Rola wapnia w fizjologii i patologii neuronów

Rola wapnia w fizjologii i patologii neuronów STRESZCZENIE artykule na wstępie przedstawiono ewolucyjne aspekty dwoistej roli jonów wapnia W jako cząsteczek sygnałowych oraz kationów o działaniu cytotoksycznym. Następnie omówiono mechanizmy homeostazy wapnia w neuronach z uwzględnieniem specyficznych funkcji tych komórek pobudliwych, oraz mechanizmy generacji i przekazywania sygnału wapniowego. W oparciu o te informacje została przedstawiona w zarysie rola Ca 2+ w specyficznych funkcjach komórek nerwowych, jak pobudliwość, przewodnictwo nerwowe, przekaźnictwo synaptyczne, plastyczność i różne formy mobilności. Następnie omówiono rolę zaburzeń homeostazy wapnia i jego funkcji sygnałowych w mechanizmach uszkodzenia i śmierci neuronów w ostrych schorzeniach, ze szczególnym uwzględnieniem niedokrwienia mózgu, oraz w przewlekłych chorobach neurozwyrodnieniowych. WPROWADZENIE Wapń jest dwuwartościowym kationem zewnątrzkomórkowym, a wysoki gradient jego stężeń w przedziałach na zewnątrz i wewnątrz komórki przekracza wartość 10 4. We krwi i płynach tkankowych ssaków stężenie Ca 2+ jest utrzymywane na stałym poziomie około 10 3 M, podczas gdy jego spoczynkowe stężenie w cytosolu wynosi poniżej 10 7 M. Równie niskie stężenia jonów Ca 2+ obserwuje się zarówno w komórkach ssaków jak i u prokaryota, co świadczy o tym, że mechanizmy usuwania wapnia z komórek są stare i ewolucyjnie zachowane. Wiadomo od dawna, że jony Ca 2+ odgrywają kluczową rolę w fizjologii komórek, a zwłaszcza neuronów. Z drugiej strony masowy napływ Ca 2+ jest toksyczny dla komórek, a udział wapnia w mechanizmach uszkodzenia i śmierci neuronów jest przedmiotem badań od wielu lat. Uważa się, że cyto- i neurotoksyczność Ca 2+ wynika z jego właściwości chemicznych oraz szczególnej roli w mechanizmach przekazywania sygnału, leżących u podstaw fizjologicznych funkcji komórek, a szczególnie neuronów. Stąd też ich zaburzenie może mieć skutki letalne. Uniwersalne mechanizmy komórkowej homeostazy Ca 2+ oraz sygnalnej roli wapnia, dotyczące także neuronów, zostały przedstawione szczegółowo w innych rozdziałach bieżącego zeszytu Postępów Biochemii. W tym rozdziale zwrócimy uwagę na wybrane szczegółowe aspekty, ważne dla funkcji fizjologicznych lub patologii neuronów. DWOISTA ROLA WAPNIA W KOMÓRKACH: ASPEKTY EWOLUCYJNE Ewolucja życia na Ziemi potoczyła się w kierunku wykorzystania fosforanów jako anionów wewnątrzkomórkowych kluczowych dla metabolizmu energetycznego i przemian lipidów, regulacji aktywności białek i replikacji DNA. Przeciw-jonem w tych procesach jest Mg 2+, natomiast długotrwały wzrost stężenia Ca 2+ wewnątrz komórki jest dla niej zabójczy, ponieważ jony Ca 2+ konkurują z Mg 2+, a fosforany wapnia są praktycznie nierozpuszczalne w wodzie. Dla uniknięcia wytrącania się tych soli, stężenie Ca 2+ wewnątrz komórki musi być utrzymywane poniżej poziomu 10 5 M [1]. Elżbieta Salińska * Jerzy W. Łazarewicz Instytut Medycyny Doświadczalnej i Klinicznej im. M. Mossakowskiego Polskiej Akademii Nauk, Warszawa * Pracownia Farmakoneurochemii, Zakład Neurochemii, Instytut Medycyny Doświadczalnej i Klinicznej im. M. Mossakowskiego Polskiej Akademii Nauk, ul. Pawińskiego 5, 02-106 Warszawa; tel.: (22) 608 65 28, e-mail: elas@cmdik.pan.pl Artykuł otrzymano 11 września 2012 r. Artykuł zaakceptowano 2 października 2012 r. Słowa kluczowe: homeostaza wapnia, ischemia mózgu, plastyczność neuronalna, receptory glutaminianergiczne, transdukcja sygnału, zwyrodnienie neuronów Wykaz skrótów: CICR (ang. Ca 2+ -induced Ca 2+ release) indukowany przez wapń wyrzut wapnia; ER siateczka śródplazmatyczna; IP 3 inozytolo-1,4,5-trifosforan; LTD (ang. long term depression) długotrwałe osłabienie synaptyczne; LTP (ang. long term potentiation) długotrwałe wzmocnienie synaptyczne; NCX wymiennik Na + /Ca 2+ ; PMCA (ang. plasma membrane Ca 2+ -ATPase) Ca 2+ -ATPaza błony plazmatyczej; ROC (ang. receptor-operated channels) receptory jonotropowe; SERCA Ca 2+ -ATPaza siateczki sarko/śródplazmatycznej (ang. sarcoplasmic/endoplasmic reticulum Ca 2+ -ATPase); VOCC (ang. voltage-operated Ca 2+ channels) kanały wapniowe zależne od potencjału błony Podziękowanie: Praca powstała w trakcie realizacji projektu badawczego nr N N401 003935 finansowanego ze środków przyznanych przez MNiSW. Sugerowane są hipotezy dotyczące rozwoju mechanizmów homeostazy Ca 2+ w komórkach, które stały się kluczowe dla pojawienia się funkcji tych jonów w procesach przekazywania sygnałów, a których zaburzenie prowadzi do śmierci komórek. Chociaż obecnie stężenie Ca 2+ w oceanach waha sie w granicach 10 2-10 3 M, zapewne ewolucja najwcześniejszych form życia, a być może także prostych eukaryota, miała miejsce w wodach w których stężenie jonów Ca 2+ początkowo nie przekraczało 10 4 M. Późniejszy jego wzrost do obecnego poziomu wymusił na komórkach ewolucję mechanizmów adaptacyjnych [1]. W rezultacie zarówno współczesne prokaryota jak i eukaryota dysponują dwoma podstawowymi mechanizmami usuwania Ca 2+ z komórek przez błonę plazmatyczną, to jest ATPazami PMCA zależnymi od dostępności ATP, oraz wymienni- Postępy Biochemii 58 (4) 2012 403

kiem NCX napędzanym gradientem jonów sodu zależnym od aktywności Na + -K + -ATPazy. W przebiegu ewolucji eukaryota wzbogaciły mechanizmy homeostazy Ca 2+ w bardziej rozwinięte systemy buforowania wapnia wewnątrz komórek. Należy do nich pobieranie Ca 2+ przez struktury wewnątrzkomórkowe: ER i mitochondria, a także wiązanie przez liczne białka wiążące wapń o znaczącej pojemności buforowej. Ponadto pojawiły się kanały pojemnościowe w błonach plazmatycznych oraz receptory/kanały wrażliwe na IP 3 i rianodynę, odgrywające rolę w utrzymaniu zrównoważonego bilansu wapniowego w komórkach, uzupełnianiu zasobów Ca 2+ i uwalnianiu Ca 2+ z ER do cytosolu. W neuronach, komórkach pobudliwych cechujących się intensywnymi przepływami jonów wapnia, obserwujemy różnorodne drogi kontrolowanego wzrostu wewnątrzkomórkowego stężenia Ca 2+ i usuwania go z cytosolu [2]. Rozbudowany system homeostazy wapnia u eukaryota stał się w przebiegu ewolucji sprawnym narzędziem dla wykorzystania jonów wapnia w wewnątrzkomórkowych mechanizmach przekazywania sygnałów, szczególnie silnie rozwiniętych w neuronach [3]. Uważa się, że uniwersalna rola Ca 2+ jako cząsteczki służącej do przekazu sygnału wynika z unikalnych właściwości fizykochemicznych tego kationu, ponieważ w swej sferze koordynacyjnej może on pomieścić od 4 do 12 atomów tlenu [4]. Dzięki obecności obfitych zasobów jonów Ca 2+ w przestrzeniach na zewnątrz i wewnątrz komórki indukcja sygnału wapniowego jest błyskawiczna, ponadto jest możliwość jego szybkiego wygaszenia dzięki sprawnym mechanizmom usuwania tego kationu z cytosolu. GENEROWANIE SYGNAŁU WAPNIOWEGO W NEURONACH Wewnątrzkomórkowe sygnały wapniowe w neuronach są elementem łańcucha przekazu informacji w układzie nerwowym, zapoczątkowanego przez sygnał zewnątrzkomórkowy, w postaci pobudzenia synaptycznego docierającego do tych komórek w przebiegu neurotransmisji chemicznej lub elektrycznej [3]. W efekcie depolaryzacji błony plazmatycznej i/lub aktywacji receptorów, dochodzi do napływu jonów Ca 2+ do cytosolu ze środowiska zewnątrzkomórkowego lub do ich mobilizacji z zasobów wewnątrz komórki, co prowadzi do wzrostu stężenia Ca 2+ wewnątrz neuronów. Napływ Ca 2+ do neuronów przez błonę plazmatyczną zachodzi za pośrednictwem kanałów wapniowych VOCC lub receptorów jonotropowych ROC, a zwłaszcza receptorów dla glutaminianu specyficznie wrażliwych na N-metyl- -D-asparaginian (NMDAR) [5]. Z kolei pobudzenie receptorów metabotropowych sprzężonych za pośrednictwem białek G z fosfolipazą C, do których należą receptory metabotropowe dla glutaminianu (mglur) grupy I, prowadzi do mobilizacji wapnia z zasobów w ER, zachodzącej za pośrednictwem wtórnego przekaźnika IP 3 i specyficznych dla niego receptorów [6]. Początkowy krótkotrwały wzrost stężenia Ca 2+ w cytosolu spowodowany napływem z zewnątrz może być przedłużony i wzmocniony w wyniku wtórnego uwalniania Ca 2+ z ER, głównie za pośrednictwem receptorów rianodynowych, w mechanizmie CICR [7]. Dla kodowania sygnału przekazywanego za pośrednictwem jonów Ca 2+ wykorzystywana jest charakterystyka wzrostu wewnątrzkomórkowego stężenia tych jonów: jego amplituda, częstotliwość, czas trwania i lokalizacja wewnątrz komórki Rycina 1. Komórkowa homeostaza Ca 2+ na przykładzie dendrytu neuronów glutaminianergicznych w warunkach komfortu i niedoboru energetycznego. (A) Warunki prawidłowe. Ściśle kontrolowany napływ Ca 2+ przez VOCC i ROC (głównie NMDAR) jest równoważony przez wyrzut jonów wapnia z neuronów za pośrednictwem pompy PMCA i wymiennika NCX. Buforowanie Ca 2+ wewnątrz komórki przez białka wiążące wapń (CaBP) oraz pobieranie przez mitochondria (na drodze uniportu zgodnie z gradientem elektrochemicznym) i ER dzięki pompie SERCA. Mobilizacja Ca 2+ z ER w wyniku aktywacji receptorów metabotropowych grupy I (mglur1/5) i otwarcia kanałów receptorów IP 3 R lub w drodze CICR. (B) Warunki niedoboru energetycznego, np. w niedokrwieniu mózgu. Zahamowanie ATPaz, depolaryzacja neuronów oraz pobudzenie VOCC i ROC, zwłaszcza NMDAR prowadzi do napływu Ca 2+ do neuronów, wspomaganego przez odwrócenie trybu pracy NCX. Pobudzenie mglur I i wzrost stężenia Ca 2+ w cytosolu indukuje wyrzut wapnia z zasobów w ER za pośrednictwem IP 3 R i RyR (CICR). Początkowe przeładowanie mitochondriów wapniem owocuje ich deenergizacją, aktywacją megakanałów (MPT) z uwalnianiem Ca 2+ z mitochondriów. 404 www.postepybiochemii.pl

[8]. Postęp w badaniu z dużą rozdzielczością stężenia Ca 2+ w żywych komórkach pozwolił na ujawnienie, na tle globalnych wzrostów stężenia Ca 2+ przyrównywanych do analogowych sygnałów wapniowych, iskrzeń wapniowych (ang. calcium sparks) będących krótkotrwałymi lokalnymi bardzo znacznymi wzrostami stężeń Ca 2+, którym przypisuje się rolę cyfrowych sygnałów wapniowych [9]. Na dywersyfikację sygnałów wapniowych generowanych w neuronach ma także wpływ zróżnicowanie struktury molekularnej i składu podjednostkowego białek zaangażowanych w regulację przepływów Ca 2+. NAPŁYW JONÓW WAPNIA DO NEURONÓW Z PRZESTRZENI ZEWNĄTRZKOMÓRKOWEJ Sygnał elektryczny docierający do neuronu (tj. depolaryzacja błony) jest przetwarzany przez VOCC w sygnał wapniowy, którego pierwszym elementem jest napływ Ca 2+ do komórki i podwyższenie jego lokalnego stężenia (Ryc. 1A). Ten efekt, zwykle krótkotrwały, ma jednak doniosłe skutki regulacyjne. Heteromeryczne VOCC są pentamerami o złożonej strukturze podjednostkowej. W ich skład wchodzą podjednostki α1, kodowane przez 10 genów, zawierające sensor napięcia, por kanału selektywnego dla Ca 2+ i miejsce fosforylacji przez kinazę białkową zależną od camp, podjednostki α2 i δ, kodowane przez 3 geny i regulujące amplitudę prądów jonowych, oraz podjednostki β i γ pełniące funkcje regulatorowe. Skład podjednostkowy determinuje właściwości czynnościowe VOCC. W oparciu o kryteria elektrofizjologiczne i farmakologiczne wyodrębniono pięć typów VOCC, kanały L, P/Q, N, R i T. Wykazano istotne różnice w lokalizacji poszczególnych typów tych kanałów w różnych częściach komórki nerwowej i w ich funkcjach. Kanały N i P/Q są głównie zlokalizowane presynaptycznie i regulują zależną od Ca 2+ egzocytozę pęcherzyków synaptycznych [10]. Kanały L są zlokalizowane zarówno w części pre- jak i postsynaptycznej, głównie jednak w części proksymalnej dendrytów i ciele neuronów. Przypisuje się im rolę w regulacji za pośrednictwem jonów Ca 2+ transkrypcji genów, w aktywacji genów szybkiej odpowiedzi i w aktywacji wraz z kalmoduliną białka CREB [11]. Znane są złożone oddziaływania i powiązania czynnościowe kanałów L z różnorodnymi zależnymi od wapnia mechanizmami przekazywania sygnałów w neuronach [12]. Obecnie dysponujemy rozbudowanym zestawem narzędzi farmakologicznych służących do sterowania aktywnością VOCC [13]. ROC przetwarzają docierający z zewnątrz sygnał chemiczny, jakim jest związanie się specyficznego neuroprzekaźnika z receptorem w błonie synaptycznej w sygnał wapniowy wewnątrz komórki. Pobudzenie receptorów jonotropowych prowadzi bowiem do aktywacji kanału przepuszczalnego dla Ca 2+. Wśród ROC najbardziej rozpowszechnione w mózgu są jonotropowe receptory dla glutaminianu trzech podtypów: NMDAR, AMPAR i kainianowe (KAR) (Ryc. 1A) [14]. Szczególnie wysoką przepuszczalnością dla jonów wapnia cechują się NMDAR. Są to tetramery, składające się z dwóch podjednostek NR1 i dwóch podjednostek NR2. Występuje wiele wariantów poszczególnych podjednostek (NR1 1-4a/b oraz NR2 A-D ), co zapewnia ogromną różnorodność tych receptorów. Ich unikalną cechą jest detekcja koincydencji zdarzeń kluczowych dla aktywacji receptora: dostępności agonisty, którym jest neuroprzekaźnik - glutaminian, koagoniasty - glicyny lub D-seryny, oraz depolaryzacji błony plazmatycznej neuronu, w czym mogą pośredniczyć AMPAR [15]. Aktywacja kanału jonowego NMDAR zależy bowiem od depolaryzacji, która zwalnia jony Mg 2+ blokujące kanał. C-końcowe cytoplazmatyczne fragmenty podjednostek NMDAR służą do połączenia tych receptorów z innymi elementami gęstości postsynaptycznych (PSD, ang. post-synaptic density) w kolcach dendrytycznych synaps, co ma zasadnicze znaczenie dla procesów przekazywania sygnałów. AMPAR są heteromerami składającymi się z podjednostek GluR1-4 kodowanych przez cztery geny. Ich przepuszczalność dla jonów Ca 2+ jest normalnie bardzo ograniczona, jednak wzrasta ona dramatycznie przy braku w strukturze podjednostki GluR2, co ma istotne znaczenie funkcjonalne i patologiczne [16]. KAR mają strukturę i właściwości zbliżone do AMPAR. Inne przepuszczalne dla Ca 2+ podtypy ROC, to receptory jonotropowe dla acetylocholiny (nach), ATP (P2X) i serotoniny (5-HT3) [17], które cechują się mniej intensywnymi przepływami Ca 2+ i pozostają w cieniu receptorów dla glutaminianu. Podobnie jak w komórkach niepobudliwych, w neuronach zachodzi napływ wapnia za pośrednictwem kanałów pojemnościowych SOCC (ang. store-operated calcium channels) z udziałem białka Orai1, których aktywność jest regulowana przez wrażliwe na zawartość Ca 2+ w ER białka sensorowe STIM [18], wykryte w neuronach licznych okolic mózgu [19]. Napływowi pojemnościowemu wapnia przypisuje się udział w mechanizmach plastyczności neuronalnej [20]. UWALNIANIE JONÓW WAPNIA Z WEWNĘTRZNYCH ZASOBÓW NEURONÓW W uwalnianiu Ca 2+ zmagazynowanego w ER do cytosolu pośredniczą dwa typy kanałów wapniowych zlokalizowanych w błonach ER (Ryc. 1A) [6,7]. Jeden z nich, to receptor IP 3 (IP 3 R) o budowie tetrameru (monomeru), zbudowanego z trzech sklonownych izoform, a poszczególne podtypy IP 3 R różnią się właściwościami funkcjonalnymi [21]. Agonista tego receptora IP 3, to produkt sprzężonej z receptorami metabotropowymi fosfolipazy C [3]. IP 3 pełni funkcję globalnego przekaźnika sygnału w komórce, co wynika z jego długiego, mierzonego w sekundach okresu półtrwania i rozległego zakresu dyfuzji w komórkach w granicach 20 μm. IP 3 Rs integrują ten sygnał i przekształcają go w sygnał lokalny przekazywany przez jony Ca 2+. Ten podział ról wynika z faktu, że droga dyfuzji uwalnianych z ER jonów Ca 2+ jest 200 razy krótsza niż IP 3 [22]. Aktywność IP 3 R jest zwrotnie regulowana przez jony Ca 2+, przy czym Ca 2+ w stężeniach do 0,1 0,3 μm potęgują aktywność kanału, a przy wyższych stężeniach go inaktywują [23]. Z kolei białka wiążące wapń oraz cytochrom c hamują inaktywację kanału przez wyższe stężenia jonów Ca 2+ [24,25]. Drugi typ receptorów/kanałów wapniowych zaangażowanych w proces wyrzutu Ca 2+ z ER w neuronach, to receptor rianodynowy (RyR) (Ryc. 1A) [26]. RyR to homotetramer o dużej masie cząsteczkowej ok. 500 kda, z N- -końcową domeną cytoplazmatyczną, domeną błonową w pobliżu końca C cząsteczki oraz regionem pośrednim, zawierającym miejsca wiążące jony Ca 2+, ATP, kalmodulinę Postępy Biochemii 58 (4) 2012 405

(CaM) i inne modulatory [27]. Sklonowane trzy izoformy RyR charakteryzują się różną lokalizacją w tkankach i nieco innymi właściwościami. Izoforma RyR1 występuje głównie w mięśniach szkieletowych, RyR2 w sercu i neuronach mózgu, a RyR3, choć nazywana neuronalną lub mózgową, jest wykrywana głównie w tkankach obwodowych. Aktywność RyR jest regulowana przez wapń, przy czym Ca 2+ w niskich stężeniach pobudza, a w wysokich hamuje aktywność RyRs [28]. Kofeina i cykliczna ADP-ryboza są odpowiednio egzoi endogennymi aktywatorami RyR [29]. Uwalnianie jonów Ca 2+ z ER w neuronach, zachodzące za pośrednictwem IP 3 R, jest wykorzystane w mechanizmie przekazywania sygnałów z udziałem receptorów metabotropowych, w tym w mglur grupy I, obejmującej dwa typy receptorów: mglur1 i mglur5 (Ryc. 1A) [30]. Jak wspomniano powyżej, niskie stężenia jonów Ca 2+ aktywują oba rodzaje receptorów/kanałów wapniowych występujących w ER. Ta cecha jest podstawą dla CICR, czynnościowego sprzężenia poprzez Ca 2+ kanałów i receptorów pośredniczących w napływie Ca 2+ ze środowiska zewnętrznego (zwłaszcza VOCC i NMDAR) z receptorami uwalniającymi Ca 2+ z ER, a szczególnie RyR. Znaczenie czynnościowe CICR polega na wzmacnianiu i przedłużaniu sygnału wapniowego w neuronach [31]. Bez względu na drogę uwolnienia Ca 2+ z ER, opróżnienie tych zasobów wapnia indukuje pojemnościowy napływ Ca 2+ do komórki oraz uzupełnienie zasobów w ER [18]. Niezależnie od znanych funkcji sekrecyjnych związanych z tworzeniem amyloidu β, białko presenilina odgrywa ważną rolę w integracji homeostazy wapnia w komórce, moduluje aktywność IP 3 R i RyR, pracę pompy wapniowej SERCA, wpływa na aktywację SOCC, a sama tworzy w błonie ER kanał wycieku Ca 2+ (ang. leak channel) [32]. BUFOROWANIE Ca 2+ I WYGASZANIE SYGNAŁU WAPNIOWEGO W NEURONACH Kontrolowany wzrost wewnątrzkomórkowego stężenia Ca 2+ w neuronach (sygnał wapniowy), dla zachowania swej kluczowej roli w systemie przekazu informacji w komórkach, wymaga skutecznych mechanizmów wygaszania, co sprowadza się do usuwania wolnych jonów Ca 2+ z cytosolu. Do tych mechanizmów należą wyrzut wapnia na zewnątrz komórki za pośrednictwem pompy PMCA i wymiennika NCX oraz buforowanie wewnątrz neuronów, polegające na pobieraniu Ca 2+ przez organelle komórkowe - ER i mitochondria oraz wiązaniu przez wyspecjalizowane białka [2]. USUWANIE Ca 2+ Z NEURONÓW Dla pełnego i długoterminowego wyrównania bilansu wapniowego komórki nerwowej oraz utrzymania niskiego stężenia Ca 2+ w cytosolu decydujące są mechanizmy usuwania tych jonów na zewnątrz (Ryc. 1A). W warunkach spoczynkowych tę rolę spełnia PMCA. Cząsteczka tego enzymu ma złożoną strukturę, w tym 10 fragmentów przeszywających błonę i 4 pętle wewnątrzkomórkowe z krótkim fragmentem N-końcowym, miejsce wiążące kwaśne fosfolipidy, domenę katalityczną oraz fragment C-końcowy zawierający miejsca modulatorowe wiążące CaM i fosforylowane przez kinazy białkowe C i A [33]. W mózgu występuje ponad 30 izoform PMCA; białko to jest kodowane przez 4 geny i są cztery alternatywne warianty jego składania. Dawno poznany mechanizm działania PMCA polega na zmianie konformacyjnej cząsteczki, zachodzącej dzięki hydrolizie ATP. Wyrzutowi wapnia z cytoplazmy towarzyszy napływ protonów do wnętrza komórki. Jako błonowa pompa wapniowa PMCA cechuje się względnie niską wydajnością, ale wysokim powinowactwem do jonów Ca 2+, dzięki czemu utrzymuje ich stężenie na prawidłowym poziomie poniżej 10 7 M. W neuronach pobudzonych dochodzi do znacznego wzrostu stężenia Ca 2+ w komórce. Do jego usuwania włącza się wymiennik NCX, wykorzystujący energię elektrochemicznego gradientu sodu (Ryc. 1A). Posiada on znacznie niższe niż PMCA powinowactwo dla jonów Ca 2+, ale dużą wydajność transportu. NCX jest białkiem transportowym niezależnym od potasu, kodowanym przez geny NCX1, 2 i 3 [34]. Ponadto występuje też transporter zależny od potasu, kodowany przez geny NCKX1 i 2. Białka te mają rozbudowaną strukturę zawierającą 11 domen transbłonowych, pętle cytoplazmatyczne z miejscami modulatorowymi, a po stronach na zewnątrz i wewnątrz komórki posiadają liczne miejsca wiążące jony [35]. Aktywność NCX jest modulowana przez ATP, stopień ufosforylowania, fosfoargininę, jony H + i Na +. Zależy ona też od stężenia jonów Ca 2+ w cytosolu, jest bardzo niska przy wartościach spoczynkowych poniżej 10-7 M, natomiast osiąga maksymalną wartość przy stężeniu Ca 2+ 10-4 M [36]. Transport polega na wymianie 1 jonu Ca 2+ na 3 jony Na +, lub 1 jonu Ca 2+ i 1 jonu K + na 4 jony Na +, i jest odwracalny, przy czym kierunek transportu jest regulowany przez potencjał błonowy oraz gradienty stężeń jonów Ca 2+ i Na +. Odwrócony tryb pracy prowadzący do napływu wapnia, cechuje komórkę o niskim potencjale błonowym, z podwyższonym stężeniem sodu. Tak więc, wymiennik NCX pracujący w trybie odwróconym jest alternatywną drogą wnikania wapnia do komórek. POBIERANIE Ca 2+ PRZEZ MITOCHONDRIA I ER Obok wytwarzania ATP i regulacji metabolizmu w komórce, inną uniwersalną funkcją mitochondriów jest pobieranie jonów Ca 2+. Fakt, że ulega on znaczącej aktywacji dopiero przy stężeniu Ca 2+ > 0,5µM czyni z tego mechanizmu bufor wapniowy o stosunkowo niskim powinowactwie, ale dużej pojemności (Ryc. 1A). Ponieważ zewnętrzna błona mitochondrialna jest przepuszczalna dla substancji drobnocząsteczkowych (o małej masie cząsteczkowej), napływ Ca 2+ do mitochondriów polega na transporcie przez błonę wewnętrzną na zasadzie uniportu napędzanego przez potencjał mitochondrialny i gradient elektrochemiczny Ca 2+ [37]. Usuwanie Ca 2+ z mitochondriów do cytosolu zachodzi ze znacznie mniejszą szybkością, głównie na zasadzie wymiany z jonami Na + [38]. Zarówno uniporter jak i mitochondrialny wymiennik NCX są hamowane przez czerwień rutenową i kationy dwuwartościowe, przy czym jony Mg 2+ hamują aktywność uniportera przez działanie na miejsce regulatorowe. Za mechanizm mogący prowadzić do szybkiego usuwania nadmiaru jonów Ca 2+ z mitochondiów uważana jest aktywacja megakanałów (kanałów MPT, ang. mitochondrial permeability transition), co przy przeładowaniu mitochondriów jonami wapnia może się stać zarazem elementem dysfunkcji mitochondriów mogącej prowadzić 406 www.postepybiochemii.pl

do nekrotycznej lub apoptotycznej śmierci neuronów [39]. Ponieważ w warunkach spoczynkowych w neuronach stężenie Ca 2+ jest znacznie niższe niż powinowactwo mitochondrialnego uniportera, buforowanie przez mitochondria wewnątrzkomórkowego stężenia Ca 2+ nabiera znaczenia regulacyjnego przy lokalizacji tych struktur w pobliżu zewnątrzkomórkowych lub wewnątrzkomórkowych kanałów wapniowych, gdzie lokalne stężenia jonów wapnia mogą na krótko osiągać wysokie wartości i wymagają buforowania [40]. Wysokie powinowactwo do Ca 2+ wykazuje system buforowania wapnia w ER, w skład którego wchodzą wapniowa AT- Paza SERCA, transportująca wapń do światła ER, białka wiążące Ca 2+ zlokalizowane wewnątrz kanałów ER, oraz receptory/kanały IP 3 i RyR uwalniające Ca 2+ (Ryc. 1A) [7,41]. Aktywności SERCA i pobieraniu Ca 2+ przez cysterny ER towarzyszy przeciwprądowy przepływ H +. Wykryto dotąd trzy izoformy i szereg wariantów SERCA: 1a i b, 2a i b oraz 3. Najlepiej poznano strukturę molekularną SERCA 2b zawierającą dziesięć domen transbłonowych, trzy domeny cytoplazmatyczne, w których zlokalizowane są miejsca wiązania ATP i ulegające fosforylacji, oraz dwa miejsce wiążące Ca 2+ [42]. Wzrastającą uwagę przyciąga homeostaza wapnia w jądrze komórkowym. Podwójna błona jądrowa jest w ciągłym kontakcie z ER, zachowując jej funkcje transportu Ca 2+. Pory w błonie jądrowej są przepuszczalne dla małych cząstek, w tym dla jonów Ca 2+. Wykazano, że transport Ca 2+ w błonie jądrowej jest spolaryzowany i są różnice w zawartości białek transportujących Ca 2+ w błonie zewnętrznej i wewnętrznej. Błona wewnętrzna obfituje w receptory IP 3 i rianodynowe, a błona zewnętrzna zawiera SERCA. Ułatwia to generowanie i wygaszanie sygnału Ca 2+ w nukleoplazmie, obfitującej w białka wiążące wapń. Te mechanizmy stanowią podłoże dla bezpośredniej roli wapnia w mechanizmach przekazywania sygnałów w jądrze komórkowym [43]. BIAŁKA WIĄŻĄCE Ca 2+ O znaczeniu mechanizmów wiązania Ca 2+ wewnątrz komórki świadczy to, że wolne jony Ca 2+ w cytosolu stanowią zaledwie 1% całkowitej zawartości wapnia, a reszta przypada na wapń związany z cząsteczkami jak ATP, a przede wszystkim z różnorodnymi białkami. Pomijając enzymy takie jak niektóre fosfolipazy A 2, posiadające w swojej strukturze miejsca wiążące Ca 2+ z niskim powinowactwem i aktywowane w obecności tych kationów [44], należy podkreślić znaczenie właściwych białek wiążących Ca 2+ [45]. Wśród nich wyróżniamy bufory wapniowe jak parwalbumina, kalbindyna i kalretinina, którym przypisuje się m. in. udział w wiązaniu i wewnątrzkomórkowym transporcie tego kationu, oraz sensory wapnia jak CaM, kalcyneuryna, białka S100 i troponina, a także neuronalne sensory wapnia (NCS), spełniające omówione poniżej funkcje regulacyjne ważne w mechanizmach przekazywania sygnałów. Właściwe białka wiążące wapń posiadają w swej strukturze różną liczbę domen zwanych EF-hand, umożliwiających wiązanie Ca 2+ [2,46]. Białka wiążące wapń, zarówno o niskim jak i o wysokim powinowactwie, występują w dużych ilościach zarówno w cytosolu, jak i w świetle cystern ER, w jądrze oraz w macierzy mitochondriów. CZUJNIKI WAPNIA; NIEGENOMOWE KONSEKWENCJE PRZEKAZYWANIA SYGNAŁU WAPNIOWEGO W NEURONACH Wynikiem wzrostu wewnątrzkomórkowego stężenia Ca 2+ jest ich przyłączenie się do białek zawierających domeny EF-hand, będących wewnątrzkomórkowymi czujnikami Ca 2+ i mediatorami zależnych od wapnia dalszych szlaków przekazywania sygnału. Przykładem specyficznych dla neuronów i wyspecjalizowanych białek będących sensorami wapnia są synaptotagminy, zlokalizowane w części presynaptycznej zakończeń synaptycznych i odgrywające kluczową rolę w zależnym od Ca 2+ wyrzucie neurotransmiterów nagromadzonych w pęcherzykach synaptycznych [47]. Kalmodulina (CaM) odgrywa szczególną rolę uniwersalnego czujnika wapnia integrującego sygnał wapniowy w neuronach i zaangażowanego w regulację bardzo licznych procesów komórkowych (Ryc. 2). W kompleksie z Ca 2+ wiąże się ona z szeregiem białek efektorowych, w tym enzymów takich jak kinazy i fosfatazy białkowe, cyklazy czy syntazy NO i reguluje ich aktywność [48]. Ważne miejsce wśród zależnych od wapnia i CaM mechanizmów przekazywania sygnałów w neuronach zajmuje szlak aktywowany przez pobudzenie receptorów NMDA lub VOCC i napływ Ca 2+, obejmujący aktywację syntazy NO, pobudzenie cyklazy guanylowej, produkcji cgmp i odpowiednich kinaz białkowych, fosfataz i kanałów jonowych, co prowadzi do modulacji aktywności synaptycznej [49]. Istotną rolę w procesie przekazywania sygnału odgrywają cyklazy adenylanowe wrażliwe na wapń i CaM. Natomiast wśród kinaz białkowych zależnych od wapnia i CaM (CaM kinaz), należy wyróżnić CaM kinazę II (CaMKII) zlokalizowaną postsynaptycznie, która jest podstawowym zależnym od wapnia regulatorem plastyczności synaptycznej. Przykłady mechanizmów, ważnych dla krótko- i długotrwałych zmian plastycznych w neuronach, a kontrolowanych przez Ca 2+, CaM i CaMKII to fosforylacja receptorów AMPA oraz aktywacja jądrowego czynnika transkrypcyjnego CREB [50]. Fosfataza białkowa, kalcyneuryna jest enzymem aktywowanym przez wapń i CaM, co powoduje, że CaM kontroluje także defosforylację białek [51]. Ca 2+ A REGULACJA EKSPRESJI GENÓW Szybkie odpowiedzi wewnątrzkomórkowe na wzrost stężenia Ca 2+ angażują głównie potranslacyjną modyfikację białek już obecnych w komórce. Jednakże długotrwałe zmiany strukturalne i funkcjonalne komórki, będące odpowiedzią na sygnał wapniowy, wymagają uruchomienia ekspresji odpowiednich genów. Wykazano, że sygnał wapniowy jest niezbędny do uruchomienia ekspresji genów wczesnej odpowiedzi takich jak np. c-fos czy zif/268, a w konsekwencji również do aktywacji ekspresji genów różnych białek docelowych. W neuronach można wyróżnić dwa mechanizmy, dzięki którym elektryczny sygnał pobudzenia komórki przekładany jest na transkrypcję. W pierwszym, jony Ca 2+ po wniknięciu do komórki aktywują znajdujące się w pobliżu cytoplazmatyczne przekaźniki, które następnie przekazują sygnał do jądra. W drugim jony Ca 2+ działają bezpośrednio w jądrze. Postępy Biochemii 58 (4) 2012 407

Podstawowym szlakiem uruchamianym przez wzrost stężenia Ca 2+ w cytoplazmie jest szlak Ras/MAP kinaza/ ERK1/2 (ang. extracellular signal-regulated kinase 1/2), który prowadzi do aktywacji jądrowych kinaz Rsk 1-3, mających zdolność fosforylacji związanych z DNA białek regulujących transkrypcję (Ryc. 2). Szlak ten aktywowany jest głównie napływem Ca 2+ przez kanały związane z NMDAR [52], jednakże napływ Ca 2+ przez zależne od potencjału kanały typu L (L-VOCC) również może uruchomić ten szlak [53]. Nie jest do końca wyjaśnione, w jaki sposób sygnał wapniowy uruchamia kaskadę Ras/MAPK/ERK1/2. Część badaczy uważa, że kompleks Ca 2+ /CaM reguluje aktywację Ras poprzez czynnik uwalniający nukleotyd guanylowy Ras (Ras-GRF), inni z kolei opowiadają się za udziałem zależnej od Ca 2+ /CaM kinazy kinazy (CaMKK) oraz zależnej od Ca 2+ /CaM kinazy I (CaMKI) [54]. Przekaz sygnału przez ERK1/2 w jądrze zachodzi albo bezpośrednio za pomocą ufosforylowanego ERK1/2 (perk1/2) przedostającego się do jądra, albo pośrednio poprzez kinazy fosforyzowane przez perk1/2 w cytoplazmie przed ich przemieszczeniem się do jądra. Do kinaz tych należą zlokalizowana w jądrze i wymagająca obecności aktywnej MAPK MKS1/2 oraz RSK2, która jest importowana do jądra po jej ufosforylowaniu przez REK1/2 w cytoplazmie [54]. Wzrost stężenia Ca 2+ w cytoplazmie aktywuje również przekazywanie sygnału przez kinazy zależne od Ca 2+ i CaM (CaMKs) (Ryc. 2). CaMKs I, II i IV mogą fosforylować CREB na reszcie seryny 133 (Ser133), co jest niezbędne do zapoczątkowania transkrypcji, jednakże największe znaczenie wydają się mieć CaMKs II oraz IV. CaMK II zlokalizowana jest głównie w cytoplazmie, a jej aktywna forma może ulegać przemieszczeniu do jądra. W jądrze znajdują się również izoformy CaMKII mogące być aktywowane przez przedostające się do jądra jony Ca 2+ związane z CaM. Natomiast CaMK IV jest enzymem zlokalizowanym głównie w jądrze i jak wykazano jej aktywacja zbiega się w czasie z aktywacją CREB [55]. CREB nie jest jedynym czynnikiem transkrypcyjnym, który może aktywować jony Ca 2+ i CaM. Wykazano bowiem, że działanie CaMKIV jest niezbędne przy aktywowaniu C/EBPβ, ATF-1 oraz SRF [52]. Wiadomo, że chociaż napływ Ca 2+ przez L-VOCC silnie aktywuje CREB, to równoważny napływ Ca 2+ przez pozostałe VOCC nie skutkuje zainicjowaniem zależnej od CREB ekspresji genów [55]. Napływ Ca 2+ przez kanały związane z NMDAR jest dominującym elementem aktywacji ekspresji genów w embrionalnym rozwoju neuronów, jednakże wraz z dojrzewaniem tkanki mózgowej tę rolę przejmują również inne mechanizmy powodujące wzrost wewnątrzkomórkowego stężenia Ca 2+ [55]. Wykazano, że w dojrzałej tkance mózgowej napływ Ca 2+ przez VOCC typu L prowadzi do długotrwałej fosforylacji CREB, podczas gdy wejście Ca 2+ kanałami związanymi z NMDAR skutkuje krótkotrwałą fosforylacją [56]. Oprócz opisanych powyżej dwóch szlaków przekazywania sygnału wapniowego w cytoplazmie, transkrypcja może być aktywowana bezpośrednio przez wzrost stężenia Ca 2+ w jądrze. Podwyższenie poziomu Ca 2+ w jądrze najczęściej związane jest z uwalnianiem Ca 2+ z magazynów wewnątrzkomórkowych, ale może też być wynikiem przemieszczenia się kompleksu Ca 2+ /CaM do jądra. Bezpośredni napływ Ca 2+ do jądra wiąże się z silną lub powtarzającą się stymulacją dendrytów, co powoduje masowy napływ Ca 2+, przemieszczającego się do ciała komórki. Ponieważ struktura błony jądrowej pozwala na dyfuzję Ca 2+ do jądra, przy wzroście stężenia Ca 2+ w pobliżu tej błony, część przemieszcza się do nukleoplazmy, a ponadto jony Ca 2+ mogą być uwalniane z zasobów wewnątrz podwójnej błony jądrowej [43,57]. Uważa się, że jony Ca 2+ w jądrze nie angażują się w aktywację specyficznych czynników transkrypcyjnych, ale raczej kontrolują, poprzez aktywację jądrowej CaMKIV, aktywność białek wiążących CREB (CBP). CBP może oddziaływać z wieloma czynnikami transkrypcyjnymi, stanowiąc mechanizm, poprzez który sygnał wapniowy w jądrze może modulować aktywność potencjalnie dużej liczby tych czynników, a co za tym idzie ekspresję dużej liczby genów [58]. Rycina 2. Rola Ca 2+ w przekazywaniu sygnału uruchamiającego transkrypcję genów w neuronach. Napływ Ca 2+ do wnętrza neuronów przez VOCC lub ROS powoduje aktywację kilku szlaków sygnałowych jak cyklazy adenylanowej (AC), kinazy aktywowane kompleksem Ca 2+ /kalmodulina przez Ras. Każda z tych dróg prowadzi do przekazania sygnału do jądra i uruchomienia kinaz przemieszczonych do jądra (PKA, RSK1-3 i CaMKII) oraz aktywacji jądrowych kinaz (CaMKII i IV), co w efekcie umożliwia fosforylację CREB i rozpoczęcie transkrypcji genu. CREB jest najlepiej poznanym do tej pory czynnikiem transkrypcyjnym regulowanym sygnałem wapniowym (Ryc. 2). Wiąże się w postaci dimeru do domeny DNA nazwanej elementem odpowiedzi na camp (CRE) i jest kluczowym elementem w ekspresji genów aktywowanej sygnałem wapniowym w komórkach pobudliwych. Uruchomienie transkrypcji genów, w której pośredniczy CREB, wymaga fosforylacji reszty Ser133 w tym białku. Fosforylacja ta może być katalizowana przez szereg kinaz, takich jak kinaza białkowa A (PKA), CaMK I, II i IV, regulowana przez ERK kinaza RSK2 czy kinazy regulowane przez p38 MAP [52]. Nie oznacza to jednak, że każda fosforylacja reszty Ser133 skutkuje aktywacją 408 www.postepybiochemii.pl

transkrypcji. Wykazano, że do zapoczątkowania transkrypcji niezbędny jest dodatkowy czynnik aktywowany jądrową CaMKIV, którym jest białko wiążące CREB (CBP). CBP jest białkowym koaktywatorem, który nie wiąże się bezpośrednio z DNA, może za to oddziaływać z wieloma czynnikami transkrypcyjnymi [58]. Łączenie CBP z wybranym promotorem jest inicjowane przez kaskady uruchamiane sygnałem wapniowym, ale żaden z tych szlaków nie aktywuje samego CBP. Aktywacja CBP kontrolowana jest przez jony Ca 2+ w jądrze oraz jądrową CaMKIV, jednak sam mechanizm aktywacji jest do tej pory niejasny. CaMKII, która również może fosforylować w CREB resztę Ser133, fosforyluje też resztę Ser142, co skutkuje zahamowaniem transkrypcji. Fosforylacja reszty Ser142 jest indukowana sygnałem pochodzącym z depolaryzacji błony komórkowej, która ma miejsce w czasie trwania transkrypcji aktywowanej CREB [55]. Oddziałujące z CBP czynniki transkrypcyjne inne niż CREB, również mogą być zaliczone do regulowanych przez sygnał wapniowy. Jednym z nich jest c-jun, którego aktywacja przez sygnał wapniowy w komórkach hipokampa nie wymaga, jak w innych przypadkach, fosforylacji reszt seryny 63 i 73, za to jest kontrolowana przez CaMKIV i aktywację CBP. To sugeruje, że CBP przyłączone do c-jun jest jednocześnie miejscem regulacji transkrypcji aktywowanej przez Ca 2+ [52]. Innym elementem regulowanym przez jony Ca 2+ jest czynnik SRF (ang. serum response factor), znaleziony na promotorze c-fos i miejscach regulatorowych kilku innych genów [59]. Łączy się on z domeną SRE (ang. serum response element) w postaci dimeru, często w towarzystwie jednego z koaktywatorów transkrypcji z rodziny TCFs (ang. ternary complex factors), również regulowanego przez Ca 2+ lub MRTF (ang. myocardin-related transcription factor) [59,60]. W odróżnieniu od CREB/CBP, ekspresja genów regulowana przez SRF jest kontrolowana przez mechanizm uruchamiany przez cytoplazmatyczny sygnał wapniowy [57]. Uważa się, że szlakiem przekazywania sygnału zaangażowanym w aktywację SRF raczej nie jest kaskada Ras/MAPK/ERK1/2 i że zaangażowane są tu CaM kinazy [52]. CaMKII, która katalizuje fosforylację reszty Ser103 w SRF wydaje się jednak nie być jedynym aktywatorem SRF regulowanym Ca 2+ i prawdopodobnie w aktywację transkrypcji zaangażowane są jeszcze inne białka [61]. Wzrost stężenia jądrowego Ca 2+ może bezpośrednio regulować proces transkrypcji poprzez DREAM (ang. downstream regulatory element antagonist modulator). Jest to białko zawierające wiążącą Ca 2+ domenę EF-hand, łączące się z DRE (ang. downstream regulatory element). Kompleks DRE- AM/DRE hamuje transkrypcję, prawdopodobnie przez hamowanie elongacji transkrypcji. Gdy wzrasta stężenie Ca 2+ w jądrze, Ca 2+ wiąże się do DREAM, zmniejszając jednocześnie jego powinowactwo do DRE. Skutkiem tego jest odłączenie się DREAM od DNA i zwolnienie hamulca transkrypcji docelowego genu. DREAM jest białkiem szeroko rozpowszechnionym w układzie nerwowym, szczególnie w neuronach czuciowych, gdzie odpowiedzialny jest za ekspresję prodynorfiny, genu związanego z modulacją bólu [62]. FIZJOLOGICZNA ROLA JONÓW WAPNIA W NEURONACH Jony Ca 2+ są uniwersalnym przekaźnikiem informacji we wszystkich komórkach, pełnią jednak szczególną rolę w komórkach pobudliwych, gdzie sprzęgają pobudzenie z ich specyficzną funkcją. W układzie nerwowym jony Ca 2+ są zaangażowane w neurotransmisję na wielu etapach tego procesu. Regulują one pobudliwość neuronów, w części presynaptycznej synaps aktywują sekrecję neuroprzekaźników chemicznych, a w części postsynaptycznej pełnią funkcję wtórnego przekaźnika sygnału [3]. Jak omówiono powyżej, jony Ca 2+ i zależne od nich szlaki sygnałowe są w neuronach zaangażowane w przekaz informacji od synapsy do jądra. Zmiany stężenia jonów Ca 2+ wewnątrz komórki, a więc sygnały wapniowe, są w neuronach wykorzystywane do krótkotrwałej regulacji aktywności tych komórek lub w procesach długo trwających. Wśród procesów długo trwających należy wymienić mechanizmy wzrostu neurytów, tworzenia i przebudowy sieci neuronalnej, regulacji siły połączeń synaptycznych oraz procesy warunkujące przeżycie lub programowaną śmierć tych komórek. Te długotrwałe mechanizmy wymagają zmiany ekspresji genów. ROLA WAPnIA W NEUROTRANSMISJI Od dawna znany jest udział Ca 2+ w stabilizacji potencjału błony plazmatycznej i regulacji pobudliwości komórek pobudliwych; wiadomo, że niedobory wapnia, które obserwuje się np. w tężyczce prowadzą do zaburzenia pobudliwości. Szczegółowy mechanizm tego zjawiska jest złożony [63], jego ważnym elementem jest aktywacja przez Ca 2+ kanałów potasowych regulujących potencjał błonowy, a zarazem biorących udział w mechanizmach plastyczności neuronalnej [64]. Regulowany przez Ca 2+ proces sprzężenia depolaryzacji z egzocytozą neuroprzekaźników chemicznych nagromadzonych w pęcherzykach synaptycznych, zachodzi w części presynaptycznej zakończenia nerwowego. W wyniku depolaryzacji dochodzi do aktywacji VOCC typu N i P/Q i do lokalnego wzrostu wewnątrzkomórkowego stężenia Ca 2+ do poziomu ocenianego na 20-50 μm [65]. Jednak natura i regulacja presynaptycznych sygnałów wapniowych odpowiedzialnych za uwalnianie neuroprzekaźników jest procesem bardziej złożonym, w którym poza wspomnianymi kanałami wapniowymi uczestniczą inne liczne elementy regulacji homeostazy Ca 2+. Jest to mechanizm przyczyniający się do pewnej autonomii zakończeń synaptycznych [66]. W regulacji aktywności kanałów wapniowych oraz w dalszych etapach uwolnienia neuroprzekaźników z pęcherzyków synaptycznych do przestrzeni synaptycznej uczestniczy szereg białek wiążących wapń, pełniących rolę sensorów wapnia, zawierających motyw EF-hand, jak CaM, kalcyklina i NCS-1 lub też, jak wspomniana wyżej synaptotagmina, domenę C2 wiążącą Ca 2+ i fosfolipidy, pierwotnie odkrytą w strukturze kinazy białkowej C [47]. W części postsynaptycznej zakończenia nerwowego, w wyniku pobudzenia receptorów i depolaryzacji, jony Ca 2+ wnikają do komórki przez bramkowane ligandem kanały wapniowe ROC, przez zależne od potencjału kanały Postępy Biochemii 58 (4) 2012 409

wapniowe VOCC, a także są mobilizowane z ER za pośrednictwem receptorów metabotropowych sprzężonych przez białka G z fosfolipazą C i IP 3 R oraz za pośrednictwem RyR w procesie CICR. W efekcie aktywowane są zależne od wapnia szlaki przekazywania sygnału. Jedne z nich prowadzą poprzez potranslacyjną modyfikację (zwłaszcza fosforylację i nitrozylację) białek do wspomnianych powyżej krótkotrwałych (mierzonych w minutach) zmian aktywności neuronów. Istotnym aspektem wapniowej regulacji transmisji synaptycznej jest zależna od Ca 2+ synteza wstecznych neuroprzekaźników w synapsach. Wniknięcie Ca 2+ do części postsynaptycznej aktywuje bowiem zależną od Ca 2+ i CaM neuronalną syntazę tlenku azotu (nnos), co prowadzi do uwolnienia NO [49]. Z kolei efektem aktywacji przez wapń fosfolipazy A 2 jest uwolnienie kwasu arachidonowego oraz jego metabolitów, eikozanoidów, a aktywacja fosfolipazy Cβ w wyniku dalszych przemian doprowadza do syntezy endokannabinoidów [67]. Od dawna sugerowano, że NO, CO i eikozanoidy mogą pełnić rolę wstecznych neuroprzekaźników transsynaptycznych i dyfundując do części presynaptycznej zakończenia synaptycznego regulują uwalnianie glutaminianu, a przez to siłę neurotransmisji pobudzającej [68,69]. Jednak ostatnio uwaga badaczy skupia się głównie na endokannabinoidach [67]. Inną zależną od Ca 2+ specyficzną funkcją komórek nerwowych jest ruch w różnych formach. Takie fundamentalne procesy, jak migracja prekursorów komórek nerwowych, wzrost aksonów, a w mniejszej skali zmiany morfologiczne w aksonach i dendrytach związane z różnicowaniem, uczeniem się i pamięcią oraz regeneracją, są regulowane przez zmiany stężenia Ca 2+ na zewnątrz i wewnątrz komórek i modulację aktywności zależnych od Ca 2+ kinaz białkowych [70]. UDZIAŁ SYGNAŁU WAPNIOWEGO W LTP I FORMOWANIU PAMIĘCI Jedną z najważniejszych funkcji jonów Ca 2+ w komórkach nerwowych jest udział w mechanizmach związanych z uczeniem się i zapamiętywaniem. Większość badaczy jest zgodna, że głównym elementem zapoczątkowującym procesy tworzenia się pamięci jest pobudzenie neurotransmisji glutaminianergicznej, aktywacja NMDAR i napływ Ca 2+ do komórek nerwowych. Uczenie się i zapamiętywanie, procesy o podstawowym życiowym znaczeniu, są od wielu lat obiektem intensywnych badań, jednak ich dokładny mechanizm oraz biochemiczne podstawy nie zostały jeszcze w wystarczający sposób poznane. Wiadomo, że doświadczenia nabywane w czasie nauki wywołują krótkotrwałe zmiany w przekaźnictwie synaptycznym w specyficznych rejonach mózgu, a impulsy te zapoczątkowują kaskadę wewnątrzkomórkowych przemian, które prowadzą do trwałych zmian w połączeniach synaptycznych, co wiązane jest z konsolidacją pamięci. W związku z czasowym rozciągnięciem procesów formowania pamięci, od lat funkcjonują pojęcia pamięci krótkotrwałej (STM, ang. short term memory) oraz pamięci długotrwałej (LTM, ang. long term memory). Uważa się, że pamięć krótkotrwała tworzona jest w ciągu krótkiego czasu od nabycia informacji lub treningu i bazuje na przejściowych modyfikacjach wcześniej istniejących białek, głównie na fosforylacji i defosforylacji enzymów, receptorów lub kanałów jonowych, mogących momentalnie zmieniać wydajność przekaźnictwa synaptycznego [71]. Za rejon mózgu odpowiedzialny za ten typ pamięci u ssaków uważa się hipokamp oraz jego różne odpowiedniki w mózgach innych zwierząt. Pamięć ta może funkcjonować od minut do godzin. Natomiast zależna od syntezy nowych białek pamięć długotrwała jest związana ze zmianami strukturalnymi istniejących już oraz z generacją nowych połączeń synaptycznych [72]. Przechowywana jest ona przez godziny, dni, tygodnie i lata od zarejestrowania informacji. Informacje zapisywane są w różnych rejonach mózgu, głównie w korze, ale dokładny mechanizm tego zapisu oraz miejsca przechowywania informacji nadal nie są w pełni poznane i pozostają przedmiotem badań. W latach 70-tych ubiegłego wieku opisano zjawisko długotrwałego wzmocnienia połączeń synaptycznych w odpowiedzi na krótką stymulację elektryczną, które nazwano LTP, a w niedługi czas potem opisano zjawisko długotrwałego osłabienia synaptycznego, LTD [73,74]. Do indukcji LTP niezbędne jest zadziałanie impulsów elektrycznych o wysokiej częstotliwości, natomiast przy wywołaniu LTD działają impulsy o niskiej częstotliwości, ale czas ich trwania jest dłuższy [75]. Uważa się, że zarówno LTP jak i LTD odzwierciedlają komórkowe i molekularne mechanizmy leżące u podstaw plastyczności synaps zaangażowanej w procesie uczenia się i zapamiętywania i do dziś opisano wiele różnych form tych zjawisk [76]. Najlepiej poznanymi formami LTP i LTD są te, które obserwuje się w rejonie CA1 hipokampa i które zapoczątkowane są aktywacją NMDAR. Indukcję LTP zapoczątkowuje uwalnianie glutaminianu, aktywacja NMDAR i napływ Ca 2+ do neuronów. Podwyższony poziom wewnątrzkomórkowego Ca 2+ razem z kalmoduliną aktywują CaMKII, która może fosforylować podjednostki AMPAR, aktywując je w ten sposób i przyczyniając się do dalszego napływu Ca 2+. Dochodzi do niego albo bezpośrednio przez przepuszczalne dla Ca 2+ receptory pozbawione podjednostki GluR2, lub pośrednio na skutek depolaryzacji błon i aktywacji VOCC [77]. Utrzymanie LTP wymaga przekazania komórkowego sygnału do jądra i uruchomienia syntezy białek. Wykazano, że w czasie LTP ma miejsce zarówno aktywacja szlaku Ras/MAPK/ERK1/2 jak i CaMKIV. Jak wiadomo, aktywacja tych szlaków prowadzi do fosforylacji CREB i aktywacji ekspresji genów. Wzmożoną fosforylację CREB obserwowano od 3 min do 60 min po inicjacji LTP [73]. Dla zainicjowania LTP ważny jest nie tylko napływ Ca 2+ kanałami związanymi z NMDAR. Wykazano, że określone formy LTP obserwowane w wielu rejonach mózgu wymagają również aktywacji mglur. Główną rolę odgrywają tutaj mglur grupy I mglur1 i mglur5 [78]. LTP zależne od mglur w większości przypadków również wymaga wzrostu wewnątrzkomórkowego stężenia Ca 2+, a źródła tego wzrostu mogą różnić się w zależności od formy LTP. Może on wynikać z napływu Ca 2+ przez aktywowane receptory NMDA, AMPA, VSCCs typu L lub kanały TRP (ang. transient receptor potential) oraz uwalniania Ca 2+ z wewnątrzkomórkowych magazynów aktywowanych przez IP 3 [78,79]. 410 www.postepybiochemii.pl

Według obecnej wiedzy, uruchomienie w neuronach LTD związane jest z pamięcią przestrzenną, zapamiętywaniem informacji o nowych obiektach oraz o zmianach ich rozmieszczenia, a także odpowiedzią na stres [74]. Spośród wielu form LTD najważniejszymi wydają się być LTD zależne od NMDAR oraz od mglur. Podobnie jak w przypadku LTP zależnego od aktywacji NMDAR, zainicjowanie LTD wiąże się z napływem Ca 2+ do neuronów postsynaptycznych. O tym czy po napływie Ca 2+ przez kanały związane z NMDAR zainicjowane zostanie LTP czy LTD decyduje wielkość przepływu tego jonu. LTD wymaga niewielkiego wzrostu stężenia Ca 2+, podczas gdy do inicjacji LTP konieczny jest znaczny wzrost, przekraczający określoną krytyczną wartość [75]. Czas utrzymywania się podwyższonego stężenia Ca 2+ również jest czynnikiem decydującym, gdyż niewielkie zmiany w długości trwania pobudzenia mogą spowodować odwrócenie modyfikacji synaptycznej [80]. Sposób w jaki buforowany jest wapń w przedziale postsynaptycznym też może stać się punktem wytyczającym dalszy bieg procesów wewnątrzkomórkowych w kierunku LTD lub LTP [76]. W odróżnieniu od LTP, LTD zależne od NMDAR nie uruchamia aktywacji CaMKII, za to wzrost stężenia Ca 2+ aktywuje kaskadę fosfatazy białkowej, w skład której wchodzi kalcyneuryna, zależna od kompleksu wapń/cam fosfataza serynowo-treoninowa, fosfataza białkowa 1 (PP1) i inhibitor-1, ufosforylowane białko odpowiedzialne za aktywność PP1. Defosforylacja w czasie LTD specyficznych białek jak również defosforylacja podjednostki GluR1 AMPAR w miejscu reszty Ser831, może prowadzić do endocytozy i internalizacji tych receptorów, co dodatkowo podtrzymuje LTD [76]. Jony Ca 2+ są również ważnym elementem LTD zależnego od aktywacji mglur. Najlepiej zbadany jest proces LTD zależnego od mglur w móżdżku, rejonie, gdzie nie zaobserwowano występowania LTP, ale jego występowanie wykazano również w hipokampie, prążkowiu, korze i rdzeniu kręgowym [81]. W móżdżku do aktywacji LTD niezbędna jest równoczesna stymulacja znajdującej się na dendrycie synapsy łączącej komórkę Purkiniego z włóknem pnącym, będącym aksonem neuronu doprowadzającego sygnał do móżdżku oraz synapsy łączącej ją z włóknem równoległym sąsiadującej komórki. Wywołana sygnałem z włókna pnącego depolaryzacja części dendrytycznej powoduje otwarcie VOCC i napływ Ca 2+ do wnętrza neuronu. Z kolei glutaminian uwolniony z zakończenia we włóknie równoległym pobudza mglur grupy I, uruchamiając wewnątrzkomórkową kaskadę prowadzącą do mobilizacji Ca 2+ z otwieranych przez receptory IP 3 magazynów wewnątrzkomórkowych. W móżdżku dominującą rolę w tym procesie odgrywają receptory mglur1. Podwyższenie poziomu Ca 2+ oraz diacylglicerol (DC) powstający obok IP 3 po pobudzeniu mglur1, aktywują kinazę białkową C (PKC), która z kolei fosforyluje resztę Ser880 podjednostki GluR2 AMPAR, co powoduje odłączenie receptora od błony komórkowej, jego endocytozę i internalizację [81]. Hipokampalna forma LTD aktywowanego przez mglur grupy I wydaje się przebiegać niezależnie od wzrostu wewnątrzkomórkowego stężenia Ca 2+ i uruchamiania uwalniania Ca 2+ z magazynów komórkowych oraz aktywacji kinaz białkowych, chociaż wymaga udziału białka G związanego z receptorami mglur1 i mglur5. Jednak dokładny mechanizm hipokampalnej formy LTD uruchamianego przez aktywację mglur grupy I jest wciąż przedmiotem intensywnych badań [81]. OSTRE ZABURZENIA HOMEOSTAZY WAPNIA PROWADZĄCE DO USZKODZENIA I ŚMIERCI NEURONÓW: ROLA W ISCHEMII MÓZGU Utrzymanie wewnątrzkomórkowego stężenia jonów Ca 2+ na niskim poziomie jest warunkiem prawidłowego przekazu sygnału wapniowego. Jest to proces wymagający dużych nakładów energii. Neurony, z powodu masowych przepływów jonów Ca 2+ związanych z aktywnością elektryczną, są szczególnie podatne na zaburzenia metabolizmu energetycznego prowadzące do nieprawidłowości homeostazy tych jonów. Przyczyną ostrych zaburzeń homeostazy Ca 2+ może być także nadmierne pobudzenie neuronów, jak to ma miejsce przy uszkodzeniu ekscytotoksycznym, w którym pośredniczą receptory dla pobudzających aminokwasów [82,83]. W tych warunkach dochodzi do intensywnego napływu jonów Ca 2+ do neuronów przez receptory jonotropowe, zwłaszcza NMDAR, przez VOCC, a także w wyniku odwrócenia kierunku transportu Ca 2+ przez wymiennik NCX [83]. Skutki nieprawidłowości homeostazy Ca 2+ i w konsekwencji niewłaściwego przekazu sygnału wapniowego, mogą się ograniczać do krótkotrwałych lub utrwalonych (np. w formie ognisk padaczkorodnych) zaburzeń czynnościowych komórek nerwowych, lub mogą się przejawić w postaci nekrotycznej lub apoptotycznej śmierci neuronów. W ostro przebiegającym niedokrwieniu mózgu pierwotnym czynnikiem zakłócającym homeostazę Ca 2+ jest deficyt energetyczny, mogący doprowadzić do wyłączenia pomp (ATPaz) sodowych i wapniowych oraz odwrócenia trybu pracy transporterów błonowych, przemieszczenia glutaminianu do przestrzeni synaptycznej, pobudzenia NMDAR i niekontrolowanego napływu jonów Ca 2+ do neuronów zgodnie z mechanizmami ekscytotoksyczności (Ryc. 1B). Wg obecnych poglądów zaburzenia homeostazy wapnia i toksyczność pobudzeniowa, to nierozdzielnie ze sobą wiązane elementy ogólnej patogenezy uszkodzenia neuronów w ostrych stanach patologicznych mózgu [83-85], obejmującej ponadto stres oksydacyjny, dysfunkcję mitochondriów i ER oraz inne procesy związne z nekrotyczną lub apoptotyczną śmiercią komórek. Aspekt historyczny, a także szczegóły klasycznej hipotezy o roli wapnia w ischemii mózgu na tle innych mechanizmów patogennych, zostały obszernie omówione poprzednio [85]. W wyniku niedokrwienia mózgu i rozwijających się zaburzeń energetycznych oraz nadmiernego pobudzenia receptorów dla glutaminianu, w neuronach obserwuje się zróżnicowany obraz zmian w homeostazie wapnia (Ryc. 1B). Ta różnorodność jest odbiciem istnienia różnych form niedokrwienia mózgu (ogniskowego i globalnego, z odwracalnym lub nieodwracalnym upośledzeniem krążenia krwi) i różnorodnych dodatkowych uwarunkowań patofizjologicznych jak kwasica, hiperglikemia, przewlekła hipoksja. Udokumentowany w Postępy Biochemii 58 (4) 2012 411

licznych publikacjach [85] wzrost wewnątrzkomórkowego stężenia Ca 2+ dotyczy zarówno okresu niedokrwienia, jak i po niedokrwieniu (ten ostatni jest określany jako wtórny wzrost stężenia wapnia). Wynika on zarówno z napływu jonów wapnia z przestrzeni zewnątrzkomórkowej przez ROC (zwłaszcza NMDAR), przez VOCC i na skutek odwrócenia trybu pracy wymiennika NCX, jak i mobilizacji kationu z zasobów wewnątrzkomórkowych (Ryc. 1B). Wykazano jednak, że neurotoksyczność jest skorelowana nie tyle z poziomem wzrostu stężenia jonów wapnia w neuronach, co raczej z całkowitym obciążeniem komórek napływającymi jonami wapnia, przy czym istotne znaczenie patogenne ma napływ Ca 2+ za pośrednictwem NMDAR, podczas gdy aktywacja VOCC mało uszkadza neurony [83]. Istnieją jednak dane toksykologiczne, wskazujące na patogenną rolę nadmiernej mobilizacji Ca 2+ z ER. Wykazano silne toksyczne działanie na neurony wywołanego przez tapsygarginę niekontrolowanego wyrzutu Ca 2+ z ER [86] oraz rolę tego mechanizmu w działaniu neurotoksyn środowiskowych, takich jak polichlorowane bisfenole [87]. Kluczowe znaczenie w tych zjawiskach może odgrywać stres ER (Ryc. 3 i 4). Udział opróżnienia zasobów Ca 2+ w ER i związanych z nim mechanizmów molekularnych w uszkodzeniu neuronów mózgu był już od dawna sugerowany [88]. Rycina 3. Wybrane mechanizmy uszkodzenia neuronów zależne od Ca 2+, rozwijające się w wyniku ostrych zaburzeń homeostazy Ca 2+. Niekontrolowany wzrost wewnątrzkomórkowego stężenia Ca 2+ zaburza przekazywanie sygnału w neuronach, prowadzi do aktywacji wrażliwych na wapń enzymów katabolicznych jak protezy, lipazy i endonukleazy, uszkadza strukturę błon i DNA, indukuje stres oksydacyjny, zaburza funkcję mitochondriów i ER. W efekcie dochodzi do uszkodzenia i śmierci neuronów. Szczegółowe wyjaśnienia w tekście. Rycina 4. Zaburzenia homeostazy Ca 2+ wywołane przez niedokrwienie mózgu indukują dysfunkcję mitochondriów i ER, co prowadzi do śmierci neuronów o charakterze kontinuum nekrotyczno-apoptotycznego. Pobudzenie NMDAR i mglur grupy I przez uwolniony z komórek glutaminian (Glu) prowadzi do pierwotnego wzrostu stężenia Ca 2+, co aktywuje neuronalną syntazę NO (nnos) i indukuje kaskady zaburzeń uszkadzających neurony, wymienione na Ryc. 3. Nagromadzenie Ca 2+ w mitochondriach aktywuje megakanały, co wywołuje uwolnienie z nich białek proapoptotycznych, cytochromu c i AIF oraz zwiększoną produkcją reaktywnych form tlenu (ROS). Zwiększona produkcja NO i ROS aktywuje kanały TRPM 2/7 i powoduje wtórny wzrost stężenia Ca 2+. Opróżnienie zasobów Ca 2+ w ER, w którym pośredniczą receptory IP 3 (IP 3 R) i rianodynowe (RyR) indukuje stres ER. O przewadze nekrozy lub apoptozy decyduje stan energetyczny neuronu. Zaburzenia homeostazy wapnia, prowadzące do wzrostu stężenia Ca 2+ w cytosolu, aktywują wrażliwe na Ca 2+ enzymy kataboliczne, proteazy i lipazy (Ryc. 3), co wywołuje uszkodzenie błon oraz zmiany w cytoszkielecie komórki, a aktywacja endonukleaz prowadzi do uszkodzenia DNA [83,84]. Stres oksydacyjny jest niezwykle ważnym elementem patogenezy wywołanego przez niedokrwienie uszkodzenia komórek nerwowych, w którym pośredniczy wapń [89]. Zaburzenia homeostazy wapnia i niekontrolowany wzrost stężenia Ca 2+ w komórkach aktywują produkcję reaktywnych form tlenu, co z kolei potęguje zaburzenia homeostazy wapnia [85]. Ponadto istnieją wspólne 412 www.postepybiochemii.pl