Aktywność przeciwgrzybowa bakterii z rodzaju Lactobacillus w obecności polioli i ich galaktozylowych pochodnych

Transkrypt

1 dr hab. inż. Anna Zadernowska Olsztyn Katedra Mikrobiologii Przemysłowej i Żywności Wydział Nauki o Żywności Uniwersytet Warmińsko-Mazurski w Olsztynie RECENZJA rozprawy doktorskiej mgr inż. Lidii Lipińskiej pt.: Aktywność przeciwgrzybowa bakterii z rodzaju Lactobacillus w obecności polioli i ich galaktozylowych pochodnych wykonanej w Instytucie Technologii Fermentacji i Mikrobiologii, Wydziału Biotechnologii i Nauk o Żywności pod kierunkiem: dr hab. inż. Elżbiety Klewickiej Bakterie fermentacji mlekowej, od lat są stosowane w przemyśle spożywczym w celu zabezpieczenia produktów przed rozwojem niepożądanej mikroflory. W ostatnich latach obserwujemy wzmożone nimi zainteresowanie, głównie z uwagi na tzw. czyszczenie etykiet (ang. clean lebel). Producenci usuwają z produktów substancje które mogą się źle kojarzyć konsumentom, zaprzestaje się stosowania klasycznych konserwantów a w ich miejsce wprowadza się bakterie fermentacji mlekowej o udowodnionych zdolnościach syntetyzowania metabolitów o właściwościach antymikrobiologicznych. Przykładem mogą być kultury ochronne stosowane w przemyśle mięsnym. Większość badań oraz zastosowań aplikacyjnych dotyczy jednak bakterii chorobotwórczych np. Listeria monocytogenes. Nieliczne doniesienia traktują o właściwościach przeciwgrzybowych metabolitów bakterii fermentacji mlekowej i z reguły wskazują one na ograniczone możliwości hamowania rozwoju grzybów. Z całą pewnością badania Doktorantki dotyczące właściwości przeciwgrzybowych metabolitów Lactobacillus sp. wpisują się w nurt nowoczesnych badań naukowych z zakresu mikrobiologii. Natomiast badania dotyczące możliwości modulacji spektrum aktywności przeciwgrzybowej bakterii Lactobacillus poprzez wprowadzenie do podłoża wzrostowego polioli oraz ich galaktozylowych pochodnych są w wielu aspektach nowatorskie i znacznie poszerzają wiedzę w zakresie mikrobiologii żywności.

2 Ocena pracy Przedstawiona do recenzji praca jest obszerna, zawiera 200 numerowanych stron, 56 tabel i 45 rysunków przedstawiających wyniki badań. Moim zdaniem, jej obszerność nie wynika z nadmiernego rozbudowania któregoś z elementów, a z ogromu analiz wykonanych przez Doktorantkę. Układ pracy jest typowy dla prac doktorskich, z małym wyjątkiem a mianowicie w ostatnim rozdziale zatytułowanym: Wykaz osiągnięć naukowych, Doktorantka przedstawia dane bibliometryczne dotyczące Jej dorobku naukowego oraz wykaz osiągnięć naukowych z okresu studiów doktoranckich. Uważam, że umieszczenie takiego rozdziału jest bardzo dobrym pomysłem, szczególnie, że dorobek naukowy Doktorantki jest imponujący. Pozostałe typowe dla tego typu prac rozdziały to: Wstęp literaturowy, Cel i zakres pracy, Materiały i metody, Wyniki, Dyskusja wyników, Wnioski, Literatura, Dokumentacja, Spis tabel, Spis rysunków. Autorka cytuje 131 pozycji literaturowych, które moim zdaniem zostały dobrane prawidłowo, są to głównie pozycje anglojęzyczne w większości z kilku, kilkunastu ostatnich lat. Znaczną ich część Autorka cytuje we wstępie literaturowym, który w mojej ocenie został bardzo dobrze przygotowany. Autorce udało się zachować odpowiednie proporcje między podrozdziałami dotyczącymi występowania, metabolizmu oraz aktywności antybakteryjnej i przeciwgrzybowej bakterii Lactobacillus a charakterystyką, otrzymywaniem i właściwościami polioli i galaktozylo-polioli. Celem pracy było określenie aktywności przeciwgrzybowej bakterii z rodzaju Lactobacillus hodowanych w obecności polioli i ich galaktozydowych pochodnych oraz izolacja i identyfikacja wymienionych związków o aktywności przeciwgrzybowej po fermentacji mlekowej. Dla zrealizowania postawionego celu Autorka wykonała szereg analiz podzielonych na trzy główne etapy, które w czytelny sposób przedstawiła na rysunku w rozdziale Cel i zakres pracy. Dwa początkowe etapy obejmowały selekcję szczepów bakterii Lactobacillus sp. zdolnych do wzrostu w obecności polioli i galaktozylo-polioli i jednocześnie ograniczających wzrost grzybów. W wyniku I etapu selekcji wytypowano z 60 szczepów bakterii Lactobacillus sp., 18 szczepów bakterii, u których zaobserwowano w obecności polioli i ich pochodnych aktywność przeciwgrzybową względem przynajmniej jednego szczepu testowego (badano 2 szczepy drożdży i 9 szczepów pleśni). Drugi etap badań obejmował określenie przeżywalności w jałowej cieczy pofermentacyjnej i tempa wzrostu grzybów strzępkowych hodowanych w podłożu z zawartością od 0 do 70% jałowej cieczy pofermentacyjnej Lactobacillus sp. W wyniku otrzymanych wyników wytypowano do dalszych analiz

3 5 szczepów Lactobacillus sp. o najsilniejszych właściwościach przeciwgrzybowych w obecności polioli lub galaktozylo-polioli. Po przygotowaniu cieczy pofermentacyjnych wybranych szczepów przeprowadzono bardzo dokładne analizy ich składu jakościowego i ilościowego z użyciem metod enzymatycznych, chromatograficznych i spektroskopowych. Ponadto w układzie modelowym zbadano minimalne stężenie hamujące kwasu mlekowego, octowego i fenylomlekowego. Przeprowadzono badania dynamiki wzrostu i syntezy metabolitów kwaśnych trzech wybranych bakterii. Doktorantka przeprowadziła również analizę profilu enzymatycznego bakterii z rodzaju Lactobacillus. Aby pogłębić wiedzę dotyczącą wpływu filtratów pofermentacyjnych przeprowadzono ocenę wzrostu i morfologii grzybów z użyciem mikroskopii świetlnej i skaningowej mikroskopii elektronowej. W końcowym etapie badań Pani mgr inż. Lidia Lipińska zbadała in situ aktywność przeciwgrzybową wybranej cieczy pofermentacyjnej wobec Alternaria brassicicola na powierzchni owoców czereśni. Uważam, że eksperymentalna część badań została bardzo dobrze przemyślana. Mimo, że jest bardzo rozbudowana to jest w pełni czytelna i przejrzysta. Weryfikując hipotezę badawczą dotyczącą istnienia możliwości rozszerzenia właściwości przeciwgrzybowych bakterii Lactobacillus sp. poprzez dobór warunków hodowli a w szczególności składu podłoża wzrostowego Doktorantka zastosowała wiele technik i metod badawczych poczynając od typowych analiz mikrobiologicznych przez metody enzymatyczne, chromatograficzne, spektroskopowe. Na uznanie zasługuje dociekliwość Doktorantki i modyfikacja na bieżąco zakresu analiz, jeśli wyniki poszczególnych analiz z jakichś powodów Autorkę zaskoczyły, odbiegały od spodziewanych rezultatów natychmiast wprowadzano kolejne, pogłębione analizy np. po otrzymaniu złożonego profilu metabolitów bakterii Lactobacillus sp. w obecności mannitolu przeprowadzono badania dynamiki wzrostu i syntezy metabolitów kwaśnych trzech badanych szczepów. W pełni zgadzam się ze stwierdzeniem Autorki, że wyniki przeprowadzonych badań potwierdziły możliwość modulacji spektrum aktywności antagonistycznej bakterii Lactobacillus sp. względem grzybów zanieczyszczających żywność po wprowadzeniu do podłoża polioli oraz ich galaktozylowych pochodnych. Za istotną, bardzo ciekawą część pracy uważam wykazanie możliwości inhibicji pleśni przez ciecze pofermentacyjne bezpośrednio na owocach czereśni. Po przeanalizowaniu pracy nasunęło mi się kilka uwag i pytań do Doktorantki:

4 - w części metodycznej w podrozdziale błędnie podano odniesienie do tabeli, podano tabelę nr 2 podczas gdy powinna to być tabela nr 5 - w tabeli 4 podano skład pożywek hodowlanych, w opisie podłoża MRS firmy BTL podano, że w składzie znajduje się 20g glukozy, natomiast w tabeli 5 oraz w dalszej części pracy (np. na stronie 164) znajduje się informacja, że w podłożu nie było glukozy a jedynie galaktoza, z czego wynika ta nieścisłość? - podrozdział nosi tytuł : dynamika wzrostu i charakterystyka cech morfologicznych drożdży, natomiast w opisie tego podrozdziału (str. 40) widnieje zdanie: Liczebność komórek drożdży w badanych próbach określono metodą hodowlaną (metoda płytkowa) po 4, 8, 24 i 48 godzinach w celu ustalenia wpływu cieczy pofermentacyjnej bakterii Lactobacillus sp. na przeżywalność badanych drożdży. Moim zdaniem jeśli mówimy o określeniu dynamiki wzrostu to nie powinniśmy używać określenia przeżywalność bo to dwie różne rzeczy. W części pracy opisującej wyniki tego etapu Doktorantka również używa określenia przeżywalność. Może lepiej byłoby konsekwentnie używać określenia dynamika wzrostu gdy mówimy o hodowli w podłożu z MRS z dodatkiem cieczy pofermentacyjnej i przeżywalność gdy mówimy o jałowych cieczach pofermentacyjnych. - co zdaniem doktorantki było powodem wzrostu liczebności komórek drożdży w próbie odniesienia (jałowym roztworze soli fizjologicznej) na przykład po 48 godzinach inkubacji drożdży Candida vini ŁOCK 0009, str. 105, rysunek 34 A - w tabeli 24. Produkcja kwasów DL-mlekowego i octowego przez Lactobacillus ŁOCK 0906 w podłożu MRS z dodatkiem sorbitolu po fermentacji odnotowano ph na poziomie 5,47 podczas gdy w podłożu MRS bez dodatku sorbitolu ph wynosiło 4,14. Doktorantka odnotowała, że w tym wariancie hodowli było najniższe stężenie kwasu DL-mlekowego. Czy dodatek do podłoża MRS sorbitolu mógł tak istotnie wpłynąć na metabolizm Lactobacillus sp., że po fermentacji ph niewiele różniło się od ph wyjściowego podłoża (5,70)? - biorąc pod uwagę wykazane w badaniach ograniczone działanie przeciwgrzybowe kwasów, czy Doktorantka brała pod uwagę możliwość neutralizacji cieczy pofermentacyjnej w celu

5 doprowadzenia jej do neutralnego ph przed zastosowaniem do ograniczenia rozwoju pleśni na produkcie? Powyższe pytania i uwagi w żaden sposób nie obniżają wartości naukowej i poznawczej pracy, w znacznej części są to uwagi dyskusyjne a ich niewielka liczba przy tak rozbudowanej i wielopłaszczyznowej pracy świadczy o jej bardzo dobrym, rzetelnym przygotowaniu. WNIOSEK KOŃCOWY Stwierdzam, że praca doktorska mgr inż. Lidii Lipińskiej pt.: Aktywność przeciwgrzybowa bakterii z rodzaju Lactobacillus w obecności polioli i ich galaktozylowych pochodnych, spełnia wymagania stawione przez Ustawę w art. 13 ustawy z dn. 14 marca 2003 r. o stopniach i tytule naukowym oraz stopniach i tytule z zakresu sztuki (Dz. U. z 203 r. Nr 65, poz.595; z późn. zm.), jest bowiem samodzielnym i wartościowym dorobkiem naukowym, wnosi do nauki wiele elementów poznawczych i ma znaczną wartość aplikacyjną. W związku z powyższym zwracam się do Wysokiej Rady Wydziału Biotechnologii i Nauk o Żywności w Łodzi o przyjęcie pracy i dopuszczenie Pani mgr inż. Lidii Lipińskiej do publicznej obrony zawartych w niej tez. Biorąc pod uwagę wysoką wartość naukową recenzowanej pracy oraz potencjał aplikacyjny rozprawy wnoszę o jej wyróżnienie. Olsztyn, dn. 07 lipca 2018 dr hab. inż. Anna Zadernowska