UNIWERSYTET MEDYCZNY W BIAŁYMSTOKU ZAKŁAD BIOCHEMII LEKARSKIEJ ul. A. Mickiewicza 2, 15-089 Białystok tel. (085) 748 55 78, faks (085) 748 55 78 e-mail: zdbioch@umwb.edu.pl Białystok 19. 02. 2016 Ocena rozprawy doktorskiej lek. Igi Kwiecień p.t.: Wpływ łącznego stosowania fluorków i kofeiny na aktywność wybranych enzymów wskaźnikowych oraz profil antyoksydacyjny w wątrobie szczura, wykonanej pod kierunkiem Pani Prof. dr hab. Ewy Birkner i Pani dr Aleksandry Kasperczyk w Katedrze i Zakładzie Biochemii Wydziału Lekarskiego z Oddziałem Lekarsko Dentystycznym w Zabrzu, Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Katowicach. Oceniany doktorat obejmuje trzy zagadnienia - dotyczą fluoru, kofeiny i wątroby, których łącznikiem jest układ oksydacyjno-redukcyjny. Fluor jest pierwiastkiem bardzo reaktywnym, powszechnie występującym w otoczeniu człowieka. Jego ilość podwaja się z upływem każdej dekady. Dostatecznie udokumentowano jedynie znaczenie fluoru w profilaktyce próchnicy, a miejscowe stosowanie fluorków w postaci past, płukanek czy lakierów przetrwało próbę czasu. Nadmiar fluoru w organizmie może być, a najczęściej jest, przyczyną licznych patologii. Ale do chwili obecnej nie ustalono norm prawidłowego stężenia fluorków we krwi, czy też nie określono dopuszczalnych dawek tego pierwiastka. Kofeina jest alkaloidem również powszechnie występującym w otoczeniu człowieka. Obecna jest w liściach, ziarnach i owocach wielu roślin. Zawierają ją takie produkty codziennego użycia jak herbata, kawa czy liczne napoje. Wiele ogólnie dostępnych leków w swoich składach również zawiera kofeinę. Najlepiej poznanym efektem biologicznym kofeiny są jej właściwości pobudzające. Pomimo
2 wielu różnych badań dotyczących bezpieczeństwa jej stosowania, ciągle istnieje wiele kontrowersji dotyczących wpływu, zwłaszcza nadmiaru kofeiny na organizm ludzki. Wątroba jest narządem integrującym metabolizm ustrojowy. Odgrywa kluczową rolę w metabolizmie węglowodanów, białek i lipidów. Pełni funkcję dystrybutora substratów energetycznych i różnych metabolitów. Jest miejscem detoksykacji wielu ksenobiotyków. Uszkodzenie wątroby skutkuje zmianą metabolizmu, co może być przyczyną wielu patologii. Liczne doniesienia wskazują na przeciwstawny wpływ fluoru i kofeiny na stan oksydacyjno-redukcyjny organizmu. Podjęcie zatem przez Doktorantkę badań dotyczących oceny łącznego wpływu fluoru i kofeiny na układ oksydacyjno-redukcyjny wątroby uważam za przedsięwzięcie w pełni uzasadnione. Badania tym bardziej są zasadne, że pochodzą z ośrodka, który od wielu lat zajmuję się podobną problematyką badawczą. Doktorantka podawała szczurom fluorek sodu oraz fluorek sodu łącznie z kofeiną przez okres 3 miesięcy w dawkach zaakceptowanych i opisanych w licznych publikacjach zespołu Pani Prof. Ewy Birkner. W celu realizacji tego zadania Doktorantka postanowiła ocenić we krwi szczurów - zawartość jonów fluorkowych przy użyciu elektrody jonoselektywnej, - aktywności trzech enzymów wskaźnikowych wątroby w homogenatach wątroby dokonać pomiarów - aktywności dysmutazy ponadtlenkowej i jej izoenzymów, - aktywności katalazy, - aktywności peroksydazy, transferazy i reduktazy glutationowej, - zawartości dialdehydu malonowego Autorka rozprawy swoje badania przeprowadziła na 18 szczurach, a na powyższe badania uzyskała zgodę Komisji Bioetycznej Śląskiego Uniwersytetu Medycznego.
3 Oceniana rozprawa obejmuje 51 stron maszynopisu oraz 107 pozycji piśmiennictwa, 12 rycin i 24 tabele. Jest podzielona na typowe rozdziały. We wstępie Autorka przedstawia w sposób bardzo zwięzły cztery zagadnienia. Jedno dotyczy informacji na temat właściwości własności fizyko chemicznych i oddziaływania fluoru, drugie toksycznego uszkodzenia wątroby, trzecie stresu oksydacyjnego w komórce wątroby, a czwarte - kofeiny. Cel pracy jest krótki, dość jasno sprecyzowany. Metodologia pracy uwzględnia odpowiednie przygotowanie krwi i tkanek do badań, metodę elektrochemiczną oznaczania jonów fluorkowych, adekwatną do założonego celu badań, metody oznaczeń aktywności badanych enzymów oraz metodę pomiaru zawartości dialdehydu malonowego. Uzyskane wyniki Doktorantka poddała rozbudowanej analizie statystycznej. Wyniki każdego pomiaru zostały przedstawione w sposób w czytelny na 1 rycinie i w 2 tabelach w sumie wyniki obejmują 12 rycin i 24 tabele. W dyskusji Doktorantka konfrontuje wyniki badań własnych z obserwacjami innych autorów. Zestaw cytowanej literatury obejmuje właściwe proporcje pomiędzy piśmiennictwem współczesnym a archiwalnym, uwzględnia szereg publikacji krajowych. Podsumowaniem pracy są trzy wnioski, wynikające z przebiegu rozprawy. Najbardziej interesującym spostrzeżeniem, które podsumowuje rozprawę jest udokumentowanie ochronnego działania kofeiny na układ oksydacyjnoredukcyjny w wątrobie, w przebiegu ekspozycji na fluor. Oceniana rozprawa jest bardzo zwarta, napisana poprawnym językiem, podczas jej lektury znalazłem jednak błędy edytorskie, takie jak brak akapitów, miejscami odmienna czcionka w tekście rozprawy, niepoprawna numeracja ryciny 1 i 2 oraz tabeli VI, XII i XV, czy pojedyncze błędy literowe. Z obowiązku recenzenta chciałbym przedstawić pewne własne sugestie, które mogą być użyteczne w przygotowaniu publikacji do druku: 1. Proponuję zmodyfikować informacje, podane we Wstępie (strona 8), związane z -glutamylotranspeptydazą. Enzym ten nie katalizuje hydrolizy peptydów do aminokwasów lub oligopeptydów. Wprawdzie wykazuje on
4 aktywność proteazy, ale niemal wyłącznie odcina glutaminian od glutationu. Jest to typowa transferaza związana z przenoszeniem reszty glutaminianowej. 2. Nie odnalazłem odnośnika literaturowego przy stosowanej metodzie oznaczania fluorków, a opis metody oznaczania aktywności dysmutazy ponadtlenkowej nie uwzględnia metodologii oznaczeń aktywności izoenzymów. 3. W opisach wyników oznaczania aktywności enzymów przy opisie aldolazy, katalazy, reduktazy glutationowej, peroksydazy glutationowej, transferazy glutationowej Doktorantka posługuje się terminem stężenie, a przecież oceniała aktywność enzymów a nie ich zawartość. 4. Ze względu na stosunkowo małą liczebność szczurów w obrębie badanych grup (6 to graniczna, najmniejsza ilość w grupie do obliczeń statystycznych), może należy podać informację w jak licznych powtórzeniach Doktorantka wykonywała swoje pomiary. Znając metodologię prac z Zakładu Biochemii w Zabrzu zapewne Doktorantka swoje pomiary wykonywała w wielu powtórzeniach. 5. Treści niektórych zdań w rozprawie mogą budzić kontrowersje. Na przykład w rozdziale Wyniki w punkcie 5.1 Wykazano istotny statystycznie wpływ grupy na stężenie fluoru. Moim zdaniem jest dokładnie odwrotnie to fluor wpływał na grupy. Powyższe moje sugestie i uwagi mają w większości charakter polemiczny nie podważają merytorycznych założeń treści rozprawy doktorskiej. Dotyczą przede wszystkim z reguły trudnych i specjalistycznych procedur i nazewnictwa biochemicznego. Nie wykluczam, że tego typu potknięcia przemawiają za dużą samodzielnością w przygotowywaniu rozprawy. Reasumując stwierdzam, iż oceniana praca została zaplanowana, wykonana i napisana poprawnie, świadczy o wiedzy, dociekliwości naukowej Doktorantki.
5 Uważam, iż, rozprawa doktorska lek. Igi Kwiecień p.t.: Wpływ łącznego stosowania fluorków i kofeiny na aktywność wybranych enzymów wskaźnikowych oraz profil antyoksydacyjny w wątrobie szczura spełnia warunki określone w art. 13 ust. 1 ustawy z dnia 14 marca 2003 r. o stopniach naukowych i tytule naukowym oraz o stopniach i tytule w zakresie sztuki (Dz. U. Nr 65, poz. 595, z późn. zm.). W związku z powyższym przedkładam Panu Dziekanowi i Wysokiej Radzie Wydziału Lekarskiego z Oddziałem Lekarsko Dentystycznym w Zabrzu, Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Katowicach wniosek o dopuszczenie wyżej wymienionej do kolejnego etapu przewodu doktorskiego. prof. dr hab. Krzysztof Sobolewski