Aleksandra Duda-Chodak

Uniwersytet Rolniczy im. H. Kołłątaja w Krakowie Wydział Technologii Żywności Katedra Technologii Fermentacji i Mikrobiologii Technicznej Aleksandra Duda-Chodak Załącznik II Autoreferat

1. Imię i Nazwisko: Aleksandra Duda-Chodak Miejsce pracy: Uniwersytet Rolniczy w Krakowie, Wydział Technologii Żywności, Katedra Technologii Fermentacji i Mikrobiologii Technicznej, ul. Balicka 122, 30-149 Kraków 2. Posiadane dyplomy, stopnie naukowe/ artystyczne - z podaniem nazwy, miejsca i roku ich uzyskania oraz tytułu rozprawy doktorskiej. 1992-1997 studia magisterskie, kierunek Biologia, Wydział Biologii i Nauk o Ziemi, Uniwersytet Jagielloński, Kraków, czerwiec 1997 dyplom magistra biologii, Wydział Biologii i Nauk o Ziemi, Uniwersytet Jagielloński, Kraków. Praca magisterska pt. Fenotyp leukocytów w przebiegu choroby oparzeniowej dzieci, promotor prof. dr hab. Juliusz Pryjma, 1997-1998 studia doktoranckie, Wydział Biologii i Nauk o Ziemi, Uniwersytet Jagielloński, Kraków, 1998-2002 studia doktoranckie, Wydział Lekarski, Collegium Medicum, Uniwersytet Jagielloński, Kraków, 19.04.2002 dyplom doktora nauk biologicznych, Wydział Lekarski, Collegium Medicum UJ, Kraków. Rozprawa doktorska pt. Ekspresja cytokin i rola reaktywnych form tlenu w uszkodzeniu wywołanym ischemią-reperfuzją w śluzówce żołądka szczura, promotor pracy: prof. dr hab. med. Stanisław J. Konturek. 3. Informacje o dotychczasowym zatrudnieniu w jednostkach naukowych/ artystycznych. 1998-2002 starszy referent inżynieryjno-techniczny, Katedra Fizjologii, Wydział Lekarski CMUJ. 2003-2006 asystent naukowo-dydaktyczny, Katedra Technologii Fermentacji i Mikrobiologii Technicznej, Wydział Technologii Żywności, Akademia Rolnicza im. Hugona Kołłątaja w Krakowie. 2006 - obecnie adiunkt naukowo-dydaktyczny, Katedra Technologii Fermentacji i Mikrobiologii Technicznej, Wydział Technologii Żywności, Akademia Rolnicza (od 2008 roku Uniwersytet Rolniczy) im. Hugona Kołłątaja w Krakowie. 1

4. Wskazanie osiągnięcia wynikającego z art. 16 ust. 2 ustawy z dnia 14 marca 2003 r. o stopniach naukowych i tytule naukowym oraz o stopniach i tytule w zakresie sztuki (jednolity tekst Dz. U. grudzień 2014, poz. 1852) Osiągnięciem naukowym wynikającym z art. 16 ust. 2 ustawy z dnia 14 marca 2003 roku o stopniach naukowych i tytule naukowym oraz o stopniach i tytule w zakresie sztuki i stanowiącym podstawę do ubiegania się o stopień naukowy doktora habilitowanego jest monografia pt. Interakcje związków przeciwutleniających występujących w roślinach oraz suplementach diety z bakteriami reprezentującymi mikrobiotę jelitową człowieka, której jestem autorem. Praca została opublikowana w 2015 roku w Zeszytach Naukowych Uniwersytetu Rolniczego im. Hugona Kołłątaja w Krakowie, w serii Rozprawy, numer 525, zeszyt 402, Wydawnictwo Uniwersytetu Rolniczego w Krakowie. Recenzenci rozprawy : prof. dr hab. Zbigniew Czarnecki, Uniwersytet Przyrodniczy w Poznaniu dr hab. inż. Agnieszka Filipiak-Florkiewicz, Uniwersytet Rolniczy w Krakowie Omówienie celu naukowego w/w rozprawy, jak również osiągniętych wyników wraz z omówieniem ich ewentualnego wykorzystania Wprowadzenie i cel naukowy Od wielu lat wiadomo o istotnej roli związków przeciwutleniających w zapobieganiu lub wspomaganiu leczenia różnych chorób, powszechne są także badania wskazujące na ich zdolność do hamowania wzrostu mikroorganizmów patogennych. Doniesienia te sprawiają, że coraz częściej sięgamy po żywność wzbogacaną lub po suplementy diety zawierające różne przeciwutleniacze, w tym polifenole. Jak dotąd jednak nie prowadzono zbyt wielu badań oceniających jak składniki przeciwutleniające, obecne w żywności czy suplementach w znacznych stężeniach, wpływają na skład jakościowy i ilościowy prawidłowej mikrobioty jelitowej (ang. intestinal microbiota, IM). Wykazano natomiast, że zaburzenia w funkcjonowaniu IM uczestniczą w patogenezie licznych chorób. Od dawna przyjmuje się, że mikrobiota jelitowa pełni istotną rolę w prawidłowym funkcjonowaniu organizmu, między innymi jest wyposażona w olbrzymi zestaw enzymów odpowiedzialnych za różnorodne przemiany składników pokarmowych, które docierają do jelita. Z powodu ogromnej różnorodności gatunków tworzących IM u poszczególnych osobników, profil powstających metabolitów oraz ich końcowy wpływ na organizm są bardzo zmienne w populacji ludzkiej. Często zdarza się, że jedynie produkt bakteryjnego metabolizmu danego składnika może 2

ulec wchłonięciu w jelicie i wpłynąć korzystnie na zdrowie człowieka. Brak odpowiednich gatunków bakterii w mikroflorze osobnika oznacza, że dany związek, mimo spożycia, nie będzie mógł wywrzeć oczekiwanego efektu. Z drugiej strony, zdarza się też, że na skutek metabolizmu bakteryjnego z obojętnego składnika obecnego w żywności powstają pochodne negatywnie oddziałujące na zdrowie konsumenta. Dlatego też, głównym celem prezentowanej monografii było poznanie interakcji pomiędzy przeciwutleniającymi składnikami roślin i suplementów diety a bakteriami, będącymi przedstawicielami mikroflory jelita ludzkiego. W pracy sformułowano 3 cele szczegółowe: (1) ocena potencjału antyoksydacyjnego oraz składu polifenolowego wybranych surowców roślinnych i suplementów diety o deklarowanym prozdrowotnym działaniu na organizm człowieka; (2) określenie wpływu związków polifenolowych zawartych w ekstraktach z badanych surowców i suplementach diety, a także w postaci czystych związków polifenolowych, na wybrane gatunki mikrobioty jelitowej; (3) zbadanie wpływu poszczególnych gatunków bakterii jelitowych na potencjał antyoksydacyjny i stężenie wybranych związków przeciwutleniających występujących w badanych surowcach. Sformułowano następujące hipotezy badawcze: 1) naturalne składniki przeciwutleniające i związki polifenolowe zawarte w surowcach roślinnych i suplementach diety nie wywierają hamującego wpływu na bakterie będące przedstawicielami fizjologicznej mikrobioty jelitowej, 2) gatunki bakterii, stanowiące fizjologiczną mikrobiotę jelita ludzkiego, na skutek swojego metabolizmu zwiększają potencjał antyoksydacyjny składników polifenolowych obecnych w surowcach roślinnych i suplementach diety. Przebieg doświadczeń i metodyka badań Formułując hipotezy, przyjęto założenie wyjściowe, że badane surowce roślinne oraz suplementy diety zawierają składniki przeciwutleniające, w tym polifenole, w znaczących stężeniach. Aby zweryfikować to założenie oraz poszczególne hipotezy, na pierwszym etapie badań określono wyjściowy potencjał antyoksydacyjny [Duda-Chodak i in. 2011] oraz skład polifenolowy [Duda-Chodak i in. 2010, 2011] surowców roślinnych i komercyjnie dostępnych suplementów diety. Jako źródło polifenoli i przeciwutleniaczy wybrano surowce o znanych właściwościach prozdrowotnych i/lub długoletniej tradycji stosowania w medycynie naturalnej różnych krajów: świeże owoce maliny (M), czarnego bzu (BEZ), żurawiny (Z), borówki brusznicy (B), pigwowca japońskiego (P) i derenia (D), suszone owoce goji (G) i cytryńca chińskiego (CCH), czerwoną cebulę (CC), czosnek niedźwiedzi (CN), pokrzywę (PO), zieloną herbatę (GT) i nasiona soi (S), a także suplementy diety o deklarowanym 3

prozdrowotnym działaniu na organizm człowieka: spirulinę (SP, wysuszona biomasa sinic Spirulina platensis), Citrosept (CIT, ekstrakt z miąższu i pestek grejpfruta) i sok z noni (NO). Wszystkie wymienione surowce i suplementy zawierają antyoksydanty, w tym różne polifenole, i są wykorzystywane (często równocześnie) do leczenia rozmaitych schorzeń jako preparaty dostępne bez recepty, a zatem poza wszelką kontrolą. Ponieważ ich dawkowanie, sposób przyrządzania i stosowania zależą od leczonego schorzenia oraz od tradycji w danym regionie świata, postanowiono w celu ujednolicenia i uproszczenia porównań uzyskanych wyników przygotować z wszystkich surowców jednakowe 10% ekstrakty etanolowe (nie dotyczyło to gotowych suplementów w płynie, tj. soku z noni i Citroseptu). W doświadczeniach zostały także zastosowane, w postaci pojedynczych związków, najczęściej spożywane z dietą polifenole: (+)-katechina (CAT), kwercetyna (Q), rutyna (RUT), naringenina (N), naringina (NR), hesperydyna (HR), hesperetyna (H), kemferol (KMP) i florydzyna (PHL), będące przedstawicielami różnych klas flawonoidów, oraz rezweratrol (RS) reprezentant stilbenów. Polifenole stosowano jako roztwory w DMSO o stężeniu 25 mg/ml, z wyjątkiem kwercetyny i kemferolu, dla których stężenie wynosiło 5 mg/ml. Drugi etap prac miał na celu określenie wpływu badanych surowców oraz poszczególnych związków polifenolowych na wybrane gatunki mikrobioty jelitowej. Do doświadczeń wykorzystano czyste kultury siedmiu różnych gatunków, będących przedstawicielami najważniejszych rodzajów bakterii tworzących fizjologiczną mikrobiotę jelitową człowieka: Escherichia coli (DSM 1116, EC), Bacteroides galacturonicus (DSM 3978, BAC), Eubacterium cylindroides (DSM 3983, EUB), Bifidobacterium catenulatum (DSM 16992, BF), Enterococcus caccae (DSM 19114, EN), Lactobacillus sp. (DSM 20059, LCB) oraz Ruminococcus gauvreauii (DSM 19829, RUMI). Wszystkie badane szczepy zostały zakupione w niemieckiej kolekcji czystych kultur mikroorganizmów i linii komórkowych DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH) i zgodnie z kartami charakterystyk zostały one wyizolowane z jelita ludzkiego. Wpływ ekstraktów i suplementów diety oraz pojedynczych związków polifenolowych na poszczególne bakterie oceniano na podstawie zmian liczebności ich komórek po 24-godzinnej inkubacji (37 C) z ekstraktami, suplementami lub polifenolami dodanymi do medium w różnym stężeniu. Stężenie końcowe ekstraktów i suplementów wynosiło 1,0, 2,5 i 5,0%, zaś stężenie polifenoli wynosiło 20, 100 oraz 250 µg/ml (lub 4, 20 oraz 50 µg/ml dla kwercetyny i kemferolu). Liczebność komórek określano na podstawie pomiarów zmętnienia zawiesiny przy użyciu densytometru wyskalowanego w jednostkach McFarlanda. W przypadku wykazania działania hamującego rozwój bakterii wyznaczano wartość minimalnego stężenia hamującego (MIC) dla danego składnika. Ostatni etap prac dotyczył oceny wpływu bakterii jelitowych na związki polifenolowe. Aby ocenić, jak przedstawiciele mikrobioty jelita ludzkiego wpływają na składniki przeciwutleniające 4

obecne w diecie, oznaczono zmiany potencjału antyoksydacyjnego (AOX) w podłożach z dodatkiem polifenoli, ekstraktów roślinnych i suplementów diety po inkubacji z poszczególnymi gatunkami bakterii jelitowych. Dla ułatwienia porównań między poszczególnymi drobnoustrojami lub badanymi substancjami wprowadzono pojęcie współczynnika interakcji (WI), zdefiniowanego jako stosunek AOX medium z bakteriami do AOX takiego samego medium (tzn. ta sama pożywka, takie samo stężenie związku polifenolowego/ekstraktu, te same warunki inkubacji), ale bez dodatku bakterii. WI jest równy 1 jeśli bakterie w żaden sposób nie wpływają na zdolność zmiatania rodnika ABTS przez obecne w tej pożywce związki. Wartości WI>1 oznaczają, że pod wpływem dodanego gatunku bakterii doszło do takich zmian w składzie pożywki, które zwiększyły zdolność wygaszania rodnika, a wartość WI<1 zmiany pod wpływem bakterii zmniejszyły potencjał antyoksydacyjny. Aby ustalić, czy wykazane zmiany potencjału antyoksydacyjnego są zależne od przemian związków polifenolowych obecnych w badanych próbach pod wpływem bakterii jelitowych, zbadano zmiany w stężeniu najważniejszych związków polifenolowych pod wpływem bakterii (metodą HPLC) [Duda-Chodak i in. 2010]. Wyniki i dyskusja Spośród badanych związków polifenolowych najwyższy potencjał antyoksydacyjny wykazały kemferol, naringenina i rezweratrol (wszystkie powyżej 4000 mmol równoważników troloksu (TE)/100 g substancji). Słabszymi zmiataczami rodnika ABTS okazały się kwercetyna i (+)-katechina. Najniższy potencjał przeciwrodnikowy miały glikozydy hesperydyna (578,0±3,5 mmol TE/100 g) i naringina (881,0±12,1 mmol TE/100 g). Porządkując polifenole analizowane w tej pracy w kolejności rosnącego potencjału przeciwrodnikowego (wyrażonego w mmol TE/mol), uzyskano szereg: HR < H < NR < RS CAT < PHL < N Q KMP RUT. W prezentowanej pracy przedyskutowano wpływ budowy chemicznej na zdolność wygaszania różnych rodników. Stwierdzono, że kluczowe znaczenie dla zdolności zmiatania rodnika ABTS przez dany związek ma równoczesna obecność grupy OH w pozycji C4, C5 i C7 oraz grupy ketonowej przy C4. Wśród analizowanych surowców na szczególną uwagę zasługuje Citrosept, czyli gotowy, komercyjny ekstrakt z miąższu i pestek grejpfruta. Bardzo wysoka aktywność antyoksydacyjna (21269,7±3601,1 mg troloksu/100 ml) tego suplementu diety korespondowała z dużą zawartością polifenoli ogółem (2577,2±14,7 mg w przeliczeniu na katechinę/100 ml). Analiza profilu polifenoli w Citrosepcie wykazała, że najważniejszymi składnikami są naringina (1018,0±131,1 mg/l) oraz jej aglikon naringenina (19,8±12,3), a zatem składniki charakterystyczne dla grejpfrutów. Na uwagę zasługuje także duże stężenie hesperydyny (463,0±96,9 mg/l) i obecność jej aglikonu hesperetyny (19,9±1,07). W Citrosepcie wykryto również kwercetynę oraz kwasy fenolowe (głównie p-kumarowy, chlorogenowy i galusowy), choć obecne w znacznie mniejszym stężeniu. 5

Na tle badanych surowców wyróżniał się także ekstrakt z zielonej herbaty, o bardzo wysokiej aktywności antyoksydacyjnej (10998,3±282,3 mg troloksu/100 ml) i zawartości polifenoli ogółem (9549,0±46,0 mg katechiny/100 g liści). Analiza HPLC wykazała, że stężenie (-)-epigalokatechiny w herbacie użytej do badań było duże i wynosiło 5022,3 mg w przeliczeniu na 100 g liści, (-)-epikatechiny 1116,5 mg/100 g, a galusanu (-)-epigalokatechiny 2876,1 mg/100 g (w sumie wykryto 9064,3 mg flawanoli/100 g herbaty). W analizowanej zielonej herbacie wykryto ponadto obecność takich związków polifenolowych, jak kwas galusowy, apigenina, kemferol, rutyna, glukozyd kwercetyny i kwercetyna. Jako stosunkowo bogate źródło przeciwutleniaczy na uwagę zasługują także sok z noni (424,5±39,5 mg troloksu/100 ml) oraz ekstrakty z derenia, pigwowca, czarnego bzu i czosnku niedźwiedziego (259 283 mg troloksu/100 ml). Z kolei bardzo niską aktywnością przeciwrodnikową charakteryzowały się ekstrakty ze spiruliny (24,1±1,2), czerwonej cebuli (43,2±2,9), cytryńca chińskiego (54,0±4,1) i soi (66,0±9,0). Bardzo dużą zawartość polifenoli, oprócz Citroseptu i ekstraktu z zielonej herbaty, wykazano dla ekstraktu z czarnego bzu (883,1±119 mg katechiny/100 g wyjściowego surowca). W owocach tych dominowały flawonoidy, w szczególności rutyna (89,32±30,14 mg/100 g ś.m.), procyjanidyna B1 (ok. 26,6), florydzyna (ok. 13,5) i izokwercetyna (ok. 10,3). Wykryto także kwasy fenolowe, przede wszystkim kwas galusowy (ok. 11 mg/100 g) oraz kwasy p-kumarowy, chlorogenowy i elagowy. Dużą zawartością polifenoli cechowały się także ekstrakty z jagód goji i ziela pokrzywy (odpowiednio 810,6 i 618,9 mg katechiny/100 g wyjściowego surowca). Najmniej polifenoli ogółem oznaczono w ekstrakcie z czerwonej cebuli (90,5 mg katechiny/100 g), który miał także jedną z najniższych spośród badanych surowców aktywność antyoksydacyjną. Wyniki prezentowanej pracy wykazały zaskakująco silny, dawkozależny wpływ etanolu na niektóre z badanych gatunków bakterii. W przypadku większości badanych bakterii niskie stężenia (0,1 1,0%) lekko stymulowały wzrost drobnoustrojów, choć tylko w przypadku E. cylindroides (końcowe stężenie etanolu 0,1 1,0%), Lactobacillus sp. (stężenie 1%) oraz B. galacturonicus (0,4% i 1%) efekt był istotny statystycznie. Przy wyższych stężeniach dodatek etanolu do medium powodował zahamowanie wzrostu wszystkich badanych bakterii, choć w różnym stopniu. Najmocniejszy, o zupełnie niespodziewanej sile, efekt inhibitorowy zanotowano dla B. catenulatum już przy stężeniu 2% EtOH liczebność populacji malała do niespełna 30% wartości kontrolnej, zaś obecność w medium 3% i więcej etanolu powodowała zmniejszenie liczebności populacji tej bakterii o co najmniej 95%. Wzrost E. cylindroides w obecności 3% etanolu był zahamowany o nieco ponad 30%, zaś przy stężeniu 5% EtOH całkowicie. Z kolei EC i BAC przeżywały w stężeniu 5% EtOH, jednak liczebność ich populacji była niższa prawie 10-krotnie w porównaniu z kontrolą. Wykazano, że kwercetyna i kemferol już w stężeniu 20 µg/ml działały hamująco na wszystkie badane gatunki bakterii, przy czym w przypadku BF i EN siła hamowania była 6

porównywalna do efektu działania kontrolnego antybiotyku chloramfenikolu. Naringenina działała bakteriobójczo wobec EN, RUMI, LCB, BAC i BF, a bakteriostatycznie na pozostałe bakterie, jednak dopiero w stężeniu powyżej 100 µg/ml. Hesperetyna w najwyższym stężeniu ograniczała wzrost wszystkich badanych gatunków z wyjątkiem LCB, przy czym przeważnie było to zmniejszenie liczebności populacji o kilkanaście procent w stosunku do kontroli pozytywnej, czyli liczebności bakterii w medium bez polifenolu. Bakteriostatyczny efekt hesperetyny był wyraźnie widoczny w przypadku Ruminococcus i Enterococcus, a liczebność populacji tych bakterii po zastosowaniu 250 µg hesperetyny/ml wynosiła odpowiednio 27% i 38% wartości kontrolnej. E. cylindroides to jedyna bakteria, spośród badanych, niewrażliwa na rezweratrol. Wobec pozostałych bakterii związek ten działał bakteriobójczo (EN, RUMI, LCB, BAC) lub bakteriostatycznie (EC, BF) i to już w stężeniu 100 µg/ml. Ani (+)-katechina, ani rutyna nie wpływały znacząco na badane bakterie, z wyjątkiem E. caccae, którego liczebność była nieznacznie ograniczona w obecności tych związków. Z kolei florydzyna powodowała lekką stymulację wzrostu LCB, BF, EC i EUB, a efekt inhibitorowy wykazywała jedynie wobec EN. Wyznaczone wartości MIC dla poszczególnych polifenoli w odniesieniu do konkretnych gatunków wahały się od 20 do ponad 250 µg/ml i były z reguły wyższe od MIC dla chloramfenikolu. Porównując budowę chemiczną badanych polifenoli, zaobserwowano kilka ciekawych prawidłowości. Stwierdzono, że dla właściwości przeciwbakteryjnych badanych związków kluczowa jest jednoczesna obecność niepodstawionych grup OH w pozycji C5, C7 i C4 oraz grupy ketonowej przy C4. Nie stwierdzono, by obecność grupy OH przy C3 oraz wiązania podwójnego C2=C3 znacząco wpływała na aktywność antybakteryjną flawonoidów. Potwierdzono natomiast, że aglikony są silniejszymi inhibitorami niż ich glikozydy, tracące potencjał antybakteryjny prawdopodobnie na skutek zawady sterycznej, jaka występuje po przyłączeniu cząsteczek cukrów. Tę wzmożoną aktywność aglikonów należy mieć na uwadze w przypadku przyjmowania związków polifenolowych w postaci preparatów farmaceutycznych, gdzie związki te występują w wysokich stężeniach i głównie w postaci aglikonów, podczas gdy w surowcach roślinnych dominują formy glikozydowe. Dokładne mechanizmy działania polifenoli na poszczególne bakterie nie zostały jak dotąd rozpoznane. Bakterie zawierają metaloenzymy, a ponieważ flawonoidy silnie wiążą jony metali, ich działanie może doprowadzić do różnych zaburzeń metabolicznych (zahamowania enzymów, upośledzenia funkcji kanałów jonowych) lub niedoboru żelaza w przewodzie pokarmowym, co wpłynie na wrażliwsze populacje bakteryjne i zmieni skład mikrobioty jelitowej. Wśród innych proponowanych mechanizmów aktywności bakteriobójczej flawonoidów należy wymienić zahamowanie aktywności enzymów i generowanie reaktywnych form tlenu przez EGCG czy zahamowanie aktywności gyrazy DNA przez kwercetynę [Cushnie i Lamb 2005, Boots i in. 2008]. W związku z tym nadmierna ilość polifenoli, jakie dotrą do jelita, może spowodować zahamowanie wzrostu i zmniejszenie liczebności dobroczynnej, pożytecznej części mikrobioty, 7

która odpowiada za biokonwersję składników diety oraz zwiększenie ich biodostępności i bioprzyswajalności. Z tego powodu suplementacja diety preparatami zawierającymi wysokie stężenia pojedynczych składników, zwykle w formie aglikonów, może zamiast pomóc wywołać efekt niekorzystny dla zdrowia. Szczególnie silny hamujący wpływ na pożyteczne bakterie z rodzaju Lactobacillus wykazano dla rezweratrolu i naringeniny, a na bakterie Bifidobacterium dla kwercetyny. O negatywnym wpływie polifenoli należy także pamiętać, przyjmując leki, gdyż wiele polifenoli wchodzi w interakcję z enzymami odpowiadającymi za metabolizm ksenobiotyków, głównie z cytochromem P450 (CYP3A4), powodując zmniejszenie lub zwiększenie siły oddziaływania leku na organizm, co w każdym przypadku może być niebezpieczne [Ho i in. 2001]. Wpływ ekstraktów był znacznie mniej spektakularny niż oczyszczonych polifenoli, ze względu na złożoną matrycę żywności oraz mniejsze stężenia związków w medium. Poszczególne rośliny i preparaty wywierały różnorodny wpływ od stymulującego, przez neutralny, bakteriostatyczny, aż po bakteriobójczy w zależności od gatunku bakterii oraz zastosowanego stężenia. Najmniej wrażliwy na działanie badanych ekstraktów okazał się R. gauvreauii (RUMI). Jedynie po zastosowaniu Citroseptu oraz ekstraktu z cytryńca chińskiego uzyskano zahamowanie wzrostu tej bakterii. W przypadku RUMI zwiększenie liczebności można uzyskać poprzez dodatek bioaktywnych składników zawartych w spirulinie, czerwonej cebuli, jagodach goji, czarnym bzie oraz soku z noni. Z kolei wobec E. caccae wszystkie badane ekstrakty, z wyjątkiem spiruliny w stężeniu 1 2,5%, wykazywały działanie bakteriostatyczne. Dość wrażliwym gatunkiem był także E. cylindroides, którego wzrost hamowała większość badanych ekstraktów, z wyjątkiem wyciągów z derenia i pokrzywy w stężeniu 5% (stymulacja wzrostu). Uzyskane wyniki mają wartość aplikacyjną, gdyż wiele firm farmaceutycznych czyni starania, by w niedalekiej przyszłości wprowadzić na rynek preparaty zaprojektowane tak, aby docelowo zmniejszyć lub zwiększyć liczebność konkretnej grupy drobnoustrojów wchodzących w skład naszej mikrobioty. Dzięki temu można będzie skuteczniej prowadzić profilaktykę otyłości, cukrzycy i niektórych nowotworów czy leczyć choroby metaboliczne lub przewlekłe w obrębie przewodu pokarmowego (nietolerancje pokarmowe, IBD, chorobę Crohna). Zgodnie z wynikami uzyskanymi w przeprowadzonych badaniach, w celu wzbogacenia mikrobioty jelitowej w populację B. galacturonicus można wykorzystać bioaktywne składniki pokrzywy, maliny, żurawiny, derenia, czerwonej cebuli oraz jagód goji. Liczebność B. catenulatum natomiast można zwiększyć poprzez suplementację diety sokiem z noni, zaś do stymulacji wzrostu Lactobacillus sp. można wykorzystać składniki bioaktywne z pigwowca, czosnku niedźwiedziego, pokrzywy, brusznicy, soi, zielonej herbaty, Citroseptu, jagód goji, czarnego bzu lub noni. Surowce te mogą być zatem z powodzeniem stosowane do jogurtów jako dodatki smakowe, a zarazem wzbogacające te artykuły w naturalne związki przeciwutleniające. Do produktów zawierających żywe kultury bakterii z rodzaju 8

Lactobacillus nie zaleca się natomiast dodawania ekstraktów z owoców żurawiny, cytryńca chińskiego i z cebuli ani też tych materiałów roślinnych w postaci liofilizowanej czy suszonej. Cytryniec chiński (CCH) jako jedyny spośród ocenianych surowców hamował wzrost wszystkich badanych drobnoustrojów jelitowych, a wyznaczona wartość MIC była równa lub większa od 5%, co stwarza możliwość jego zastosowania do eliminacji niepożądanych gatunków mikrobioty jelitowej, przed suplementacją gatunkami pożądanymi. Drugim skutecznym inhibitorem okazał się Citrosept. Co prawda, suplement ten nie wykazywał istotnego wpływu na wzrost B. catenulatum, a w sposób dawkozależny stymulował wzrost Lactobacillus sp., jednak wobec pozostałych badanych gatunków działał bakteriostatycznie (EN, RUMI, EC, BAC) lub bakteriobójczo (EUB), powodując ograniczenie liczebności bakterii (do poziomu stanowiącego od 2% kontroli w przypadku EUB do 85% kontroli dla RUMI), a wartość MIC wyniosła 5%. Silne działanie inhibitorowe wykazano także dla ekstraktu z owoców pigwowca japońskiego wobec EUB i BAC, z wartościami MIC odpowiednio 2,5 i 5%. Brak negatywnego wpływu na LCB oraz bakteriostatyczny wpływ na EC i EN czyni ten surowiec bardzo interesującym dla przetwórstwa i przemysłu farmaceutycznego. Analiza uzyskanych wyników potencjału antyoksydacyjnego podłoży wzbogacanych związkami polifenolowymi lub ekstraktami roślinnymi po inkubacji z/bez bakterii pozwoliła na rozpoznanie kilku typów przemian, które dokładnie przedyskutowano w rozprawie. Wykazano między innymi, że w prostym podłożu, o niskim bazowym AOX (jak bulion odżywczy dla Escherichia coli) w zależności od rodzaju dodanego czystego polifenolu i jego stężenia, następował wzrost potencjału, a zanotowane wartości końcowe AOX kształtowały się w zakresie od ok. 108% do nieco ponad 553% wartości wyjściowej. W przypadku wzbogacania ekstraktami lub preparatami zwiększenie AOX było znacznie wyższe, uzyskano wartości od ok. 117% do prawie 1431% wyjściowego potencjału antyoksydacyjnego oznaczonego dla tego medium. W chwili, gdy do doświadczeń stosowano bardziej złożone media, o wyższym bazowym AOX, różnice wywołane dodatkiem polifenolu lub ekstraktu nie były już tak spektakularne. Nadal, co prawda, następował wzrost potencjału o kilkanaście do kilkudziesięciu procent, ale wartości końcowe nie przekraczały więcej niż 2,5- i 3,5-krotnie (odpowiednio dla pojedynczych polifenoli i ekstraktów) wartości bazowej. W wielu przypadkach zaobserwowano, że przy niskich stężeniach dodatków polifenoli (w postaci roztworu czystego związku lub ekstraktu/preparatu) potencjał antyoksydacyjny medium wzbogacanego był niższy niż kontrolnego. Oznacza to, że doszło do reakcji pomiędzy polifenolami a składnikami medium, co doprowadziło do zablokowania grup uczestniczących w zmiataniu rodnika ABTS. Tego typu zmiany obserwowano między innymi w przypadku doświadczeń z E. caccae, B. catenulatum oraz E. cylindroides. W miarę wzrostu stężenia polifenolu lub ekstraktu, potencjał AOX zwykle się zwiększał, co odpowiada reakcjom wiązania polifenoli z proteinami opisanym przez Le Bourvellec i Renard [2012]. Reakcje te mogą być odwracalne lub 9

nieodwracalne. Do połączeń nieodwracalnych należą m.in. wiązania kowalencyjne między polifenolem a makrocząsteczką. Połączenia odwracalne to przede wszystkim niekowalencyjne oddziaływania, międzycząsteczkowe, które mimo swojej słabej siły mogą prowadzić do wytrącania białek przez polifenole i zaburzenia aktywności enzymów (co z kolei może prowadzić do zahamowania wzrostu bakterii). Skutki interakcji polifenol-makrocząsteczka zależą od proporcji między tymi składnikami. Przy niskiej zawartości polifenoli w stosunku do cząsteczek białek powstają kompleksy rozpuszczalne. Wraz ze wzrostem zawartości polifenolu zmniejsza się rozpuszczalność kompleksów i początkowo zwiększa się ich rozmiar i złożoność, by ostatecznie z roztworu wytrąciły się białka niejako opłaszczone polifenolami [Le Bourvellec i Renard 2012]. Wydaje się, że właśnie początkowe etapy tych interakcji miały miejsce w doświadczeniach wykonywanych w tej pracy. Kolejny typ zmian to obniżenie się potencjału antyoksydacyjnego podłoża na skutek zbyt wysokiego stężenia dodanych związków. Obserwowano, że po początkowym wzroście potencjału AOX następowało mimo dalszego zwiększania dawki związku zatrzymanie wzrostu lub wręcz zmniejszenie aktywności przeciwrodnikowe medium. Prawdopodobnie w tej sytuacji, oprócz interakcji ze składnikami podłoża (matrycą) dochodzi również do polimeryzacji flawonoidów, ich autoutleniania lub reakcji enzymatycznych powodujących degradację polifenoli (np. pod wpływem obecnej w surowcach roślinnych polifenolooksydazy). Takie sytuacje zaobserwowano dla kilku różnych podłoży wzbogacanych hesperydyną i hesperetyną oraz po dodaniu ekstraktów z derenia i brusznicy. Potencjał antyoksydacyjny mediów wzbogaconych związkami polifenolowymi może pod wpływem bakterii zwiększać się lub zmniejszać bądź też pozostawać bez zmian. Wzrost i spadek potencjału AOX może wynikać zarówno z przemian związków polifenolowych pod wpływem bakterii do pochodnych o odpowiednio większych lub mniejszych właściwościach antyoksydacyjnych, jak również z uwalniania polifenoli (bez ich przemian) z wiązań z matrycą podłoża, powodującego zwiększenie się liczby wolnych cząsteczek lub grup mogących wchodzić w reakcje z rodnikiem. Ponadto, podczas swoich procesów metabolicznych, bakterie wytwarzają różne związki, np. kwasy organiczne, które obniżają ph badanego roztworu i wpływają na strukturę cząsteczki przeciwutleniacza. Przy niższym ph roztworu wiele polifenoli jest bardziej stabilnych i przyjmuje postać uprotonowaną, dzięki czemu mają większy potencjał zmiatania wolnych rodników [Materska 2008]. Wytworzone metabolity mogą także powodować zmianę polarności środowiska i poprzez wpływ na lipofilowość/hydrofilowość polifenoli modyfikować ich potencjał antyoksydacyjny. Szczególnie wysoki przyrost aktywności antyoksydacyjnej nastąpił pod wpływem E. coli dla podłoży z dodatkiem ekstraktu z czarnego bzu (wartość WI 2,75-4,88, w zależności od stężenia ekstraktu), żurawiny (WI 1,6-3,83), czosnku niedźwiedziego (WI 1,99-3,29) oraz zielonej herbaty (WI 1,32-1,95). Przy czym, poza ostatnim przykładem, wartość WI malała wraz ze wzrostem 10

stężeniem ekstraktu, co może wynikać z bakteriostatycznego wpływu tych ekstraktów na EC. W przypadku ekstraktu z zielonej herbaty, przypuszczalnie zbyt duże stężenie katechin spowodowało, że część z nich znajdowała się w podłożu w formie niedostępnej, tj. związanej z białkami czy polisacharydami obecnymi w pożywkach. Wykazano wzrost AOX podłoży z dodatkiem hesperydyny pod wpływem EN, BF i EUB, a z dodatkiem Citroseptu pod wpływem EC (WI 2,32-3,10) i RUMI (1,28-1,51). Znaczący wzrost AOX pod wpływem bakterii wykazano też dla innych flawanonów zidentyfikowanych w ekstrakcie z grejpfruta, tj. hesperetyny (pod wpływem EC), naringeniny (EC, w mniejszym stopniu EN, BF i LCB) oraz naringiny (EC, EN). Znaczący wzrost potencjału antyoksydacyjnego w mediach z dodatkiem (+)-katechiny zaobserwowano pod wpływem EN, BF, LCB i EUB (z maksymalną wartością współczynnika interakcji WI wynoszącą 1,67). Przypuszczalnie do przemian metabolicznych kwercetyny były zdolne Lactobacillus (WI 1,6-2,18) oraz Enterococcus (WI 1,08-1,41), podczas gdy rutynozyd kwercetyny mógł być przekształcany do aglikonu lub pochodnych o większym potencjale AOX przez EC (WI 1,7-2,0), EN (1,5-1,95) i EUB (1,23-1,48). Właściwości przeciwrodnikowe podłoży z dodatkiem florydzyny i rezweratrolu zwiększały się pod wpływem EN, BF, EC i LCB (maksymalne wartości WI odpowiednio 2,13 i 1,79), zaś podłoża z kemferolem pod wpływem wszystkich bakterii oprócz BAC (max. WI wyniosło 2,18). W doświadczeniach z ekstraktami roślinnymi i suplementami diety wzrost potencjału antyoksydacyjnego w obecności E. coli zanotowano praktycznie we wszystkich próbach. Współczynnik interakcji wahał się od 1,01 do 4,88 (czarny bez), co oznacza prawie 5-krotne zwiększenie potencjału antyoksydacyjnego składników medium z dodatkiem ekstraktu z czarnego bzu pod wpływem tej bakterii. Wyjątkiem były podłoża z dodatkiem ekstraktu z czerwonej cebuli (WI=0,43; 1,72 i 0,80 dla rosnących stężeń) oraz 5% ekstraktu z cytryńca chińskiego (0,74), co mogło być spowodowane bardzo silnym zahamowaniem wzrostu E. coli wywołanym przez te ekstrakty. W przypadku pozostałych gatunków bakterii, wyniki były bardziej zróżnicowane. Do najciekawszych można zaliczyć przypuszczalne przekształcenie związków bioaktywnych zawartych w ekstrakcie z soi do pochodnych o wyższym potencjale przeciwrodnikowym przez LCB i RUMI, zaś do pochodnych o niższym AOX przez BAC. Znaczący wzrost AOX zanotowano także w przypadku pożywek z dodatkiem ekstraktu z derenia pod wpływem RUMI (WI 1,44-2,01) i ekstraktu z brusznicy pod wpływem LCB (WI 1,08-1,63). Z kolei spadek aktywności AOX wykazano dla wszystkich stężeń Citroseptu i ekstraktów z czarnego bzu, pokrzywy, soi, oraz soku z noni w obecności Bacteroides galacturonicus oraz dla Citroseptu i ekstraktów z malin, czosnku niedźwiedziego i jagód goji pod wpływem Enterococcus caccae. Możliwe, że za ten spadek odpowiada tu wykorzystanie przez bakterie na swoje potrzeby związków przeciwutleniających obecnych w pożywce. 11

Aby zweryfikować, czy za wykazany wzrost bądź spadek potencjału antyoksydacyjnego odpowiada biotransformacja poszczególnych flawonoidów do aglikonu i/lub innych pochodnych wykonano analizę HPLC. Stwierdzono, że wykorzystane w doświadczeniach gatunki bakterii, poza kilkoma wyjątkami, nie przejawiały zdolności metabolizowania większości badanych związków polifenolowych. Istotne zmiany zanotowano dla rutyny, która częściowo ulegała reakcjom biotransformacji. Pod wpływem Escherichia coli w medium z dodatkiem rutyny nieznacznie malała zawartość rutynozydu, pojawił się też w wykrywalnym stężeniu kwercetyno-3-o-glukozyd (do 8,61±2,10 µg/ml). Zwiększała się również aktywność antyoksydacyjna medium, co mogłoby stanowić poparcie tezy o degradacji rutyny pod wpływem enzymów E. coli. W obecności E. caccae rutyna była degradowana do kwercetyny oraz innego, niezidentyfikowanego związku. B. galacturonicus i E. cylindroides przekształcały rutynę do pochodnych, które nie zostały zidentyfikowane, nie były to jednak ani kwercetyna ani jej glukozyd. Potencjał antyoksydacyjny medium z dodatkiem rutyny istotnie wzrastał pod wpływem EUB, co potwierdzałoby powstanie metabolitów o wyższym AOX. Wzrost stężenia rutyny w obecności bakterii (wyraźny szczególnie dla niższych dawek) świadczy o uwalnianiu tego glikozydu z połączeń z matrycą pożywki. Metabolity powstałe w reakcjach zachodzących z udziałem BAC natomiast miały niższy potencjał antyoksydacyjny od wyjściowego (bez bakterii). Ponieważ rozerwanie pierścienia aromatycznego przez enzymy bakteryjne powoduje spadek potencjału antyoksydacyjnego związku, można przypuszczać, że BAC dokonał właśnie tego typu przemiany w obrębie cząsteczek rutyny. Na podstawie tych wyników można wnioskować, że bakterie jelitowe mają zdolność do metabolizowania tego samego związku poprzez odmienne szlaki metaboliczne i z wytworzeniem odmiennych pochodnych, także takich o niższym potencjale antyoksydacyjnym. Wzrost potencjału antyoksydacyjnego medium pod wpływem Ruminococcus gauvreauii dla najniższej dawki naringiny wynikał prawdopodobnie z przemian tego flawanonu do pochodnych o wyższym potencjale antyoksydacyjnym. Spadkowi zawartości naringiny pod wpływem RUMI nie towarzyszyło jednak pojawienie się aglikonu naringeniny, a zatem przemiany metaboliczne musiały prowadzić do powstania innych pochodnych, np. kwasów fenolowych. Taki szlak biotransformacji znany jest dla bakterii Clostridium orbiscindens, która przekształca naringeninę aż do floroglucyny, poprzez stadium dihydrochalkonu oraz kwasu 3-(4-hydroksyfenylo)- propionowego [Schoefer i in. 2003]. Co ciekawe, bakteria ta nie ma zdolności metabolizowania naringiny (glikozydu). Podobnie Eubacterium ramulus nie działa na naringinę, podczas gdy naringeninę przekształca do kwasów fenolowych [Schneider i Blaut 2000]. Zanotowany spadek potencjału antyoksydacyjnego w podłożach z naringiną w wyniku działania Bacteroides galacturonicus nie wynikał z przemian tego związku do aglikonu. Nie wykryto naringeniny, a zmiany w stężeniu naringiny pod wpływem BAC w większości przypadków nie były istotne 12

statystycznie. Także w pozostałych podłożach nie stwierdzono istotnych zmian stężenia tego glikozydu pod wpływem innych badanych bakterii. W przypadku hesperydyny zmiany potencjału antyoksydacyjnego medium nie znalazły uzasadnienia w przemianach tego związku pod wpływem bakterii dla żadnej z nich, z wyjątkiem Ruminococcus gauvreauii, nie zaobserwowano istotnych statystycznie zmian ani stężenia HR, ani czasu retencji odpowiadającego jej piku na chromatogramach. W tym przypadku na uwagę zasługuje znacznie mniejsze (niż wynikałoby to z dodanej dawki) stężenie HR w medium wzbogaconym najwyższą dawką tego glikozydu, co znalazło odzwierciedlenie w niskim potencjale antyoksydacyjnym tej próby. W obecności bakterii doszło do dalszego obniżenia AOX, czemu towarzyszył znaczny spadek zawartości hesperydyny, ale nie przełożyło się to na pojawienie się wykrywalnych stężeń aglikonu hesperetyny. Jeśli zatem miałby to być rozpad hesperydyny pod wpływem RUMI, to należałoby przypuszczać, że proces zachodzi dalej niż tylko do aglikonu i prowadzi do powstania związków o niższym potencjale antyoksydacyjnym niż potencjał wyjściowego glikozydu. W podłożach z dodatkiem ekstraktów końcowe stężenia wykrywanych i identyfikowanych polifenoli były znacznie niższe niż w przypadku czystych związków i w większości przypadków poniżej progu detekcji metody. Dla tych związków, które udało się zidentyfikować wykazano tylko kilka istotnych statystycznie zmian stężenia pod wpływem badanych gatunków bakterii. W podłożach wzbogacanych ekstraktem z soi (w stężeniu 5%) nastąpił pod wpływem Eubacterium cylindroides całkowity zanik daidzyny (z wyjściowej wartości 4,12±0,49 µg/ml do 0) z jednoczesnym pojawieniem się jej aglikonu - daidzeiny (wzrost z 0 do 4,22±2,03 µg/ml) i brakiem zmian w poziomie genisteiny. Należy zaznaczyć, że w stężeniu 5% ekstrakt z soi bardzo silnie hamował wzrost EUB; być może te śladowe ilości bakterii, które pozostały, to właśnie te, które zyskały zdolność do degradacji daidzyny do daidzeiny. Pozostałe testowane gatunki bakterii nie wpływały na poziom izoflawonoidów w medium lub związki te występowały w stężeniu niewykrywalnym. W doświadczeniach z dodatkiem ekstraktów wykazano także zachodzenie, pod wpływem bakterii, nieznacznych zmian stężenia rutyny, stanowiącej składnik niektórych surowców. W podłożu wzbogacanym najwyższą dawką ekstraktu czosnku niedźwiedziego stężenie rutyny malało pod wpływem E. caccae z 0,16±0,02 do 0,08±0,01 µg/ml. Jednocześnie w medium pojawiała się kwercetyna, której stężenie wzrastało z poziomu niewykrywalnego do 0,20±0,00 µg/ml. Wyniki te potwierdzają rezultaty doświadczeń z czystymi polifenolami, wskazujące na zdolność degradacji rutyny do kwercetyny przez EN. Z kolei podczas przemian tego samego ekstraktu, ale pod wpływem Ruminococcus gauvreauii, stężenie rutyny malało z 2,32±0,26 do 1,86±0,02 µg/ml. Nie pojawiły się w wykrywalnych ilościach ani kwercetyna ani kwercetyno-3-o-glukozyd, zatem ubytek rutyny polegał na czymś więcej niż odszczepieniu cząsteczki monocukru lub dwucukru od aglikonu, 13

tym bardziej, że podczas rozdziału chromatograficznego zaobserwowano nowy, niezidentyfikowany związek. Nie zanotowano zmian pod wpływem EUB, zaś w próbach z EC polifenole miały stężenia poniżej progu detekcji. Stężenie rutyny w podłożach wzbogaconych ekstraktem z jagód goji (w stężeniu 5%), będących bogatym źródłem tego związku, malało pod wpływem EUB z 0,43±0,05 do 0,23±0,32 µg/ml, ale nie towarzyszyły temu zmiany stężeń kwercetyno-3-o-glukozydu i kwercetyny. Nie zanotowano żadnych zmian stężenia rutyny pod wpływem RUMI, a w próbach z EC i EN jej poziom był poniżej możliwości detekcji aparatu. Co ciekawe, w medium z 5% dodatkiem ekstraktu z czarnego bzu stężenie rutyny nie ulegało zmianie pod wpływem EN, podczas gdy stężenie kwercetyny się zwiększało (z 0,18±0,03 do 2,00±0,01 μg/ml). W przypadku pozostałych bakterii nie wykazano zmian stężenia tych związków lub stwierdzono, że ich poziom mieści się poniżej progu wykrywalności. Nie stwierdzono także istotnych zmian stężenia hesperydyny i naringiny pod wpływem większości badanych gatunków bakterii (w tym RUMI) w podłożach z dodatkiem Citroseptu. Wyjątek stanowiły próby inkubowane z EUB, w których poziom naringiny malał z 37,19±2,23 do 21,49±4,33 µg/ml, zaś hesperydyny pozostawał bez zmian. Potwierdza to wyniki doświadczeń z czystymi polifenolami, w których wykazano, że badane bakterie nie metabolizują flawanonów obecnych w grejpfrucie. Brak zmian ilości hesperydyny pod wpływem RUMI może być konsekwencją znacznego błędu wynikającego z faktu, że stężenie tego związku w medium było na progu wykrywalności. Wykazano, że niektóre badane gatunki bakterii powodują spadek zawartości kwasów fenolowych w podłożu, co może świadczyć zarówno o procesach degradacji tych związków przez bakterie, jak i o ich wykorzystaniu jako źródła węgla i energii w procesach metabolicznych mikroorganizmów. W podłożach z 5% dodatkiem ekstraktu z czosnku niedźwiedziego stwierdzono spadek stężenia kwasu protokatechowego (PCA) pod wpływem Enterococcus caccae. Bakteryjny metabolizm PCA prowadzi do wytworzenia kwasów pirogronowego, bursztynowego, szczawiowego, acetaldehydu i acetylocoa, które są włączane w cykl kwasów trójkarboksylowych [Karegoudar i Kim 2000]. W mediach wzbogacanych 5% ekstraktem z cytryńca chińskiego wykazano z kolei spadek stężenia kwasu galusowego (GA) pod wpływem E. coli i E. caccae, odpowiednio z 6,51±0,86 do 0,33±0,47 µg/ml oraz z 23,24±3,78 do 13,84±6,59 µg/ml. Także w podłożach z najwyższą dawką ekstraktu z jagód goji poziom kwasu galusowego malał z 1,44±0,19 do 0,17±0,24 µg/ml pod wpływem EC. Z kolei w przypadku dodatku do pożywki 5% ekstraktu z zielonej herbaty zanotowano wzrost stężenia kwasu galusowego (z niewykrywalnego do 6,11±4,38 µg/ml) z całkowitym rozkładem (-)-epigalokatechiny (z 5,87±0,65 µg/ml do 0) pod wpływem E. caccae, co może wskazywać na zdolność tej bakterii do odszczepiania reszty kwasu galusowego od cząsteczki (-)-epigalokatechiny. Odmienne prawidłowości wykazano w 14

doświadczeniach z zieloną herbatą pod wpływem Eubacterium cylindroides oraz Lactobacillus sp. zmniejszało się zarówno stężenie kwasu galusowego, jak i galusanu (-)-epigalokatechiny; odpowiednio z 4,12±0,45 do 2,34±3,50 µg/ml i z 171,86±18,90 do 114,86±32,96 µg/ml dla EUB oraz z 6,61±0,73 do 2,97±0,30 µg/ml i z 172,83±19,21 µg/ml do niewykrywalnego dla LCB. Wykorzystanie kwasu galusowego przez LCB może tłumaczyć sugerowane wcześniej stymulowanie wzrostu tej bakterii przez kwas galusowy. Stężenie, obecnego w ekstrakcie z malin kwasu elagowego malało pod wpływem EC (z 0,08±0,01 do 0,03±0,05 µg/ml), EN (z 0,39±0,06 µg/ml do niewykrywalnego) oraz LCB (z 0,32±0,02 do 0,17±0,24 µg/ml). Uzyskane wyniki potwierdzają sugerowane wcześniej interakcje związków polifenolowych ze składnikami pożywek. W niektórych przypadkach, pod wpływem bakterii dochodziło do uwalniania tych związków z wytworzonych połączeń, prawdopodobnie na skutek wykorzystywania przez bakterie do swojego metabolizmu aminokwasów czy cukrów albo na skutek zmiany ph medium pod wpływem metabolitów bakterii. Większość badanych gatunków w warunkach beztlenowych wytwarza kwasy organiczne, które powodują spadek odczynu podłoża i zmianę siły oddziaływań między cząsteczkami. Wywołana przez bakterie zmiana ph podłoża powoduje też zmiany struktury cząsteczek polifenoli. Wiadomo, że kwercetyna w bardziej kwaśnym środowisku staje się mniej lipofilna, co wynika z przyjęcia formy uprotonowanej i prowadzi do zwiększenia zdolności oddawania protonu [Materska 2008]. Wnioski 1) Wyniki uzyskane w prezentowanej pracy wskazują, że należy odrzucić pierwszą hipotezę badawczą. Naturalne składniki przeciwutleniające oraz związki polifenolowe zawarte w surowcach roślinnych mogą wywierać silne inhibitorowe działanie na bakterie będące przedstawicielami fizjologicznej mikrobioty jelitowej. Szczególnie silny wpływ hamujący na bakterie Lactobacillus sp., Enterococcus caccae i Bacteroides galacturonicus wykazano dla rezweratrolu i naringeniny, a na Bifidobacterium catenulatum kwercetyny. Wzrost Ruminococcus gauvreauii był silnie hamowany przez wszystkie wymienione polifenole i dodatkowo przez kemferol, który działał bakteriobójczo także wobec Eubacterium cylindroides. Spośród badanych ekstraktów roślinnych i suplementów diety ekstrakt z cytryńca chińskiego, jako jedyny, znacząco hamował wzrost wszystkich badanych bakterii jelitowych (MIC 5%). Ekstrakt z miąższu i pestek grejpfruta (Citrosept) hamował wzrost badanych bakterii, oprócz LCB, zaś ekstrakt z owoców pigwowca działał silnie hamująco na B. galacturonicus (MIC 5%) i E. cylindroides (MIC 2,5%). Pozostałe ekstrakty wykazywały 15

bardziej zróżnicowany wpływ: od hamującego, przez neutralny, do stymulującego, w zależności od gatunku bakterii. Stwierdzono, że dla właściwości antyoksydacyjnych i antybakteryjnych badanych związków polifenolowych kluczowa była jednoczesna obecność wolnych grup hydroksylowych przyłączonych do szkieletu cząsteczki w pozycji C5, C7 i C4 oraz grupy ketonowej przy C4. Wykazano, że glikozydy flawonoidów są słabszymi inhibitorami niż ich aglikony, prawdopodobnie na skutek zawady sterycznej, jaka występuje po przyłączeniu cząsteczek cukrów. 2) Na podstawie uzyskanych wyników należy odrzucić drugą hipotezę badawczą. Wykazano, że bakterie będące przedstawicielami fizjologicznej mikrobioty jelitowej mogą przekształcać polifenole z wytworzeniem pochodnych o niższym potencjale antyoksydacyjnym. W przypadkach gdy w obecności bakterii rosła aktywność antyoksydacyjna badanych roztworów, często przyczyną tego były nie przemiany metaboliczne polifenoli, ale prawdopodobnie ich uwalnianie z powiązań z białkami czy innymi składnikami obecnymi w środowisku reakcji. Biorąc pod uwagę uzyskane wyniki stwierdzono, że możliwe jest takie dobranie składników polifenolowych, by zwiększyć lub zmniejszyć liczebność wybranej grupy bakterii wchodzących w skład mikrobioty jelitowej. Takie celowane terapie w przyszłości mogą zostać wykorzystane do przywracania równowagi w przewodzie pokarmowym i wspomagania leczenia różnych chorób wywołanych przez dysbiozę. Na zakończenie pracy sformułowano także kilka wskazówek dla konsumentów oraz producentów żywności. Piśmiennictwo 1. Boots A.W., Haenen G.R., Bast A. 2008. Health effects of quercetin: from antioxidant to nutraceutical. Eur. J. Pharmacol. 585 (2-3), 325-37. 2. Cushnie T.P.T., Lamb A.J. 2005. Antimicrobial activity of flavonoids. Int J Antimicrob Agents 26, 343-356. 3. Duda-Chodak A., Tarko T., Rus M. 2011. Antioxidant activity and total polyphenol content of selected herbal medicinal products used in Poland. Herba Pol., 57 (1), 48 61. 4. Duda-Chodak A., Tarko T., Satora P., Sroka P., Tuszyński T. 2010. The profile of polyphenols and antioxidant properties of selected apples cultivars grown in Poland, J. Fruit Ornament. Plant Res., 18(2), 39-50. 5. Ho P.C., Saville D.J., Wanwimolruk S. 2001. Inhibition of human CYP3A4 activity by grapefruit flavonoids, furanocoumarins and related compounds. J Pharm Pharm Sci. 4 (3), 217-227. 6. Karegoudar T.B., Kim C.K. 2000. Microbial degradation of monohydroxybenzoic acids. J. Microbiol., 38 (2), 53 61. 7. Le Bourvellec C., Renard C.M.G.C. 2012. Interactions between polyphenols and macromolecules: quantification methods and mechanisms. Crit. Rev. Food Sci. Nutr., 52 (3), 213 248. 8. Materska M. 2008. Quercetin and its derivatives: chemical structure and bioactivity a review. Pol. J. Food Nutr. Sci., 58 (4), 407 413. 16

9. Schneider H., Blaut M. 2000. Anaerobic degradation of flavonoids by Eubacterium ramulus. Arch. Microbiol., 173 (1), 71 75. 10. Schoefer L., Mohan R., Schwiertz A., Braune A., Blaut M. 2003. Anaerobic degradation of flavonoids by Clostridium orbiscindens. Appl. Environ. Microbiol., 69 (10), 5849 5854. 5. Omówienie pozostałych osiągnięć naukowo badawczych Moje zainteresowania naukowo-badawcze zmieniały się w czasie, przede wszystkim ze względu na zmianę miejsca pracy. Mimo że od wielu lat pracuję i prowadzę badania naukowe na Wydziale Technologii Żywności to moje podstawowe wykształcenie biologa, a następnie praca i doktorat na Wydziale Lekarskim Collegium Medicum UJ nie dają o sobie zapomnieć. Patrząc z perspektywy tych kilkunastu lat na projekty i tematy badawcze, w których uczestniczyłam, mogę z radością zauważyć, że mają one wspólny mianownik, jakim jest poznanie mechanizmów oddziaływania świata zewnętrznego na zdrowie człowieka, choć oczywiście na bardzo wielu poziomach i płaszczyznach. Generalnie obszary badawcze, jakimi się zajmowałam lub nadal zajmuję można zebrać w pięć 5 głównych nurtów: 1. Badanie mechanizmów odpowiedzialnych za kontrolowanie procesów apoptozy i nekrozy w komórkach. 2. Mechanizmy powstawania, zapobiegania i leczenia wrzodów i nowotworów przewodu pokarmowego. 3. Aspekty technologiczne, analityczne i zdrowotne przeciwutleniaczy. 4. Interakcje związków antyoksydacyjnych z mikroorganizmami. 5. Możliwości wykorzystania mikroorganizmów na szeroko rozumiane potrzeby człowieka. Ad. 1. Jeszcze w trakcie studiów oraz podczas I roku studiów doktoranckich w UJ zajmowałam się tematyką związaną z badaniem mechanizmów odpowiedzialnych za kontrolowanie procesów apoptozy i nekrozy w komórkach. Celem badań była między innymi ocena stopnia apoptozy w leukocytach izolowanych od pacjentów z różnymi chorobami zakaźnymi. Dostępne w tamtym czasie metody okazały się mało przydatne, gdyż komórki eksponujące na swej powierzchni resztę fosfatydyloseryny są w organizmie rozpoznawane i usuwane przez krążące we krwi fagocyty. To powoduje, że w organizmie komórki są usuwane już we wczesnym stadium apoptozy i ich analiza w oparciu o wiązanie aneksyny-v nie jest możliwa. Ponieważ aktywność kaspaz jest jednym z najwcześniejszych markerów procesu apoptozy opracowano metodę bezpośredniego oznaczania aktywności kaspaz, która może być przydatna w ocenie apoptozy ex vivo. W tym celu zastosowano zmodyfikowaną formę rodaminy: (Asp) 2-rodamina 110. Po katalitycznym odłączeniu grup 17

aspartylowych przez aktywne kaspazy fluorescencja barwnika silnie wzrastała, co oznaczano z użyciem cytometru przepływowego. Wykazano, że w chorobach bakteryjnych aktywacja kaspaz przeważała w monocytach i granulocytach, podczas gdy w chorobach o etiologii wirusowej - w limfocytach T. Wykazano też, że w limfocytach izolowanych od pacjentów zakażonych wirusem HIV aktywność kaspaz była wyższa w limfocytach T CD4 + niż w limfocytach T CD8 +. Aktywność kaspaz nie korelowała ze stopniem zaawansowania choroby, korelowała natomiast ze stopniem replikacji wirusa w wirusowych chorobach zakaźnych. W ramach tych badań wykazano także, że apoptoza zmniejszała zdolność monocytów do prezentacji antygenu i pełnienia funkcji wspomagających. Ponadto stwierdzono, że pod wpływem cytokin w monocytach dochodziło do zmian fenotypowych i funkcjonalnych. Wyniki uzyskane w trakcie omówionych doświadczeń zaprezentowano w postaci pracy przeglądowej oraz komunikatów na konferencjach naukowych (załącznik IV, pkt. D1, załącznik VI, pkt. B21-B24). Ad. 2. Z uwagi na podjęcie pracy na Wydziale Lekarskim, zdecydowałam się na rezygnację ze studiów doktoranckich na Wydziale Biologii i Nauk o Ziemi UJ i rozpoczęcie nowych studiów doktoranckich na Wydziale Lekarskim Collegium Medicum UJ, co spowodowało zmianę moich zainteresowań badawczych. Zespół, do którego dołączyłam, a także ośrodek naukowy w Erlangen, gdzie odbyłam w sumie 9-miesięczny staż naukowo-badawczy, zajmowały się szeroko pojętą tematyką patomechanizmów kancerogenezy i powstawania wrzodów. W ramach tego rozległego obszaru można wyróżnić kilka głównych tematów badawczych: (1) badanie patomechanizmu kancerogenezy i powstawania wrzodów żołądka i dwunastnicy, ze szczególnym uwzględnieniem roli apoptozy oraz wpływu toksyn Helicobacter pylori, czynników wzrostu i hormonów; (2) doskonalenie różnych modeli doświadczalnych oraz porównanie mechanizmu powstawania wywołanych w ten sposób uszkodzeń błony śluzowej żołądka i dwunastnicy; (3) rola Helicobacter pylori w procesach powstawania wrzodów oraz nowotworów żołądka, dwunastnicy, trzustki i innych narządów, (4) rola reaktywnych form tlenu (RFT) w patogenezie różnych chorób. Początkowo zajmowałam się w szczególności mechanizmami regulującymi apoptozę oraz rolą tego procesu w powstawaniu i gojeniu uszkodzeń błony śluzowej żołądka. Helicobacter pylori (HP) jest znanym czynnikiem ryzyka powstawania wrzodów trawiennych w obrębie żołądka i dwunastnicy. Ponieważ dokładny patomechanizm jego działania nie został do końca poznany większość badań, w jakich uczestniczyłam dotyczył rozpoznania patomechanizmu działania HP, szczególnie w kontekście choroby wrzodowej oraz nowotworów. W przeprowadzonych doświadczeniach wykorzystywano różne modele doświadczalne wrzodów żołądka (m.in. z wykorzystaniem kwasu octowego, etanolu, aspiryny, stresu, ischemii i reperfuzji) 18