MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2011, 63: 321-326 Aleksandra A. Zasada Ocena wpływu zastosowanych odczynników na szybkość uzyskania wyniku identyfikacji laseczki wąglika w teście RSI-PCR dla genu plcr Zakład Bakteriologii Narodowego Instytutu Zdrowia Publicznego Państwowego Zakładu Higieny w Warszawie Kierownik: prof. dr hab. M. Jagielski Szybka i wiarygodna identyfikacja B. anthracis jest kluczowa dla podjęcia skutecznej terapii osób narażonych na kontakt z przetrwalnikami tego drobnoustroju. Zastosowanie technik biologii molekularnej znacząco skraca czas uzyskania wyniku. Jednak molekularna identyfikacja jest utrudniona przez wysokie podobieństwo genetyczne laseczek z grupy B. cereus. Wiele opracowanych testów okazało się nieswoistych. Jednakże jak dotychczas swoistość opisanego w 2007 roku testu RSI-PCR (Restriction Site Insertion - PCR) dla genu plcr do identyfikacji laseczki wąglika nie została podważona. W niniejszej pracy przedstawiono możliwość znacznego skrócenia czasu potrzebnego na uzyskanie wyniku w tym teście poprzez zastosowanie nowoczesnych, szybkich polimeraz i enzymów restrykcyjnych. Dzięki użyciu tego typu odczynników czas uzyskania wyniku metodą RSI-PCR dla genu plcr wynosi około dwóch godzin. Bacillus anthracis jest etiologicznym czynnikiem wąglika choroby występującej u zwierząt i ludzi. Ze względu na łatwość rozprzestrzeniana i wysoką śmiertelność w przypadku wziewnej ekspozycji na przetrwalniki tego drobnoustroju, B. anthracis został zakwalifikowany przez Centrum Zwalczania i Zapobiegania Chorób (Centers for Disease Control and Prevention CDC) do kategorii A czynników bioterrorystycznych (1). Szybkie i niezawodne wykrycie laseczki wąglika jest kluczowe dla podjęcia natychmiastowego właściwego leczenia lub chemioprofilaktyki u osób narażonych w przypadku celowego uwolnienia przetrwalników B. anthracis do środowiska. Bezbłędna identyfikacja tego drobnoustroju jest znacznie utrudniona przez genetyczne podobieństwo laseczki wąglika do innych gatunków bakterii należących do grupy B. cereus, które powszechnie występują w środowisku, jak np. B. thuringiensis, B. cereus (sensu stricto), B. weihenstephanensis (12). W ostatnich latach zostało opracowanych wiele różnych testów do wykrywania i identyfikacji laseczki wąglika. Głównym ich założeniem była wiarygodna identyfikacja, wysoka czułość i szybkość uzyskania wyniku. W 2007 roku został opisany przez nasz zespół badawczy test RSI-PCR (Restriction Site Insertion PCR) dla genu plcr jako markera chromosomalnego do identyfikacji B. anthracis
322 A.A. Zasada Nr 4 (6). Test ten umożliwia wykrycie mutacji nonsensownej w genie plcr - kodującym aktywator transkrypcji takich czynników jak fosfolipazy czy hemolizyny - swoistej dla B. anthracis (5, 9). W niniejszej pracy zostaną przedstawione możliwości skrócenia czasu potrzebnego na uzyskanie wyniku w tym teście dzięki zastosowaniu najnowszych, udoskonalonych odczynników do biologii molekularnej polimeraz DNA i enzymów restrykcyjnych. MATERIAŁ I METODY Szczepy bakteryjne. Materiał badań stanowiło 8 szczepów B. anthracis znajdujących się w kolekcji Zakładu Bakteriologii NIZP-PZH. Izolacja DNA. Izolację DNA przeprowadzono jak opisano wcześniej (6). W celu zapewnienia bezpieczeństwa pracy personelu oraz uniemożliwienia przypadkowego wydostania się B. anthracis do środowiska izolację DNA przeprowadzono w laboratorium trzeciej klasy bezpieczeństwa biologicznego (biosafety level 3 BSL3) NIZP-PZH z zastosowaniem odpowiednich środków ochrony osobistej (11). PCR. PCR przeprowadzono stosując trzy rodzaje polimerazy DNA: DFS-Taq DNA Polymerase (Bioron, Niemcy), Phire Hot Start II DNA Polymerase (Finnzymes, Finlandia) oraz PyroStart Fast PCR Master Mix (Fermentas, Litwa). Reakcję prowadzono w objętości 20 µl. Mieszanina reakcyjna z polimerazą DFS-Taq DNA zawierała: bufor reakcyjny complete (16 mm (NH 4 ) 2 SO 4, 67 mm TrisHCl ph 8,8, 0,01% Tweed-20, 2,5 mm MgCl 2 ), dntp ilości 200 µm każdy, startery w ilości 0,5 µm każdy, polimerazę w ilości 1,5 u oraz 2 μl matrycowego DNA (około 5-10 ng). Warunki reakcji: wstępna denaturacja w temperaturze 94ºC przez 3 min, następnie 30 cykli składających się z trzech etapów kolejno denaturacji, przyłączania starterów oraz elongacji odpowiednio w temperaturze 94ºC, 58ºC i 72ºC, każdy etap przez 45 s oraz końcowe wydłużanie przez 3 min w temperaturze 72ºC. Mieszanina reakcyjna z polimerazą Phire Hot Start II DNA zawierała: bufor reakcyjny z MgCl 2 w końcowym stężeniu 1,5 mm, dntp ilości 200 µm każdy, startery w ilości 0,5 µm każdy, polimerazę w ilości 0,4 μl (producent nie podaje stężenia) oraz 2 μl matrycowego DNA (około 5-10 ng). Warunki reakcji: wstępna denaturacja w 98 C przez 30 s, następnie 30 cykli: składających się kolejno z denaturacji w 98ºC przez 5 s, przyłączania starterów w 58ºC przez 5 s i elongacji w 72ºC przez 10 s, oraz końcowe wydłużanie przez 1 min w temperaturze 72ºC. Mieszanina reakcyjna z PyroStart Fast PCR Master Mix zawierała: master mix (producent nie podaje składu), startery w ilości 0,5 µm każdy oraz 2 μl matrycowego DNA (około 5-10 ng). Warunki reakcji: wstępna denaturacja w 95 C przez 1 min, następnie 30 cykli: składających się kolejno z denaturacji w 96ºC przez 1 s, przyłączania starterów w 58ºC przez 5 s i elongacji w 72ºC przez 25 s, oraz końcowe wydłużanie przez 10 s w temperaturze 72ºC. PCR przeprowadzono w termocyklerze Mastercycler 5333 (Eppendorf, Niemcy). Dodatkowo dla porównania reakcję z polimerazą Phire Hot Start DNA przeprowadzono również w termocyklerze Arktik (Thermo Scientific, USA). Trawienie enzymem restrykcyjnym. W celu zredukowania czasu potrzebnego na przeprowadzenie reakcji trawienia restrykcyjnego zastosowano enzym SspI typu FastDigest (Fermentas, Litwa). Do mieszaniny po reakcji PCR dodawano 2,5 μl buforu reakcyjnego oraz 1 µl enzymu (producent nie podaje stężenia). Reakcję trawienia restrykcyjnego przeprowadzono w temperaturze 37 C przez 5 min.
Nr 4 Szybka identyfikacja B. anthracis 323 Elektroforeza. Rozdział elektroforetyczny prowadzono w 2% żelu agarozowym z dodatkiem Midori Green Advanced (Nippon Genetics Europe GmbH, Niemcy) w buforze TBE. WYNIKI Zarówno w przypadku zastosowania polimerazy Phire Hot Start II DNA jak też w przypadku zastosowania PyroStart Fast PCR Master Mix w PCR dla wszystkich badanych szczepów uzyskano amplifikat o oczekiwanej wielkości 278 pz. Czas przebiegu reakcji w termocyklerze Mastercycler 5333 z polimerazą Phire Hot Start II DNA wyniósł 1 godzinę, natomiast z PyroStart Fast PCR Master Mix godzinę i 10 minut. Dla porównania reakcja z polimerazą Phire Hot Start II DNA w nowszym typie termocyklera Arktyk trwała 48 minut. Jest to znaczące skrócenie czasu PCR w porównaniu z reakcją z użyciem tradycyjnej polimerazy np. poliemerazy DFS-Taq DNA której czas przebiegu w termocyklerze Mastercycler 5333 wyniósł 2 godziny 25 minut. Pomimo ominięcia etapu oczyszczania produktu PCR przed reakcją cięcia restrykcyjnego i prowadzenia reakcji restrykcyjnej zaledwie przez 5 min stwierdzono całkowite i swoiste trawienie amplifikatów polegające na odcięciu fragmentu o wielkości 60 pz. W żelu agarozowym widoczny był pozostały fragment o wielkości 218 pz (Ryc. 1). Ryc. 1. Przykładowe elektroforegramy amplifikatu fragmentu genu plcr uzyskanego dla B. anthracis z zastosowaniem różnych polimeraz. A DFS-Taq DNA Polymerase, B Phire Hot Start II DNA Polymerase, C PyroStart Fast PCR Master Mix. Oznaczenia ścieżek: M GeneRuler 100bp DNA Ladder, 1 amplifikat fragmentu genu plcr B. anthracis, 2 amplifikat fragmentu genu plcr B. anthracis po trawieniu enzymem SspI.
324 A.A. Zasada Nr 4 DYSKUSJA Tradycyjną metodą identyfikacji laseczki wąglika jest ocena właściwości hemolitycznych na podłożu z krwią, ocena zdolności ruchu, wrażliwości na penicylinę oraz bakteriofaga gamma (10). Jednakże jest to metoda niezwykle czasochłonna. Ze względu na to, iż dla zdrowia i życia osób narażonych na kontakt z przetrwalnikami B. anthracis kluczową rolę odgrywa szybkość rozpoznania czynnika chorobotwórczego, rozwój technik wykrywania i identyfikacji laseczki wąglika podąża w kierunku maksymalnego skrócenia czasu potrzebnego na uzyskanie wyniku. Z tego też powodu PCR został uznany za jedną z głównych metod identyfikacji tego patogenu (3). Aby jeszcze bardziej przyspieszyć uzyskanie wyniku wykorzystano technologię real-time PCR, która pozwala nie tylko na odczyt powstającego amplifikatu już w czasie trwania reakcji, ale także wykrycia określonych zmian w sekwecji nukleotydowanej poprzez zastosowanie odpowiednio zaprojektowanej sondy molekularnej (np. MGB minor groove binder) lub zmian w profilu topnienia produktu PCR (np. High- -Resolution Melting) (4, 7). Jednakże aparatura do real-time PCR jest znacznie droższa niż tradycyjny termocykler wraz z zestawem do elektroforezy. Przeprowadzone w niniejszej pracy porównanie trzech polimeraz tradycyjnej oraz dwóch szybkich wykazało największe skrócenie czasu przebiegu PCR przy zastosowaniu polimerazy Phire Hot Start II DNA. Zastosowanie tej polimerazy pozwoliło skrócić czas przebiegu reakcji amplifikacji o 1 godzinę i 25 minut (58,6%). Pomimo, że czas przebiegu reakcji z użyciem PyroStart Fast PCR Master Mix był o 10 min dłuższy niż przy zastosowaniu polimerazy Phire Hot Start II DNA, różnica ta nie miała dużego wpływu na całkowity czas badania, ponieważ zastosowanie gotowej mieszaniny zawierającej wszystkie niezbędne składniki z wyjątkiem starterów i matrycowego DNA skraca czas przygotowania mieszaniny reakcyjnej. Zwraca uwagę fakt, że znaczący wpływ na szybkość uzyskania wyniku oprócz właściwości stosowanych polimeraz ma szybkość zmian temperatury w termocyklerze, zarówno tradycyjnym jak też typu real-time. Przeprowadzone w niniejszej pracy porównanie dwóch tradycyjnych termocyklerów wykazało różnicę w czasie przebiegu reakcji wynoszącą 12 min (20%). Porównanie dwóch aparatów real-time PCR RAZOR i Applied Biosystems Tabela I. Wybrane metody identyfikacji B. anthracis z zastosowaniem aparatury real-time PCR opisane w piśmiennictwie. Metoda Wykrywanie genów paga i capb Wykrywanie genów paga i capb High-Resolution Melting dla swoistych fragmentów genów plcr i gyra Wykrywanie genów paga i capb Termocykler ABI 7300/7500 (Applied Biosystems) RAZOR (Idaho Technology Inc.) LightCycler 480 (Roche Diagnostics) LightCycler (Roche Applied Science) Czas uzyskania wyniku Pozycja piśmiennictwa 100 min (8) 40 min (8) 60 min (4) 1 h (2)
Nr 4 Szybka identyfikacja B. anthracis 325 7300/7500 przeprowadzone przez Matero i wsp. wykazało jeszcze większą różnicę w czasie reakcji sięgającą aż 60% (8). W tabeli I przedstawiono przykładowe czasy niezbędne dla uzyskania wyniku w zależności od zastosowanego typu wyposażenia. Znaczny wpływ na skrócenie czasu potrzebnego na uzyskanie wyniku identyfikacji B. anthracis metodą RSI-PCR dla genu plcr ma rodzaj zastosowanego enzymu restrykcyjnego. Trawienie amplifikatu PCR tradycyjnym enzymem restrykcyjnym wymaga inkubacji przez 1-16 godzin. Natomiast zastosowanie enzymu restrykcyjnego typu FastDigest pozwala skrócić czas reakcji trawienia do zaledwie 5 minut. W niniejszej pracy nie omówiono wpływu metody izolacji DNA na czas potrzebny na uzyskanie wyniku identyfikacji od chwili przyjęcia próbki do laboratorium. Jednak ze względu na różnorodność metod stosownych do izolacji DNA w zależności od rodzaju próbki (kliniczna, środowiskowa, czysta hodowla bakteryjna) jest to zagadnienie złożone i jego pełne omówienie wymaga oddzielnej publikacji. Podsumowując, zastosowanie wprowadzonych w ostatnim czasie na polski rynek nowoczesnych szybkich odczynników do biologii molekularnej pozwala skrócić czas niezbędny na uzyskanie wyniku identyfikacji B. anthracis metodą RSI-PCR dla genu plcr do około dwóch godzin. Dzięki temu czas ten jest niewiele dłuższy od czasu potrzebnego na uzyskanie wyniku w przypadku zastosowania techniki real-time PCR. A.A. Zasada Evaluation of molecular biology reagents used in plcr-tergeted RSI-PCR assay for B. anthracis identification and their influence on time necessary for obtaining results SUMMARY Fast and reliable identification of B. anthracis is crucial for a successful therapy of persons exposed to anthrax spores. Use of molecular biology techniques significantly reduces time necessary for obtaining results. However, the molecular identification is hampered by the high genetic similarity of the B. cereus group bacteria. A lot of published B. antharcis identification approaches turned out to be non-specific. Nevertheless, the plcr-targeted RSI-PCR assay described in 2007 is still regarded as highly specific for anthrax identification. In this paper possibility of significant reduction of time necessary for obtaining results by the use of modern, fast polymerases and restriction enzymes will be presented. The use of a such reagents enable to reduce time of the plcr-targeted RSI-PCR assay to about two hours. PIŚMIENNICTWO 1. Centers for Disease Control and Prevention. Bioterrorism agents/diseases. http://emergency.cdc. gov/agent/agentlist-category.asp 2. Bell CA, Uhl JR, Hadfield TL i inni. Detection of Bacillus anthracis DNA by LightCycler PCR. J Clin Microbiol 2002; 40: 2897-02. 3. Budowle B, Beaudry JA, Barnaby NG i inni. Role of law enforcement response and microbial forensics in investigation of bioterrorism. Croat Med J 2007; 48: 439-49.
326 A.A. Zasada Nr 4 4. Derzelle S, Mendy C, Laroche S, Madani N. Use of high-resolution melting and melting temperature-shift assay for specific detection and identification of Bacillus anthracis based on single nucleotide discrimination. J Microbiol Methods 2011; 87: 195-201. 5. Ellerbrok H, Nattermann H, Ozel M i inni. Rapid and sensitive identification of pathogenic and apathogenic Bacillus anthracis by real-time PCR. FEMS Microbiol Lett 2002; 214: 51-59. 6. Gieczyński R, Zasada AA, Raddadi N i inni. Specific Bacillus anthracis identification by a plcrtargeted restriction site insertion-pcr (RSI-PCR) assay. FEMS Microbiol Lett 2007; 272: 55-59. 7. Hurtle W, Bode E, Kulesh DA i inni. Detection of the Bacillus anthracis gyra gene using a minor groove binder probe. J Clin Microbiol 2004; 42: 179-85. 8. Matero P, Hemmila H, Tomaso H, Piiparinen H i inni. Rapid field identification assay for Bacillus anthracis, Brucela spp., Francisella tularensis and Yersinia pestis. Clin Microbiol Infect 2011; 17: 34-43. 9. Slamti L, Perchat S, Gominet M i inni. Distinct mutations in PlcR explain why some strains of the Bacillus cereus group are nonhemolytic. J Bacteriol 2004; 186: 3531-38. 10. Turnbull PCB. Wąglik u ludzi i zwierząt, zapobieganie oraz zwalczanie przewodnik. WHO, Wydanie III, Puławy 2000. 11. Zasada AA, Gierczyński R, Rzeczkowska M i inni. Wykrywanie i identyfikacja wysoce patogennych bakterii w ramach międzynarodowego projektu EQADeBa Część I: Próbki zawierające żywe patogeny. Przegl Epidem 2011; 65: 401-7. 12. Zasada AA, Jagielski M. Ocena przydatności wybranych chromosomalnych markerów do identyfikacji Bacillus anthracis. I. Ocena markerów SG-749, SG-450 i SG-300. Med Dośw Mikrobiol 2006; 58: 347-54. Otrzymano: 21 XI 2011 r. Adres Autora: 00-791 Warszawa, ul. Chocimska 24, Zakład Bakteriologii NIZP-PZH