RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 169335 (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (21) Numer zgłoszenia: 2 9 4 2 2 3 (22) Data zgłoszenia: 1 3.0 4.1 9 9 2 (51) IntCl6: A01N 63/00 (54) Sposób wytwarzania biopreparatu zawierającego zarodniki konidialne Verticiilium lecanii (43) Zgłoszenie ogłoszono: 18.10.1993 BUP 21/93 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: 31.07.1996 WUP 07/96 (73) Uprawniony z patentu: P abianickie Zakłady Farm aceutyczne "POLFA", Pabianice, PL (7 2) Twórcy wynalazku: Cecylia Bajan, Warszawa, PL Alicja Fedorko, Warszawa, PL Elżbieta Mierzejewska, Warszawa, PL Krystyna Kmita, Brwinów, PL Krystyna Lubisz, Pabianice, PL Anna Filip, Łódź, PL Jadwiga Szczepaniak, Pabianice, PL Hanna Goźlińska, Łódź, PL Leon Sedlaczek, Łódź, PL PL 169335 B1 (57) Sposób wytwarzania biopreparatu zawierającego zarodniki konidialne Verticillium lecanii, znamienny tym, że proces biosyntezy prowadzi się w wieloetapowej hodowli wgłębnej w fermentorach przemysłowych przy użyciu pożywki o naturalnym poziomie ph 4,7-5,7, przy czym w ostatnim, produkcyjnym etapie hodowli stosuje się pożywkę o składzie: glukoza 1,5-2% wagowych lub sacharoza 2-3% wagowych, pepton 0,3-0,7% wagowych, ekstrakt drożdżowy 0,05-0,3% wagowych, fosforan potasu jednozasadowy 0,1 % wagowych, azotan potasu 0,3% wagowych inne sole mineralne i mikroelementy w ilości 0,25-0,4% wagowych oraz olej słonecznikowy w ilości 0,1% wagowych lub olej sojowy w ilości 0,02-0,1% wagowych, a następnie po uzyskaniu w hodowli stężenia zarodników konidialnych m inim um 10 w 1 ml, dodaje się wypełniacze, substancji przylepnych i emulgujących, oddziela filtrat, a pozostałość suszy i poddaje mieleniu lub granulacji.
Sposób wytwarzania biopreparatu zawierającego zarodniki konidialne Verticillium lecanii Zastrzeżenie patentowe Sposób wytwarzania biopreparatu zawierającego zarodniki konidialne Verticillium lecanii, znamienny tym, że proces biosyntezy prowadzi się w wieloetapowej hodowli wgłębnej w fermentorach przemysłowych przy użyciu pożywki o naturalnym poziomie ph 4,7-5,7, przy czym w ostatnim, produkcyjnym etapie hodowli stosuje się pożywkę o składzie: glukoza 1,5-2% wagowych lub sacharoza 2-3% wagowych, pepton 0,3-0,7% wagowych, ekstrakt drożdżowy 0,05-0,3% wagowych, fosforan potasu jednozasadowy 0,1% wagowych, azotan potasu 0,3% wagowych inne sole mineralne i mikroelementy w ilości 0,25-0,4% wagowych oraz olej słonecznikowy w ilości 0,1% wagowych lub olej sojowy w ilości 0,02-0,1% wagowych, a następnie po uzyskaniu w hodowli stężenia zarodników konidialnych minimum 10 w 1 ml, dodaje się wypełniacze, substancji przylepnych i emulgujących, oddziela filtrat, a pozostałość suszy i poddaje mieleniu lub granulacji. * * * Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania biopreparatu owadobójczego o wysokiej aktywności w postaci proszku zawierającego zarodniki Verticillium lecanii, przeznaczonego do ochrony roślin w szklarniach. Składnikiem czynnym biopreparatu są żywe zarodniki konidialne powstające w wyniku namnożenia kultury Verticillium lecanii w taki sposób, aby powstawało tych zarodników około 70-80% w stosunku do blastospor. Verticillium lecanii jest drobnoustrojem należącym do klasy grzybów niedoskonałych i tworzy kilka szczepów atakujących wiele gatunków owadów. Szczepy używane przez nas zostały wyizolowane z ciał zainfekowanych owadów w Instytucie Ekologii PAN w Dziekanowie Leśnym. Wrażliwymi na infekcję zarodnikami Verticillium lecanii są szkodniki roślin szklarniowych takie jak mszyce, mączlik i przędziorki. Infekcja owada ma przebieg typowy. Zarodnik, pokryty lepką substancją, łatwo przyczepia się do ciała ofiary, kiełkuje i dzięki wytwarzanym przez siebie enzymom rozpuszcza oskórek owada. Grzybnia przerasta ciało owada, w ciągu 4-5 dni powodując jego śmierć, a jednocześnie wytwarza nowe zarodniki konidialne, które są źródłem infekcji dla następnych owadów. Infekcyjność biopreparatu Verticillium lecanii stosowanego do oprysków, zależy od temperatury i wilgotności powietrza. Konieczność zapewnienia wysokiej wilgotności - powyżej 80% sprawia, że biopreparat może być stosowany w dużej skali tylko w szklarniach. Verticillium lecanii nie jest chorobotwórczy lub toksyczny dla człowieka i zwierząt wyższych. /J. Boczek, J. J. Lipa - Biologiczne metody walki ze szkodnikami roślin, 1978/. Znane sposoby wytwarzania biopreparatu z Verticillium lecanii polegają na prowadzeniu hodowli powierzchniowej przez kilka dni, zbieraniu zarodników i mieszaniu ich z wypełniaczem tak, aby 1 g preparatu zawierał nie mniej niż 2 miliardy konidii. Dla prawidłowego wytwarzania zarodników o wysokiej patogeniczności stosuje się pożywki zawierając przyswajalny azot, węglowodany i sole mineralne. Warunkiem uzyskania biopreparatu o wysokiej aktywności jest właściwa selekcja szczepu, odpowiedni dobór pożywek używanych do hodowli i namnażania biomasy, a także odpowiednia obróbka wytworzonej biomasy. Wadą hodowli powierzchniowych jest to, że praktycznie nie można ich wdrożyć do przemysłu.
169 335 3 Istota badań dotyczyła hodowli wgłębnej Verticillium lecanii. Brak doniesień literaturowych i patentowych na temat hodowli wgłębnej Verticillium lecanii sprawił, że konieczne było przeprowadzenie szeregu badań dotyczących wpływu między innymi takich czynników jak skład pożywki, ph pożywki, mieszania, napowietrzania, temperatury hodowli, procentu materiału szczepiennego itp. na wzrost, zarodnikowanie i wirulentność hodowanego grzyba. W wyniku tych badań udało się uzyskać metodą hodowli wgłębnej biopreparat o wysokiej aktywności. Sposób wytwarzania biopreparatu według wynalazku, polega na tym że wytwarza się go w procesie kilkuetapowej hodowli wgłębnej kultury Verticillium lecanii, poprzedzonej pasażow aniem szczepu na zmiennych podłożach stałych. Pożywki mają optymalny skład i ph naturalne w granicach wartości 5,2-6,1 i 4,7-5,7. Wytwarzanie biopreparatu obejmuje następujące etapy: - hodowlę inoculum, - hodowlę materiału posiewowego, - nanmażanie biomasy z wytwarzaniem zarodników konidialnych, - oddzielanie biomasy, - suszenie z wypełniaczem, - mielenie lub granulowanie. Materiałem wyjściowym do wytwarzania biopreparatu jest wyselekcjonowana kultura Verticillium lecanii. Świeżą kulturą zmytą ze skosów agarowych, szczepi się płynną pożywkę w celu wyhodowania inoculum. Dla hodowli inocularnych stosuje się pożywkę o składzie: ekstrakt drożdżowy w ilości 0,3% wagowych, pepton w ilości 0,5% wagowych, glukoza w ilości 1% wagowych, olej słonecznikowy w ilości 0,1% wagowych, lub olej sojowy w ilości 0,02-0,1% wagowych. Pożywka ma ph naturalne i po sterylizacji oraz dodaniu sterylnego roztworu glukozy utrzymuje się w granicach wartości 5,2-6,1. Inoculum stanowi materiał szczepienny do hodowli kultury prowadzonej w tankach. Proces hodowli w tankach prowadzi się w dwóch etapach: 1. Hodowla materiału posiewowego. 2. Namnażanie biomasy i wytwarzanie zarodników konidialnych. Dla hodowli materiału posiewowego stosuje się pożywkę o takim samym składzie jak dla hodowli inocularnych, lub pożywkę o składzie: ekstrakt drożdżowy w ilości 0,3% wagowych, glukoza w ilości 0,3% wagowych, pepton w ilości 0,3% wagowych, chlorek wapnia w ilości 0,3% wagowych, olej słonecznikowy w ilości 0,1% wagowych lub olej sojowy w ilości 0,02-0,1% wagowych. Pożywka ma ph naturalne i po sterylizacji wynosi około 6,0. Materiałem posiewowym wyhodowanym w tanku posiewowym szczepi się pożywkę w tanku fermentacyjnym, w którym prowadzi się właściwy proces. Pożywka w tanku fermentacyjnym zawiera: glukozę w ilości 2% wagowych, lub sacharozę w ilości 3% wagowych, pepton w ilości 0,7% wagowych, ekstrakt drożdżowy w ilości 0,3% wagowych, sole mineralne w ilości 0,4-0,8% wagowych, olej słonecznikowy w ilości 0,1% wagowych lub olej sojowy w ilości 0,02-0,1% wagowych. Pożywka ma ph naturalne i po sterylizacji oraz dodaniu roztworu glukozy utrzymuje się w granicach wartości 4,7-5,7. Proces kończy się, gdy ilość zarodników konidialnych osiągnie przewagę nad ilością blastospor (około 70-80%). Po zakończeniu procesu, do biomasy dodaje się wypełniacza z dodatkiem substancji przylepnych i emulgujących, filtruje lub wiruje, przemywając na koniec osad roztworem substancji obniżającej napięcie powierzchniowe i następnie suszy w warunkach sterylnych w temperaturze 30-40 C. Po zmieleniu otrzymuje się produkt w postaci proszku o barwie kremowej lub jasno beżowej, który zawiera 108-109 zarodników konidialnych w 1 gramie. Zaletą sposobu według wynalazku jest uzyskiwanie metodą hodowli wgłębnej biopreparatu aktywnego biologicznie zawierającego odpowiednio wysokie stężenie zarodników konidialnych. Skład pożywek jest tak dobrany, że zachodzi potrzeba korekty ph, co wyklucza ryzyko
4 169 335 niekorzystnych dla kultury drobnoustroju zmian w jakości składników pożywki. Odpowiednio dobrane warunki prowadzenia procesu oraz skład surowcowy pożywek zapewnia prawidłowy rozwój grzyba, czego wynikiem jest duży procent zarodników konidialnych w stosunku do blastospor w gotowym produkcie. Preparat stosowany w sposób właściwy w szklarniach może stanowić konkurencję dla preparatów chemicznych szczególnie w kwiaciarstwie i przy produkcji zdrowej żywności. W odróżnieniu od wszystkich środków chemicznych nie powoduje wykształcenia się odporności u owadów wrażliwych na tą infekcję. Rozwój grzybni w ciele owada i wytwarzanie nowych zarodników będących źródłem infekcji dla następnych owadów sprawia, że okres działania preparatu wydłuża się. Preparat nie jest szkodliwy dla człowieka (V klasa szkodliwości). Przykład I. Inoculum hoduje się w kolbach stożkowych o pojemności 2 dm3 napełnionych 0,25 dm3 pożywki płynnej, która zawiera w 1 dm3 wody destylowanej następujące składniki: ekstrakt drożdżowy 3 g, pepton 5 g, glukoza 10 g, olej słonecznikowy 1 g. Pożywkę w kolbach szczepi się kulturą zebraną ze skosu agarowego. Po zaszczepieniu kolby inkubuje się w temperaturze 23 C na trzęsawce obrotowej przez 48 godzin. Po zakończeniu inkubacji ph inoculum wynosi około 6,0. Liczb zarodników konidialnych i blastospor w 1 ml inoculum wynosi około 107. Tak przygotowane inoculum przeszczepia się do pożywki produkcyjnej, przygotowanej w tanku fermentacyjnym. Pożywka produkcyjna zawiera w 1 dm3 wody destylowanej uzupełnionej w 10% wodą wodociągową następujące ilości składników: glukoza 20 g, pepton 7 g, ekstrakt drożdżowy 0,5 g MgSO4 7 H2O 0,5 g, KH2PO4 1 g, NaNO3 3 g, CaCl2 3 g, olej słonecznikowy 1 g. PH pożywki jest naturalne i po sterylizacji wynosi 5,2. Do zaszczepienia pożywki produkcyjnej używa się inoculum w ilości 10% objętościowych. Proces hodowli w tanku prowadzi się w temperaturze 23 C przy stałym mieszaniu i napowietrzaniu przez 48 godzin, następnie pozostawia się tylko przepływ powietrza i kończy, gdy ilość zarodników konidialnych osiągnie przewagę nad ilością blastospor (około 70-80%). W trakcie biosyntezy ph brzeczki zmienia się w sposób naturalny w zakresie 5,1-7,2. Po zakończeniu procesu hodowli biomasę miesza się z wypełniaczem, emulgatorami i substancjami przylepnymi, oddziela filtrat, a pozostałość suszy w warunkach sterylnych w temperaturze 30-40 C. Po zmieleniu otrzymuje się produkt w postaci proszku o barwie kremowej, który zawiera około 109 zarodników konidialnych w 1 g. Przykład II. Inoculum hoduje się w warunkach takich jak w przykładzie I, stosując pożywkę o składzie: ekstrakt drożdżowy 3 g, pepton 3 g, glukoza 3 g, CaCl2 3 g, olej słonecznikowy 1 g, woda destylowana 1 dm3. Po zakończeniu inkubacji na trzęsawce obrotowej, ph inoculum wynosi 6,8. Liczba zarodników konidialnych i blastospor wynosi około 106-107 w 1 ml kultury. Tak przygotowane inoculum przeszczepia się do pożywki produkcyjnej o składzie takim jak w przykładzie I, zachowując te same warunki procesu hodowli i sposób otrzymywania gotowego produktu. Otrzymany biopreparat zawiera w 1 g około 109 zarodników konidialnych. Przykład III. Inoculum przygotowane jak w przykładzie I, przeszczepia się do pożywki produkcyjnej o składzie: sacharoza 25 g, pepton 5 g, ekstrakt drożdżowy 3 g, MgSO4 7 H2O 0,5 g, KH2PO4 1 g, NaNO3 3 g, CaCl2 2 g, olej sojowy 0,2 g, woda destylowana 1 dm3. Proces prowadzi się w warunkach takich jak w przykładzie I. Po zakończeniu procesu ph wynosi około 6,0. Zawierającą w przewadze zarodniki konidialne biomasę miesza się z wypełniaczem i postępuje jak w przykładzie I. Otrzymany biopreparat zawiera w 1 g około 10 zarodników konidialnych. Przykład IV. Inoculum przygotowanym jak w przykładzie I szczepi się pożywkę posiewową przygotowaną w tanku posiewowym. Pożywka zawiera 1 dm3 wody destylowanej uzupełnionej w 10% wodą wodociągową następujące ilości składników: ekstrakt drożdżowy 3 g, pepton 5 g, glukoza 10 g i olej sojowy 1 g. PH pożywki jest naturalne i po sterylizacji wynosi 5,5-6,0. Do zaszczepienia pożywki używa się inoculum w ilości 10% objętościowych. Hodowlę w tanku posiewowym prowadzi się w temperaturze 23 C przez 20-24 godzin w warunkach
169 335 5 ciągłego mieszania i napowietrzania hodowli. Przepływ powietrza utrzymuje się w granicach 0,8-1,0 na każdy 1 l brzeczki w ciągu minuty, a nadciśnienie w tanku w granicach 0,04-0,06 MPa. Po zakończeniu hodowli ph materiału posiewowego wynosi 4,5-5,5. Materiałem posiewowym szczepi się pożywkę produkcyjną w tanku fermentacyjnym przygotowaną jak w przykładzie I lub III. Do zaszczepienia pożywki produkcyjnej używa się materiału posiewowego w ilości 10% objętościowych. Proces hodowli prowadzi się do momentu uzyskania stężenia zarodników konidialnych minimum 108 w 1 ml kultury, zachowując te same warunki hodowli i sposób otrzymywania gotowego produktu jak w przykładzie I. Otrzymany biopreparat zawiera w 1 g około 109 zarodników konidialnych.
169 335 Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz. Cena 2,00 zł.