Badanie długości czynników sieciujących metodami symulacji komputerowych

Transkrypt

1 Badanie długości czynników sieciujących metodami symulacji komputerowych Agnieszka Obarska-Kosińska Prof. dr hab. Bogdan Lesyng Promotorzy: Dr hab. Janusz Bujnicki Zakład Biofizyki, Instytut Fizyki Doświadczalnej, UW Pracownia Bioinformatyki i InŜynierii Białka, IIMCB

2 Metody badania struktur białek i oddziaływań białko-białko Doświadczalne: Krystalografia rentgenowska NMR Teoretyczne: Modelowanie ab initio Modelowanie homologiczne Modelowanie de novo Dokowanie

3 Modelowanie teoretyczne Problemy: DuŜy koszt obliczeniowy Niedoskonała funkcja pseudoenergii Alternatywne modele de novo Alternatywne modele dimeru

4 Sieciowanie molekularne (ang. molecular cross-linking) Grupy funkcyjne białek: -NH 2, -COOH, -SH Sieciowanie wewnątrz- i między- molekularne Reszty lizynowe Reszty Glu i Asp Reszty cysteinowe

5 Czynniki sieciujące I rodzaju (ang. bridge type cross-linkers) BIAŁKO A BIAŁKO B CZYNNIK SIECIUJĄCY I RODZAJU homo-dwufunkcyjne hetero-dwufunkcyjne MTS-11-O3-MTS

6 Czynniki sieciujące II rodzaju (ang. zero-length cross-linkers) CZYNNIK SIECIUJĄCY II RODZAJU BIAŁKO A BIAŁKO B Np.: karbodiimidy, Cu2+-o-fenantrolina

7 Sieciowanie zdefiniowanych miejsc BIAŁKO A MUTAGENEZA MUTANTY JEDNOCYSTEINOWE BIAŁKO B CZYNNIKI SIECIUJĄCE + ELEKTROFOREZA śelowa (SDS-PAGE)

8 Sieciowanie nieznanych miejsc CZYNNIKI SIECIUJĄCE BIAŁKO A BIAŁKO B TRAWIENIE WIDMO MASOWE SPEKTROMETRIA MAS I m/z

9 Grupy funkcyjne czynników sieciujących Reaktywne wobec grupy aminowej: Estry N-hydroksysukcynoimidylowe (estry NHS) i ich pochodne sulfo-nhs. Estry kwasu imidowego Reaktywne wobec grupy sulfhydrylowej: Maleimidy. Disulfidy.

10 Zalety metody sieciowania molekularnego MoŜliwość badania białek w ich stanie natywnym białka błonowe i inne, które nie ulegają krystalizacji regiony ruchliwe, niewidoczne w strukturach krystalograficznych Wielkość białka teoretycznie nieograniczona Analiza wyników sieciowania: Elektroforeza Ŝelowa szybka i prosta Spektrometria mas szybka i czuła DuŜa róŝnorodność czynników sieciujących: Szeroki zakres długości Szeroki zakres specyficzności grup reaktywnych

11 Określanie długości czynników sieciujących Sumowanie długości wiązań Symulacje dynamiki stochastycznej: Green i wsp popularne homo-dwufunkcyjne czynniki sieciujące

12 Metody przeszukiwania przestrzeni konformacyjnej Przeszukiwanie konformacyjne systematyczne i losowe Metoda symulacji Monte Carlo Metoda symulacji Dynamiki Molekularnej i Stochastycznej Metoda mieszana MC/SD

13 Cel pracy Obliczenie długości 16 homo-dwufunkcyjnych czynników sieciujących metodą MC/SD pracownia dr. hab. J. Bujnickiego IIMCB, Warszawa pracownia dr. hab. P. Friedhoffa Uniwersytet Giessen, Niemcy

14 Materiały Obliczenia: Klaster halo Oprogramowanie firmy Schrodinger: Maestro budowa modelowych cząsteczek Jaguar obliczenia ab initio MacroModel minimalizacja energii, symulacje MC/SD Analiza danych: Statistica

15 Metody Zbudowanie modelowych cząsteczek Minimalizacja energii metoda najszybszego spadku 100 kroków metodą sprzęŝonych gradientów RMS gradientu energii 0,05 kj*mol -1 * Å -1 Model rozpuszczalnika GB/SA Pole siłowe AMBER* Obliczenia ładunków atomowych ESP Obliczenia ab initio B3LYP (metoda DFT) Baza funkcyjna 6-31G** Model Poissona-Boltzmanna dla wody Symulacje MC/SD Pole siłowe AMBER* Model rozpuszczalnika GB/SA Temperatura 300 K Krok czasowy 1,5 fs Stosunek kroków SD : MC wynosił 1:1 Faza równowaŝenia 50 ps Czas symulacji 100 ns Monitorowanie długości co 1 ps

16 Homo dwufunkcyjne czynniki sieciujące MTS owe -SH -NH 2 MTS-1-MTS MTS-8-O2-MTS MTS-pX-MTS MTS-2-MTS MTS-11-O3-MTS MTS-3-MTS MTS-14-O4-MTS MTS-4-MTS MTS-17-O5-MTS MTS-5-MTS MTS-6-MTS maleimido-azobenzen (AzoMal) maleimidowe MTS-8-MTS zawierające grupę sulfo NHS MTS-10-MTS BS3 DTSSP

17 Cząsteczki modelowe -SH -NH 2 MTS owe maleimidowe zawierające grupę sulfo NHS

18 Wyniki MTS-pX-MTS liczba konformacji odległość S [Å]

19 MTS-owe czynniki sieciujące

20 Homo-dwufunkcyjne MTS-owe czynniki sieciujące

21 Homo-dwufunkcyjne maleimidowe czynniki sieciujące AzoMal-cis AzoMal-trans O O O N N O N N liczba konformacji liczba konformacji odległość S [Å] odległość S [Å]

22 Homo-dwufunkcyjne maleimidowe czynniki sieciujące 6000 AzoMal 5000 liczba konformacji cis trans odleg S [Å]

23 Homo-dwufunkcyjne czynniki sieciujące zawierające grupę sulfo-nhs BS3 DTSSP liczba konformacji liczba konformacji odległość S [Å] odległość S [Å]

24 Testy zbieŝności

25 Porównanie otrzymanych długości z wartościami uŝywanymi w publikacjach {Green, 2001 #15},{Guan, 2002 #31},{Grintsevich, 2008 #11},{Ermolova, 2003 #32},{Loo, 2001 #33} (Pierce Chemical, Rockford IL, 2008), (Pierce Chemical, 1999)

26 Czynniki sieciujące jako linijki molekularne

27 Doświadczalna weryfikacja wyników liczba konformacji odległość S [Å]

28 Dziękuję za uwagę.