Znaczenie cytometrii przepływowej w diagnostyce białaczki z dużych ziarnistych limfocytów T

diagnostyka laboratoryjna Journal of Laboratory Diagnostics 2009 Volume 45 Number 2 125-135 Praca oryginalna Original Article Znaczenie cytometrii przepływowej w diagnostyce białaczki z dużych ziarnistych limfocytów T Katarzyna Błachnio 1, Grzegorz Rymkiewicz 1,2, Monika Gos 3, Tomasz Sadowski 4, Anna Borawska 5, Konrad Ptaszyński 2 1 Pracownia Cytometrii Przepływowej Zakładu Patologii, 2 Zakład Patologii, 3 Zakład Biologii Komórki, 4 Zakład Chemii Klinicznej, 5 Klinika Nowotworów Układu Chłonnego Centrum Onkologii - Instytut im. M. Skłodowskiej-Curie w Warszawie Streszczenie Cel badań: Omówienie danych kliniczno-patologiczno-laboratoryjnych i analiza skuteczności procedur diagnostycznych u chorych podejrzanych o procesy rozrostowe z dużych ziarnistych limfocytów T ze szczególnym uwzględnieniem roli cytometrii przepływowej (FCM) w ustaleniu ostatecznego rozpoznania. Metody badawcze: U 12 pacjentów wykonano morfologię krwi z rozmazem, badania histopatologiczno-immunohistochemiczne (HP/IH) trepanobiopsji szpiku, badania FCM krwi lub szpiku oraz badania molekularne (PCR). Wyniki: Neutropenię i limfocytozę obserwowano u wszystkich pacjentów, splenomegalię u 8, reumatoidalne zapalenie stawów u 4, autoimmunologiczne zapalenie tarczycy u 2, w pojedynczych przypadkach zespół Sjögrena i twardzinę. Rozpoznanie białaczki T-LGL ustalono u 11 chorych, a u 1 chorego poliklonalną limfocytozę z dużych, ziarnistych limfocytów T (LGLs). Komórki T-LGL wykazują zawsze dodatnią ekspresję: CD45, CD2 i CD3, zwykle CD8 z ujemną ekspresją CD4. T-LGL w FCM różniły się od LGLs utratą lub spadkiem ekspresji antygenów pan-t, najczęściej CD5, CD7 i CD43, obniżoną ekspresją CD44 i CD52, obecnością izoformy cząsteczki CD45 - CD45RA, CD11c i antygenów komórek NK (CD16, CD56 i CD57), brakiem ekspresji CD25, CD27, CD71. W badaniu HP/IH trepanobiopsji szpiku komórki T-LGL zlokalizowane były śródmiąższowo, tworząc drobne skupienia oraz w zatokach. Wnioski: Najważniejszym elementem w rutynowej diagnostyce T-LGL jest badanie FCM uzupełnione o badanie morfologii komórek białaczkowych. Wykazano 100% zgodność badań FCM i PCR w różnicowaniu T-LGL od LGLs. Flow cytometry signification in T-cell large granular leukemia diagnosis Summary Aim: The purpose of this study was to review the clinical, pathological and laboratory data of patients (pts) with the initial diagnosis of T-cell large granular leukemia (T-LGL), where particular attention was given to the results obtained with the use of 3-color flow cytometry (FCM) to make a final diagnosis. Methods: Histopathological (HP), immunohistochemical (IH) and FCM evaluations of peripheral blood (PB) / bone marrow (BM) of 12 pts with suspicion of T-LGL were performed. When the diagnosis of T-LGL was suspected, evaluation of a PB film was necessary. The PB samples were also investigated by polimerase chain reaction (PCR). Results: There was a neutropenia and lymphocytosis observed in all pts investigated, 8 pts showed splenomegaly. An autoimmune diseases such as rheumatoid arthritis was seen in 3 pts, Hashimoto`s thyroiditis in 2 pts. Sjögren syndrom or scleroderma was present in 1 pt each. The T-LGL was diagnosed in 11 cases and only one of the pts had features of reactive polyclonal lymphocytosis (LGLs). The T-LGL cells are usually CD8 positive, CD4 negative and differed from cells of pts with LGLs in FCM. The T-LGL cells showed CD45, CD45RA, CD2 and CD3 expression; an absence or decrease of pan-t-cell antigens expression such as CD5, CD7 and CD43; weaker expression of CD44 and CD52; expression of CD11c and NK antigens such as: CD16, CD56, CD57; absence of CD25, CD27, CD71. The IH studies of the BM trephines showed interstitial clusters and intrasinusoidal linear infiltrations of lymphocytes. Conclusions: FCM is the most important components of the routine diagnosis of T-LGL cells supplemented with the examination of morphologic features of those cells. In summary, we have shown a high conformation of FCM and PCR in differentiating T-LGL cells from those of LGLs lymphocytosis. Słowa kluczowe: białaczka z dużych ziarnistych limfocytów T (T-LGL), cytometria przepływowa Key words: T-cell granular lymphocyte leukemia (T-LGL), flow cytometry Szczególne podziękowania chcielibyśmy złożyć paniom: Prof. dr hab. med. Oldze Mioduszewskiej i dr med. Monice Prochorec-Sobieszek za krytyczne uwagi dotyczące niniejszej publikacji. 125

Znaczenie cytometrii przepływowej w diagnostyce białaczki z dużych ziarnistych limfocytów T Wstęp Białaczka z dużych, ziarnistych limfocytów T (ang. T-cell large granular leukemia, T-LGL) stanowi około 2-3% białaczek z dojrzałych komórek T/NK. T-LGL jest rzadką i heterogenną chorobą o przewlekłym przebiegu (limfocytoza > 6 miesięcy) z obecnością we krwi obwodowej zwiększonego odsetka dużych, ziarnistych limfocytów, komórek o obfitej jasnoniebieskiej cytoplazmie z azurofilnymi ziarnistościami. W badaniach laboratoryjnych stwierdza się prawidłową lub podwyższoną wartość leukocytozy (WBC>10x10 9 /l), neutropenię (<1,5x10 9 /l) oraz nieznaczną lub średnią limfocytozę w zakresie 2-20 x 10 9 /l. Choroba przeważnie występuje u osób dorosłych w wieku 45-75 lat, z taką samą częstością zachorowań zarówno u mężczyzn, jak i u kobiet. Rzadkie (<3%) są przypadki, kiedy choroba rozwijała się u osób młodych poniżej 25. roku życia [1, 2, 7, 8, 12, 20, 23]. Początkowe objawy T-LGL są niespecyficzne. U około 60-70% pacjentów choroba wykrywana jest przypadkowo w trakcie badań okresowych i często połączona jest z nawracającymi infekcjami bakteryjnymi. Chorzy często skarżą się na zmęczenie, mają podwyższoną temperaturę ciała oraz uczucie pełności i bóle w brzuchu będące wynikiem splenomegalii (>14 cm w długiej osi w badaniach USG i TK), która opisywana jest w 20-50% przypadków [1, 7, 8, 10, 11, 20, 23]. Komórki T-LGL zajmują krew obwodową (ang. peripheral blood, PB), szpik (ang. bone marrow, BM), wątrobę i śledzionę. Powiększenie węzłów chłonnych (limfadenopatia) nie występuje [1, 2, 7-9, 12, 19, 20, 23]. Zaobserwowano występowanie T-LGL u pacjentów z reumatoidalnym zapaleniem stawów (RZS), które występuje u około 30% chorych [7, 8, 11, 10-12, 19, 20, 23]. Unikalną cechą T-LGL jest częste współistnienie z innymi chorobami autoimmunologicznymi, hematologicznymi i nowotworowymi, takimi jak: zespół Sjögrena, toczeń rumieniowaty układowy, twardzina, nawracające zapalenie błony naczyniowej oka, zapalenie tarczycy typu Hashimoto, autoimmunologiczne endokrynopatie, wrzodziejące zapalenie jelita grubego, autoimmunologiczne zapalenie wątroby, zespół hemofagocytarny, autoimmunologiczne cytopenie i zespoły mielodysplastyczne, a nawet z innymi chłoniakami z komórek B, głównie o mniejszej złośliwości. Białaczka T-LGL może towarzyszyć także niedoborom immunologicznym, na przykład: pospolitemu zmiennemu niedoborowi odporności (ang. common variable immunodeficiency, CVID). Chorzy z T-LGL mają często różne nieprawidłowości serologiczne, takie jak: czynnik reumatoidalny (ang. rheumatoid factor, RF), przeciwciała przeciwjądrowe, przeciwpłytkowe, antyfosfolipidowe, krążące kompleksy immunologiczne i hipergammaglobulinemię poliklonalną [1, 2, 5, 7, 8, 10-12, 19, 20, 23]. Ocena fenotypu komórek limfoidalnych za pomocą cytometrii przepływowej z oceną morfologii w rozmazach z PB i BM ma najważniejsze znaczenie w codziennej rutynowej diagnostyce T-LGL w Centrum Onkologii w Warszawie (COI), jak i w innych ośrodkach diagnostyczno-leczniczych. Cytometria przepływowa pozwala na precyzyjną ilościową oraz jakościową analizę fenotypu komórek T-LGL i różnicowanie z procesami nienowotworowymi i innymi białaczkami z dojrzałych komórek T/NK [12]. Ocena klonalności komórek przeprowadzona z użyciem reakcji łańcuchowej polimerazy (ang. Polimerase Chain Reaction, PCR) z zastosowaniem starterów specyficznych dla genów TCR (ang. T-cell Receptor) traktowana jest w COI jako metoda pomocnicza w przypadkach wątpliwych. Celem pracy było omówienie danych kliniczno-patologiczno-laboratoryjnych i analiza skuteczności procedur diagnostycznych, takich jak: badania histopatologiczno-immunohistochemiczne (HP/IH) trepanobiopsji BM, badania rozmazów PB i BM, badania cytometryczne (FCM) i molekularne (PCR) u chorych podejrzanych o procesy rozrostowe z dużych ziarnistych limfocytów T (LGLs) krwi obwodowej ze szczególnym uwzględnieniem roli FCM w ustaleniu ostatecznego rozpoznania na podstawie materiału od chorych COI w Warszawie. Materiał i metody Pacjenci Badaniem objęto 12 pacjentów z podejrzeniem o procesy rozrostowe z dużych, ziarnistych limfocytów T krwi obwodowej postawionym na podstawie oceny morfologii w rozmazach PB, cech klinicznych i wstępnych badań laboratoryjnych zdiagnozowanych w latach 1998-2008 w COI w Warszawie. Wszystkie dane kliniczno-laboratoryjne, np. objawy ogólne, choroby towarzyszące, stan chorych podczas przyjęcia i wyniki badań laboratoryjnych, zaczerpnięto z dostępnej dokumentacji klinicznej. Rozpoznanie T-LGL ustalono w oparciu o nową klasyfikację WHO rozrostów hematopoetycznych i limfoidalnych [2] z wykorzystaniem cytometrycznych kryteriów diagnostycznych [1, 3, 6, 12, 24], oceny morfologii komórek limfoidalnych PB i BM w rozmazach i badaniach HP szpiku, oceny immunofenotypu w badaniach FCM i IH [2, 15, 19] oraz analizy molekularnej w korelacji z danymi kliniczno-laboratoryjnymi [14, 19]. Badania morfologiczne Morfologię PB i BM oceniano w rozmazach barwionych metodą May-Grünwald-Giemza (MGG). Trepanobiopsje BM utrwalano w utrwalaczu Oksfordzkim, przeprowadzano i barwiono w sposób rutynowy hematoksyliną i eozyną (HE) oraz oceniono mikroskopowo. W badaniu HE szpiku oceniano komórkowość, typ zajęcia BM przez komórki T-LGL, linie: czerwonokrwinkową, granulocytarną i megakariocyty oraz obecność odczynowych grudek chłonnych. W pojedynczych przypadkach, przy braku dostępnego badania HE oceniano poszczególne linie szpikowe w mielogramie (pacjent nr 8) lub na podstawie oceny trepanobiopsji z innego ośrodka (pacjenci 10-11) (tab. I-III). Badania immunohistochemiczne Odczyny immunohistochemiczne z użyciem zestawu wizualizującego EnVision TM Detection System (DAKO) wykonano na skrawkach parafinowych trepanobioptatów z wykorzy- 126

K. Błachnio i inni Tabela I Parametry laboratoryjne w białaczce T-LGL i LGLs. nr płeć/ WBC LYMPH LYMPH LYMPH T-LGL T-LGL NEU PLT RBC HCT HGB MCV γ S wiek (x10 9 /l) analizator (x10 9 /l) FCM (x10 9 /l) FCM (%) FCM (x10 9 /l) FCM (%) (x10 9 /l) (x10 9 /l) (x10 12 /l) (%) (g/ dl) (fl) glob. 1 k/36 15,7 11,9 11,3 72 9,9 88 2,55 381 3 24,8 8,2 86 + 2 k/55 17,8 16,4 15,8 89 14,6 92 0,71 285 3,3 33,4 10,9 102-3 k/28 5,41 3,6 4,3 79 2,3 55 1,24 309 3,8 34,9 12 90,9-4 m/70 36,4 34,5 34,6 95 32,5 94 0,06 57 5,1 46,3 14,9 90,4 + 5 k/57 7,7 6,3 6,5 85 4,8 73 0,8 21 nb nb 7,8 nb + 6 k/58 9,2 6,6 7 77 5,1 72 1.7 230 3 24,8 13,4 86-7 m/54 2,6 2,1 2 76 1,9 95 0,4 267 4,2 36,2 12,1 87,1 nb + 8 m/59 4,2 3,3 3,2 77 2,5 79 0,58 114 4,9 39,9 11,2 80 + 9 m/40 22,6 18 8,6 38 7,4 86 0,74 176 4,7 37,7 13,0 80 nb + 10 k/34 4,58 4 3,9 86 3,5 88 0,25 70 3,32 29,2 10,3 88 + 11 k/43 3,20 1,97 1,8 56 1,2 70 0,84 143 4,71 40,3 14,2 8,6 N - 12 m/37 11,1 9,1 5,5 50 4,7^ 84^ 0,12 68 5,2 44 14,2 83 + Skróty: k kobieta, m mężczyzna, zwiększona, obniżona, N norma, nb nie badano, WBC krwinki białe, LYMPH limfocyty, oceniane w analizatorze hematologicznym i cytometrii przepływowej (FCM) wartości podane w (%) i wartościach bezwzględnych, T-LGL ilość komórek białaczkowych podana w (%) i wartościach bezwzględnych, ^ ilość LGLs podana w (%) i wartościach bezwzględnych, NEU granulocyty, PLT płytki krwi, RBC krwinki czerwone, HCT hematokryt, HGB hemoglobina, MCV średnia objętość krwinki czerwonej, γ glob gamma globuliny, S splenomegalia. staniem przeciwciał mono- i poliklonalnych: CD3 (polyclonal, DAKO), CD4 (4B12, Novocastra), CD8 (C8/144B, DAKO), CD56 (CD564, Novocastra), CD57(NK-1, Novocastra), granzyme B (11F1, Novocastra). Rutynowo stosowano kontrole pozytywne i negatywne dla ww. przeciwciał. W badaniach IH nie stosowano odczynów: CD2, CD7 i CD43, gdyż odczyny te są pozytywne również na innych komórkach pochodzenia szpikowego, uniemożliwiając ocenę ich ewentualnej utraty na komórkach limfoidalnych. Nie oceniano odczynu IH anty- CD5 na komórkach limfoidalnych, gdyż w szpiku występują limfocyty B o koekspresji CD5. W pojedynczych przypadkach, przy braku dostępnego badania HP/IH, oceniano stopień zajęcia BM za pomocą oceny analizy FCM (pacjenci nr 7-9) (tab. I-III). Cytometria przepływowa Immunofenotypowanie komórek limfoidalnych przeprowadziliśmy, wykorzystując 3-kolorową FCM z użyciem panelu przeciwciał do analizy limfocytów T i NK opisanych przez nas wcześniej [22]. Zakres przeciwciał: Zastosowane przeciwciała monoklonalne były bezpośrednio połączone z fluoresceiną (FITC), fikoerytryną (PE, R-PE) lub Peridinin chlorophyll fikoerytryną (PerCP). Panel przeciwciał monoklonalnych przeciwko określonym antygenom różnicowania (ang. cluster of differentiation, CD) zastosowanych do analizy FCM zawierał następujące przeciwciała: CD45 FITC (2D1), i jego izoformy: CD45RA FITC (L48), CD45RO PE (UCHL1) oraz CD2 PE (S5.2), CD3 PerCP, (UCHT1), CD4 FITC (4SK3), CD5 FITC (L17F12), CD7 FITC (4-H9), CD8 PE i PerCP (SK1), CD11c PE (S-HCL3), CD14 PE (14- MOP9), CD25 PE (2A3), CD27 FITC (L128), CD16&56 PE (16&56-MY31), CD56 PE (NCAM16.2), CD57 FITC (NHK- 1), CD62L PE (SK11), CD71 FITC (LO1.1), CD95 PE (DX2), HLADR PE (HLADR-L243), TCRαβ FITC (WT31), TCRγδ PE (11F2) firmy Becton Dickinson (BD). Ponadto, CD3 FITC i RPE (UCHT1) oraz CD16 RPE (DJ130c) firmy DAKO, CD43 RPE (L10), CD52 RPE (YTH34.5) firmy SEROTEC, CD44 RPE (MEM-85) firmy CALTAG. Negatywne kontrole inkubowano z połączoną z fluorochromami immunoglobuliną o identycznym izotypie, jak pozostałe przeciwciała: simultest (BD) i IgG1 PerCP (BD). Antygeny komórek wyznako- 127

Znaczenie cytometrii przepływowej w diagnostyce białaczki z dużych ziarnistych limfocytów T Tabela II Cytometryczna ocena immunofenotypu i ocena klonalności w białaczce T-LGL i LGLs. nr CD45 CD45 RA RO CD2 CD3 CD4 CD5 CD7 CD8 CD16 CD56 CD16&56 CD57 CD25 CD27 CD43 CD44 CD52 CD71 CD11c HLADR CD95 CD62L TcR (FCM) TCRG ((PCR) TCRG ((PCR) 1 + + - + + - -* +/- + +/- - -* - - - + + + - +/- +/- - +/- αβ+, γδ- VγIf,Vγ10-Jγ Vγ9,Vγ11-Jγ B 2 + + - + + - - - + +/- - +/- - - - + + + - + +/- - nb αβ+, γδ- VγIf,Vγ10-Jγ M 3 + + - + + - + -* + + - -* +/- - - + + + - + + +/- - αβ+, γδ- VγIf,Vγ10-Jγ M 4 + + - + +/- - +/- +/- + + - +/- +/- - - + + + - +/- + + - αβ+, γδ- VγIf,Vγ10-Jγ B 5 + + - + + - + +/- + nb nb - - - nb nb nb nb nb +/- +/- nb nb αβ+, γδ- nb nd 6 + + - + + - - +/- + + - +/- +/- +/- + - - - + + + - nb + - - αβ-, γδ+ VγIf,Vγ10-Jγ B 7 + + - + + - + +/- + +/- - - +/- - - + + + - + + - +/- αβ+, γδ- VγIf,Vγ10-Jγ M 8 + + - + + - + + + +/- - - - - - + + + - + +/- - +/- αβ+, γδ- VγIf,Vγ10-Jγ B 9 + + - - + + - - + +/- +/- + + - - - + + + - + - - - αβ-, γδ+ VγIf,Vγ10-Jγ M 10 + + - + + - -/+ + + +/- - -/+ - - - + + + - + - nb nb αβ+, γδ- Vγ9,Vγ11-Jγ M 11 + + - + + - +/- + + +/- -/+ - -/+ - - + + + - +/- -/+ - - αβ+, γδ- VγIf,Vγ10-Jγ B 12 + -/+ +/- + + - + + + - - - - - +/- + + + - - +/- - +/- αβ+, γδ- nd P Skróty: [-] ujemna ekspresja, [-*] ekspresja na mniej niż 20%, [+/-] ekspresja na subpopulacji komórek (>20<100% komórek), [+] ekspresja (100% komórek), nieprawidłowa niższa ekspresja CD2, CD3 CD5,CD7 i CD43 (mglista, na subpopulacji) niższa ewentualnie wyższa, niż ekspresja na prawidłowych limfocytach T, TCRG (PCR): M produkt monoklonalny, B product biklonalny/bialleliczny, P produkt poliklonalny, nb nie badano. Tabela III Morfologia szpiku i wyniki badań immunohistochemicznych w T-LGL. nr Typ zajęcia szpiku LGL (%) IH (Immunofenotyp) Prekursory Prekursory granulocytów & Komórkowość czerwonokrwinkowe Megakariocyty Grudki chłonne (skupiska odczynowych limfocytów) 1 s,w. 58 CD3+,CD4-,CD8+,CD57-,granzym B+ N N + 2 s,w. 20 CD3+,CD4-,CD8+,CD57-,granzym B+ N N + 3 s,w. 20 CD3+,CD4-,CD8+,CD57+,granzym B+ N N - 4 s.w. 25 CD3+,CD4-,CD8+,CD57+/-,granzym B+ N N N - 5 s.w. 20 CD3+,CD4-,CD8+,CD57-,granzym B+/- N N - 6 N s.w. 15 CD3+,CD4-,CD8-,CD57+/-,granzym B+/- N N + 7 bd bd 73* CD3+,CD4-,CD8+,CD56-* bd bd bd bd 8 bd bd 48*^ CD3+,CD4-,CD8+,CD56-* N N bd 9 N w 35* CD3+,CD4-,CD8+,CD56- granzym B+ N N N - 10 s 30 # CD3+ N N N + 11 s 10 # CD3+ N N N - Skróty: zwiększona, obniżona, N-norma, * ocena cytometryczna szpiku,^ mielogram szpiku, # oszacowanie szpiku w innym ośrodku hematologicznym, s. zajęcie śródmiąższowe, limfocyty skupione w grupy, w. zajęcie wewnątrzzatokowe, limfocyty położone w naczyniach, przesunięcie dojrzewania granulocytów w lewo, bd brak danych. 128

K. Błachnio i inni wane ww. przeciwciałami w sposób rutynowy analizowano w ciągu 1 godziny przy użyciu cytometru przepływowego FACSCalibur (BD) z laserem argonowym o długości fali 488nm, ustawiając bramkę na populacji komórek limfoidalnych (5000 komórek/próbkę). Bramka na komórkach limfoidalnych została ustawiona w oparciu o wielkość (FSC) i ziarnistość komórek (SSC) (ryc. 2A) z wykorzystaniem przeciwciał CD45/CD14, które pozwalają na dokładne zlokalizowanie badanych komórek limfoidalnych CD45+/CD14- (ryc. 2B) w analizowanej próbce. Immunofenotypowo ekspresję antygenów powierzchniowych ocenialiśmy na skali logarytmicznej. Do analizy wyników użyto programu CellQuest. Sposób interpretacji: Ekspresję powierzchniową oceniano na podstawie porównania mediany intensywności fluorescencji (ang. median fluorescence intensity, MFI) badanego antygenu na komórkach T-LGL z intensywnością fluorescencji w próbce zawierającej kontrolę izotopową i MFI antygenów na prawidłowych limfocytach T z PB lub BM współistniejących z T-LGL. Przyjęto, że komórki badane wykazują ekspresję analizowanego antygenu, jeżeli odsetek komórek wykazujących fluorescencję jest wyższy niż kontrola izotypowa i wynosi nie mniej niż 20 procent. Ustalono, że ekspresja antygenów pan-t (CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD25 i CD43) na komórkach T-LGL może mieć następujący charakter: i) jednopikowy typu bright, taki sam jak na prawidłowych limfocytach T (+) (ryc. 2B), ii) mglisty typu dim, obniżony w stosunku do prawidłowych limfocytów T na 100% komórek T-LGL (+ ), iii) mglisty typu dim, obniżony w stosunku do prawidłowych limfocytów T na subpopulacji (>20<100%) komórek T-LGL (+/- ) oraz iv) komórki T-LGL nie mają ekspresji badanego antygenu (-). Dodatkowo, ekspresję antygenów innych niż pan-t (CD27, CD44, CD45 i jego izoformy, CD16, CD16&CD56, CD56, CD57, CD52, CD62L, CD71, CD95 i HLADR) oceniano na komórkach T-LGL w podobny sposób: dodatnia na wszystkich komórkach (+), na subpopulacji (+/-), (>20<100%) i brak ekspresji (-). W przypadku ekspresji CD52 i CD44 porównywaliśmy MFI na komórkach T-LGL z prawidłowymi limfocytami T. Jako kryterium klonalności T-LGL: przyjmowaliśmy utratę antygenów pan-t na populacji komórek wykazującej ekspresję TCRαβ+ lub TCRγδ+. Badania molekularne Ocenę klonalności komórek przeprowadzono za pomocą techniki PCR z zastosowaniem starterów specyficznych dla locus TCRG i analizy heterodupleksów. Do badania wykorzystywano DNA genomowe wyizolowane z PB lub BM od pacjentów z podejrzeniem T-LGL. Ocenę klonalności przeprowadziliśmy u 12 pacjentów. Reakcje amplifikacji przeprowadziliśmy z wykorzystaniem starterów i zgodnie z warunkami opracowanymi w ramach programu BIOMED-II [25]. W reakcjach używano 100ng DNA, które powielono stosując dwa zestawy starterów specyficznych dla locus TCRG (I zestaw - VγIf, Vγ10-Jγ, II zestaw - Vγ9, Vγ11-Jγ). Otrzymany produkt denaturowano w 95º C przez 5 minut, a następnie renaturowano w 4º C przez 1 godzinę. Przygotowane w ten sposób próbki rozdzielono w 6% niedenaturującym żelu poliakrylamidowym (napięcie: 110V, czas: 2h), który po elektroforezie barwiono w roztworze bromku etydyny (0,5 µg/ml). Kryterium klonalności T-LGL: detekcja na żelu poliakrylamidowym jednego wyraźnego prążka świadczy o obecności monoklonalnej rearanżacji w locus TCRG. Jednakże w wielu przypadkach rozrostów T-komórkowych dochodzi do rearanżacji locus TCRG na obu kopiach chromosomu 7 (rearanżacja bialleliczna), co uwidacznia się na żelu w postaci dwóch prążków. Obraz ten może być podobny, jeśli w badanym materiale obecne są dwie populacje komórek białaczkowych (wyjątkiem są rearanżacje niewykrywalne przez stosowany zestaw starterów). Z tego powodu próbki, w których w analizie heterodupleksów wykryto dwa wyraźne prążki, określane są jako biklonalne/bialleliczne [13, 25]. Wyniki Rozrosty LGLs w naszym materiale zdarzają się bardzo rzadko. Spośród 2450 wykonanych badań u chorych na rozrosty limfoidalne, przesłanych do Pracowni Cytometrii Przepływowej COI, tylko 12 (<0,5%) dotyczyło badań LGLs. Pacjenci z objawami kliniczno-laboratoryjnymi związanymi z podejrzeniem LGLs, częściej niż do onkologów trafiają do hematologów, reumatologów i immunologów klinicznych. U 11 chorych (pacjenci nr 1-11) rozpoznaliśmy T-LGL a u chorego nr 12 (tab. I-III) poliklonalną limfocytozę z dużych, ziarnistych limfocytów T (LGLs) towarzyszącą pospolitemu zmiennemu niedoborowi odporności (CVID) przebiegającemu z hipogammaglobulinemią, nawracającymi infekcjami bakteryjnymi, splenomegalią objawami kliniczno-patologiczno-laboratoryjnymi przypominającymi T-LGL. Charakterystyka laboratoryjno-kliniczna pacjentów Omawiana grupa obejmuje 7 kobiet i 5 mężczyzn w wieku 28-70 lat (średnia 47 lat). Objawy ogólne (nawracające infekcje, wieloletni przebieg kliniczny chorób autoimmunologicznych, nieprawidłowości w obrazie morfologii PB) wskazują, że u 27% chorych (pacjenci nr 1,3, 10) choroba rozpoczęła się przed 25. rokiem życia. W badaniach laboratoryjnych (tab. I) Rycina 1 Charakterystyczne cechy cytologiczne T-LGL. Komórki krwi obwodowej wykazują typowe ziarnistości cytoplazmatyczne (strzałka). (MGG, powiększenie 1000x). 129

Znaczenie cytometrii przepływowej w diagnostyce białaczki z dużych ziarnistych limfocytów T u wszystkich pacjentów z T-LGL stwierdziliśmy limfocytozę w zakresie 1,97-34,5 x 10 9 /l z medianą 6,3 x 10 9 /l, odpowiadającą limfocytozie od 38 do 95% (mediana: 77%), trwającą co najmniej 6 miesięcy, neutropenię w zakresie 0,06-2.55 x 10 9 /l z medianą 0,74 x 10 9 /l, odpowiadającą neutropenii od 0,1 do 26,2% (mediana: 13,9%). U 4/11 pacjentów z T-LGL wykazaliśmy podwyższoną leukocytozę (WBC>10 x 10 9 /l), u 2 obserwowaliśmy leukopenię (WBC<4 x 10 9 /l), zaś u 5/11 pozostałych pacjentów wartość leukocytozy mieściła się w granicach normy. Anemię (HGB<12 g/dl dla kobiet i <14 g/dl dla mężczyzn) wykazaliśmy u 7/11 badanych chorych, małopłytkowość (PLT<150 x 10 9 /l) u 5 pacjentów. Na podstawie analizy średniej objętości krwinek czerwonych (ang. mean corpuscular volume, MCV) u 6 chorych występowała niedokrwistość normocytarna, a u 1 niedokrwistość makrocytarna. W badaniu elektroforetycznym białek surowicy u 8/9 pacjentów stwierdziliśmy poliklonalną hypergammaglobulinemię. Splenomegalię, obecność RF, zapalenie tarczycy typu Hashimoto z podwyższonym mianem przeciwciał przeciwtarczycowych, zespół Sjögrena i twardzinę stwierdziliśmy odpowiednio u 7, 3 (pacjenci nr 5, 6, 8), 2 (pacjenci nr 5, 6), 1 (pacjent nr 11) i 1 (pacjent nr 10) na 11 chorych z T-LGL. U jednego chorego (pacjent nr 5) zdiagnozowano chłoniaka sytemu MALT kilka lat przed wystąpieniem objawów T-LGL. U pacjenta nr 12 z LGLs w badaniach występowała neutropenia, leukocytoza z limfocytozą, małopłytkowość, prawidłowy poziom HGB i krwinek czerwonych, hipogammaglobulinemia oraz splenomegalia bez współistniejących chorób autoimmunologicznych. Wyłącznie u tego pacjenta występowała okresowa limfadenopatia, która najprawdopodobniej towarzyszyła przewlekłym i nawracającym infekcjom. Badania morfologii krwi obwodowej i szpiku We krwi obwodowej pacjentów dominowały duże, ziarniste limfocyty T z niskim stosunkiem jądrowo-cytoplazmatycznym. Cytoplazma komórek była obfita z obecnymi mniej lub bardziej licznymi ziarnistościami (ryc. 1). Pacjent nr 9 posiadał nieliczne i drobne ziarnistości cytoplazmatyczne, widoczne w pojedynczych komórkach pod immersją obiektywu mikroskopu (powiększenie 1000x). U wszystkich chorych jądra komórkowe, owalne lub okrągłe, położone były ekscentrycznie, zaś chromatyna skondensowana. Wśród 11 zbadanych pacjentów z rozpoznaniem T-LGL, u 9 wykonano trepanobiopsję BM (tab. III). U 1 z 9 badanych (pacjent nr 9) pacjentów wykazaliśmy wyłącznie zajęcie BM z obecnością pojedynczych limfocytów w ławicach wewnątrz zatok szpiku, u 6 obserwowano dyskretne zajęcie wewnątrz zatok oraz Rycina 2 Analiza cytometryczna komórek nowotworowych T-LGL i prawidłowych limfocytów T i B we krwi obwodowej. A) Obraz FSS/SSC (wielkość/ziarnistość) widoczna jest jedna populacja komórek limfoidalnych stanowiąca 74% jądrzastych elementów morfotycznych krwi obwodowej, B) CD45 vs. CD14, kk. Neo. z ekspresją CD45 o charakterze bright, C) CD4 vs. CD8, kk. Neo. są CD8+, kk T są CD4+ i CD8+ o niższej ekspresji (R2,R3), D) CD7 vs. CD2, kk. Neo. są CD7-/CD2+, kk T są CD7+/CD2+ (R4), E) CD7 vs. CD43, kk. Neo. są CD7+/-/CD43+ o niższej ekspresji, niż prawidłowe limfocyty T (R5), F) CD7 vs. CD3, kk. Neo. są CD3+/CD7+, kk T mają wyższą ekspresję CD7+/CD3+ (R6), G) CD5 vs. CD25, kk. Neo. są CD5+/CD25-, kk T są CD5+/CD25+ (R7), H) CD5 vs. CD19, kk. Neo. są CD5-/CD19-, kk. T są CD5+/ CD19- (R8), I) CD5 vs. CD16, kk. Neo. są CD5+/CD16+/-, kk. T. są CD5+/CD16+ (R10), kk NK są CD16+/CD5- (R9), J) CD5 vs. CD56, kk. Neo. są CD5-/CD56+, kk T są CD5+/CD56- (R11), K) CD11c vs. CD57, kk. Neo. są CD11c+/CD57+/-, kk T i B są CD57-/CD11c- (R12), L) CD2 vs. CD57, kk. Neo. są CD2+/CD57-, kk T są CD2+/CD57+ (R15). 130

K. Błachnio i inni śródmiąższowe nacieki a u 2 pozostałych (pacjenci nr 10-11) stwierdzono wyłącznie nacieki śródmiąższowe T-LGL. Komórkowość BM ocenialiśmy na zwiększoną w 6/9, na zmniejszoną w 1 i na prawidłową w 2 pozostałych przypadkach T-LGL. U wszystkich badanych pacjentów proces dojrzewania granulocytów w BM był zahamowany przy jednoczesnym wzroście liczby młodych postaci (tzw. przesunięcie dojrzewania w lewo, ) i przy współistniejącej neutropenii w PB. Jednocześnie stwierdziliśmy spadek stosunku liczby komórek szeregu mieloidalnego do liczby komórek szeregu czerwonokrwnikowego u 2 chorych, u 7 stosunek był w granicach normy, a w 1 przypadku wzrosła odsetkowo linia mieloidalna. U 3 chorych obserwowaliśmy także spadek liczby erytroblastów, zahamowanie ich dojrzewania, hipoplazję oraz zmiany megaloidalne, które towarzyszyły niedokrwistości, a u pozostałych 7 chorych stwierdziliśmy prawidłową ilość prekursorów linii czerwonokrwinkowej. Liczba i morfologia megakariocytów nie wykazywała odchyleń od normy. U 4/9 chorych stwierdziliśmy odczynowe grudki chłonne usytuowane śródmiąższowo. Badania immunohistochemiczne Wykonane odczyny dostarczyły informacji o stopniu zajęcia BM przez T-LGL oraz pozwoliły ocenić formę nacieku. Badania IH wykazały, że komórki T-LGL są zazwyczaj CD3+/ CD4-/ CD8+/granzym B+ oraz wykazują zmienny odczyn na CD57. U chorych nr 10 i 11 dysponowaliśmy jedynie opisami badań HP/IH, które zostały ocenione w innym ośrodku diagnostycznym z oceną IH obejmującą tylko odczyny CD3 i CD20 (tab. III). Badania cytometryczne W większości (9/11) badanych przypadków T-LGL obecna była monoklonalna populacja limfocytów o fenotypie: CD3+/ CD4-/CD8+/TCRαβ+. U pacjenta nr 9 stwierdzono populację monoklonalną: CD3+/CD4-/CD8-/TCRγδ+. U chorego nr 6 wykazaliśmy obecność dwóch różnych populacji komórek nowotworowych: pierwsza: CD3+/CD4-/CD8+ dim / TCRγδ+ i druga: CD3+/CD4-/CD8-/TCRγδ+, co odpowiadało biklonalnej T-LGL (tab. II). Limfocyty pacjenta nr 12 były CD3+/ CD4-/CD8+/TCRαβ+. U 10/11 badanych chorych obserwowaliśmy dodatnią ekspresję CD8+ i brak ekspresji CD4- (ryc. 2C), a u pacjenta nr 9, z biklonalnym fenotypem, jedna populacja komórek była (CD8+ dim ) o obniżonej ekspresji, a druga populacja komórek była (CD8-) [18]. We wszystkich badanych przypadkach T-LGL wykazaliśmy nieprawidłową ekspresję lub utratę co najmniej 1 antygenu pan-t, zaś u 10/11 chorych 2 lub większej ilości antygenów. W większości badanych przypadków T-LGL komórki nowotworowe miały niższą ekspresję CD7, CD5 i CD43 niż prawidłowe limfocyty T (ryc. 2E-2G, 2I). W przypadku antygenu CD7, u 2/11 pacjentów zaobserwowaliśmy utratę jego ekspresji (CD7-) (ryc. 2D), a w 6/11 przypadkach stwierdziliśmy ekspresję dim na wszystkich komórkach T-LGL (CD7+ )(ryc. 2F) lub na zmiennej subpopulacji komórek T-LGL (CD7+/- ) (ryc. 2E). W 3 przypadkach ekspresja CD7 na komórkach prawidłowych i białaczkowych była porównywalna (CD7+). Ekspresja CD5 w analizowanych przypadkach T-LGL była heterogenna. W 2/11 przypadków doszło do utraty tego antygenu (CD5-) (ryc. 2H, 2J), w 5/11 przypadkach stwierdziliśmy ekspresję dim na wszystkich komórkach T-LGL (CD5+ ) (ryc. 2G, 2I), lub na zmiennej subpopulacji komórek T-LGL (CD5+/- ). W 2 przypadkach ekspresja CD5 była porównywalna z ekspresją na prawidłowych limfocytach T. W przypadku biklonalnej T-LGL jedna subpopulacja komórek była (CD5-), a druga (CD5+/- ) [18]. Wśród antygenów o zmienionej ekspresji, które zawsze występowały na T-LGL było CD43, CD2 i CD3. Ich ekspresja była niższa niż na prawidłowych limfocytach T odpowiednio w 6/10 (CD43+ ), 4/11 (CD2+ ) (ryc. 2E) i 4/11 (CD3+ ) przypadkach. U 2 pacjentów zaobserwowaliśmy wyższą ekspresję (CD43+ ), zaś ekspresja była taka sama, jak na współistniejących prawidłowych limfocytach T odpowiednio w 2/10 (CD43+), 7/11 (CD2+) i 7/11 (CD3+) przypadkach. W 1/11 przypadków stwierdziliśmy ekspresję CD3 tylko na subpopulacji komórek (CD3+/- ). Ponadto, ekspresję CD11c na różnym odsetku komórek T-LGL stwierdziliśmy u wszystkich chorych (ryc. 2K). We wszystkich przypadkach T-LGL, komórki posiadały ekspresję CD45 typu bright, miały wyłącznie ekspresję izoformy CD45RA, a brak ekspresji CD45RO. Ekspresję CD16, CD56 i CD57 stwierdziliśmy na wszystkich komórkach T-LGL odpowiednio w 2/10, 0/11 i 1/11, a na subpopulacji komórek w 8/10 2/10 i 4/11 przypadkach (ryc. 2I-2K). Brak ekspresji ww. antygenów stwierdziliśmy w 0/10, 7/10 i 6/11 przypadków. W przypadkach braku ekspresji CD57 na komórkach nowotworowych, prawidłowe limfocyty T często ją miały (ryc. 2L). W przypadku biklonalnej T-LGL jedna subpopulacja komórek była (CD57+), a druga (CD57-) [18]. Komórki T-LGL miały zmienną ekspresję antygenów CD95, CD62L, a ponadto były CD44+ i CD52+ we wszystkich przypadkach. Ekspresja CD52 i CD44 na komórkach T-LGL była zawsze niższa (CD52+ ) (CD44+ ), niż na współistniejących, nielicznych prawidłowych limfocytach T. Ekspresja antygenu HLADR była w 9/11 przypadków dodatnia, aczkolwiek występowała na zmiennej subpopulacji komórek. Nie stwierdziliśmy obecności antygenów CD25, CD27 czy CD71 w komórkach T-LGL badanych pacjentów (ryc. 2G). U pacjenta nr 12 z odczynową limfocytozą nie obserwowaliśmy zmian immunofenotypu komórek, w tym utraty ekspresji antygenów pan-t a komórki nie miały: CD11c, CD16, CD56, CD57 i CD16&CD56. Ponadto, komórki posiadały równocześnie obie izoformy cząsteczki CD45 i częściowo ekspresję CD27+/- na subpopulacji limfocytów T. Ekspresja CD52 i CD44 na limfocytach ziarnistych była taka sama, jak na pozostałych limfocytach T. Badanie molekularne Za pomocą metody multipleks PCR z wykorzystaniem starterów specyficznych dla locus TCRG i analizy heterodupleksów ocenialiśmy klonalność w badanych próbkach Obecność monoklonalnego lub biklonalnego/biallelicznego produktu rearanżacji w locus TCRG stwierdziliśmy w 10 badanych przypadkach. Rearanżacji w locus TCRG najczęściej 131

Znaczenie cytometrii przepływowej w diagnostyce białaczki z dużych ziarnistych limfocytów T Rycina 3 Przykładowy wynik oceny klonalności z wykorzystaniem zestawu starterów specyficznych dla locus TCRG. M wzorzec wielkości GeneRuler 50bp, Fermentas; HD heterodupleksy, MP prążki wskazujące na obecność populacji monoklonalnej, kolumna 1,2 kontrole pozytywne monoklonalne, kolumny 3-9 pacjenci z T-LGL, kolumny 3, 4, 5, 6 i 9 odpowiednio pacjenci nr 2, 3, 7, 9 i 10 (produkt monoklonalny), kolumny 7 i 8 odpowiednio pacjenci 6 i 8 (produkt biklonalny/bialleliczny), kolumna 10 kontrola negatywna poliklonalna, kolumna 11 pacjent nr 12. podlegały segmenty VγIf,Vγ10-Jγ, jedynie w dwóch przypadkach stwierdziliśmy rearanżację segmentów Vγ9,Vγ11- Jγ (pacjenci nr 1, 10). W przypadku pacjentki nr 5 dysponowaliśmy jedynie materiałem BM zabezpieczonym w bloczku parafinowym. Wyizolowane z tego materiału DNA było zbyt słabej jakości, aby uzyskać informacyjny wynik w analizie molekularnej. Wzór prążków charakterystyczny dla populacji poliklonalnej zaobserwowaliśmy u pacjenta z odczynową limfocytozą (pacjent nr 12) (tab. II, ryc. 3). Dyskusja Spektrum proliferacji dużych ziarnistych limfocytów (ang. large granular lymphocytosis, LGLs) obejmuje 4 jednostki nozologiczne: i) reaktywną (przemijającą <6 miesięcy) ekspansję LGL, najczęściej na podłożu infekcji wirusowej, ale również w chorobach autoimmunologicznych i innych nowotworach) ii) przewlekłą limfocytozę LGL (>6 miesięcy), najczęściej na podłożu chorób autoimmunologicznych i niedoborów immunologicznych iii) klasyczną, przewlekłą białaczkę LGL (T-LGL) i iv) rzadką agresywną białaczkę LGL występującą w Azji i Ameryce Południowej. Białaczki LGL są klasyfikowane zgodnie z klasyfikacją WHO jako nowotwory układu chłonnego. Wyróżnia się białaczkę CD3+/T-cell LGL (85% przypadków) i CD3-/natural killer (NK)-cell LGL (15% przypadków) [2, 7, 20, 23]. W tym opracowaniu przedstawiliśmy różnicowanie nienowotworowej przewlekłej limfocytozy LGLs z białaczką CD3+/T- LGL, które charakteryzują się podobnymi cechami kliniczno- -laboratoryjnymi, obecnością dużych, ziarnistych limfocytów w rozmazach PB i współistnieją z podobnymi chorobami bez wyraźnych różnic w badaniach hematologicznych. Celem naszej pracy była możliwie jak najszersza charakterystyka kliniczno-patologiczno-laboratoryjna i analiza skuteczności procedur diagnostycznych u pacjentów COI z rozpoznaniem T-LGL z zastosowaniem metod rutynowych (ocena morfologii komórek w rozmazach, IH na skrawkach parafinowych trepanobioptatu, analizy biochemiczne) i nowych metod diagnostycznych (FCM i PCR), ze szczególnym uwzględnieniem wyników uzyskanych za pomocą FCM w ustaleniu rozpoznania i diagnostyki różnicowej z procesami nienowotworowymi. W naszych badaniach laboratoryjnych, podobnie jak w piśmiennictwie, stwierdziliśmy splenomegalię i niedokrwistość w 64%, RZS w 36%, podwyższoną limfocytozę w 100% z prawidłową lub podwyższona leukocytozą odpowiednio w 45 i 36%, neutropenię w 100% i hypergammaglobulinemię poliklonalną [8, 10, 11, 19, 20]. W badaniu elektroforetycznym surowicy u 89% zbadanych chorych wykazaliśmy hipergammaglobulinemię, mimo że zdarzają się przypadki T-LGL z hipogammaglobulinemią lub gammapatią monoklonalną [8, 11, 20]. Obecność podwyższonej frakcji gamma globulin wskazuje na toczący się przewlekły proces zapalny lub chorobę autoimmunologiczną współistniejącą z T-LGL. Nadmierna reaktywność limfocytów B zależy od zaburzeń ich funkcjonowania, wskutek wpływu patologicznego klonu T-LGL. Przypuszcza się, że nieznany czynnik etiologiczny (np. wirus), stymuluje klonalną proliferację LGLs i jednocześnie pobudza poliklonalną aktywność komórek B [7, 10, 16, 23, 26]. U pacjenta z odczynową ekspansją LGLs, w porównaniu do chorych z T-LGL, w badaniach laboratoryjnych nie stwierdziliśmy niedokrwistości, a dodatkowo wykazaliśmy hipogammaglobulinemię, która jest składową CVID. Prawidłowa liczba dużych, ziarnistych limfocytów T (LGLs) mieści się w zakresie 0,2-0,4 10 9 /l (tab. I). Według WHO i obserwacji innych autorów wykrycie monoklonalnej populacji T-LGL w liczbie >2,0 10 9 /l jest ważnym kryterium diagnostycznym [1, 2, 23]. W naszych badaniach wzrost liczby T-LGL > 2,0 10 9 /l (zakres 1,2-32,5 10 9 /l, mediana 4,8 10 9 /l, tab. I) stwierdziliśmy u 9/11 (82%) chorych z T-LGL, co jest zgodne z wynikami innych autorów [8, 9]. Z naszego punktu widzenia, podobnie jak wg innych autorów, ocena morfologii komórek ziarnistych w rozmazie wraz z nieprawidłową ekspresją antygenów pan-t są najbardziej specyficzne dla ustalenia rozpoznania T-LGL, niezależnie od liczby limfocytów ziarnistych w PB [2, 20]. Należy jednak pamiętać, że zdarzają się T-LGL (pacjent nr 9) zbudowane z drobniejszych komórek z ledwie widocznymi w mikroskopie ziarnistościami cytoplazmatycznymi. Rozpoznanie w takich przypadkach, poza immunofenotypem, należy ustalać w korelacji z danymi kliniczno-laboratoryjnymi. Białaczka T-LGL jest rzadko występującą, heterogenną chorobą, wywodzącą się z limfocytów CD45RA+/CD45RO-/ CD27-, w której w około 80% dochodzi do rozrostu klonalnego aktywowanych, cytotoksycznych i efektorowych limfocytów T: CD3+/CD4-/ CD8+/TCRαβ+. W naszej grupie 11 chorych z T-LGL, ten wariant rozpoznaliśmy u 9 (82%) chorych. Znane są rzadsze warianty białaczki T-LGL: i) CD3+/ CD4+/CD8-/TCRαβ+, ii) CD3+/CD4+/CD8+/TCRαβ+, iii) CD3+/CD4-/CD8-/TCRγδ+, który rozpoznaliśmy u pacjen- 132

K. Błachnio i inni ta nr 9 oraz pojedyncze przypadki iv) biklonalnych T-LGL, który rozpoznaliśmy u pacjenta nr 6 i który został opisany przez nas wcześniej [2, 18] (tab. II). U naszych chorych, jak i w piśmiennictwie, ww. warianty immunofenotypowe T-LGL nie różnią się między sobą przebiegiem klinicznym, morfologią i chorobami współistniejącymi. Komórki T-LGL zawsze są CD3+, najczęściej CD8+ z częstym spadkiem lub utratą ekspresji antygenów pan - T: CD5, CD7, CD43 oraz decydującą w rozpoznaniu ekspresją antygenów związanych z komórkami NK (ang. NK-associated antigens): przeważnie CD57, rzadziej CD16, a w nielicznych przypadkach CD56, co można ustalić za pomocą badania FCM [3, 12, 14, 23]. Dodatnie są odczyny na granzym-b, perforynę oraz TIA-1 (ang. cytotoxic granule-associated proteins) oceniane głównie w badaniach IH [4, 15, 17, 19]. Nieprawidłowości ekspresji antygenów pan-t nie są wyłącznie cechą T-LGL, ale są wspólną cechą różnych podtypów chłoniaków z obwodowych i prekursorowych limfocytów T/NK, w których dochodzi do utraty ww. antygenów [3, 7]. We wszystkich zbadanych przez nas przypadkach, podobnie jak w innych badaniach dotyczących T-LGL [1, 12, 19, 20] zaobserwowaliśmy zmiany w ekspresji powierzchniowych antygenów charakterystycznych dla komórek T, dokładnie omawianych przez nas w wynikach. W 91% przypadków zmiany ekspresji dotyczyły 2 lub więcej antygenów. W 82% i 73% przypadków T-LGL był wyraźny spadek lub utrata ekspresji odpowiednio, CD5 i CD7 w porównaniu do współistniejących prawidłowych limfocytów T. Nasze obserwacje są zgodne z wynikami uzyskanymi przez Lundell i wsp. [12] i wskazują na charakterystyczne zmiany ekspresji CD7 i CD5 w T-LGL. Dodatkowo, stwierdziliśmy częste zmiany ekspresji CD43 w T-LGL, wcześniej nie publikowane. Ponadto, stwierdziliśmy ekspresję CD11c i CD45RA we wszystkich przypadkach T-LGL. W każdym opracowaniu dotyczącym diagnostyki T-LGL autorzy podkreślają znaczenie oceny CD16, CD56 i CD57 [1-3, 6-12, 19, 20, 23-26]. Przykładowo wszystkie analizowane przypadki przez Lundell i wsp. [12] były CD57+, chociaż autorzy podkreślają, że połowa przypadków miała ekspresję tego antygenu tylko na subpopulacji komórek T-LGL. U badanych chorych nie wykazaliśmy ekspresji CD57 aż w 6/11 przypadków, natomiast ekspresja CD57 występowała na prawidłowych limfocytach T, utrudniając interpretację cytometryczną antygenów NK na komórkach T-LGL (ryc. 2L). W tej sytuacji ocena odczynu CD57 w badaniu IH wydaje się niewiarygodna, gdyż często występuje tylko na subpopulacji odczynowych limfocytów T, które towarzyszą komórkom T-LGL i nie można ich odróżnić od komórek białaczkowych w badaniu HP/IH trepanobiopsji szpiku. W naszych przypadkach ekspresję CD16, CD56, CD57 i CD16&CD56 stwierdziliśmy odpowiednio w 10/10, 3/10, 5/11 i 5/11 badanych chorych. Naszym zdaniem jej znaczenie jest przeceniane w diagnostyce T-LGL, tym bardziej, że około 1/3 przypadków z podwyższonym odsetkiem poliklonalnych limfocytów T γδ w przebiegu chorób zapalnych, autoimmunologicznych oraz infekcji wirusowych posiada ekspresję CD16 i CD57 na limfocytach T, które równocześnie tracą, lub mają obniżoną ekspresję CD5 w stosunku do prawidłowych limfocytów T [21]. W takich przypadkach, podejrzewanych o T-LGL, z ekspresją TCRγδ+, przy zmianach ekspresji dotyczących CD5 należy szczególnie ostrożnie formułować rozpoznanie T-LGL i konfrontować je łącznie z danymi kliniczno-laboratoryjnymi. Na podstawie naszych wyników przypuszczamy, że najbardziej użytecznym antygenem NK w diagnostyce T-LGL jest CD16. Według naszej opinii, ocena ekspresji antygenów komórek NK nie ma większego znaczenia w diagnostyce różnicowej między T-LGL0 i LGLs a służy do wykluczenia innych białaczek CD8+/CD4- z dojrzałych komórek T/NK. W diagnostyce różnicowej z białaczkami CD8+/CD4- z dojrzałych komórek T/NK, wykorzystaliśmy również charakterystyczną w naszych badaniach ekspresję CD11c i CD43 i brak ekspresji antygenów CD25, CD27 czy CD71 na komórkach T-LGL. Z uwagi na doniesienia o próbach stosowania w terapii T-LGL Alemtuzumabu (przeciwciało anty-cd52) potwierdziliśmy ekspresję tego antygenu na komórkach wszystkich 10 zbadanych przypadków T-LGL, która podobnie jak ekspresja CD44, była niższa niż na prawidłowych limfocytach T [1, 20]. Na komórkach T-LGL opisywano wysoką ekspresję CD95, CD62L i HLADR, której w naszych przypadkach nie potwierdziliśmy, a stwierdziliśmy odpowiednio w 2/9, 3/8 i 9/11 przypadkach. Ten typ ekspresji ww. antygenów w naszych przypadkach nie różnicował T-LGL od LGLs [8, 24]. Do badania włączyliśmy także pacjenta z objawami klinicznymi charakterystycznymi dla T-LGL z obecnością we PB dużych, ziarnistych limfocytów T, u którego rozpoznaliśmy CVID. W badaniu FCM u tego pacjenta nie stwierdziliśmy nieprawidłowości ekspresji antygenów charakterystycznych dla limfocytów T lub komórek NK oraz CD11c. Ponadto, ekspresja antygenów powierzchniowych CD44 i CD52 była taka sama, jak na prawidłowych limfocytach T z ekspresją obu izoform cząsteczki CD45. Zmiany ekspresji analizowanych przez nas antygenów w diagnostyce LGLs wskazują na największą użyteczność FCM do prawidłowego rozpoznania T-LGL. Sama analiza cytologiczna preparatów PB i BM barwionych metodą MGG jest niewystarczająca do ustalenia rozpoznania, choć stanowi pierwszy element w algorytmie diagnostycznym. Utrata antygenów pan-t na LGLs różnicuje w sposób najprostszy T-LGL od procesów nienowotworowych, ale zdarzają się choroby autoimmunologiczne, zapalenia czy infekcje wirusowe, w których obserwuje się wzrost populacji limfocytów T γδ z utratą lub obniżoną ekspresją CD5 [21]. Innym z badań, które pozwalają na różnicowanie pomiędzy białaczką T-LGL a LGLs jest ocena klonalności genów TCR przeprowadzana z wykorzystaniem łańcuchowej reakcji polimerazy i analizy heterodupleksów. Szacuje się, że metoda jest w stanie wykryć około 70-80% rearanżacji w obrębie genów TCR z wykorzystaniem zestawów starterów specyficznych dla loci TCRG, TCRB i TCRD. W naszych badaniach wykorzystywaliśmy jedynie zestaw starterów specyficzny dla 133

Znaczenie cytometrii przepływowej w diagnostyce białaczki z dużych ziarnistych limfocytów T locus TCRG, co pozwoliło jednak na potwierdzenie rozpoznania białaczki T-LGL u 11 pacjentów i braku klonalnej rearanżacji loci TCRG u chorego nr 12 (tab. II, ryc. 3). Zdarzają się także przypadki T-LGL, w których produkt klonalny wykrywany jest jedynie z pomocą starterów specyficznych dla locus TCRB [19]. W związku z tym, wydaje się uzasadnione stosowanie wszystkich dostępnych zestawów starterów specyficznych dla genów TCR. Ocena klonalności nie zawsze jednak pozwala na ostateczne potwierdzenie rozpoznania białaczki T-LGL, choć w naszych przypadkach stwierdziliśmy 100% zgodność badań FCM i PCR. Podobny wynik oceny klonalności mogą dawać oligoklonalne/monoklonalne rozrosty komórek T, występujące w trakcie odpowiedzi immunologicznej na silne antygeny (np. infekcja HIV czy EBV) lub w przebiegu chorób autoimmunologicznych [26]. Metody molekularne (PCR i ewentualnie Southern blot) nie pozwalają także na ocenę klonalności w wybranych populacjach komórek T bez uprzedniego sortowania lub wzbogacania populacji komórek. Problem ten rozwiązano, między innymi w diagnostyce T-LGL, stosując do oceny klonalności techniki FCM z wykorzystaniem komercyjnie dostępnych, licznych specyficznych przeciwciał względem części zmiennej białek z rodziny TCRβ (TCR-Vβ) [1, 12]. Badania porównujące czułość obu tych metod wykazały, że mimo swoich zalet (szybkość oznaczenia, oznaczenie ilościowe i jakościowe) FCM nie jest aż tak czuła jak metody molekularne, głównie ze względu na brak przeciwciał specyficznych dla wszystkich TCR-Vβ. Autorzy tych badań zaproponowali następujący schemat postępowania: próbki, które w wyniku analizy TCR-Vβ z wykorzystaniem FCM, dały niejednoznaczny wynik lub nie wykazano w nich rozrostu klonalnego powinny zostać przesłane do dalszych analiz molekularnych [12, 14]. Rutynowe badanie HP/IH trepanobioptatu BM u 4 naszych pacjentów, diagnozowanych początkowo w innych ośrodkach hematologicznych, okazało się niewystarczające do ustalenia podejrzenia lub rozpoznania T-LGL. Wynikało to, między innymi z wykorzystania tylko odczynu CD3 i CD20 do oszacowania komórek limfoidalnych i współistnienia innych, licznych zmian jakościowych i ilościowych w populacjach komórek szpiku. W przypadkach podejrzenia T-LGL diagnostykę IH poszerzamy, podobnie jak w innych ośrodkach, o ocenę odczynu IH: CD4, CD8, granzym B oraz CD57, mimo iż ocena odczynu CD57 może być niewiarygodna i występować wyłącznie na nienowotworowych limfocytach T [1, 19]. Stosowanie innych odczynów IH: CD2, CD5, CD7, CD43 i ich interpretacja jest utrudniona w BM z powodu obecności dodatnich na te odczyny nielimfoidalnych populacji komórkowych. Należy podkreślić nieporównywalnie niską wartość badań IH (materiał utrwalony) w ocenie utraty antygenów pan-t w stosunku do badań FCM (materiał nieutrwalony, znakowanie żywych komórek). W naszych badaniach, w pobranym BM od chorych z białaczką T-LGL, najczęściej obserwowaliśmy zwiększoną komórkowość, opisywaną w ponad 50% przypadków oraz zahamowanie dojrzewania granulocytów ze wzrostem odsetka młodszych postaci [2, 8, 11, 19]. Ocena IH wykazała obecność dyskretnych, wewnątrz zatok lub rzadziej śródmiąższowych nacieków limfocytów T: CD3+/CD8+/CD57+/granzym B+, opisywanych wcześniej przez Evansa i Osuji [4, 17] i szeroko omówionych przez Prochorec i wsp. [19]. Zgodnie z piśmiennictwem, jak i wg naszych obserwacji sama ocena HP/IH jest niewystarczająca dla rozróżnienia różnych form rozrostów LGLs z T-LGL. Ponadto, według naszej opinii i wcześniejszych opracowań, nowoczesna diagnostyka FCM T-LGL jest wysoce czuła i specyficzna i nie wymaga potwierdzenia rozpoznania badaniem HP/IH trepanobioptatu szpiku [11]. Nowoczesna diagnostyka nowotworów układu chłonnego, w tym T-LGL, wymaga współdziałania wielu specjalistów, w tym: hematopatologów, cytometrystów, analityków medycznych i lekarzy klinicystów. W ciągu ostatnich lat obserwuje się znaczący wzrost ilości laboratoriów cytometrycznych w rękach diagnostów laboratoryjnych, przy braku wprowadzania standardów oceny immunofenotypu i jego interpretacji w większości z nich oraz braku prawidłowego współdziałania ww. specjalistów. Naszym celem było przedstawienie znaczenia diagnostycznego cytometrii przepływowej w rzadkiej postaci białaczki T-LGL i przedstawienie standardu interpretacji ekspresji poszczególnych antygenów w diagnostyce cytometrycznej chłoniaków w naszym laboratorium. Wnioski 1. Na podstawie przeprowadzonych badań wnioskujemy, że w przypadkach z klasycznymi objawami kliniczno-laboratoryjnymi, nieprawidłowa ekspresja antygenów pan-t, szczególnie CD7, CD5 i CD43, obecność jednej izoformy cząsteczki CD45 - CD45RA, ekspresja CD11c i CD16, obniżenie ekspresji CD44 i CD52 oraz brak ekspresji CD25, CD27 i CD71 w badaniach FCM wraz z oceną morfologiczną komórek limfoidalnych BM i PB są konieczne do ustalenia rozpoznania T-LGL. 2. Samodzielne badanie HP/IH trepanobiopsji okazuje się często niewystarczające do ustalenia prawidłowego rozpoznania. W przypadku braku dostępności badań FCM, badania HP/IH powinny być uzupełnione oceną klonalności metodami molekularnymi. Piśmiennictwo 1. Aribi A, Huh Y, Keating M i wsp. T-cell large granular lymphocytic (T-LGL) leukemia; Experience in a single institution over 8 years. Leuk Res 2007; 7: 939-945. 2. Chan WC, Foucar K, Morice WG i wsp. T-cell large granular lymphocyte leukemia. W: Swerdlow SH, Campo E, Harris NL i wsp. World Health Organization classification of tumors. Pathology and genetics of tumours of hematopoietic and lymphoid tissues. Lyon: IARC Press; 2008: 272-273. 3. Craig FE, Foon KA. Flow cytonetric immunophenotyping for hematologic neoplasms. Blood 2008; 111: 3941-3967. 4. Evans HL, Burks E, Viswanatha D i wsp. Utility of immunohistochemistry in bone marrow evaluation of T-lineage large granular lymphocyte leukemia. Hum Pathol 2000; 31: 1266-1273. 5. Holm AM, Tjønnfjord G, Yndestad A i wsp. Polyclonal expan- 134

K. Błachnio i inni sion of large granular lymphocytes in common variable immunodeficiency-association with neutropenia. Clin Exp Immunol 2006; 144: 418-424. 6. Jennings D, Foon KA. Recent advances in flow cytometry: Application to the diagnosis of hematologic malignancy. Blood 1997; 90: 2863-2892. 7. Lamy T, Loughran TP Jr. Large granular lymphocyte leukemia. Cancer Control 1998; 5: 25-33. 8. Lamy T, Loughran TP Jr. Clinical features of large granular lymphocyte leukemia. Semin Hematol 2003; 40: 185-195. 9. Langerak AW, Sandberg Y, van Dongen JJ. Spectrum of T-large granular lymphocyte lymphoproliferation: ranging from expanded activated effector T cells to T-cell leukaemia. Br J Haematol 2003; 123: 561-562. 10. Loughran TP Jr, Starkebaum G, Kidd P i wsp. Clonal proliferation of large granular lymphocytes in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum 1988; 31: 31-36. 11. Loughran TP Jr. Clonal diseases of large granular lymphocytes. Blood 1993; 82: 1-14. 12. Lundell R, Hartung L, Hill S i wsp. T-cell large granular lymphocyte leukemias have mulitple phenotypic abnormalities involving pan-t-cell antigens and receptors for MHC molecules. Am J Clin Pathol 2005; 124: 937-946. 13. Meleshko AN, Lipay NV, Stasevich IV i wsp. Rearrangements of IGH, TCRD and TCRG genes as clonality marker of childhood acute lymphoblastic leukemia. Exp Oncol 2005; 27: 319-324. 14. Morice WG, Kimlinger T, Katzmann JA i wsp. Flow cytometric assessment of TCR-Vbeta expression in the evaluation of peripheral blood involvement by T-cell lymphoproliferative disorders: a comparison with conventional T-cell immunophenotyping and molecular genetic techniques. Am J Clin Pathol 2004; 121: 373-383. 15. Morice WG, Kurtin PJ, Tefferi A i wsp. Distinct bone marrow findings in T-cell granular lymphocytic leukemia revealed by paraffin section immunoperoxidase stains for CD8, TIA-1, and granzyme B. Blood 2002; 99: 268-274. 16. O Keefe CL, Plasilova M, Wlodarski M i wsp. Molecular analysis of TCR clonotypes in LGL: a clonal model for polyclonal responses. J Immunol 2004; 172: 1960-1969. 17. Osiuj N, Beiske K, Randen U i wsp. Characteristic appearances of the bone marrow in T-cell large granular lymphocyte leukaemia. Histopathology 2007; 50: 547-554. 18. Prochorec-Sobieszek M, Chełstowska M, Rymkiewicz G i wsp. Biclonal T-cell receptor γδ+ large granular lymphocyte leukemia associated with rheumatoid arthritis. Leukemia&Lymphoma 2008; 49: 828-831. 19. Prochorec-Sobieszek M, Rymkiewicz G, Makuch-Lasica H i wsp. Characteristics of T-cell large granular lymphocyte proliferations associated with neutropenia and inflammatory arthropathy. Arthritis Res Ther 2008; 10: R55. 20. Rose MG, Berliner N. T-cell large granular lymphocyte leukemia and related disorders. Oncologist 2004; 9: 247-258. 21. Roden AC, Morice WG, Hanson CA. Immunophenotypic attributes of benign peripheral blood gammadelta T cells and conditions associated with their increase. Arch Pathol Lab Med 2008; 132: 1774-1780. 22. Siwicki JK, Rymkiewicz G, Błachnio K i wsp. Spontaneously immortalized T lymphocytes from Nijmegen Breakage Syndrome patients display phenotypes typical for lymphoma cells. Leuk Res 2008; 32: 569-577. 23. Sokoł L, Loughran TPJr. Large granular lymphocyte leukemia. Oncologist 2006; 11: 263-273. 24. Sun T. Chronic T-Large Granular Lymphocytic Leukemia. Flow cytometric analysis of hematologic neoplasms. A color atlas and text. Second edition. Lippincott Williams & Wilkins A Woltters Kluvver Company 2002: 160-164. 25. van Dongen JJ, Langerak A.W., Brüggemann M i wsp. Design and standardization of PCR primers and protocols for detection of clonal immunoglobulin and T-cell receptor gene recombinations in suspect lymphoproliferations: report of the BIOMED-2 Concerted Action BMH4-CT98-3936. Leukemia 2003; 12: 2257-2317. 26. Włodarski MW, Schade AE, Maciejewski JP. T-large granular lymphocyte leukemia: current molecular concepts. Review. Hematology 2006; 11: 245-256. Adres Autorów: Pracownia Cytometrii Przepływowej Zakładu Patologii Centrum Onkologii Instytut im. M. Skłodowskiej-Curie ul. Roentgena 5 02-781 Warszawa e-mail: grzegorzrymkiewicz@coi.waw.pl (Praca wpłynęła do Redakcji: 2009-02-12) (Praca przekazana do opublikowania: 2009-07-03) 135