania). (autorzy, rok wydania, tytuł publikacji, wydawnictwo, tom, strony, IF, MNiSW, * autor prowadzący korespondencję) P1. Ostrowski M, Jakubowska A *. (2011) Purification and biochemical characterization of indole-3-acetic acid-aspartic acid synthetase from immature seeds of pea (Pisum sativum L.) Journal of Plant Growth Regulation, 30, 30-40, IF 2.859, 35 pkt MNiSW Mój wkład w niniejszą pracę polegał na zaplanowaniu badań, przeprowadzeniu izolacji i oczyszczania enzymu, charakterystyki biochemicznej i immunochemicznej oczyszczonego enzymu, przygotowaniu wersji wstępnej manuskryptu. Mój udział procentowy szacuję na 95%. P2. Ostrowski M*, Jakubowska A. (2013) GH3 expression and IAA-amide synthetase activity in pea (Pisum sativum L.) seedlings are regulated by light, plant hormones and auxinic herbicides Journal of Plant Physiology, 170, 361-368, IF 2.770, 35 pkt MNiSW 3

Mój wkład w niniejszą pracę stanowił opracowanie koncepcji badań, przeprowadzenie wszystkich doświadczeń laboratoryjnych, analizy bioinformatycznej i obliczeń statystycznych. Napisałem pierwszą wersję manuskryptu, przygotowałem ryciny oraz wykonałem korektę pracy po recenzjach. Mój wkład procentowy szacuję na 95%. P3. Ostrowski M*, Jakubowska A. (2014) UDP-glycosyltransferases of plant hormones Advances in Cell Biology 4, 43-60, IF 0.203, 15 pkt MNiSW Mój wkład w niniejszej pracy polegał na opracowaniu koncepcji artykułu przeglądowego, napisaniu artykułu i wykonaniu korekty. Mój wkład procentowy szacuję na 95%. P4. Ostrowski M*, Świdziński M, Ciarkowska A, Jakubowska A. (2014) IAAamido synthetase activity and GH3 expression during development of pea seedlings Acta Physiologiae Plantarum, 36, 3029-3037, IF 1.584 25 pkt MNiSW W niniejszej pracy opracowałem koncepcję badań, koordynowałem badania prowadzone przez pozostałych współautorów, przeprowadziłem lokalizację subkomórkową aktywności enzymatycznej amidosyntetazy IAA metodą wirowania różnicowego, oznaczyłem aktywność katalityczną oraz ekspresję genu GH3, przygotowałem preparat białka do identyfikacji metodą LC-MS-MS, przeprowadziłem analizę bioinformatyczną (amino-acid alignment), wykonałem obliczenia statystyczne, przygotowałem manuskrypt, wykonałem korektę pracy. Mój wkład procentowy szacuję na 80 %. P5. Ostrowski M*, Hetmann A, Jakubowska A. (2015) Indole-3-acetic acid UDP-glucosyltransferase from immature seeds of pea is involved in modification of glycoproteins Phytochemistry, 117, 25-33, IF 2.547, 35 pkt MNiSW Mój wkład w pracę stanowił opracowanie koncepcji badań, koordynację doświadczeń z pozostałymi współautorami, izolację i oczyszczanie enzymu, przeprowadzenie analizy kinetycznej enzymu (wyznaczenie K m i V max, wpływ glukonolaktonu) metodą spektrofotometryczną i izotopową, identyfikację inhibitora i wyznaczenie parametrów inhibicji, izolację glikoprotein, analizę znakowania frakcji glikoprotein z użyciem izotopu [ 14 C]IAA, obliczenia statystyczne. Napisałem manuskrypt i wykonałem korektę po recenzji. Mój wkład procentowy szacuję na 80 %. P6. Ostrowski M*, Ciarkowska A, Jakubowska A. (2016a) The auxin conjugate indole-3-acetyl-aspartate affects responses to cadmium and salt stress in Pisum sativum L. Journal of Plant Physiology 191, 63-72, IF 2.557, 35 pkt MNiSW 4

W niniejszej pracy opracowałem koncepcję badań, przeprowadziłem wpływ IAA- Asp oraz stresu solnego i stresu metali ciężkich na: parametry wzrostu siewek, aktywność enzymatyczną katalazy, peroksydazy askorbinianowej, gwajakolowej (metody spektrofotometryczne i elektroforetyczne), poziom karbonylacji białek, nadtlenku wodoru. Wykonałem analizę statystyczną wyników i ryciny. Przygotowałem manuskrypt i poprawiłem artykuł po recenzjach. Mój wkład procentowy szacuję na 85%. P7. Ostrowski M*, Mierek-Adamska A, Porowińska D, Goc A, Jakubowska A. (2016b) Cloning and biochemical characterization of indole-3-acetic acid-amido synthetase from pea. Plant Physiology and Biochemistry 107, 9-20, IF 2.756, 35 pkt MNiSW Mój wkład w niniejszą pracę dotyczył opracowania koncepcji badań, koordynacji badań wykonywanych przez innych autorów, opracowania i wykonania procedury oczyszczania białka rekombinowanego, przeprowadzenie charakterystyki biochemicznej oczyszczonego enzymu, wykonanie analizy bioinformatycznej (amino acid alignment), napisania pracy i korekty artykułu. Mój wkład procentowy szacuję na 65%. c) omówienie celu naukowego ww. prac i osiągniętych wyników cytowania prac wchodzących w skład osiągnięcia naukowego zostały podkreślone Wprowadzenie Kwas indolilo-3-octowy (IAA) jest najważniejszym przedstawicielem auksyn, najwcześniej odkrytych hormonów roślinnych regulujących większość procesów fizjologicznych i patofizjologicznych (Woodward i Bartel 2005, Ludwig-Müller 2011). Aktywność biologiczną auksyn oprócz wspomnianego IAA wykazują także inne związki zawierające w swojej strukturze pierścień indolowy, takie jak kwas indolilo-3- pirogronowy (IPyA), kwas indolilo-3-propionowy (IPA), kwas indolilo-3-masłowy (IBA), kwas 4-chloro-indolilo-3-octowy (4-Cl-IAA). Należy podkreślić, iż właściwości hormonalne auksyn przejawiają również niektóre związki aromatyczne występujące w roślinach, np. kwas fenylooctowy (PAA) oraz związki syntetyczne takie jak kwas naftylo-1-octowy (1-NAA), czy kwas 2,4-dichlorofenoksyoctowy (2,4-D) Prawidłowy przebieg procesów fizjologicznych, jak i adaptacja do zmieniających się warunków środowiska, zależą od precyzyjnej kontroli stężenia fitohormonu. Rośliny utrzymują homeostazę hormonalną za pomocą kilku mechanizmów: poprzez biosyntezę i degradację cząsteczek sygnałowych, transport oraz czasową inaktywację na drodze koniugacji (Bajguz i Piotrowska 2009, Ludwig-Müller 2011). Należy zaznaczyć, że 5

zjawisko koniugacji jest powszechne wśród wszystkich fitohormonów. Koniugaty pełnią kilka funkcji: są magazynem hormonu, umożliwiają jego transport, zabezpieczają cząsteczkę fitohormonu przed degradacją, stanowią etap pośredni w katabolizmie auksyn. Ze względu na budowę chemiczną koniugaty podzielono na amidowe oraz estrowe. Pierwsza grupa dotyczy połączeń auksyn z aminokwasami, peptydami lub białkami za pomocą wiązania amidowego. Koniugaty estrowe powstają w wyniku połączenia wiązaniem estrowym hormonu z cukrami lub cyklicznym alkoholem (myo-inozytol). Na podstawie badań Bandurskiego i Schulze (1977) przyjmuje się, że rośliny jednoliścienne syntetyzują głównie koniugaty estrowe IAA, natomiast połączenia amidowe są uprzywilejowaną formą związaną auksyn w tkankach roślin dwuliściennych. Należałoby jednak ostrożniej sformułować tę tezę, bowiem rośliny jednoliścienne gromadzą koniugaty amidowe, a w tkankach roślin dwuliściennych wykryto wysoką aktywność enzymu syntetyzującego estry IAA (Jakubowska i Kowalczyk 2004). Auksyny tworzą koniugaty estrowe wówczas gdy grupa karboksylowa kwasu indolilooctowego reaguje z grupą hydroksylową cukrowca lub cyklicznego alkoholu (myo-inozytol). Ze względu na niską wartość potencjału przenoszenia grupy indoliloacetylowej, synteza połączeń estrowych wymaga aktywacji IAA. Aktywną formą IAA o wysokim potencjale przenoszenia jest 1-O-indolilo-3-acetylo-β-Dglukoza (1-O-IA-glukoza,IA-Glc). Energia swobodna uwalniania podczas hydrolizy tego β-piranozydu (acetalu alkilowo-acetylowego) zasila przebieg reakcji termodynamicznie niekorzystnej, jaką jest synteza właściwych koniugatów estrowych IAA (np. IA-myo-inozytolu) (Leźnicki i Bandurski 1988). Niniejsze reakcje zachodzą zgodnie z równaniami: IAA + UDPG 1-O-IA-glukoza + UDP 1-O-IA-glukoza + myo-inozytol IA-myo-inozytol + glukoza Reakcję aktywacji IAA przeprowadza zależna od urydynodifosfoglukozy (UDPG), glukozylotransferaza (GTaza) (syntaza IAGlc), natomiast kolejną reakcję (przeniesienie reszty IAA z 1-O-IA-glukozy na resztę myo-inozytolu czy resztę cukrowcową katalizują acylotransferazy. Syntaza IAGlc należy do licznej grupy glukozylotransferaz fitohormonów, którą szerzej omówiono w pracy przeglądowej (Ostrowski i Jakubowska 2014). Jest pierwszą, dobrze poznaną glukozylotransferazą 6

auksyn (Leźnicki i Bandurski 1988; Kowalczyk i Bandurski 1991). Enzym oczyszczony z bielma nasion kukurydzy wyraźnie preferuje IAA jako akceptor reszty glukozy, ale wydajnie glukozyluje również syntetyczną auksynę, kwas naftylo-1- octowy (1-NAA) (Kowalczyk i wsp. 2002). Niedojrzałe nasiona grochu przejawiają aktywność glukozylotransferazy IAA na równie wysokim poziomie, co bielmo nasion kukurydzy (Jakubowska i Kowalczyk 2004). Odkrycie to było intrygujące z uwagi na fakt, iż u roślin dwuliściennych nie znaleziono akceptora reszty IAA przenoszonej za pośrednictwem IA-glukozy. Początkowo sądzono, że 1-O-IA-glukoza stanowi aktywną formę auksyny w syntezie koniugatów amidowych obficie występujących w tkankach grochu, jednak badania Staswicka i wsp. opublikowane w 2005 roku wykluczyły tę hipotezę. Geny kodujące syntazę IAGlc zidentyfikowano także u innych roślin dwuliściennych (np. Arabidopsis thaliana) (Jackson i wsp. 2001). Jeszcze skromniej przedstawiają się wyniki badań dotyczących enzymów przenoszących resztę indoliloacetylową z 1-O-IA-glukozy na akceptory takie jak myoinozytol czy cukry. Z bielma niedojrzałych nasion kukurydzy oraz z nasion ryżu (Oryza sativa) wyizolowano acylotransferazę przenosząca resztę IAA z 1-O-IAglukozy na myo-inozytol (Kesy i Bandurski 1990, Kowalczyk i wsp. 2003, Ciarkowska i wsp. 2016). Ponadto w nasionach kukurydzy funkcjonuje acylotransferaza cukrowcowa katalizująca transfer aktywnej grupy indoliloacetylowej na oligosacharydy zawierające galaktozę (Starzyńska i Kowalczyk 2012). O ile w przypadku IAA-myo-inozytolu wiadomo, że koniugat ten stanowi formę zapasową fitohormonu, to rola połączeń IAA z oligosacharydami pozostaje niewyjaśniona. W przeciwieństwie do połączeń estrowych, reakcja syntezy koniugatów amidowych auksyn pozostawała nieznana aż do 2002 roku kiedy to Staswick i wsp. opisali kilka rekombinowanych białek rzodkiewnika należących do rodziny Gretchen Hagen 3 (GH3), które syntetyzowały połączenia IAA z aminokwasami. Koniugaty amidowe tworzone są poprzez reakcję grupy karboksylowej hormonu i grupy aminowej aminokwasu. Formą aktywną auksyny jest w tym przypadku IAA-adenylan (IAA-AMP) powstający w reakcji katalizowanej z udziałem ATP: IAA + ATP IAA-AMP + PP i W drugim etapie zachodzi reakcja tworzenia wiązania amidowego z aminokwasem: 7

IAA-AMP + L-aminokwas IAA-aminokwas + AMP Uwalniany w pierwszym etapie reakcji pirofosforan (PP i ) zawiera wysokoenergetyczne wiązanie bezwodnikowe, którego hydroliza zasila przebieg drugiej części reakcji. Białka z rodziny GH3 należą do syntetaz/acyloadenylaz podobnych do lucyferazy ze świetlika (Hagen i wsp. 1984, Staswick i wsp. 2005) Transkrypty GH3 po raz pierwszy znaleziono w siewkach soi jako produkty ekspresji wczesnych genów auksynowych (Hagen i wsp. 1984), pojawiające się kilka minut po zwiększeniu stężenia auksyny. Białka kodowane przez geny GH3 stanowią grupę monomerycznych, cytozolowych polipeptydów o masie cząsteczkowej od 67 do 72 kda i kwasowym punkcie izoelektrycznym (Westfall i wsp. 2010). W genomie Arabidposis thaliana stwierdzono obecność 19 genów GH3, które na podstawie analiz filogenetycznych zaklasyfikowano do trzech grup (Staswick i wsp. 2005). W grupie I znalazł się enzym JAR1 katalizujący biosyntezę jasmonylo-izoleucyny, koniugatu amidowego będącego aktywnym fizjologicznie hormonem. Najliczniejsza grupa II zawiera amidosyntetazy tworzące połączenia IAA z aminokwasami oraz białko GH3.5 mające dodatkowo zdolność do syntezy amidowych połączeń kwasu salicylowego oraz kamaleksyny (indolilo-3-karboksylo-cysteiny, ICA-Cys) - głównej fitoaleksyny w rzodkiewniku (Staswick i wsp. 2005, Westfall i wsp. 2010, Wang i wsp. 2012). Grupę III białek GH3 reprezentuje enzym GH3.12/GDG1/PBS3 zaangażowany w tworzenie koniugatów pochodnych kwasu benzoesowego z aminokwasami (Okrent i wsp. 2009). Zdecydowana większość koniugatów IAA z aminokwasami stanowi magazyn hormonu, z którego na drodze hydrolizy enzymatycznej uwalniana jest aktywna cząsteczka sygnałowa - kwas indolilo-3-octowy (Woodward i Bartel 2005). Dwa koniugaty, IAA-asparaginian (IAA-Asp) oraz IAA-glutaminian (IAA-Glu) funkcjonują raczej jako połączenia nieodwracalne i uczestniczą w katabolizmie kwasu indolilo-3- octowego. W ostatnich latach pojawiło się kilka publikacji sugerujących, że IAA-Asp, niezależnie od IAA, może wykazywać aktywność biologiczną (González-Lamothe. I wsp. 2012, Böttcher i wsp. 2013). Obserwując rozwój badań nad koniugatami auksyn w ciągu ostatnich kilkudziesięciu lat, należy zauważyć, że początkowo badania te miały charakter identyfikacji i analizy koniugatów w tkankach roślinnych. Wraz z rozwojem technik 8

biochemii i biologii molekularnej, możliwa stała się izolacja białek enzymatycznych odpowiedzialnych za syntezę i hydrolizę form związanych fitohormonów oraz identyfikacja genów kodujących te enzymy. Ostatnie lata badań zaowocowały poznaniem niektórych mechanizmów molekularnych leżących u podstaw koniugacji. Obiecująco rysują się również perspektywy roli niektórych koniugatów amidowych auksyn w odpowiedzi roślin na różne rodzaju stresu biotycznego i abiotycznego. Cel badań Zważywszy na fakt, że niedojrzałe nasiona grochu wykazują zróżnicowaną zdolność do syntezy koniugatów amidowych i estrowych IAA w trakcie wzrostu, interesujące było poznanie mechanizmów regulujących koniugację IAA w tkankach grochu. Kontynuując badania dotyczące biochemicznych i molekularnych podstaw syntezy koniugatów auksyn zaplanowano następujące zadania: 1) wszechstronna charakterystyka biochemiczna syntetazy IAA-Asp oczyszczonej z niedojrzałych nasion grochu 2) sklonowanie genu kodującego syntetazę IAA-Asp w nasionach grochu i zbadanie wpływu czynników środowiskowych na ekspresję genu syntetazy, charakterystyka białka rekombinowanego 3) wpływ IAA-asparaginianu na reakcję siewek grochu na stres abiotyczny czy IAA-Asp wykazuje aktywność biologiczną? 4) ustalenie roli syntazy IAGlc w nasionach grochu uzyskane wyniki i dyskusja 1. Charakterystyka biochemiczna i lokalizacja wewnątrzkomórkowa amidosyntetazy IAA z nasion grochu (wyniki z prac P1 i P3) Badania prowadzone w ramach pracy doktorskiej umożliwiły opracowanie procedury izolacji i oczyszczania syntetazy IAA-asparaginianu z niedojrzałych nasion grochu. Jest to pierwszy enzym katalizujący syntezę koniugatów amidowych hormonów roślinnych wyizolowany z tkanki roślinnej za pomocą klasycznych metod biochemicznych. Interesującym aspektem enzymatycznej syntezy IAA-asparaginianu jest fizjologiczna rola tej reakcji. Spośród przebadanych tkanek roślin, jedynie niedojrzałe, zielone nasiona grochu o 9

średnicy 5-6 mm charakteryzowały się bardzo wysoką aktywnością amidosyntetazową (Ostrowski i Jakubowska 2011). Niewiele większe nasiona niedojrzałe (średnica 8 mm) przejawiały 3-krotny spadek syntezy IAA-Asp. Nasiona mniejsze (3 mm) prezentowały 2-krotnie mniejszą aktywność enzymu. Dojrzałe nasiona, zarówno suche jak i kiełkujące cechowała śladowa aktywność amidosyntetazy IAA. Omawiany enzym oczyszczono do stopnia jednorodności elektroforetycznej. Oczyszczony preparat enzymu charakteryzujący się dobrą aktywnością katalityczną posłużył do badań stanowiących opisywane osiągnięcie. Analizy specyficzności substratowej udowodniły, że IAA oraz L-asparaginian są najbardziej preferowanymi substratami w reakcji koniugacji. Spośród przebadanych kilku auksyn naturalnych i syntetycznych, oprócz IAA, stosunkowo dobrym akceptorem reszty aminoacylowej okazał się kwas naftylo-1-octowy (1- NAA). Inne naturalne (IBA, IPA, PAA) oraz syntetyczne (2,4-D) auksyny były bardzo słabymi substratami w syntezie koniugatu. Pod tym względem enzym z grochu przypomina niektóre izoenzymy GH3 z rzodkiewnika (Arabidopsis thaliana) otrzymane w bakteryjnym systemie ekspresyjnym (Staswick i wsp. 2005). Należy jednak podkreślić, że w przeciwieństwie do syntetazy IAA-Asp z grochu, rekombinowane amidosyntetazy z A. thaliana wykazywały bardzo wyraźne powinowactwo wobec PAA, co sugeruje, że GH3 z rzodkiewnika nieswoiście adenylują kwas indolilo-3-octowy. Jeszcze ściślejszą swoistością substratową charakteryzuje się syntetaza względem aminokwasów będących akceptorami reszty indoliloacetylowej (Ostrowski i Jakubowska 2011). Wśród przebadanych 14 aminokwasów białkowych, wyraźnie preferowanym substratem był asparaginian. Co ciekawe, mimo podobieństwa strukturalnego, L-glutaminian był słabym akceptorem reszty IAA. Z uwagi na fakt, iż asparaginian był dominującym substratem w reakcji katalizowanej przez wyizolowany enzym, oczyszczone białko nazwano syntetazą IAA-asparagininu (syntetaza IAA-Asp). Analizy immunochemiczne przeprowadzone metodą Western blot wykazały, że oczyszczony polipeptyd o masie 70 kda ulega reakcji z przeciwciałami poliklonalnymi anty-gh3, co sugeruje obecność rodziny acyloadenylaz Gretchen Hagen 3 w grochu. Syntetazę IAA-Asp poddano trawieniu trypsyną i identyfikacji metodą chromatografii cieczowej połączonej z tandemową spektrometrią mas (LC-MS/MS) (Ostrowski i wsp. 2014b). Otrzymane fragmenty peptydowe syntetazy IAA-Asp z grochu oraz dostępne w bazie danych NCBI sekwencje kilku 10

białek GH3 z innych roślin (Populus trichocarpa, Nicotiana tabaccum, Ricinus comunnis, Glycine max, Arabidopsis thaliana) analizowano stosując wielokrotne przyrównanie (multiple alignment) w programie CLUSTALW. Analizy te wykazały wysoką identyczność sekwencji enzymu z nasion grochu z sekwencjami białek GH3 (od 54 do 83%), potwierdzając tym samym, że amidosyntetaza z grochu jest kolejnym członkiem rodziny GH3. Intrygującym zagadnieniem w enzymatycznej koniugacji auksyn katalizowanej przez białka GH3 jest lokalizacja wewnątrzkomórkowa tych enzymów. Badania kinetyczne aktywności enzymatycznej wyraźnie wskazują na konieczność ph >8 w środowisku reakcji (Staswick i wsp. 2005, Ostrowski i Jakubowska 2008, Chen i wsp. 2009). Jednak nikt z autorów nie analizował aktywności enzymatycznej syntetazy IAA-aminokwasów w różnych frakcjach subkomórkowych roślin. Badania te zaplanowałem w ramach grantu MNiSW Iuventus Plus, którym kierowałem w latach 2010-2011. Lokalizację wewnątrzkomórkową amidosyntetazy GH3 w 12-dniowych siewkach grochu przeprowadzono dwiema metodami, analizując aktywność katalityczną frakcji otrzymanych w wyniku wirowania różnicowego homogenatu oraz śledząc sygnał immunofluorescencji będący efektem reakcji z przeciwciałami anty-gh3 (Ostrowski i wsp. 2014b). Badanie aktywności enzymatycznej wykazało, że 88% aktywności całkowitej, mierzonej względem homogenatu z siewek grochu, pozostaje w supernatancie stanowiącym frakcję rozpuszczalnych białek cytozolowych, otrzymanym po odwirowaniu homogenatu przy sile odśrodkowej 100 000 g. Analizy immunolokalizacji przeprowadzone metodą mikroskopii fluorescencyjnej z króliczymi przeciwciałami anty-gh3, wykazały silny sygnał immunofluorescencyjny w cytoplazmie komórek otrzymanych z 12-dniowych etiolowanych siewek grochu. Wcześniejsze wyniki analiz immunochemicznych sytuowały białka GH3 w cytoplazmie (Wright i wsp. 1987). Zespół prof. Jutty Ludwig-Müller (2009) zlokalizował rekombinowane białko fuzyjne PpGH3 z mchu Physcomitrella patens w cytoplazmie komórek. Cytoplazmatyczna lokalizacja fuzyjnego białka GH3.11/FIN219-GUS została również przeprowadzona w komórkach skórki cebuli (Hsieh i wsp. 2000). Obecność amidosyntetazy IAA z rodziny GH3 w cytoplazmie jest interesująca w kontekście przedziałowości metabolizmu koniugatów amidowych auksyn. Jak bowiem wiadomo, hydroliza 11

połączeń amidowych zachodzi w świetle retikulum endoplazmatycznego (Ludwig- Müller 2011). Niewykluczone, że cytozolowa lokalizacja enzymów koniugujących IAA jest wyrazem oddzielenia syntezy koniugatów od hydrolizy uwalniającej aktywny fitohormon. 2. Wpływ czynników środowiskowych na amidosyntetazę IAA (wyniki z prac P2 i P3) W przeciwieństwie do wielu gatunków roślin, dla których w bazie danych zdeponowano liczne pełne sekwencje nukleotydowe GH3, nie stwierdzono obecności GH3 z grochu. Jedynie znaleziono fragment sekwencji PsGH3 JI-281, który koduje część potencjalnego białka GH3 zawierającego jeden z motywów (motyw I) wiązania ATP/AMP (Ostrowski i Jakubowska 2013). Analiza in silico przeprowadzona z użyciem wspomnianej sekwencji ujawniła wysokie podobieństwo do odcinków nukleotydowych kodujących GH3 w tytoniu, soi i rzodkiewniku zdeponowanych w bazie NCBI. Startery zaprojektowane do tej sekwencji umożliwiły otrzymanie produktu PCR z użyciem cdna powstającego na podstawie mrna wyizolowanego z siewek grochu. Na podstawie tych danych zaplanowano analizę ekspresji genu GH3 w siewkach grochu metodą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym opartego na odwrotnej transkrypcji (qrt-pcr). Ekspresję genu analizowano w etiolowanych siewkach grochu 3-,6- i 12-dniowych (Ostrowski i wsp. 2014b). Otrzymane wyniki wykazały, że siewki 3-dniowe charakteryzują się najniższym poziomem względnej ekspresji genu GH3, natomiast w roślinach 6-dniowych, wartość ta wzrasta dwukrotnie. Najwyższy, bowiem ok. 19-krotnie większy niż 3-dniowe, poziom transkrypcji mrna GH3, przejawiają siewki 12-dniowe. Rezultaty te wskazują, że ekspresja genu GH3 zmienia się wraz z rozwojem rośliny. Jest to zrozumiałe zważywszy na fakt, że w trakcie rozwoju siewki zmienia się stężenie auksyny, która jest regulatorem ekspresji genu GH3. Kolejnym etapem badań była weryfikacja tezy, że podobnie jak w innych roślinach białka GH3 są regulowane przez rozmaite czynniki środowiskowe. W pracy tej, także realizowanej w ramach wspomnianego wcześniej grantu Iuventus Plus, wykazano, że aktywność amidosyntetazowa ma znaczenie w przystosowaniu roślin do warunków środowiska. Wpływ wybranych czynników środowiskowych (światło, herbicydy auksynowe, fitohormony) na syntezę IAA-aminokwasów w grochu 12

zbadano na poziomie ekspresji genu PsGH3 oraz aktywności enzymatycznej syntetazy IAA-asparaginianu (Ostrowski i Jakubowska 2013). Badania uwzględniające zarówno ekspresję genu jak i aktywność katalityczną enzymu pozwalają uzyskać pełniejszy obraz roli białek GH3 w odpowiedziach roślin na czynniki środowiskowe. Promotory genów GH3 są wrażliwe na stężenie auksyny, zawierają bowiem elementy odpowiedzi auksynowych (AuxREs) (Hagen i Guilfoyle 2002). Początkowo sądzono, że jedynie ta grupa fitohormonów reguluje transkrypcję GH3, ale w kilku roślinach zidentyfikowano sekwencje regulatorowe w promotorach genów GH3 kontrolowane przez inne hormony roślinne (Kumar i wsp. 2012). Z tego względu sprawdzono, czy i które hormony mają wpływ na koniugację poprzez wpływ na ekspresję genu GH3 i/lub aktywność amidosyntetazy IAA (Ostrowski i Jakubowska 2013). Analizy przeprowadzono na 10-dniowych etiolowanych siewkach grochu, które inkubowano w roztworach IAA, kwasu abscysynowego (ABA), kwasu jasmonowego (JA), jasmonianu metylu (MeJA), kwasu salicylowego (SA), gibereliny (GA 3 ) i kinetyny. Wyniki analiz opartych na reakcji qrt-pcr wykazały, że oprócz SA, wszystkie pozostałe fitohormony, indukowały ekspresję genu GH3 PsJI-281, a najsilniejszy efekt wywoływał IAA. Badania poziomu transkrypcji uzupełniono o analizę ekspresji białka metodą Western blot, która wykazała jednakową intensywność prążka dla białka GH3 we wszystkich próbach badanych i kontroli. Brak różnic w analizie immunochemicznej może być spowodowany obecnością kilku izoenzymów GH3 w tkankach grochu. Poszczególne białka GH3 mogą z różnym powinowactwem wiązać się z przeciwciałami poliklonalnymi. Jest to tym bardziej prawdopodobne, iż rodziny białek GH3 znalezione w innych roślinach zawierają polipeptydy charakteryzujące się podobną masą cząsteczkową. W celu uzyskania pełniejszego obrazu regulacji koniugacji IAA w grochu, zbadano wpływ fitohormonów na aktywność syntetazy IAA-aminokwasów. Wyniki tej analizy wykazały, iż wszystkie fitohormony indukują tę aktywność. Kwas indolilo-3-octowy powodował najsilniejszy efekt, natomiast kwas salicylowy w nieco słabszym stopniu indukował syntezę IAA- Asp. Giberelina wykazywała o połowę mniejszy efekt indukujący niż SA. Jeszcze gorszy wpływ przejawiały kinetyna i kwas jasmonowy. Ester metylowy kwasu jasmonowego tylko w nieznacznym stopniu zwiększał szybkość syntezy IAA-Asp w porównaniu z kontrolą. Studiując literaturę na temat genów GH3 można znaleźć 13

kilka przykładów regulacji ich ekspresji przez fitohormony w różnych roślinach. Böttcher i wsp. (2010) opisali indukcję genu GH3-1 u winorośli (Vitis vinifera L.) pod wpływem etylenu i ABA. Z kolei transkrypcja większości spośród piętnastu genów SlGH3 pomidora (Solanum lycopersonicum L.) była regulowana przez JA, SA i brasinolid (Kumar i wsp. 2012). Zupełnie różnym pod tym względem jest gen GH3.16 z sosny Pinus pinaster L., którego transkrypcja była indukowana wyłącznie przez auksynę (Reddy i wsp. 2006). Innym czynnikiem środowiskowym regulującym ekspresję GH3 jest światło. Percepcja różnych długości fal (światło niebieskie, czerwone, dalekiej czerwieni, białe) z udziałem fotoreceptorów uruchamia szlaki transdukcji tego sygnału zazębiające się często z kaskadami transdukcji sygnałów hormonalnych. Wśród genów GH3 zidentyfikowano kilka mutantów charakteryzujących się zaburzeniami w odpowiedzi roślin na światło (Hsieh i wsp. 2000, Bierfreund i wsp. 2004, Park i wsp. 2007). Wyniki RT-PCR w czasie rzeczywistym ujawniły, że wszystkie badane długości światła (czerwień, daleka czerwień, niebieskie, białe) indukowały ekspresję Ps GH3, przy czym najsilniejszy wpływ wywierało światło białe, a najsłabszy światło niebieskie (Ostrowski i Jakubowska 2013). Analiza Western blot immunoprecypitatów z siewek grochu wykazała jednakową intensywność prążka odpowiadającego masie cząsteczkowej białek GH3 we wszystkich analizowanych próbach. Natomiast aktywność enzymatyczna syntetazy w tych próbach była różna, co potwierdza słuszność analizowania białek GH3 na kilku poziomach (ekspresja genu, aktywność enzymatyczna). Podobnie jak w przypadku ekspresji genu, najwyższą szybkość syntezy [ 14 C]IAA-asparaginianu obserwowano pod wpływem światła białego. Dobrym induktorem aktywności było także światło czerwone, natomiast daleka czerwień nie powodowała zmian szybkości reakcji enzymatycznej w porównaniu z próbą kontrolną (ciemność). Słaby efekt indukujący wywoływało światło niebieskie. Wyniki te podtrzymują hipotezę, iż w tkankach grochu występuje więcej białek GH3, których geny przejawiają zróżnicowaną wrażliwość na bodziec świetlny. Interesującym zagadnieniem w metabolizmie auksyn oraz ich funkcji sygnalizacyjnej jest działanie herbicydów auksynowych, czyli syntetycznych związków aromatycznych, które wykazują aktywność biologiczną auksyn, ale w wysokich stężeniach przejawiają efekt toksyczny wobec dwuliściennych chwastów 14

roślin uprawnych. Do herbicydów auksynowych zaliczono np. kwas 2,4- dichlorofenoksyoctowy (2,4-D), pochodne kwasu pikolinowego (Picloram) oraz kwas 3,6-dichloro-2-metoksybenzoesowy (Dicamba) (Grossmann 2007). Związki te wiążą się specyficznie z receptorami auksyny TIR1/AFB (Transport Inhibitor Response1/Auxin F-box protein binding protein) i wywołują swoiste odpowiedzi fizjologiczne. Jak wiadomo, herbicydy indukują też ekspresję genów auksynowych, w tym GH3 (Roux i Perrot-Rechenmann 1997). Badania czynników regulujących ekspresję genu GH3 i syntezę IAA-asparaginianu w siewkach grochu wzbogacono o analizę wpływu trzech herbicydów auksynowych: 2,4-D, Dicamba i Picloramu (Ostrowski i Jakubowska 2013). Wszystkie badane herbicydy bardzo silnie indukowały zarówno ekspresję mrna GH3 jak i aktywność enzymatyczną. Najlepszy efekt obserwowano w przypadku 2,4-D, natomiast Dicamba i Picloram wywoływały nieco słabszą odpowiedź. Badania aktywności enzymatycznej syntetazy IAAasparaginianu wykazały, że podobnie jak w przypadku analizy transkrypcji, najsilniejszym induktorem aktywności okazał się 2,4-D. Na drugim miejscu wśród czynników stymulujących syntezę koniugatu był Picloram, a nieznacznie słabszy od niego rezultat wywoływał Dicamba. Mechanizm molekularny leżący u podstaw silnej indukcji genów GH3 przez herbicydy auksynowe nie do końca jest jasny. Wiadomo, że 2,4-D oddziałuje z białkiem receptorowym TIR1 wiążącym naturalną auksynę (IAA) (Dharmasiri i wsp. 2005). Co ciekawe, 2,4-D jest także ligandem ABP1 (Auxin Binding Protein 1) do niedawna uważanego za błonowy receptor auksyny (Gao i wsp. 2015). Na rolę 2,4-D w indukcji syntezy IAA-aminokwasów w tkankach grochu zwrócono już uwagę podczas pionierskich badań nad koniugacją auksyn (Südi 1964). Herbicyd ten stymulował ekspresję genów GH3 także w tkankach tytoniu (Roux i Perrot- Rechenmann 1997) oraz ryżu (Jain i wsp. 2006). Pikloram należący do innej, niż 2,4- D, grupy chemicznej herbicydów auksynowych również indukował transkrypcję GH3 w tytoniu (Roux i Perrot-Rechenmann 1997), choć nie za pośrednictwem receptora TIR1, lecz jego homologu AFB5 swoiście wiążącego Pikloram (Walsh i wsp. 2006). Podsumowując tę część badań należy stwierdzić, że wszystkie analizowane czynniki, tj. fitohormony, światło i herbicydy auksynowe, indukują zarówno ekspresję genu GH3 jak i aktywność enzymatyczną amidosyntetazy IAA, natomiast wielkość tej indukcji jest zróżnicowana. 15

3. Klonowanie i charakterystyka biochemiczna rekombinowanej syntetazy indolilo-3-acetylo-aminokwasów PsGH3 (wyniki pracy P7) Do pełnego wyjaśnienia roli koniugatów amidowych auksyn ważna jest, poza izolacją i charakterystyką białek syntetyzujących te połączenia, również identyfikacja genów GH3 kodujących amidosyntetazy. Prace nad białkami GH3 u roślin ujawniły, że badane gatunki (np. pomidor, ryż, rzodkiewnik) zawierają kilkanaście genów GH3 (Staswick i wsp. 2005, Jain i wsp. 2007, Kumar i wsp. 2012). W artykule przeglądowym Westfall i wsp. (2010) podsumowano informacje na temat niektórych właściwości biochemicznych rekombinowanych białek GH3. Z danych tych wynika, iż poszczególne izoenzymy funkcjonujące u danego gatunku przejawiają zróżnicowaną specyficzność substratową względem aminokwasów przyłączanych do auksyny. Sugeruje to, iż mnogość białek GH3 raczej nie wynika z ich funkcjonalnej redundancji, lecz jest związana z pełnieniem przez poszczególne amidosyntetazy odrębnych funkcji. Biorąc pod uwagę dane literaturowe można było przypuszczać, że w tkankach grochu występuje podobna sytuacja. Analiza sekwencji EST (expressed sequences tags) dla GH3 z grochu ujawniła tylko jeden taki fragment (Ostrowski i wsp. 2016b). Otrzymany produkt PCR zawierał otwartą ramkę odczytu złożoną z 1802 pz, która koduje białko liczące 600 aminokwasów o teoretycznej masie cząsteczkowej 68,19 kda i punkcie izoelektrycznym 5,19. Analiza filogenetyczna potwierdziła, że hipotetyczne białko GH3 z grochu wykazuje najwyższą homologię z polipeptydem GH3.3 z lucerny. Otrzymanie pełnej sekwencji aminokwasowej na podstawie cdna GH3 z grochu umożliwiło porównanie jej z trzema fragmentami peptydowymi syntetazy IAA-Asp uprzednio wyizolowanej z nasion grochu (Ostrowski i wsp. 2014b). Dwa peptydy otrzymane po trawieniu syntetazy IAA-Asp, są identyczne z sekwencją białka PsGH3 (Ostrowski i wsp. 2016b). Trzeci peptyd liczący 18 reszt aminokwasowych jest w 83% identyczny z omawianą sekwencją. Rezultat ten sugeruje, że rekombinowany polipeptyd kodowany przez mrna GH3 w nasionach grochu różni się od natywnej syntetazy IAA-Asp oczyszczonej z niedojrzałych nasion. Nie można zatem wykluczyć, że podobnie jak w przypadku innych gatunków roślin, tkanki grochu zawierają więcej niż jedno białko GH3. Efektem ekspresji sekwencji cdna GH3 w E. coli jest rozpuszczalna, katalitycznie aktywna forma syntetazy IAA-aminokwasów. Uzyskano zatem dowód, że znaleziona w bazie danych sekwencja GH3 z grochu koduje 16

amidosyntetazę IAA. Fuzyjne białko enzymatyczne (His) 6- GH3 (PsGH3) oczyszczono stosując chromatografię powinowactwa z immobilizowanymi jonami niklu oraz elektroforezę preparatywną w warunkach natywnych. W rezultacie otrzymano aktywny preparat enzymu charakteryzujący się wysoką czystością. Analizy kinetyczne rekombinowanego enzymu wykazały, że spośród naturalnych i syntetycznych auksyn, IAA jest najlepszym akceptorem reszty aminoacylowej (Ostrowski i wsp. 2016b). Białko PsGH3 wykazuje kinetykę hiperboliczną charakterystyczną dla enzymów izosterycznych, co jest zrozumiałe zważywszy na jego monomeryczną budowę. Białko rekombinowane katalizuje z największą wydajnością syntezę koniugatu IAA z asparaginianem, ale jest zdolne także do tworzenia IAA-Trp i IAA-Met (ok. 40% aktywności względem reakcji z L-Asp) oraz IAA-Tyr i IAA-Phe (ok. 30% aktywności względem reakcji z L-Asp). L-Glutaminian, który ma podobną budowę do L-Asp był bardzo słabym akceptorem reszty indolilo-3- acetylowej. Wyniki te potwierdzają hipotezę, że rekombinowane białko PsGH3 jest innym enzymem niż wcześniej wyizolowana z niedojrzałych nasion syntetaza IAA-Asp (Ostrowski i Jakubowska 2011). Specyficzność substratowa PsGH3 czyni je podobnym do AtGH3.3 (najwyższa aktywność wobec Asp, Met, Tyr, Trp), AtGH3.4 oraz AtGH3.6/DFL1 (preferuje Asp, Met, Trp) (Staswick i wsp. 2005). Opisanie struktur kilku rekombinowanych białek GH3 (AtGH3.11, AtGH3.12, VvGH3-4, Westfall i wsp. 2010; Peat i wsp. 2012) otrzymanych na podstawie modeli krystalograficznych, ułatwia zrozumienie zróżnicowanego powinowactwa enzymów do L-Asp i L-Glu. Syntetazy VvGH3-4 oraz PsGH3 zawierające Arg115 w centrum aktywnym wiążą L-Asp, natomiast AtGH3-17 preferujący L-Glu posiada prolinę zamiast argininy 115. Synteza IAA-Trp przez białka GH3, w tym także PsGH3, jest ciekawym zagadnieniem z dwóch powodów. Po pierwsze, Staswick (2009) sugerował, że koniugat ten może wywoływać efekty fizjologiczne poprzez receptory TIR1/AFB. Po drugie, tryptofan oprócz tego, że funkcjonuje jako donor reszty amioacylowej w koniugacji IAA, jest prekursorem samej auksyny. Zbadano zatem wpływ tryptofanu na aktywność syntetazy PsGH3 w dwóch wariantach (Ostrowski i wsp. 2016b). W pierwszym z nich analizowano szybkość reakcji syntezy IAA-Asp jako funkcję stężenia tryptofanu przy dwóch stężeniach IAA (2 mm, 4 mm). W drugim wariancie badano wpływ stężenia tryptofanu na szybkość reakcji w warunkach różnych stężeń 17

Asp. Z wykresów Dixona wynika, że tryptofan jest inhibitorem kompetycyjnym syntetazy PsGH3 i konkuruje z asparaginianem o centrum aktywne. Ponadto dowiedziono, że mimo strukturalnego podobieństwa do kwasu indolilo-3- octowego, tryptofan nie rywalizuje z nim o miejsce w centrum katalitycznym enzymu, działając w tym wypadku jako inhibitor niekompetycyjny. Z uwagi na fakt, że ATP jest niezbędny podczas pierwszego etapu reakcji katalizowanej przez GH3, zbadano także zależność szybkości reakcji enzymatycznej od stężenia ATP (Ostrowski i wsp. 2016b). Analizy kinetyczne wykazują, że wartość K m wyznaczona dla ATP jest niemal identyczna z parametrem wcześniej wyznaczonym dla syntetazy IAA-Asp z nasion (Ostrowski i Jakubowska 2011). Udział ATP w adenylacji auksyny sugeruje, że analogi nukleotydów hamujące reakcje z udziałem ATP, mogą być także inhibitorami amidosyntetaz. Pentafosforan diadenozyny (Ap 5 A), który jest inhibitorem wielu enzymów używających ATP jako substratu, hamuje także aktywność rekombinowanej syntetazy PsGH3 (Ostrowski i wsp. 2016b). Na podstawie wykresu Dixona określono, że inhibicja ma charakter kompetycyjny. Strukturalne podobieństwo pomiędzy ATP a Ap 5 A przyczynia się najprawdopodobniej do konkurencji między tymi cząsteczkami o centrum aktywne enzymu podczas etapu adenylacji IAA, ponieważ powinowactwo PsGH3 do ATP w obecności inhibitora maleje 1,11-krotnie. Na podstawie reakcji syntezy IAA-aminokwasów (str.7/8) wiadomo, że adenylacja IAA wymaga utworzenia związku pośredniego IAA-AMP z jednoczesnym uwolnieniem pirofosforanu (PP i ) (Staswick i wsp. 2002). Pirofosforan decyduje o odwracalności reakcji oraz o położeniu stanu równowagi reakcji. Hydroliza PPi do dwóch reszt ortofosforanu jest katalizowana przez pirofosfatazę (PPazę) i uwalnia energię wiązania bezwodnikowego. Reakcja ta powoduje, że synteza IAAaminokwasu staje się nieodwracalna. W związku z tym przyjęto hipotezę, że zwiększenie szybkości degradacji PP i zwiększy także ilość syntetyzowanego IAA-Asp (Ostrowski i wsp. 2016b). W doświadczeniach zastosowano różne ilości dodawanej egzogennej pirofosfatazy (EC 3.6.1.1) z drożdży Saccharomyces cerevisiae. Biorąc pod uwagę fakt, że jony magnezu działają jako kofaktor PPazy oraz neutralizują ujemnie naładowany ortofosforan opuszczający centrum aktywne enzymu (Schmelz i Naismith 2009), wraz z ilością enzymu, zmieniano także stężenie MgCl 2. Najlepszy efekt aktywujący zaobserwowano w przypadku dodania 6 U PPazy 18

oraz 12 mm MgCl 2 (Ostrowski i wsp 2016b). Niewykluczone, że pirofosfataza zwiększa aktywność syntetaz IAA-amidów, ponieważ, jak pokazały badania Chen i wsp. (2010), PP i jest inhibitorem OsGH3-8 i konkuruje z asparaginianem o centrum aktywne enzymu. Najważniejszym rezultatem tej pracy jest identyfikacja pełnej sekwencji DNA kodującej aktywne enzymatycznie rekombinowane białko GH3 z grochu. Charakterystyka biochemiczna oczyszczonego enzymu wskazuje, że jest to drugi, po wyizolowanej wcześniej syntetazie IAA-Asp (Ostrowski i Jakubowska 2011), polipeptyd GH3 z tej rośliny. 4. Rola IAA-asparaginianu w odpowiedzi grochu na stres wywołany jonami kadmu oraz zasoleniem (wyniki pracy P6) Wysoka aktywność syntetazy IAA-asparaginianu w niedojrzałych nasionach grochu oraz regulacja tej aktywności przez czynniki środowiskowe sugerują znaczącą rolę IAA-Asp w procesach fizjologicznych (Ostrowski i Jakubowska 2011, 2013). IAA-asparaginian w przeciwieństwie do IAA-alaniny, czy IAA-leucyny, raczej nie jest źródłem aktywnej auksyny uwalnianej na drodze hydrolizy enzymatycznej. Dotychczas hydrolizę IAA-Asp obserwowano jedynie w warunkach związanych z występowaniem stresu biotycznego (Ludwig-Müller i wsp. 1996, Campanella i wsp. 2008). Wyniki te sugerują, że IAA-Asp może służyć jako źródło wolnej auksyny w warunkach stresowych. Druga z możliwości zakłada funkcjonowanie IAA- Asp jako cząsteczki sygnałowej, której degradacja na drodze hydrolizy jest konieczna w różnych warunkach stresu biotycznego. Do przyjęcia tezy o sygnalizacyjnej, niezależnej od IAA, funkcji IAA-asparaginianu skłaniają wyniki prac autorów, którzy zaobserwowali związek poziomu IAA-Asp z określonymi efektami fizjologicznymi. González-Lamothe i wsp. (2012) sugerują, że IAA-Asp działa jako cząsteczka promująca rozwój choroby wywołanej indukcją genów wirulencji patogena u A.thaliana. Z kolei Böttcher i wsp. (2013) określili IAA-Asp mianem regulatora dojrzewania owoców (ripening factor) winorośli. Już w latach dziewięćdziesiątych ubiegłego wieku Oetiker i Aeschbacher (1997) zwrócili uwagę, iż tkanki lulka (Hyoscyamus muticus) charakteryzujące się silną opornością na stres termiczny, gromadziły znaczne ilości IAA-Asp. Wobec powyższych faktów postanowiono sprawdzić, czy syntetyzowany w tkankach grochu IAA-Asp może regulować odpowiedź roślin na różne rodzaje stresu abiotycznego. W tym celu wybrano stres solny oraz stres wywołany działaniem jonów kadmu, jako dobrze poznane 19

czynniki abiotyczne zaburzające procesy fizjologiczne grochu (Ostrowski i wsp. 2016a). Wpływ IAA-Asp na odpowiedź siewek grochu na wyżej wymienione bodźce abiotyczne analizowano przez pomiar aktywności katalitycznej enzymów zaangażowanych w reakcje stresowe, takich jak katalaza, peroksydaza askorbinianowa i peroksydaza gwajakolowa. Zbadano także poziom nadtlenku wodoru oraz karbonylacji białek jako markerów stresu. Analiza parametrów morfologicznych takich jak długość pędu i korzenia etiolowanych 7-dniowych siewek grochu wykazała, że 24-godzinna inkubacja roślin w obecności IAA-Asp stymulowała wzrost korzenia, ale hamowała wydłużanie pędu. Efekt hamujący rozwój korzeni i pędów obserwowano w przypadku połączonego działania IAA-Asp i NaCl oraz IAA- Asp i CdCl 2. Dłuższy czas inkubacji (48 h) siewek grochu w tych warunkach hamował wzrost korzeni i pędów. Z kolei działanie samego IAA-Asp, nieco stymulowało wzrost długości korzenia. Wyniki te sugerują, że IAA-asparaginian reguluje wzrost roślin. IAA-Asp działa ponadto jako czynnik indukujący reakcje stresowe, zwiększa bowiem poziom karbonylacji białek i obniża stężenie nadtlenku wodoru w siewkach grochu. Wydaje się, że sam IAA-Asp działa raczej jako słaby induktor stresu, ponieważ w małym stopniu obniżał stężenie H 2 O 2, a najsilniejszy efekt stwierdzono w roślinach poddanych działaniu IAA-Asp z chlorkiem kadmu. Zważywszy na fakt, że wartość stężenia nadtlenku wodoru zależy m.in. od aktywności enzymów degradujących tę cząsteczkę, obniżenie poziomu H 2 O 2 może być efektem zwiększonej aktywności katalazy (CAT) lub peroksydaz (POX). W przypadku katalazy stwierdzono, że jej aktywność była nieznacznie indukowana przez IAA-Asp (Ostrowski i wsp. 2016a). Z badanych dwóch głównych rozpuszczalnych peroksydaz- peroksydazy askorbinianowej (APX) oraz peroksydazy gwajakolowej (GPX), IAA-Asp tylko w nieznacznym stopniu indukował aktywność APX podczas 24-godzinnej indukcji, natomiast znacznie hamował tę aktywność po 48 godzinach. Czynniki stresowe (zasolenie, jony kadmu), zarówno bez jak i w obecności IAA-Asp, powodowały obniżenie aktywności APX. Szczególnie wyraźny był wpływ IAA-Asp działającego w warunkach zasolenia. Inkubacja roślin w tych warunkach przez 48 godzin niemal dwukrotnie zwiększała aktywność enzymu względem próby kontrolnej. Niewykluczone, że wysoka aktywność APX odzwierciedla niski poziom H 2 O 2 w homogenatach roślin inkubowanych w 20

obecności IAA-Asp i wysokiego stężenia NaCl. Aktywność peroksydazy gwajakolowej wyraźnym malała pod wpływem IAA-Asp oraz pozostałych czynników. Omawiana praca po raz pierwszy opisuje wpływ IAA-Asp na odpowiedź roślin w określonych warunkach stresu środowiskowego. Badania te sugerują sygnalizacyjną lub regulatorową funkcję koniugatu auksyny, który dotąd kojarzony był głównie ze szlakiem degradacji oksydacyjnej IAA (Kai i wsp. 2007). Jednak ta hipoteza wymaga dalszych badań, zwłaszcza mechanizmu percepcji potencjalnego sygnału, jakim mógłby być IAA-Asp. Warto w tym miejscu podkreślić, iż Staswick (2009) sugerował, że jasmonylo-tryptofan (JA-Trp) oraz indolilo-3-acetylo-tryptofan (IAA-Trp) mogą hamować rozwój korzeni bocznych Arabidopsis thaliana indukowany przez IAA za pośrednictwem receptora auksyny TIR1/AFB. Jakkolwiek Staswick (2009) nie uzyskał dowodów na to, że JA-Trp i IAA-Trp działają poprzez receptor IAA, to wcześniejsze badania Hayashi i wsp. (2008) ilustrujące blokowanie białka TIR1 przez pochodne auksyny zawierające dłuższy łańcuch węglowodorowy przyłączony w pozycji α pierścienia aromatycznego, skłaniają do przyjęcia tezy o antagonistycznym działaniu koniugatów z tryptofanem wobec auksyny. Należy też pamiętać, iż inne koniugaty amidowe fitohormonów wykazują aktywność sygnalizacyjną. Dobrym przykładem jest JA-Ile, działająca przez receptor COI1 (coronatine insensitive 1), który funkcjonuje na podobnej zasadzie jak TIR1 (Katsir i wsp. 2008). Funkcję regulatorową stwierdzono również w przypadku indolilo-3- acetylo-cysteinianu (ICA-Cys), koniugatu kwasu indolilo-3-karboksylowego z cysteiną, który jest główną fitoaleksyną u rzodkiewnika (Wang i wsp. 2012). IAAasparaginian ma szansę powiększyć grono takich cząsteczek sygnałowych. 5. Rola glukozylotransferazy IAA (syntazy 1-O-IA-glukozy) w modyfikacji glikoprotein w niedojrzałych nasionach grochu (wyniki prac P4 i P5) Analiza aktywności amidosyntetazy IAA-Asp podczas rozwoju nasion grochu wykazała, że najwyższą wartość osiąga ona w niedojrzałych nasionach o średnicy ok. 5 mm (Ostrowski i Jakubowska 2011). W mniejszych nasionach (2-3 mm) poziom aktywności jest o połowę niższy. Jak pokazały wcześniejsze badania nasiona o średnicy 3 mm wykazywały wysoką aktywność syntazy 1-O-IA-glukozy (syntaza IAGlc), kluczowego enzymu w syntezie koniugatów estrowych auksyny (Jakubowska i Kowalczyk 2004). Dane te sugerują, że w zależności od stopnia 21

rozwoju nasion zmienia się profil koniugatów IAA. Jednak nie ustalono co jest akceptorem reszty IAA pobieranej z 1-O-IA-glukozy w tkankach grochu. W związku z powyższym, a także biorąc pod uwagę enigmatyczną rolę syntazy IAA-glukozy w nasionach grochu, kolejnym zadaniem było ustalenie funkcji tego enzymu. Z uwagi na fakt, że rośliny należące do klasy jednoliściennych gromadzą IAA głównie w postaci wielkocząsteczkowych połączeń z polisacharydami (IAA-β-1-4-glukan, Bandurski i wsp. 1995), przyjęto założenie, iż w nasionach grochu, w których głównym materiałem zapasowym są białka, IAA może być przechowywany w postaci koniugatów z białkami złożonymi zawierającymi komponentę cukrowcową (glikoproteinami). Możliwość tworzenia koniugatów auksyn z białkami w owocach grochu stwierdzili wcześniej Park i wsp. (2010), jednak w tym przypadku należy wykluczyć udział 1-O-IA-glukozy. Syntazę 1-O-IA-glukozy wyizolowano z niedojrzałych nasion grochu o średnicy 3-5 mm otrzymując jednorodną elektroforetycznie formę enzymu o masie cząsteczkowej odpowiadającej 56 kda (Ostrowski i wsp. 2015). Analiza bioinformatyczna peptydów otrzymanych po trawieniu białka enzymatycznego, wykazała bardzo wysoki stopień homologii pomiędzy syntazą z grochu a enzymami z kukurydzy (Zea mays) i sorgo (Sorghum bicolor). Co ciekawe, syntaza IAGlc z rzodkiewnika, który jest bliżej spokrewniony z grochem niż wymienione rośliny jednoliścienne, nie była podobna do enzymu z nasion grochu. Fakt ten można wytłumaczyć specyficznością substratową glukozylotransferaz. Zarówno syntaza IA-glukozy z nasion kukurydzy, jak i GTaza oczyszczona z grochu, wyraźnie preferują IAA jako akceptor reszty glukozy (Kowalczyk i wsp. 2003). Z kolei glukozylotransferazy z rzodkiewnika, UGT84B1 (Jackson i wsp. 2001) oraz AtJGT (Song 2005) charakteryzują się szerszą specyficznością wobec substratów glukozylacji. Analizy kinetyczne wykazały, że enzym z grochu, oprócz IAA, który jest głównym substratem reakcji, wykorzystuje, choć w dużo mniejszym stopniu, dwie inne auksyny (IPA i 1-NAA) jako akceptory reszty glukozy (Ostrowski i wsp. 2015). Niniejsze badania wykazały, że pochodne auksyny: IBA, IPA oraz nieaktywny analog syntetyczny (2-NAA) działają jako inhibitory konkurujące z IAA o centrum katalityczne enzymu. Z kolei, lakton kwasu D-glukunowego zwiększał aktywność syntazy 1-O-IA-glukozy 22

osiągając najlepszy efekt aktywujący przy stężeniu 0,3 mm. Lakton jest inhibitorem β-glukozydazy degradującej 1-O-IAGlc do IAA i glukozy (Jakubowska i Kowalczyk 2004). Jak wcześniej założono, wysokoenergetyczny związek pośredni, 1-O-IAglukoza, uczestniczy w transacylacji reszty IAA na wysokocząsteczkowe akceptory jako donor IAA. W wyniku tej reakcji powstają koniugaty estrowe z glikoproteinami w niedojrzałych nasionach grochu o średnicy mniejszej niż 5 mm (Ostrowski i wsp. 2015). Wykluczono bowiem, na podstawie analizy aktywności enzymatycznej, myo-inozytol i polisacharydy jako potencjalne akceptory reszty IAA w nasionach grochu. Frakcję glikoprotein z nasion wyizolowano oczyszczając homogenat metodą chromatografii powinowactwa na kolumnie zawierającej konkanawalinę A (ConA-Agarose). Wzbogacenie środowiska reakcyjnego o 0,05 U i 0,1 U syntazy IAGlc oczyszczonej z nasion grochu zwiększało radioaktywność [ 14 C]-IAA-glikoprotein, odpowiednio 40- i 50- krotnie w porównaniu z kontrolą, która nie zawierała syntazy. Najlepszy efekt zaobserwowano w obecności 0,1 U syntazy IAGlc z dodatkiem laktonu kwasu D- glukonowego w stężeniu 0,3 mm. Kolejnym argumentem przemawiającym za udziałem glukozylotransferazy IAA w syntezie IAGlc potrzebnej do przeniesienia IAA na glikoproteiny, jest doświadczenie w którym zamiast aktywatora syntazy, użyto jej inhibitora (2-NAA) w stężeniu 2 mm. Obserwowano wówczas spadek radioaktywności frakcji glikoprotein. Analiza frakcji glikoprotein przeprowadzona metodą SDS-PAGE w połączeniu z elektrotransferem rozdzielonych białek na membranę nitrocelulozową, ujawniła obecność pojedynczego prążka odpowiadającego masie cząsteczkowej 30 kda, który wykazywał pozytywny wynik reakcji na obecność glikoprotein. Pomiar radioaktywności [ 14 C] wyciętego z membrany prążka potwierdził najwyższy poziom znakowania w próbie zawierającej inhibitor β-glukozydazy, a najmniejszy w mieszaninie z inhibitorem syntazy IAGlc. Badania te dowodzą, że syntaza IA-glukozy generuje wysokoenergetyczny donor reszty IAA, który uczestniczy w modyfikacji glikoprotein. Kwestią otwartą pozostaje natomiast identyfikacja enzymu przenoszącego resztę indolilo3-acetylową z 1-O-IA-glukozy na glikoproteiny. 23

Podsumowanie Koniugacja IAA jest ważnym elementem metabolizmu tej cząsteczki sygnałowej i ma znaczący wpływ na transdukcję sygnału hormonalnego. Stąd identyfikacja i charakterystyka enzymów syntetyzujących i hydrolizujących koniugaty, a także kodujących je genów jest ważnym zagadnieniem badawczym tego tematu. Istotne jest także poznanie mechanizmów regulujących funkcjonowanie tych genów i białek. Funkcje koniugatów wiązano głównie z przechowywaniem hormonu, transportem lub ochroną cząsteczki sygnałowej przed degradacją, a powszechnie panującym poglądem było, iż koniugaty jako formy związane hormonów nie mają aktywności fizjologicznej. Wyniki badań przedstawione w ramach opisywanego osiągnięcia, sugerują że IAA-asparaginian może pełnić ważne funkcje w odpowiedzi na czynniki środowiskowe. Najważniejsze rezultaty badań zaprezentowanych w omawianym osiągnięciu są następujące: sklonowano gen amidosyntetazy IAA z grochu, przeprowadzono pełną charakterystykę biochemiczną pierwszego wyizolowanego z roślin enzymu uczestniczącego w syntezie IAA-Asp oraz stwierdzono jego przynależności do acyloadenylaz GH3. wykazano, że zarówno ekspresja genu kodującego amidosyntetazę IAA, jak i aktywność katalityczna enzymu, są regulowane przez różne czynniki środowiskowe, takie jak: światło, herbicydy oraz fitohormony, co wskazuje na rolę IAA-Asp w odpowiedzi na czynniki środowiskowe IAA-Asp, produkt aktywności amidosyntetazy IAA, reguluje odpowiedź siewek grochu na stres wywołany przez zasolenie i metale ciężkie na wczesnym etapie rozwoju nasion grochu powstaje, syntetyzowany przez glukozylotransferazę IAA, koniugat estrowy: 1-O-IA-glukoza, który służy do modyfikacji glikoprotein przez IAA. 24

5. Omówienie pozostałych osiągnięć naukowo-badawczych Rozwój naukowy przed uzyskaniem tytułu naukowego doktora Jestem absolwentem kierunku biologia (o specjalności biologia molekularna) Wydziału Biologii i Nauk o Ziemi Uniwersytetu Mikołaja Kopernika w Toruniu. Pracę magisterską pt. Błony otoczek jąder komórkowych łożyska ludzkiego oznaczanie aktywności sterolosulfohydrolazy siarczanu estronu z użyciem HPLC wykonałem pod kierunkiem Prof. dr hab. Jadwigi Gniot-Szulżyckiej w Zakładzie Biochemii Instytutu Biologii Ogólnej i Molekularnej UMK. Po uzyskaniu dyplomu magistra biologii odbyłem sześciomiesięczny staż absolwencki w Laboratorium Analiz Chemicznych LABOTEST w Toruniu. W tym czasie poznałem różne techniki analityczne (chromatografia gazowa, metody miareczkowe, metody spektrofotometryczne) stosowane w analizie związków nieorganicznych i organicznych występujących w różnorodnym materiale (woda, ścieki, żywność, etc.). Po zakończeniu stażu, w styczniu 2005 roku, podjąłem pracę (w wymiarze ½ etatu) na stanowisku asystenta w Katedrze i Zakładzie Histologii i Embriologii Collegium Medicum UMK w Bydgoszczy, gdzie uczestniczyłem w badaniach naukowych Katedry oraz prowadziłem zajęcia dydaktyczne z przedmiotu Biologia komórki dla studentów I roku Wydziału Lekarskiego. W Katedrze kierowanej przez Prof. dr hab. Alinę Grzankę zajmowano się analizą białek cytoszkieletu podczas apoptozy i różnicowania komórek białaczek. Były to głównie badania z użyciem mikroskopii fluorescencyjnej, mikroskopii świetlnej oraz cytometrii przepływowej. Z tego okresu pochodzi pięć prac przeglądowych opublikowanych w czasopismach o zasięgu krajowym (Załącznik nr 4, część B, poz. 6,7,9,10,11) oraz jedna krótka praca eksperymentalna, którą wydrukowano w czasopiśmie polskojęzycznym (Załącznik nr 4, część B, poz.8). Po dziewięciu miesiącach zrezygnowałem z pracy w Collegium Medicum i rozpocząłem studia doktoranckie w zakresie biologii na Wydziale Biologii i Nauk o Ziemi Uniwersytetu Mikołaja Kopernika w Toruniu pod kierunkiem dr hab. Anny Jakubowskiej (Zakład Biochemii Instytut Biologii Ogólnej i Molekularnej UMK), która prowadziła badania nad enzymatyczną syntezą i hydrolizą koniugatów auksyn. 25

Tematyka moich badań dotyczyła bardzo słabo znanego wówczas szlaku biosyntezy koniugatów amidowych auksyn. W badaniach wstępnych ustaliłem warunki oznaczeń aktywności amidosyntetazy kwasu indolilo-3-octowego w niedojrzałych nasionach grochu i wykazałem, że frakcja białkowa ekstraktu z nasion katalizuje syntezę połączeń amidowych IAA z różnymi aminokwasami, wśród których preferowany jest wyraźnie asparaginian. Identyfikację produktu reakcji enzymatycznej potwierdziłem metodami chromatograficznymi (HPLC oraz TLC). Wyniki te zostały opublikowane w postaci krótkiego artykułu w Journal of Plant Physiology (Załącznik nr 4, część A, poz.1) oraz przedstawione podczas dwóch konferencji (Załącznik nr 4, część G, poz. 1,2). W kolejnym etapie badań uzyskałem jednorodny elektroforetycznie preparat enzymu stosując klasyczne metody biochemiczne do oczyszczania białek. Przeprowadziłem częściową charakterystykę biochemiczną preparatu definiując preferencje substratowe amidosyntetazy. Stwierdziłem ponadto, że aktywność enzymu jest stymulowana przez związki tiolowe. Aktywatorami syntetazy IAA-Asp okazały się jony magnezu i wapnia, natomiast kationy Cu 2+ i Zn 2+ hamowały aktywność enzymu. W ramach charakterystyki molekularnej amidosyntetazy IAA określiłem masę cząsteczkową oraz punkt izoelektryczny białka enzymatycznego. Ponadto wykazałem, że syntetyczna auksyna, kwas naftylo-1-octowy oraz światło białe indukują aktywność amidosyntetazy IAA-aminokwasów w kilkudniowych siewkach grochu. Wyniki te sugerują, że omawiany enzym pełni rolę w regulacji poziomu auksyny w warunkach fizjologicznych. Realizację badań (zakup aparatury, odczynników) oraz podnoszenie kwalifikacji podczas szkoleń umożliwiło mi stypendium dla doktorantów Krok w Przyszłość przyznane dwukrotnie (I edycja: 2006/2007; II edycja: 2009) przez Zarząd województwa Kujawsko-Pomorskiego w ramach Zintegrowanego Programu Operacyjnego Rozwoju Regionalnego (ZPORR). Do dorobku przed uzyskaniem stopnia naukowego doktora zaliczyć należy również współautorstwo dwóch polskojęzycznych prac przeglądowych dotyczących receptorowych kinaz serynowotreoninowych (Załącznik nr 4, część B, poz.12) oraz receptorów auksyn (Załącznik nr 4, część B, poz.13). Wyniki badan otrzymane podczas studiów doktoranckich zostały zaprezentowane na kilku konferencjach krajowych (Załącznik nr 4, część G, poz. 4,5,7,8). 26

Równolegle z badaniami prowadzonymi w ramach pracy doktorskiej, kontynuowałem współpracę z Katedrą Histologii i Embriologii Collegium Medicum w Bydgoszczy, aby zakończyć rozpoczęte wcześniej badania dotyczące reorganizacji mikrofilamentów aktynowych w jądrach komórkowych komórek białaczki. Ich rezultaty były przedstawione podczas dwóch konferencji (Załącznik nr 4, część G, poz. 3,6), a następnie opublikowane w Folia Histochemica et Cytobiologica (Załącznik nr 4, część A, poz.2). Rozwój naukowy po uzyskaniu tytułu naukowego doktora W 2009 roku uzyskałem tytuł doktora nauk biologicznych na podstawie pracy pt. Syntetaza indolilo-3-acetylo-asparaginianu enzym uczestniczący w biosyntezie koniugatów amidowych auksyn w tkankach grochu (Pisum sativum L.). Praca uzyskała wyróżnienie Wydziału Biologii i Nauk o Ziemi Uniwersytetu Mikołaja Kopernika w Toruniu. Przygotowując pracę doktorską postanowiłem kontynuować temat koniugatów amidowych w grochu. Interesującym zagadnieniem była kwestia obecności w tkankach tej rośliny innych, niż syntetaza IAA-Asp, enzymów tworzących połączenia amidowe z auksyną. Ponadto, wysoka aktywność enzymatyczna syntetazy IAA-Asp sugrowała ważną rolę tego enzymu w regulacji stężenia auksyny podczas procesów fizjologicznych. Poza realizacją badań prowadzonych w ramach opisywanego osiągnięcia naukowego, uczestniczyłem w kilku innych zadaniach badawczych, które zostały przedstawione poniżej. Synteza enzymatyczna indolilo-3-acetylo-myo-inozytolu w siewkach ryżu (Oryza sativa) Oprócz realizowania głównego nurtu badań związanego z koniugacją auksyn w tkankach grochu, uczestniczyłem także w pracach Zakładu Biochemii UMK dotyczących enzymatycznej syntezy IA-myo-inozytolu w ryżu. Reakcja ta jest katalizowana przez acylotransferazę z rodziny białek podobnych do karboksypeptydaz serynowych (SCPL). Temat ten jest przedmiotem pracy doktorskiej mgr Anny Ciarkowskiej w przypadku której pełnię funkcję promotora pomocniczego. W ramach prowadzonych badań wykazano, że IAA, SA oraz 2,4-D indukują aktywność syntazy IA-myo-inozytolu w 5-dniowych etiolowanych siewkach 27

ryżu. Susza oraz 150 mm NaCl, podobnie jak ABA, hamowały tę aktywność. Analizy ekspresji genu kodującego acylotransferazę IA-inozytolu w siewkach ryżu, przeprowadzone metodą półilościowego RT-PCR, nie stwierdziły istotnych różnic pomiędzy badanymi wariantami a kontrolą. Zaobserwowano natomiast obecność trzech prążków białkowych o zbliżonych masach cząsteczkowych podczas analizy Western blot z użyciem przeciwciał otrzymanych przeciwko syntazie IAInos z kukurydzy. Może to świadczyć o niespecyficzności użytych przeciwciał, ale może także sugerować, poprzez podobieństwo z syntazą IA-myo-inozytolu z kukurydzy, obecność kilku izoform acylotransferazy różniących się stopniem glikozylacji. Wyniki tych badań zostały opublikowane w pracy Ciarkowska i wsp. (2016) (Załącznik nr 4, część A, poz.6). Z uwagi na fakt, iż wspomniany enzym ulega potranslacyjnej glikozylacji, ekspresja białka rekombinowanego musi być prowadzona w systemie eukariotycznym. Kolejne cele tej pracy obejmują przeprowadzenie ekspresji rekombinowanej acylotransferazy IA-myo-inozytolu z ryżu w komórkach drożdży oraz oczyszczenie i charakterystykę białka rekombinowanego. Dodatkowo, natywna syntaza IA-myo-inozytolu została częściowo oczyszczona z młodych siewek ryżu. W pracy doktorskiej porównano właściwości biochemiczne natywnego i rekombinowanego preparatu enzymu. Wpływ jonów kadmu na hydrolizę białek zapasowych nasion grochu W latach 2012-2013 sprawowałem opiekę nad doktorantką z Tunezji, która w Zakładzie Biochemii UMK realizowała dwa kilkumiesięczne staże. Khadija Jaouani, doktorantka z Uniwersytetu Jarzouna w Bizerte (Tunezja) zajmowała się wpływem jonów kadmu (stres wywołany metalami ciężkimi) na aktywność katalityczną różnych proteaz (aminopeptydazy, metaloproteazy, proteazy serynowe) w kiełkujących nasionach grochu. Podczas pierwszego pobytu w Toruniu, celem doktorantki było poznanie technik biochemicznych służących oczyszczaniu białek roślinnych i zastosowaniu tych metod do oczyszczenia kilku frakcji białek zapasowych z nasion grochu (leguminy, wiciliny, albuminy), które stanowią potencjalne substraty w degradacji proteolitycznej. Separację wymienionych wyżej frakcji białkowych przeprowadzono stosując frakcjonowanie siarczanem amonu oraz techniki chromatograficzne (jonowymienna, adsorpcyjna, sączenie żelowe). Staż ten zaowocował kolejną, tym razem 3-miesięczną wizytą w 2013 roku podczas której skoncentrowano się na analizie markerów stresu (karbonylacja białek, stężenie 28

nadtlenku wodoru, proliny). W trakcie tych badań analizowano skład proteomu nasion grochu w warunkach stresowych. Analizy te przeprowadzono metodą dwukierunkowej elektroforezy 2-DE obejmującej ogniskowanie izoelektryczne (IEF) i elektroforezę w warunkach denaturujących z SDS (SDS-PAGE). Wyniki otrzymane podczas obydwu pobytów zostały opracowane i wysłane do publikacji. W 2012 roku przez kilka miesięcy współpracowałem z dr hab. Małgorzatą Jefimow (Zakład Fizjologii Zwierząt UMK) oraz z dr hab. Michałem Wojciechowskim (Zakład Zoologii Kręgowców UMK), którzy w ramach projektu WZROST (Stypendia dla profesorów wizytujących) prowadzili badania z Profesorem Craigiem L. Frank (Fordham University, USA). Mój udział w tych pracach polegał na oznaczeniu cholesterolu w tkankach chomiczka syberyjskiego. Badania te polegały na ocenie wpływu diety bogatej w cholesterol i kwasy tłuszczowe na przebieg torporu u chomiczka syberyjskiego. Rezultaty otrzymane w toku tych badań zostały opublikowane w Physiological and Biochemical Zoology (Załącznik nr 4, część A, poz. 2). Enzymatyczne i nienzymatyczne funkcje fosfolipaz A 2 grupy IIA z jadów węży Viperidae i Crotalidae Kolejny cykl prac badawczych powstał w rezultacie 10-miesięcznego stażu podoktorskiego. W 2012 roku JM Rektor UMK przyznał mi stypendium postdoktorskie na realizację badań naukowych prestiżowym ośrodku zagranicznym w ramach programu WZROST ( Wzmocnienie potencjału dydaktycznego UMK w Toruniu w dziedzinach matematyczno-przyrodniczych"). Staż odbyłem w Instytucie Pasteura w Paryżu w okresie od 2 stycznia do 31 października 2013 roku w pracowni Dr Pierre- Jean Corringer pod bezpośrednią opieką Dr Grażyny Faure (Unite Recepteurs- Canaux). Badania te dotyczyły biochemicznej i fizykochemicznej charakterystyki oddziaływań fosfolipazy A 2 grupy IIA z jadu grzechotnika z różnymi białkami. Mój udział w nich polegał na opracowaniu koncepcji badań enzymologicznych, przeprowadzeniu analiz spektrofluorymetrycznych aktywności enzymatycznej, wykonaniu analiz kinetycznych, oczyszczeniu rekombinowanego białka GLIC, przeprowadzeniu analiz z użyciem powierzchniowego rezonansu plazmonów (SPR), przygotowania prób do ultrawirowania analitycznego, dichroizmu kołowego, kokrystalizacji białek. Rezultatem tych badań są trzy opublikowane artykuły oraz 29

kilkanaście komunikatów konferencyjnych zaprezentowanych podczas międzynarodowych kongresów. Poniżej opisano wyniki zaprezentowane we wspomnianych wyżej publikacjach. Czynnik krzepnięcia Xa zapobiega oligomeryzacji przeciwzakrzepowych fosfolipaz A 2 (Ostrowski M, Prijatelj-Znidarsic P, Raynal B, Saul F, Faure G (2013) Toxin Reviews) Fosfolipazy A 2 są enzymami przeprowadzającymi hydrolizę glicerofosfolipidów w pozycji sn-2 do lizofosfolipidu i kwasu tłuszczowego. Oprócz aktywności enzymatycznej, fosfolipazy A 2 zaliczane do grupy IIA, które występują w jadzie grzechotnika (Crotalus durissus terrificus) i żmii (Vipera ammodytes ammodytes), przejawiają zdolność do specyficznego oddziaływania z kilkoma białkami. Właściwość ta leży u podstaw blokowania m.in. aktywności czynnika krzepnięcia krwi Xa. Fosfolipazy A 2 (spla2) obecne w jadach Viperidae i Crotalidae są małymi zasadowymi białkami o masie cząsteczkowej od 13 do 17 kda zawierającymi siedem zachowanych ewolucyjnie mostków dwusiarczkowych (Faure i wsp. 2011). Krotoksyna z jadu grzechotnika jest heterodimerem złożonym z dwóch niekowalencyjnie połączonych podjednostek CA-CB. Podjednostka CA ma charakter kwasowy, nie wykazuje aktywności enzymatycznej fosfolipazy ani neurotoksyczności. Z kolei podjednostka CB jest zbudowana z aminokwasów zasadowych, przejawia silną aktywność katalityczną fosfolipazy A 2 oraz jest słabą neurotoksyną. Jak dotąd zidentyfikowano po cztery izoformy dla podjednostek CA i CB. W ostatnich latach ustalono strukturę krystalograficzną kompleksu krotoksyny. Wiadomo, że spla 2 funkcjonują jako niekompetycyjne inhibitory aktywności proteolitycznej czynnika Xa (FXa) (Faure i wsp. 2010). Szczegółowa wiedza na temat miejsc oddziaływań pomiędzy PLA 2 a FXa jest kluczowa dla zrozumienia mechanizmów hemostazy i poszukiwań selektywnych leków antyagregacyjnych. W omawianej pracy przedstawiono rezultaty badań strukturalnych i biochemicznych kompleksu PLA 2 -FXa (Ostrowski i wsp. 2014a). Wynik ultrawirowania analitycznego mieszaniny CB z FXa sugeruje, że tworzenie kompleksu PLA 2 -FXa przeciwdziała oligomeryzacji podjednostek CB krotoksyny. Do przyjęcia tej hipotezy skłaniają rezultaty dokowania molekularnego (molecular docking), które ujawniło, że regiony aminokwasowe w CB 30

odpowiedzialne za formowanie kompleksu krotoksyny częściowo pokrywają się z miejscami wiązania FXa. Ponadto, przeprowadzone symulacje pokazały, że tworzenie się heterodimeru CA-CB zapobiega powstawaniu dimerów i tetramerów izoform CBc/CBa2, wbrew temu co postulowali Marchi-Salvador i wsp. (2008). Analizy spektrofluorymetryczne aktywności hydrolitycznej CBd wykazały, że interakcje pomiędzy CBd a FXa nie mają istotnego wpływu na katalizę (Ostrowski i wsp. 2014a). Interesujący jest natomiast fakt, iż kompleks CBd-FXa charakteryzował się mniejszą wrażliwością na działanie inhibitora kompetycyjnego PLA 2 (3-(4- tetradecylobenzylo)-4h-1,2,3-oksadiazol-5-onu, PMS 1062). Wynik ten sugeruje, że FXa w kompleksie z CBd może częściowo maskować centrum aktywne enzymu do którego przyłącza się inhibitor. Neurotoksyczna fosfolipaza A 2 z grzechotnika jest nowym ligandem i regulatorem prokariotycznego receptora GLIC (kanału jonowego bramkowanego protonami z Gleobacter violaceus) (Ostrowski M, Porowinska D, Prochnicki T, Prevost M, Raynal B, Baron B, Sauguet L, Corringer P-J, Faure G. (2016) Toxicon) Krotoksyna, podobnie jak inne β-neurotoksyny, wykazuje neurotoksyczność presynaptyczną, chociaż molekularny mechanizm tej aktywności nie został poznany. Ponadto, wykazano, że neurotoksyczne PLA 2 mogą oddziaływać z białkami błony postsynaptycznej (Vulfius i wsp. 2011) stabilizując nieaktywny stan nikotynowego receptora acetylocholiny (nachr). Jak dotąd nie ma dowodu na oddziaływanie PLA 2 z nachr, ale wiadomo, że produkty aktywności enzymatycznej fosfolipazy, kwasy tłuszczowe, są allosterycznymi modulatorami tego receptora (Fernandez Nievas i wsp. 2008). Wobec trudności z pozyskaniem natywnego receptora acetylocholiny, postanowiono użyć jego bakteryjnego homologa do badań nad oddziaływaniem z PLA 2 z grzechotnika. Receptor acetylocholiny, podobnie jak jego bakteryjny odpowiednik strukturalny, GLIC (G. violaceus ligand-gated ion channel), należy do grupy pentamerycznych kanałów jonowych bramkowanych ligandem (pentameric ligand-gated ion channel, plgic) (Corringer i wsp. 2012). Pentameryczne LGIC są obecne w błonach postsynaptycznych połączeń nerwowo-nerwowych oraz nerwowomięśniowych, jak również w komórkach bakterii. Kanały jonowe można podzielić na 31

dwie podgrupy: kationowe receptory pobudzające oraz anionowe receptory hamujące. Do pierwszej podgrupy zalicza się nachr i receptor serotoniny. Drugą podgrupę stanowią receptor glicyny oraz receptory A i B kwasu γ-aminomasłowego. Analizy przeprowadzone z użyciem powierzchniowego rezonansu plazmonów (SPR-surface plasmon resonance) wykazały, że CB, jak również jej homolog, sekrecyjna PLA 2 człowieka, oddziałują specyficznie z GLIC (Ostrowski i wsp. 2016c). Wiązanie fosfolipazy z cząsteczką receptora ma miejsce w obrębie domeny zewnątrzkomórkowej GLIC (ECD-extracellular domain). Badania elektrofizjologiczne przeprowadzone na oocytach Xenopus laevis metodą voltage clamp potwierdziły wynik SPR i dodatkowo ujawniły, że związanie CB do receptora hamuje przepływ jonów przez kanał. Na podstawie analizy sedymentacji kompleksu CB-GLIC można przypuszczać, że każda podjednostka pentameru GLIC wiąże dwie cząsteczki CB. Jak dotąd, mimo wielu prób, nie powiodło się otrzymanie kryształu kompleksu CB- GLIC. Oddziaływanie GLIC z CB nie pozostaje bez wpływu na aktywność enzymatyczną PLA 2. Szybkość hydrolizy fosfolipidu rośnie dwukrotnie w przypadku kompleksu CB-GLIC. Nie można wykluczyć, iż zgodnie z zaproponowanym modelem stechiometrii kompleksu, 2 cząsteczki CB: 1 podjednostka GLIC, zwiększona aktywność katalityczna wynika z lepszej ekspozycji centrum aktywnego PLA 2 na substrat w kompleksie. Kwestia wpływu receptora GLIC na aktywność oddziałującej z nim PLA 2 pozostaje otwarta. Jedna z hipotez zakłada, że fosfolipaza w kompleksie z receptorem hydrolizuje fosfolipidy błonowe, a produkty aktywności enzymatycznej regulują allosterycznie kanał jonowy. Fosfolipaza A 2 z grzechotnika zwiększa prąd chlorkowy kanału CFTR oraz koryguje dysfunkcję mutanta ΔF508CFTR (Faure G, Bakouh N, Lourdel S, Odolczyk N, Premchandar A, Servel N, Hatton A, Ostrowski MK, Xu H, Saul FA, Moquereau C, Bitam S, Pranke I,Planelles G, Teulon J, Herrmann H, Roldan A,Zielenkiewicz P, Dadlez M, Lukacs GL,Sermet-Gaudelus I, Ollero M, Corringer P-J and Edelman A (2016) Journal of Molecular Biology) Mukowiscydoza oraz inne choroby zaliczane do zwłóknień torbielowatych (CFcystic fibrosis) są efektem wadliwie działającego kanału chlorkowego CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator). Najczęstszą mutacją towarzyszącą tym chorobom jest delecja fragmentu genu kodującego CFTR polegająca na utracie 32

fenyloalaniny (ΔF508CFTR) (Faure i wsp. 2016). Efektem tej mutacji jest zmniejszenie ilości kanału jonowego w błonie wynikające z proteosomalnej degradacji zmutowanego białka. Celem farmakoterapii jest podawanie pacjentom leków korygujących działanie ΔF508CFTR. Analizy SPR wykazały, że CB wiąże się do jednej z wewnątrzkomórkowych domen przyłączających nukleotyd (NBD1) białka CFTR. W efekcie tych oddziaływań, rośnie natężenie prądu chlorkowego przez kanał CFTR. Co ciekawe, sekrecyjna PLA2 człowieka, homolog CB grzechotnika, wywołuje efekt odwrotny, hamuje przepływ jonów przez kanał. Oprócz aktywacji prądu chlorkowego, CB pełni także funkcję korektora. Zgodnie z zaproponowanym modelem (Ryc. 6, Faure i wsp. 2016), CB konkuruje z cytokeratyną 8 (C8) o wiązanie z ΔF508CFTR. Zadaniem cytokeratyny 8 jest skierowanie zmutowanego białka na drogę degradacji proteosomalnej. Przyłączenie CB do ΔF508CFTR w retikulum endoplazmatycznym zapobiega związaniu C8 i kanał chlorkowy trafia do błony komórkowej, gdzie oddziałująca z nim podjednostka CB nasila prąd jonowy. Podwójna rola PLA 2 z grzechotnika nie wynika z jej aktywności enzymatycznej. Oczywiście CB, wykazująca aktywność neurotoksyczną i antykoagulacyjną, nie może być zastosowana w terapii mukowiscydozy. Można natomiast, na podstawie m.in. modelowania molekularnego kompleksu CB-CFTR, pokusić się o zaprojektowanie leku specyficznie korygującego dysfunkcję CFTR. Struktura krystaliczna nowej izoformy podjednostki CB W trakcie badań nad oddziaływaniem CB z GLIC otrzymano kryształ CBd, izoformy zasadowej podjednostki krotoksyny, której struktura pierwszorzędowa nie została dotąd poznana. Dzięki analizom krystalograficznym ustalono sekwencję aminokwasową tej izoformy oraz poznano różnice pomiędzy pozycjami aminokwasów w pozostałych trzech izoformach CB. Struktura krystaliczna podjednostki CBd została rozszyfrowana jako homodimer. Wyniki te są przygotowywane do publikacji oraz zostały zaprezentowane podczas konferencji naukowych (Załącznik nr 4, część G, poz. 19,29). Plany na przyszłość Staż podoktorski w Instytucie Pasteura w Paryżu umożliwił mi rozpoczęcie realizacji nowej tematyki badawczej związanej z funkcjami fosfolipazy A 2. Jest to jednocześnie nowy, nigdy wcześniej nie realizowany temat w Zakładzie Biochemii 33

UMK w Toruniu. Rozwinięciem współpracy nawiązanej podczas stażu w Paryżu była wizyta Dr Faure na UMK w Toruniu w 2014 roku oraz pobyt kolejnego pracownika naszego Zakładu w ramach stażu post-doc w Instytucie Pasteura. Obecnie prowadzę badania dotyczące oddziaływań fosfolipazy A 2 z białkami surowicy krwi osób po zawale mięśnia sercowego. Prace mają na celu odpowiedzieć na pytanie, czy sekrecyjna PLA 2 wydzielana z kardiomiocytów podczas zawału oddziałuje specyficznie z białkami i jaka jest rola tych interakcji w patomechanizmie choroby. Warto podkreślić, że tematyka molekularnych podstaw chorób była już przedmiotem mojego zainteresowania podczas krótkiego okresu zatrudnienia w Collegium Medicum. Kontynuując współpracę z Instytutem Pasteura prowadzę badania nad oczyszczaniem i charakterystyką fosfolipaz A 2 z jadów węży z gatunków Vipera, które do tej pory nie zostały poznane. Celem tych badań będzie próba ustalenia molekularnych podstaw działania fosfolipaz na komórki nowotworowe. Temu tematowi poświęcony jest także grant, który przygotowuję. Literatura: 1. Bajguz A, Piotrowska A (2009) Conjugates of auxin and cytokinin. Phytochemistry 70: 957-969 2. Bandurski RS, Schulze A (1977) Concentration of indole-3-acetic acid and its derivatives in plants. Plant Physiol 60: 211-213 3. Bandurski RS, Cohen JD, Slovin JP, Reinecke DM (1995) Auxin biosynthesis and metabolism. [w] Davies PJ [red.] Plant Hormones: Physiology, Biochemistry and Molecular Biology. Dordrecht: Kluwer Academic Publishers, 39-65 4. Bierfreund NM, Tintelnot S, Reski R, Decker EL (2004) Loss of GH3 function does not affect phytochrome-mediated development in a moss, Physcomitrella patens. J Plant Physiol 161:823-835 5. Böttcher C, Keyzers RA, Boss PK, Davies C (2010) Sequestration of auxin by the indole-3- acetic acid-amido synthetase GH3-1 in grape berry (Vitis vinifera L.) and the proposed role of auxin conjugation during ripening. J Exp Bot 61: 3615-3625 6. Böttcher C, Burbidge CA, Boss PK, Davies C (2013) Interactions between ethylene and auxin are crucial to the control of grape (Vitis vinifera L.) berry ripening. BMC Plant Biol 23: 13:222 7. Campanella JJ, Smith SM, Leibu D, Wexler S, Ludwig-Müller J (2008) The auxin conjugate hydrolase family of Medicago truncatula and their expression during the interaction with two symbionts. J Plant Growth Regul 27: 26-38 8. Chen Q, Zhang B, Hicks LM, Wang S, Jez JM (2009) A liquid chromatography-tandem mass spectrometry-based assay for indole-3-acetic acid-amido synthetase. Anal Biochem 390: 149-154 9. Chen Q, Westfall CS, Hicks LM, Wang S, Jez JM (2010) Kinetic basis for the conjugation of auxin by a GH3 family indole-3-acetic acid-amido synthetase. J Biol Chem 285: 29780-29786 10. Ciarkowska A, Ostrowski M, Jakubowska A (2016) Abiotic stress and phytohormones affect enzymic activity of of 1-O-(indole-3-acetyl)-β-D-glucose: myo-inositol indoleacetyl transferase from rice (Oryza sativa). J Plant Physiol 205: 93-96 11. Corringer PJ, Poitevin F, Prevost MS, Sauguet L, Delarue M, Changeux JP (2012) Structure and pharmacology of pentameric receptor channels: from bacteria to brain. Structure 20: 941-956 12. Dharmasiri N, Dharmasiri S, Estelle M (2005) The F-box protein TIR1 is an auxin receptor. Nature 435: 441-445 34

13. Faure G, Xu H, Saul F (2010) Anticoagulant phospholipases A 2 which bind to the specific soluble receptor coagulation factor Xa. W: Kini M. [red.] Toxins and hemostasis. Springer Science + Business Media B.V. 201-217 14. Faure G, Xu H, Saul FA (2011) Crystal structure of crotoxin reveals key residues involved in the stability and toxicity of this potent heterodimeric β-neurotoxin. J Mol Biol 412-176-191 15. Faure G, Bakouh N, Lourdel S, Odolczyk N, Premchandar A, Servel N, Hatton A, Ostrowski MK, Xu H, Saul FA, Moquereau C, Bitam S, Pranke I, Planelles G, Teulon J, Herrmann H, Roldan A, Zielenkiewicz P, Dadlez M, Lukacs GL, Sermet-Gaudelus I, Ollero M, Corringer PJ, Edelman A (2016) Rattlesnake phospholipase A2 increases CFTR-chloride channel current and corrects F508CFTR dysfunction: impact in cystic fibrosis. J Mol Biol 428: 2898-2915 16. Fernández Nievas GA, Barrantes FJ, Antollini SS (2008) Modulation of nicotinic acetylcholine receptor conformational state by free fatty acids and steroids. J Biol Chem 283: 21478-21486 17. Gao Y, Zhang Y, Zhang D, Dai X, Estelle M, Zhao Y (2015) Auxin binding protein 1 (ABP1) is not required for either auxin signaling or Arabidopsis development. Proc Natl Acad Sci USA 112: 2275-2280 18. González-Lamothe R, El Oirdi M, Brisson N, Bouarab K (2012) The conjugated auxin indole3- acetic acid-aspartic acid promotes plant disease development. Plant Cell 24: 762-777 19. Grossmann K (2007) Auxin herbicide action: lifting the veil step by step. Plant Sign Bahav 2: 421-423 20. Hagen G, Kleinschmidt A, Guilfoyle T (1984) Auxin-regulated gene expression in intact soybean hypocotyl and excised hypocotyl sections. Planta 162: 147-153 21. Hagen G, Guilfoyle T (2002) Auxin-responsive gene expression: genes, promoters and regulatory factors. Plant Mol Biol 49: 373-385 22. Hayashi K, Tan X, Zheng N, Hatate T, Kimura Y, Kepinski S, Nozaki H (2008) Small-molecule agonists and antagonists of F-box protein-substrate interactions in auxin perception and signaling. Proc Natl Acad Sci USA 105: 5632-5637 23. Hsieh HL, Okamoto H, Wang M, Ang LH, Matsui M, Goodman H, Deng XW (2000) FIN219, an auxin-responsive gene, definesa link between phytochrome A and the downstream regulator COP1 in light control of Arabidopsis development. Gene Develop 14: 1958-1970 24. Jackson RG, Lim EK, Li Y, Kowalczyk M, Sandberg G, Hoggett J, Ashford DA, Bowles DJ (2001) Identification and biochemical characterization of an Arabidopsis indole-3-acetic acid glucosyltransferase. J Biol Chem 276: 4350-4356 25. Jain M, Kaur N, Tyagi AK, Khurana JP (2006) The auxin-responsive GH3 gene family in rice (Oryza sativa). Funct Integr Genom 6: 36-46 26. Jakubowska A, Kowalczyk S (2004) The auxin conjugate 1-O-indole-3-acetyl-beta-D-glucose is synthesized in immature legume seeds by IAGlc synthase and may be used for modification of some high molecular weight compounds. J Exp Bot 55: 791-801 27. Kai K, Horita J, Wakasa K, Miyagawa H (2007) Three oxidative metabolites of indole-3-acetic acid from Arabidopsis thaliana. Phytochemistry 68: 1651-1653 28. Katsir L, Schilmiller AL, Staswick PE, He SY, Howe GA (2008) COI1 is a critical component of a receptor for jasmonate and the bacterial virulence factor coronatine. Proc Natl Acad Sci USA 105; 7100-7105 29. Kesy JM, Bandurski RS (1990) Partial purification and characterization of indol-3- ylacetylglucose:myo-inositol indol-3-ylacetyltransferase (indoleacetic acid-inositol synthase). Plant Physiol 94: 1598-1604 30. Kowalczyk S, Bandurski RS (1991) Enzymic synthesis of 1-O-(indol-3-ylacetyl)- β-d-glucose. Biochem J 279: 509-514 31. Kowalczyk S, Jakubowska A, Bandurski RS (2002) 1-Naphtalene acetic acid induces indole-3- ylacetylglucose synthase in Zea mays. Plant Growth Regul 38: 127-134 32. Kowalczyk S, Jakubowska A, Zielińska E, Bandurski RS (2003) Bifunctional indole-3-acetyl transferase catalyses synthesis and hydrolysis of indole-3-acetyl-myo-inositol in immature endosperm of Zea mays. Physiol Plant 119: 165-174 33. Kumar R, Agarwal P, Tyagi AK, Sharma AK (2012) Genome-wide investigation and expression analysis suggest diverse roles of auxin-responsive GH3 genes during development and response to different stimuli in tomato (Solanum lycopersicum). Mol Genet Genom 287: 221-235 34. Leznicki AJ, Bandurski RS (1988) Enzymic synthesis of indole-3-acetyl-1-o-β-d-glucose. I. Partial purification and characterization of the enzyme from Zea mays. Plant Physiol 88: 1481-1485 35

35. Ludwig-Müller J (2011). Auxin conjugates: their role for plant development and in the evolution of land plants. J Exp Bot 62: 1757-1773 36. Ludwig-Müller J, Epstein E, Hilgeneberg W (1996) Auxin-conjugate hydrolysis in chinese cabbage: characterization of an amidohydrolase and its role during infection with clubroot disease. Physiol Plant 97: 627-634 37. Ludwig-Müller J, Jülke S, Bierfreund NM, Decker EL, Reski R (2009) Moss (Physcomitrella patens) GH3 proteins act in auxin homeostasis. New Phytol 181: 323-338 38. Marchi-Salvador DP, Corrêa LC, Magro AJ, Oliveira CZ, Soares AM, Fontes MR (2008) Insights into the role of oligomeric state on the biological activities of crotoxin: crystal structure of a tetrameric phospholipase A2 formed by two isoforms of crotoxin B from Crotalus durissus terrificus venom. Proteins 72: 883-891 39. Oetiker JH, Aeschbacher G (1997) Temperature sensitive plant cells with shunted indole-3- acetic acid conjugation. Plant Physiol 114: 1385-95. 40. Okrent RA, Brooks MD, Wildermuth MC (2009) Arabidopsis GH3.12 (PBS3) conjugates amino acids to 4-substituted benzoates and is inhibited by salicylic acid. J Biol Chem 284: 9742-9754 41. Ostrowski M, Jakubowska A (2008) Identification of enzyme activity that conjugates indole-3- acetic acid to aspartate in immature seeds of pea (Pisum sativum L.) J Plant Physiol 165:54-569 42. Ostrowski M, Jakubowska A (2011) Purification and biochemical characterization of indole-3- acetyl-aspartic acid synthetase from immature seeds of pea (Pisum sativum). J Plant Growth Regul 30: 30-40 43. Ostrowski M, Jakubowska A (2013) GH3 expression and IAA-amide synthetase activity in pea (Pisum sativum L.) seedlings are regulated by light, plant hormones and auxinic herbicides. J Plant Physiol 170: 361-368 44. Ostrowski M, Jakubowska A (2014) UDP-glycosyltransferases of plant hormones. Adv Cell Biol 4: 43-60 45. Ostrowski M, Prijatelj-Žnidaršič P, Raynal B, Saul F, Faure G (2014a) Human coagulation factor Xa prevents oligomerization of anti-coagulant phospholipases A2. Toxin Rev 33: 42-47 46. Ostrowski M, Świdziński M, Ciarkowska A, Jakubowska A (2014b) IAA-amido synthetase activity and GH3 expression during development of pea seedlings. Acta Physiol Plant 36: 3029-3037 47. Ostrowski M, Hetmann A, Jakubowska A (2015) Indole-3-acetic acid UDP-glucosyltransferase from immature seeds of pea is involved in modification of glycoproteins. Phytochemistry 117: 25-33 48. Ostrowski M, Ciarkowska A, Jakubowska A (2016a) The auxin conjugate indole-3-acetylaspartate affects responses to cadmium and salt stress in Pisum sativum L. J Plant Physiol 191: 63-72 49. Ostrowski M, Mierek-Adamska A, Porowińska D, Goc A, Jakubowska A (2016b) Cloning and biochemical characterization of indole-3-acetic acid-amino acid synthetase PsGH3 from pea. Plant Physiol Biochem 107: 9-20 50. Ostrowski M, Porowinska D, Prochnicki T, Prevost M, Raynal B, Baron B, Sauguet L, Corringer PJ, Faure G (2016c) Neurotoxic phospholipase A2 from rattlesnake as a new ligand and new regulator of prokaryotic receptor GLIC (proton-gated ion channel from G. violaceus). Toxicon 116:63-71 51. Park JE, Park JY, Kim YS, Staswick PE, Jeon J, Yun J, et al. (2007) GH3-mediated auxin homeostasis links growth regulation with stress adaptation response in Arabidopsis. J Biol Chem 288: 10036-10046 52. Park S, Ozga JA, Cohen JD, Reinecke DM (2010) Evidence of 4-Cl-IAA and IAA bound to proteins in pea fruits and seeds. J Plant Growth Regul 29: 184-193 53. Peat TS, Böttcher C, Newman J, Lucent D, Cowieson N, Davies C (2012) Crystal structure of an indole-3-acetic acid amido synthetase from grapevine involved in auxin homeostasis. Plant Cell 24: 4525-4538 54. Reddy SM, Hitchin S, Melayah D, Pandey AK, Raffier C, Henderson J, Marmeisse R, Gay G (2006) The auxin-inducible GH3 homologue Pp-GH3.16 is downregulated in Pinus pinaster root systems on ectomycorrhizal symbiosis establishment. New Phytol 170: 391-400 55. Roux C, Perrot-Rechenmann C (1997) Isolation by differential display and characterization of a tobacco auxin-responsive cdna Nt-gh3, related to GH3. FEBS Lett 419: 131-136 56. Schmelz S, Naismith JH (2009) Adenylate-forming enzymes. Curr Opin Struct Biol 19: 666-671 36

37