Zagadnienia omawiane na wykładzie:

Zagadnienia omawiane na wykładzie: 1. Podsumowanie metody modelowania molekularnego 2. Analiza wyników symulacji dynamiki molekularneji weryfikacja modelu 3. Optymalizacja struktury na przykładziebiałka rozpuszczalnego 4. Zastosowanie modelowania molekularnego w badaniach błon lipidowych 5. Zastosowanie modelowania molekularnego do badania mechanizmu działania i specyficzności peptydów antybakteryjnych 6. Zastosowanie modelowania molekularnego w badaniach białek błonowych 7. Analiza konformacyjna polipeptydów 1

Wykład III Optymalizacja struktury na przykładzie białka rozpuszczalnego Omawiane zagadnienia: 1. Przestrzeń konformacyjna a. konformacja a konfiguracja b. miara w przestrzeni konformacyjnej 4. Przeszukiwanie przestrzeni konformacyjnej 5. Symulowane wyżarzanie a. przykłady zastosowań 2

Mechanika Molekularna Poszukiwanie optymalnej struktury cząsteczki (układu cząstek) jest możliwe dzięki temu, że jej energia potencjalna jednoznacznie zależy od jej aktualnej struktury przestrzennej, tj., od aktualnego położenia atomów tworzących cząsteczkę : Epot = Epot(R) 2 2 = K b b K θ θ E pot R b 0 θ 0 b θ [ ] r ε r ij i j 12 r 2 r ij ϕ 6 i j Vn 2 [ 1 cos nϕ ϕ 0 ] qi q j ε r ij Ścisły związek struktury cząsteczki z jej energią!! 3

Mechanika Molekularna Optymalizując strukturę układu, szukamy punktu przestrzeni konfiguracyjnej (współrzędnych), w którym pochodne funkcji potencjału po położeniu każdego atomu znikają, tj. siły działające na każdy atom są równe zero (struktura optymalna) Musi więc być spełniona równości w 3N-wymiarowej przestrzeni konfiguracyjnej: k { 1,, N } V r 1,, r N rk =0 r k = r k = x k, y k, z k 4

Mechanika Molekularna Metody gradientowe umożliwiają najczęściej znalezienie struktury stabilnej lokalnie Lokalna stabilność ogranicza się do względnie małego wycinka przestrzeni konfiguracyjnej 5

Struktura układu molekularnego Często znalezienie lokalnie stabilnej struktury układu molekularnego jest wynikiem satysfakcjonującym, szczególnie, gdy w następnym kroku układ poddajemy symulacji dynamiki molekularnej Często jednak chcemy znaleźć natywną strukturę białka 6

Struktura białka Natywna struktura białka odpowiada globalnemu minimum funkcji Wiemy już, że jeśli znamy tylko sekwencję aminokwasową białka, znalezienie jego struktury przestrzennej metodą szukania globalnego minimum funkcji jest bardzo trudne, jeśli nie niemożliwe Strukturę przestrzenną białka możemy czasem przewidzieć w drodze modelowania porównawczego (homology modelling wzorzec) wykorzystując fakt, że białka spokrewnione ewolucyjnie i mające podobne sekwencje mają często podobne struktury przestrzenne 7

Protein folding DNA -CUA-AAA-GAA-GGU-GUU-AGC-AAG-GUU- protein sequence -L-K-E-G-V-S-K-D- one amino acid unfolded protein spontaneous self-organisation (~1 second) native state From: Ram Samudrala University of Washington not unique mobile inactive expanded irregular unique shape precisely ordered stable/functional globular/compact helices and sheets 8

Skąd się bierze problem ze znalezieniem globalnego minimum funkcji potencjału? Stąd, że nie potrafimy skutecznie przeszukiwać przestrzeni konformacyjnej cząsteczki 10

Konformacja cząsteczki Konformacja cząsteczki : (względne) położenia wszystkich atomów tworzących cząsteczkę w przestrzeni 3D Informację o konformacji białka można zapisać w dwóch zbiorach: a. zbiorze współrzędnych wszystkich atomów b. zbiorze wszystkich kątów torsyjnych (φ-χ-ψ) 11

Przestrzeń konformacyjna Przestrzeń konformacyjna : przestrzeń (zbiór) wszystkich konformacji cząsteczki 12

Konformacja Konfiguracja Pojęcia konformacja i konfiguracja nie są zamienne Konformacja określa chwilowe położenia przestrzenne atomów wynikające z rotacji wokół wiązań, deformacji kątów walencyjnych oraz drgań oscylacyjnych wiązań znaczy to: że jeden stan konformacyjny można przeprowadzić w drugi bez zrywania wiązań kowalencyjnych (wynikają z oddziaływań wiążących) 14

Konformacja Konfiguracja Pojęcia konformacja i konfiguracja nie są zamienne Konfiguracja określa struktury atomowe, których nie można wzajemnie przekształcić, tj. przeprowadzić jedną w drugą bez rozrywania wiązań (grupy chiralne, struktury enancjomeryczne) 15

Konfiguracja (absolutna) cząsteczki Informacja o konfiguracji cząsteczki zapisana jest tylko w zbiorze współrzędnych wszystkich atomów Bardzo ważne są pozycje atomów wodoru, jeśli ich brak to pojawia się problem z centrami chiralnymi Lustrzane odbicie en.wikipedia.org/wiki/chirality 16

Miara w przestrzeni konformacyjnej Miara w przestrzeni konformacyjnej : parametr mówiący jak dobrze możemy nałożyć na siebie atomy dwóch konformacji (A i B) cząsteczki Miara : RMSD = Root Mean Square Displacement (Distance) RMSD = pierwiastek ze średniego kwadratu różnicy położeń kolejnych atomów w obu konformacjach (A i B) [ N 1 2 RMSD= ai bi N i=1 ] 1 2 gdy A=B RMSD = 0 a, b współrzędne atomów cząsteczki w konformacji A i B i numeruje kolejne atomy cząsteczki w konformacji A i B N liczba atomów w cząsteczce, lub porównywanym fragmencie cząsteczki 18

RMSD, Root Mean Square Displacement (Distance) [ N 1 2 RMSD= ai bi N i=1 ] 1 2 19

Przestrzeń konformacyjna Jak można zwiększyć skuteczność przeszukiwania przestrzeni konformacyjnej cząsteczki?? 1. Przeprowadzić bardzo długą symulację dynamiki molekularnej układu 1. Przeprowadzić symulowane wyżarzanie (znacznie krótsze) 21

Etapy symulacji dynamiki molekularnej: 3. Budowa i inicjowanie układu molekularnego (wizualizacja, wstępna optymalizacja) 5. Równoważenie układu symulacja dynamiki molekularnej, w czasie której układ dochodzi do równowagi (termicznej, nie termodynamicznej); tego fragmentu trajektorii nie analizujemy a priori nie wiadomo jak długo trwa równoważenie układu 7. Symulacja robocza symulacja dynamiki molekularnej generująca trajektorię, którą można poddać analizom 22

W procesie minimalizacji energii, równoważenia układu i symulacji dynamiki molekularnej przeszukiwana jest tylko mała część przestrzeni konformacyjnej stany termicznie dostępne 23

Symulowane wyżarzanie Symulowane wyżarzanie najczęściej stosuje się do globalnej optymalizacji struktur 1. w których wprowadzono stosunkowo niewielkie zmiany, np. wymieniono lub usunięto pojedyncze reszty aminokwasowe 1. zbudowanych kompleksów cząsteczkowych 1. uściślania struktur wyznaczonych eksperymentalnie 25

Symulowane wyżarzanie (hartowanie) Wyżarzanie (annealing) jest terminem wziętym z metalurgii. Wyżarzanie jest procesem, w którym metal jest podgrzewany do bardzo wysokiej temperatury. W tej temperaturze atomy podlegają szybkim ruchom. Jeśli podgrzaną próbkę bardzo wolno schładzamy, to atomy tworzą nowe uporządkowane struktury lokalne, co powoduje, że struktura całego metalu staje się bardziej zwarta i wytrzymała niż w stanie wyjściowym (hartowanie stali) Ta zasada poprawy struktury została wykorzystana w numerycznych procesach optymalizacji 26

www.phys.uni.torun.pl/~duch/wykłady (sztuczna inteligencja) 27

Symulowane wyżarzanie (hartowanie) Symulowane wyżarzanie (simulated annealing) jest podobnym procesem przeprowadzanym numerycznie na makrocząsteczce, w celu uniknięcia problemu lokalnych minimów w procesie optymalizacji struktury Ta metoda optymalizacji globalnej makrocząsteczek została opracowana przez grupę: S. Kirkpartick, C.D. Gelatt i M.P. Vecchi i opisana w Science 220, 671, 1983. 28

Symulowane wyżarzanie Symulowane wyżarzanie jest wariantem symulacji dynamiki molekularnej, w którym zmieniamy parametry obliczeń tak, aby układ osiągnął większą swobodę Najczęściej zmienia się temperaturę układu (ale nie tylko, np. masy atomów) według zadanego profilu czasowego Umożliwia to lepszą penetrację przestrzeni konformacyjnej 29

W symulacji dynamiki molekularnej przeszukiwana są stany termicznie dostępne im wyższe T, tym większą część przestrzeni konformacyjnej możemy przeszukać 30

Symulowane wyżarzanie umożliwia pokonanie barier energetycznych i przejścia do stanów konformacyjnych o niższej energii niż lokalne minima obsadzane w procesie minimalizacji energii czy symulacji dynamiki molekularnej http://cmm.cit.nih.gov/intro_simulation/ 31

Hipotetyczne trajektorie cząstki w symulacjach dynamiki molekularnej (na lewo) i w symulowanym wyżarzaniu (na prawo). Jasne obszary oznaczają fragmenty przestrzeni konfiguracyjnej o niskiej energii potencjalnej, a ciemniejsze o wysokiej (bariera potencjału). Pozostały obszar jest zabroniony dla cząstki. Widoczna jest różnica w zdolności penetracji przestrzeni konfiguracyjnej przez obie techniki. 32

Schemat procesu symulowanego wyżarzania W metodzie symulowanego wyżarzania prowadzimy symulacje dynamiki molekularnej w wysokiej temperaturze (tu, 500K), a następnie w temperaturze stopniowo obniżanej do zadanej 33

Energia kinetyczna schładzanej cząsteczki Zależność energii kinetycznej (krzyżyki czarne) i całkowitej (kwadraty szare) od czasu schładzania podczas symulowanego wyżarzania cząsteczki białka 34

Podnoszenie i obniżanie temperatury zwiększa lub zmniejsza energię kinetyczną cząsteczki białka, ale nie powinno prowadzić do jego denaturacji 35

Denaturacja białka http://pl.wikipedia.org/wiki/denaturacja_białka Denaturacją białka nazywamy zmiany w III- i IV-rzędowej strukturze białka natywnego, które prowadzą do utraty aktywności biologicznej lub innej indywidualnej cechy charakterystycznej tego białka przy zachowaniu jego struktury pierwszorzędowej Podczas denaturacji niszczone są wiązania wodorowe, a w obecności odczynników redukujących zerwaniu ulegają wiązania disulfidowe Najważniejszymi metodami fizycznymi denaturacji są: ogrzewanie, silne mieszanie, ph, wytrząsanie, naświetlanie itp. Podczas denaturacji obserwuje się m. in. procesy agregacji i wytrącania 36

Denaturacja białka http://pl.wikipedia.org/wiki/renaturacja_białka Denaturacja może być procesem odwracalnym lub nieodwracalnym Renaturacja jest procesem odwrotnym do denaturacji Renaturacja polega na przywracaniu II- i III-rzędowej budowy prostych białek, poprzez powolne powracanie do warunków przed denaturacją (np. ochładzania) i dotyczy wielu małych cząsteczek białek. Renaturacja stanowi dowód na to, że cała informacja o budowie białka (II- i III-rzędowej) jest zawarta w sekwencji aminokwasów, która nie ulega zmianie podczas denaturacji Struktura IV-rzędowa nie jest podczas tego procesu odtwarzana Sekwencja aminokwasowa białka determinuje jego strukturę przestrzenna C. B. Anfinsen, Nobel Lecture, 1972; Science, 1973, 181, 223-230 37

Symulowane wyżarzanie Metodycznie, jest to proces w którym prowadzimy (b) symulację dynamiki molekularnej w wysokiej temperaturze, a następnie dla 10-20 gorących struktur prowadzimy (b) symulację w stopniowo obniżanej temperaturze oraz (c) optymalizacji schłodzonych struktur Na końcu przeprowadzamy analizę porównawczą zoptymalizowanych struktur 38

Symulowane wyżarzanie stosujemy w celu wygenerowania zespołu zróżnicowanych (kryterium RMSD) i stabilnych (kryterium energetyczne) struktur cząsteczki (układu cząsteczek) wykazujących zgodność z danymi doświadczalnymi 40

Kryterium RMSD Obliczenie RMSD wymaga optymalnego nałożenia na siebie kolejnych par wygenerowanych struktur (konformacji A i B) N 2 min{ ai bi } i=1 Nie-optymalnie nałożone na siebie struktury Optymalnie nałożone na siebie struktury 41

Kryterium RMSD Parametr RMSD pozwala oszacować różnice strukturalne między dwiema optymalnie nałożonymi na siebie konformacjami tej samej cząsteczki RMSD l = r l r ri i i 2 i REF jest współrzędną położenia atomu i REF oznacza strukturę odniesienia l numeruje kolejne struktury porównywane z REF <> oznacza średniowanie po wszystkich (porównywanych) atomach w cząsteczce sumowanie przebiega po kolejnych atomach i 42

Kryterium RMSD RMSD jest parametrem uśrednionym średnim izotropowym odchyleniem kwadratowym (dla całej cząsteczki) Najczęściej RMSD oblicza się dla atomów C łańcucha peptydowego lub jedynie Cα, zaniedbując pozostałe atomy w cząsteczce 43

Przykład Zastosowanie symulowanego wyżarzania do optymalizacji struktury cząsteczki białka zmodyfikowanej metodami modelowania molekularnego Problem badawczy: Zbudowanie i optymalizacja struktury mutanta Z α1-antytrypsyny. 45

Przykład Zastosowanie symulowanego wyżarzania do optymalizacji struktury cząsteczki białka zmodyfikowanej metodami modelowania molekularnego Synteza mutanta Z α1-antytrypsyny u ludzi jest wynikiem genetycznie uwarunkowanej mutacji genu kodującego α1antytrypsynę prowadzi to do niedoboru α1-antytrypsyny w organizmie i jest przyczyną poważnych chorób, np. marskości wątroby i rozedmy płuc 46

Struktura przestrzenne formy natywnej ludzkiej α1-antytrypsyny została rozwiązana metodami eksperymentalnymi Graficzna reprezentacja elementów struktury drugorzędowej α1antytrypsyny: czerwone walce oznaczają helisy α, błękitne paski struktur β; pozostałe odcinki łańcucha są w kolorze szarym. Oznaczenia: ha,..., hi - dziewięć helis ponumerowanych kolejno od A do I. Łańcuch β nr 2 (kolor ciemnoróżowy) w arkuszu C oznaczono symbolem s2c. Wizualizacji struktury krystalicznej typu dzikiego ludzkiej α1-antytrypsyny w formie natywnej [Elliott98]. 47

Naturalny mutant Z antytrypsyny powstaje przez wymianę Glu342 Lys Struktura przestrzenna mutanta Z nie jest znana Glu342 położony jest w miejscu spojenia pętli reaktywnej z arkuszem A 48

W typie dzikim α1-antytrypsyny Glu342 leży blisko Lys290 (w przestrzeni) 49

Ujemnie naładowany Glu342 i dodatnio naładowana Lys290 tworzą mostek solny Uważa się, że to oddziaływanie ogranicza ruchliwość pętli reaktywnej Cząsteczki α1-antytrypsyny w roztworze występują w formie monomerów 50

Wymiana Glu342 Lys powoduje, że w mutancie Z α1antytrypsyny nie tworzy się mostek solny w miejscu spojenia pętli reaktywnej z arkuszem A (dwie Lys) 51

Cząsteczki mutanta Z α1-antytrypsyny w roztworze polimeryzują Z powodu polimeryzacji dotąd nie udało się rozwiązać struktury przestrzennej mutanta Z α1-antytrypsyny metodami eksperymentalnymi 52

Przewidywanie struktury przestrzennej mutanta Z antytrypsyny metodami modelowania molekularnego 1. Model mutanta Z zbudowano w oparciu o znaną strukturę przestrzenną formy natywnej antytrypsyny poprzez wymianę łańcucha bocznego kwasu glutaminowgo Glu342 na łańcuch boczny lizyny. Obie reszty występują w cząsteczce białka w formie zjonizowanej (Glu 1, Lys +1) Kwas glutaminowy Lizyna 53

1. Otrzymaną strukturę wstępnie zoptymalizowano w procesie minimalizacji energii stosując metodę największych spadków i sprzężonych gradientów (krok niezbędny przed prowadzeniem symulacji dynamiki molekularnej) 3. Tak zoptymalizowaną strukturę poddano procedurze symulowanego wyżarzania (SA) według opisanego już schematu 54

Czas symulacji wysoko-temperaturowej wynosił 200 ps (linia szara). Co 10 ps, aktualnie wygenerowana struktura wysokotemperaturowa była poddawana innej symulacji w warunkach powolnego schładzania do temperatury 310K 55

Krzywa schładzania (linia czarna) jest eksponencjalna zgodnie ze wzorem: T = 308,18 [K] + 191,81 exp(-t/8,58) [K] W sumie schłodzono 20 struktur (200ps/10ps=20) 56

1. Na kąty torsyjne i ψ we fragmentach łańcucha o strukturze helisy i kartki nałożono paraboliczny potencjał ograniczający (więzy), a w pozostałych fragmentach łańcucha potencjał z płaskim dnem w idealnej α-helisie φ i ψ wynoszą: 57 i 47 w idealnej formie β φ i ψ wynoszą: 139 i +135 Współrzędna uogólniona ξ oznacza tutaj kąt torsyjny 57

Struktura II-rzędowa białka Więzy narzucone na kąty φ i ψ (bardziej restrykcyjne we fragmentach łańcucha o strukturze α-helisy i β-kartki i mniej restrykcyjne w pozostałych fragmentach) zagwarantowały zachowanie struktury II-rzędowej białka (stosuje się też więzy odległościowe, porównaj NMR) 58

1. W wyniku otrzymano 20 struktur schłodzonych (co 10 ps prowadzono równoległą symulacje w schładzanym układzie) 2. Każdą z nich poddano dalszej optymalizacji w procesie minimalizacji energii 3. Typ dziki antytrypsyny poddano analogicznej procedurze 59

Wyniki symulowanego wyżarzania, kryterium energetyczne Porównano energię 20 końcowych struktur mutanta Z oraz typu dzikiego α1-antytrypsyny Różnica między najmniejszą i największą wartością energii wynosiła 2.3% (432 kcal/mol) dla struktur mutanta Z (20 struktur) 4.0% (773 kcal/mol) dla struktur typu dzikiego (20 struktur) 60

Wyniki symulowanego wyżarzania, kryterium RMSD Różnice wartości parametru RMSD pokazuje macierz rozbieżności (reprezentacja barwna) RMSD obliczone dla fragmentów 20 struktur uzyskanych w trakcie SA obu form antytrypsyny. Numery poszczególnych struktur oznaczono liczbami na osiach. Wartości wykraczające poza zakres oznaczono kolorem czerwonym. Najciekawsze są pary różniących się struktur 61

Porównanie dwóch modeli antytrypsyny - mutanta Z i typu dzikiego Graficzna reprezentacja dwóch modeli antytrypsyny - mutanta Z (NIEBIESKA wstążka) i typu dzikiego (CZERWONA wstążka); nałożono na siebie atomy węgla Cα zoptymalizowanych struktur obu modeli. (a): Model całej cząsteczki - z przodu widoczny jest arkusz ß; u góry znajduje się pętla reaktywna (jasne kolory). Łańcuchy 3A, 5A, i 6A oznaczono czarnymi kółkami. "Zawias", położony w rejonie spojenia arkusza A i pętli reaktywnej, oznaczono strzałkami (kreska przerywana). Żółta elipsa z prawej strony otacza pętlę reaktywną; aminokwasy P1 i P1' przedstawiono w reprezentacji kijków. Elipsa z lewej strony otacza pozycję mutacji Z; reszty 342 i 290 przedstawiono w reprezentacji kijków. 62

Porównanie dwóch modeli antytrypsyny - mutanta Z i typu dzikiego (b): Powiększenie otoczenia reszt 342 i 290. Model w reprezentacji kijków, kolory według typów atomów. Reszty Glu342 i Lys290 w typie dzikim tworzą stabilne oddziaływanie elektrostatyczne, które nie istnieje w cząsteczce mutanta Z 63

Odległości między resztami 290 i 342 obu form antytrypsyny (310K) Zależność czasowa odległości między wybranymi atomami w resztach nr 290 i 342 dzikiego typu (góra) i mutanta (dół) antytrypsyny. Podano też średnie czasowe odległości oraz ich błędy standardowe (Å). 64

(c): Pętla reaktywna (łańcuch A4) obu struktur; miejsce ataku proteinazy (Met358 i Ser359) przedstawiono w reprezentacji kijków. 65

Analiza struktury typu dzikiego i mutanta Z antytrypsyny wskazuje, że obszar przestrzeni konformacyjnej dostępny dla pętli reaktywnej mutanta Z jest większy niż dla typu dzikiego Różnice w dostępnych obszarach są jednak mniejsze, niż można by się spodziewać 66

Pomimo znacznego podobieństwa strukturalnego, typ dziki i mutant Z α1-antytrypsyny różnią się dynamiką wewnątrzcząsteczkową Można to było stwierdzić przeprowadzając analizę drgań normalnych Myo.mov http://dirac.cnrs-orleans.fr/plone/members/hinsen/ 67

Drgania normalne Drgania normalne są to kolektywne drgania atomów zachodzące z tą samą częstością i w takiej samej fazie. Zakłada się dodatkowo, że położenie środka ciężkości tych atomów nie ulega zmianie Hinsen, K. " Analysis of domain motions by approximate normal mode calculations." Proteins. 33 (1998): 417-429. Hinsen, K, Thomas, A, and Field, M J. " Analysis of domain motions in large proteins." Proteins. 34 (1999): 369-382. 68

Drgania normalne Najwolniejsze ruchy w białku są najczęściej związane z ich funkcją biologiczną, np. umożliwiają dostęp do miejsca aktywnego w enzymie. Metodą analizy drgań normalnych możemy przewidzieć te ruchy 69

Zastosowania metody symulowanego wyżarzania 1. optymalizacji struktury cząsteczki białka zbudowanej metodami modelowania molekularnego ( mutacja, homology modelling itp.) 3. uściślaniu struktur rozwiązanych metodą dyfrakcji rentgenowskiej 70

Zastosowania metody symulowanego wyżarzania 1. w przejściu od więzów do struktury przy wyznaczaniu struktury przestrzennej białka metodą NMR Distance geometry, symulowane wyżarzanie Wszystkie wyznaczone struktury spełniają warunki więzów 71

Zastosowania metody symulowanego wyżarzania 1. w procesie selekcji potencjalnych leków poprzez dokowanie Dokowanie kwasu sialowego do hemaglutaniny http://www.scripps.edu/mb/olson/people/gmm/movies/ 72

Dokowanie liganda do miejsca wiązania białka 1. dokowania liganda do miejsca wiązania w receptorze Orientacja pudła symulacyjnego użytego do dokowania ligandów w kieszeni wiążącej receptora widok z boku (góra); widok z góry (dół). Numeracja helis przebiega przeciwnie do ruchu wskazówek zegara TM1 jest granatowa, TM7 czerwona. 73

Struktury trzech antagonistycznych ligandów receptora wazopresyny V1: SR 49059 (góra), SR 121463A (środek) i L372,662 (dół). Cząsteczki przedstawiono w reprezentacji atomów ciężkich wraz z powierzchniami van der Waalsa. 74

Stereogram zrelaksowanej struktury V1R z zadokowanym selektywnym antagonistą SR 49059. Zaznaczono łańcuchy boczne reszt: Lys128 (TM3); Gln185 (TM4); Phe225 (TM5); Trp304, Phe307, Phe308 (TM6); Thr333, Ala334 (TM7). 75

Zagadnienia omawiane na wykładzie: 1. Podsumowanie metody modelowania molekularnego 2. Analiza wyników symulacji dynamiki molekularneji weryfikacja modelu 3. Optymalizacja struktury na przykładziebiałka rozpuszczalnego 4. Zastosowanie modelowania molekularnego w badaniach błon lipidowych 5. Zastosowanie modelowania molekularnego do badania mechanizmu działania i specyficzności peptydów antybakteryjnych 6. Zastosowanie modelowania molekularnego w badaniach białek błonowych 7. Analiza konformacyjna polipeptydów 76