MOLEKULARNE PODSTAWY ODPORNOŚCI MIOTŁY ZBOŻOWEJ (APERA SPICA-VENTI L.) NA HERBICYDY SULFONYLOMOCZNIKOWE

Transkrypt

1 Progress in Plant Protection / Postępy w Ochronie Roślin, 47 (3) 2007 MOLEKULARNE PODSTAWY ODPORNOŚCI MIOTŁY ZBOŻOWEJ (APERA SPICA-VENTI L.) NA HERBICYDY SULFONYLOMOCZNIKOWE MICHAŁ KRYSIAK 1, MAGDALENA BASIEWICZ 1, STANISŁAW GAWROŃSKI 1, ROMAN KIERZEK 2, KAZIMIERZ ADAMCZEWSKI 2 1 Szkoła Główna Gospodarstwa Wiejskiego Samodzielny Zakład Przyrodniczych Podstaw Ogrodnictwa Nowoursynowska 159, Warszawa michalkrysiak@interia.pl 2 Instytut Ochrony Roślin Zakład Herbologii i Techniki Ochrony Roślin Władysława Węgorka 20, Poznań I. WSTĘP Herbicydy z grupy inhibitorów syntazy acetylomleczanowej (ALS) np. pochodne sulfonylomocznikowe, są obecnie jednymi z najczęściej stosowanych środków chwastobójczych na świecie. Również w Polsce w ochronie przed chwastami ta grupa herbicydów odgrywa coraz bardziej istotną rolę. Masowość stosowania, przy ograniczonej rotacji z herbicydami o innych mechanizmach działania, sprzyja pojawieniu się biotypów chwastów odpornych na te preparaty (Saari i wsp. 1994). Na świecie obecnie zanotowano 95 biotypów roślin odpornych na inhibitory ALS, w tym 18 gatunków traw ( W ostatnich latach stwierdzono pojawienie się odpornych biotypów miotły zbożowej również na naszych polach. Syntaza acetylomleczanowa wykazuje dużą zmienność międzygatunkową, jednakże w strukturze tego białka zlokalizowane są domeny o niskiej zmienności, ze względu na pełnione przez nie funkcje metaboliczne. Mutacje zlokalizowane w odcinkach genu als, odpowiadających domenom o wysokiej konserwatywności, są prawdopodobną przyczyną niewrażliwości tego enzymu na herbicydy sulfonylomocznikowe. Wyróżnia się domenę A, znajdującą się w obszarze sekwencji aminokwasowej oraz domenę B w obrębie aminokwasów (Gressel 2002); jako standard do numeracji przyjęto sekwencję aminokwasowi białkowego prekursora ALS Arabidopsis thaliana. Pomiędzy tymi dwoma domenami występuje duży obszar sekwencji niekonserwatywnej. Celem badań była identyfikacja, w domenach A i B genu als, mutacji warunkujących odporność biotypów miotły zbożowej na herbicydy sulfonylomocznikowe.

2 Molekularne podstawy odporności miotły zbożowej II. MATERIAŁY I METODY Materiał roślinny i izolacja DNA Przebadano 5 biotypów miotły zbożowej o zróżnicowanej odporności na herbicydy sulfonylomocznikowe. Biotypy te opisano jako: R biotyp odporny, 2R biotyp odporny (analizowano dwa biotypy odporne), MR średnio odporny, MS średnio wrażliwy oraz S wrażliwy. Biotyp S pochodził ze stanowisk naturalnych. Biotypy określone jako odporne znosiły dawkę 53 g/ha chlorosulfuronu, przy zalecanej dawce g/ha. Izolację całkowitego DNA z badanych roślin przeprowadzono z wykorzystaniem odczynnika CTAB według zmodyfikowanej metody Doyle i Doyle (1987). Projektowanie starterów i amplifikacja domen Domeny A i B genu als amplifikowano techniką PCR. Ponieważ w dostępnych bazach danych nie figurują sekwencje nukleotydowe genu als miotły zbożowej, startery zaprojektowano do sekwencji mrna białkowego prekursora ALS u Lolium multiflorum (numer w Banku Genów: AF310684). Zaprojektowano 6 par starterów, z których, po optymalizacji PCR, do dalszych badań wybrano 2. PCR przeprowadzono przy stężeniu 1 μm każdego ze starterów, 25 mm MgCl 2 oraz 0,2 mm dntp. Koncentracja matrycowego DNA wynosiła 100 ng a polimerazy Taq (Fermentas) 1,25 U na 15 μl mieszaniny reakcyjnej. Program PCR rozpoczynał się 5 minutami wstępnej denaturacji w 95ºC, a każdy z kolejnych 40 cykli składał się z: 30 s w 95ºC (denaturacja), 30 s w 52ºC (przyłączanie starterów) oraz 40 s w 72ºC (elongacji). Reakcja kończył się 5 minutami elongacji w 72ºC. Otrzymane produkty PCR poddawano elektroforezie na żelu agarozowym z dodatkiem bromkiem etydyny, następnie interesujące fragmenty wycinano z żelu i reizolowano z nich DNA. Wyizolowane DNA poddawano powtórnej amplifikacji. Powtórną amplifikację DNA prowadzono wg opisanego wyżej programu ze zmianą liczby cykli na 30. Sekwencjonowanie i analiza sekwencji Sekwencjonowano bezpośrednio produkt reakcji PCR, przy czym obie nici DNA były sekwencjonowane w celu wykluczenia ewentualnych błędów sekwenatora. Sekwencjonowanie wykonano w Zakładzie Biologii Molekularnej Centrum Onkologii im. Marii Skłodowskiej-Curie w Warszawie. Uzyskane sekwencje nukleotydowe przepisywano na sekwencje białkowe w programie Transeq, a następnie porównywano w programie Clustal W. Amplifikacja domen III. WYNIKI I ICH OMÓWIENIE Użycie zaprojektowanych starterów (alsbf: 5 CCAGGTGGTCACAGTTGTT 3 i alsbr: 5 AATGTCCTTGAAAGCACC 3 ) wraz z optymalizacją PCR, umożliwiło

3 166 Progress in Plant Protection / Postępy w Ochronie Roślin, 47 (3) 2007 powielenie domeny B. Ponieważ nie udało się wyeliminować syntezy produktów ubocznych, konieczna była izolacja głównego produktu PCR z żelu agarozowego, jego oczyszczenie i ponowna amplifikacja przed sekwencjonowaniem. Ponowna amplifikacja pozwoliła uzyskać wystarczająco specyficzny produkt dla potrzeb sekwencjonowania (rys. 1). Rys. 1. Rozdział elektroforetyczny produktu ponownej amplifikacji domeny B genu als R, R2, MR, MS, S badane biotypy miotły zbożowej, K kontrola negatywna, M marker wielkości Fig. 1. Electrophoresis of the als gene domain B reamplification product R, R2, MR, MS, S investigated biotypes of wind bentgrass, K negative control, M size marker Sekwencjonowane Porównanie sekwencji nukleotydowych i aminokwasowych domeny B ujawniło 3 mutacje (rys. 2), z czego mutacja Val 571 Glu wystąpiła tylko u biotypu MS, muta cja Phe 657 Ser tylko u biotypu R, mutacja Arg 611 Pro: u wszystkich biotypów uodpornionych: R, R2, MR i MS. W badanych biotypach nie wykryto charakterystycznych dla innych gatunków mutacji Trp 574 i Ser 653. Startery zaprojektowane dla domeny A rajgrasu nie pozwoliły amplifikować jej u miotły zbożowej wystarczająco specyficznie dla celów sekwencjonowania.

4 Molekularne podstawy odporności miotły zbożowej Rys. 2. Porównanie sekwencji aminokwasowych domeny B ALS R, R2, MR, MS, S badane biotypy miotły zbożowej. Pogrubioną czcionką zaznaczone są miejsca mutacji. Nr nad miejscem mutacji oznacza pozycję aminokwasu w białku (jako standard numeracji przyjęto sekwencję białkowego prekursora ALS u A. thaliana) Fig. 2. Comparison of the domain B sequences in ALS R, R2, MR, MS, S investigated biotypes of wind bentgrass. Mutations are marked with bold type. The number above the mutation is the aminoacid s position in protein (the numbers are standarized to the numeration of aminoacids of A. thaliana s ALS precursor protein) Podsumowanie W zanalizowanej części genu als odnaleziono trzy mutacje punktowe, których efektem jest zamiana 3 aminokwasów w białku ALS. Zmienione aminokwasy w ALS biotypów odpornych mają różny charakter chemiczny od wyjściowych aminokwasów biotypu wrażliwego. Mogą one istotnie zmieniać konformację domeny B w dojrzałym enzymie i prowadzić do jego niewrażliwości na herbicydy sulfonylomocznikowe. Odnalezione mutacje nie wyjaśniają jednak w pełni tak wysokiego zróżnicowania w odporności na herbicydy sulfonylomocznikowe badanych biotypów, niezbędna jest również analiza molekularna domeny A, nad którą prace są kontynuowane. IV. LITERATURA Doyle J.J., Doyle J.L A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue. Phytochem. Bull. 19: Gressel J Molecular Biology of Weed Control. Taylor & Francis, London and New York, 504 ss. Saari L.L., Cotterman J.C., Thill D.C Resistance to acetolactate synthase-inhibiting herbicides. s W: Herbicide Resistance in Plants (S.B. Powles, J.A.M. Holtum, red.). Lewis Publishers, Boca Raton, Florida, 353 ss.

5 168 Progress in Plant Protection / Postępy w Ochronie Roślin, 47 (3) 2007 MICHAŁ KRYSIAK, MAGDALENA BASIEWICZ, STANISŁAW GAWROŃSKI, ROMAN KIERZEK, KAZIMIERZ ADAMCZEWSKI MOLECULAR BASIS OF WIND BENTGRASS RESISTANCE TO SULFONYLUREA HERBICIDES SUMMARY The intensive use of acetolactate synthase (ALS) inhibitors for crop protection, has caused many cases of weeds' resistance to these herbicides. Resistant to sulfonylureas biotypes of wind bentgrass have appeared also in Poland. In order to investigate molecular basis of this resistance, we analyzed 5 biotypes with various levels of resistance to chlorsulfuron. The domain B of the als gene from the analyzed biotypes was amplified, using PCR, and then sequenced. The comparison of the obtained sequences revealed 3 point mutations that may have been the cause of the resistance in analyzed biotypes. The mutations explain only partially the difference in the level of resistance, therefore, analyzing of the domain A is necessary. Key words: ALS inhibitors, resistance, Apera spica-venti, mutations