Wskaźniki hemostazy w niedrożności jelit u koni

UNIWERSYTET PRZYRODNICZY WE WROCŁAWIU WYDZIAŁ MEDYCYNY WETERYNARYJNEJ KATEDRA IMMUNOLOGII, PATOFIZJOLOGII I PREWENCJI WETERYNARYJNEJ ZAKŁAD PATOFIZJOLOGII Alicja Iwaszko-Simonik Wskaźniki hemostazy w niedrożności jelit u koni ROZPRAWA DOKTORSKA Promotor: Prof. dr hab. Stanisław Graczyk Wrocław 2013

SPIS TREŚCI SPIS TREŚCI... 2 WYKAZ SKRÓTÓW STOSOWANYCH W PRACY... 4 1. WSTĘP... 8 1.1. Hemostaza... 10 1.2. Rola naczyń krwionośnych w procesie hemostazy... 11 1.3. Hemostaza płytkowa... 13 1.3.1. Adhezja... 18 1.3.2. Aktywacja... 20 1.3.3. Agregacja... 21 1.4. Hemostaza osoczowa... 23 1.5. Fibrynoliza... 28 1.6. Inhibitory procesu krzepnięcia... 28 1.7. Diagnostyka hemostazy... 30 2. ZAŁOŻENIA I CELE PRACY... 35 3. MATERIAŁ I METODY... 37 3.1. Zwierzęta... 37 3.2. Układ doświadczalny... 38 3.3. Kryteria kwalifikowania koni do zabiegu laparotomii... 39 3.4. Postępowanie przed-, śród- i pooperacyjne... 39 3.5. Badania hematologiczne... 41 3.6. Badania koagulologiczne... 42 3.6.1. Ocena hemostazy pierwotnej-płytkowej... 42 3.6.2. Ocena hemostazy wtórnej osoczowej... 45 3.7. Analiza statystyczna... 46 4. WYNIKI... 48 4.1. Wskaźniki hematologiczne... 48 4.2. Wskaźniki hemostazy pierwotnej (płytkowej)... 51 4.2.1. Płytki krwi... 51 4.2.2. Czas okluzji... 53 4.2.3. Ekspresja P-selektyny (CD62P) oraz Integryny IIb 3 - GP IIb/IIIa (CD 41/61) na powierzchni płytek krwi... 54 2

4.2.4. Pochłanianie czerwieni obojętnej... 59 4.3. Wskaźniki hemostazy osoczowej... 61 4.3.1 Czasy krzepnięcia... 61 4.3.2. Fibrynogen... 63 4.3.3. Antytrombina... 64 4.3.4. Białko C... 65 4.3.5. D-dimery... 66 5. DYSKUSJA... 67 6. WNIOSKI... 92 7. PIŚMIENNICTWO... 93 8. STRESZCZENIE... 111 3

WYKAZ SKRÓTÓW STOSOWANYCH W PRACY 12-HETE - kwas 12-hydroksyeikozatetraenowy 12-HPETE - kwas 12-hydroperoksyeikozatetraenowy AA - kwas arachidonowy ADP - adenozyno-5-difosforan APTT - czas częściowej tromboplastyny po aktywacji (ang. activated partial thromboplastin time) AT - antytrombina (dawniej antytrombina III AT III) ATP - adenozyno-5-trifosforan BMBT- czas krwawienia po standardowym nacięciu błony śluzowej przedsionka jamy ustnej (ang. buccal mucosal bleeding time) Ca 2+ - wapń CD62P - P-selektyna CRT czas wypełniania naczyń kapilarnych ocenianych poprzez uciśnięcie błony śluzowej w jamie ustnej (ang. capillary refill time) CT - czas okluzji (ang. closure time) D-0 konie przed zabiegiem chirurgicznym D-1 grupa koni 24 godziny po zabiegu D-2 grupa koni 48 godziny po zabiegu D-3 grupa koni 72 godziny po zabiegu DAG - diacyloglicerol DIC zespół rozsianego wewnątrznaczyniowego wykrzepiania (ang. disseminated intravascular coagulation) EDTA wersenian potasowy, kwas edetynowy, kwas wersenowy (ang. ethylene diamine tetraacetic acid) EGF - czynnik wzrostu naskórka (ang. epidermal growth factor) ET-1 - endotelina-1 Fb - fibrynogen FDPs - produkty degradacji fibrynogenu i fibryny (ang. fibrinogen-fibrin degradation products) FITC - fluoresceina (ang. fluorescein isothiocyanate) 4

fl - femtolitr FSC - detector rozproszenia światła zgodny z kierunkiem wiązki laserowej, oceniający wielkość komórki (ang. forward scatter channel) GDP - guanozyno-5-difosforan GP Ib/IX/V - glikoproteina Ib/IX/V GPIa/IIa - integryna 2 1 GTP - guanozyno-5-trifosforan Ht hematokryt (ang. hematocrit) Hb zawartość hemoglobiny (ang. haemoglobin) HMWK - wysokocząsteczkowym kininogen (ang. high molecular weight kininogen) IF intensywność fluorescencji IL-1 interleukina 1 IL-6 interleukina 6 integryna IIb 3, inaczej receptor GP IIb/IIIa lub CD41/61 IP3 - trójfosforan inozytolu IXa - aktywny czynnik krzepnięcia IXa K konie grupy kontrolnej LPS lipopolisacharyd bakteryjny LT - leukotrieny MGG barwienie metodą May Grünwalda-Giemzy MPV średnia objętość płytek (ang. mean platelet volume) n liczba osobników N/L stosunek neutrofilów do limfocytów NO - tlenek azotu NR czerwień obojętna (ang. neutral red) NSAIDs niesteroidowe leki przeciwzapalne (ang. nonsteroidal inflammatory drugs) OCS - układ otwartych kanalików (ang. open canalicular system) PAF - czynnik aktywujący płytki (ang. platelet-activating factor) PAI - inhibitor aktywacji plazminogenu (ang. plasminogen activator inhibitor) PDGF - płytkowy czynnik wzrostu (ang. platelet-derived growth factor) PE fikoerytryna (ang. phycoerythrin) PF-4 - czynnik płytkowy 4 (ang. platelet factor 4), 5

PFA-100 aparat do oceny czasu okluzji (ang. the platelet function analyzer-100) PGE2 - prostaglandyna E2 PGG2 - prostaglandyna G2 PGH2 - prostaglandyna H2 PGI2 - prostacyklina PIP2 - difosforan fosfatydyloinozytolu PLT- płytki krwi (ang. platelets) PMP - mikrocząsteczki (ang. platelet-derived microparticles) PMV mikropęcherzyki (ang. platelet-derived microvesicles) PRP - osocze bogatopłytkowe (ang. platelet rich plasma) PSGL-1 ligand dla P-selektyny (ang. P-Selectin Glycoprotein Ligand 1) PT - czas protrombinowy (ang. prothrombin time) RBC liczba erytrocytów (ang. red blood cells), RPMI 1640 medium hodowlane (ang. roswell park memorial institute 1640), scd62p rozpuszczalna forma P-selektyny (ang. soluble P-selectin) SD odchylenie standardowe (ang. standard deviation) SSC - detektor, mierzący ilość światła rozproszonego pod kątem 90 stopni od osi optycznej, oceniający ziarnistość komórki (ang. side scatter channel) TF - czynnik tkankowy (ang. tissue factor) TF/VIIa kompleks czynnika tkankowego i aktywnego czynnika krzepnięcia VIIa TFPI - inhibitor zewnątrzpochodnego toru krzepnięcia (ang. tissue factor pathway inhibitor) TNF-α czynnik martwicy nowotworów α (ang. tumor necrosis factor α) TP białko całkowite (ang. total protein) t-pa - tkankowy aktywator plazminogenu TT - czas trombinowy (ang. thrombin time) TXA2, tromboksan-a2 TXB2 - tromboksan B2 u-pa - urokinazowy aktywator plazminogenu Va - aktywny czynnik krzepnięcia Va VIIa - aktywny czynnik krzepnięcia VIIa 6

VIIIa - aktywny czynnik krzepnięcia VIIIa vwf - czynnik von Willebranda (ang. von Willebrand Factor) WBC - liczba leukocytów (ang. white blood cells) Xa aktywny czynnik krzepnięcia Xa XIa - aktywny czynnik krzepnięcia XIa XIIIa - aktywny czynnik krzepnięcia XIIIa 7

1. WSTĘP W praktyce klinicznej u koni istotny problem diagnostyczny i terapeutyczny stanowią choroby morzyskowe będące jedną z najczęstszych przyczyn śmierci tych zwierząt (Abutarbush i wsp. 2005, Dukti i White 2009, Hackett i Hassel 2008, Ihler i wsp. 2004). Charakterystykę oraz leczenie zaburzeń morzyskowych komplikuje zróżnicowana etiopatogeneza. Według Madeja i Riha (2008) pojęcie morzysk obejmuje ponad 400 zespołów chorobowych. Próba systematyzacji sprowadza się do podziału na tzw. morzyska rzekome oraz morzyska prawdziwe. Te ostatnie zwane potocznie kolkami obejmują zespół zmian czynnościowych związanych z układem pokarmowym oraz towarzyszących im objawów bólowych, zlokalizowanych w obrębie jamy brzusznej (Alsaad i wsp 2009, Goncalves i wsp. 2002). Szacuje się, iż częstotliwość występowania kolek kształtuje się w granicach 4-10 przypadków na 100 koni rocznie (Dukti i White 2009, Tinker i wsp. 1997, White 2006b). Większość z nich (80-85%) ustępuje samoistnie lub poddaje się leczeniu zachowawczemu (farmakologicznemu). Pozostała część zaburzeń morzyskowych wymaga leczenia operacyjnego (Abutarbush i wsp. 2005, Dukti i White 2009, Dukti i White 2008, Klohnen 2009, White 2006b). Szczególna skłonność koni do występowania morzysk wynika z uwarunkowań anatomicznych i czynnościowych przewodu pokarmowego tych zwierząt (Turek 2004). Koń jest zwierzęciem roślinożernym, jego przewód pokarmowy jest ewolucyjnie przystosowany do ciągłego pobierania małych ilości paszy włóknistej. Ma to odzwierciedlenie w budowie anatomicznej jego przewodu pokarmowego, charakteryzującej się małym w stosunku do masy ciała żołądkiem, długimi jelitami, długą krezką jelitową oraz różną średnicą poszczególnych odcinków jelit. Czynnikami usposabiającymi do rozwoju zaburzeń morzyskowych są m.in. niewłaściwe żywienie, nieprawidłowe użytkowanie i stres, a także procesy zapalne błony śluzowej przewodu pokarmowego, czy też zmiany organiczne w przewodzie pokarmowym (np. blizny w ścianie jelit powstałe po wędrówce pasożytów wewnętrznych, zwężenie światła jelit, zrosty jelit) (Cohen i wsp. 1999, Goncalves i wsp. 2002, Madej i Riha 2008). Najczęstszą przyczyną występowania morzysk u koni jest nagła zmiana diety, zwłaszcza zmiana udziału dodatkowych pasz treściwych (ziarno) w dziennej dawce żywieniowej, co nasila fermentację i wzmożone wytwarzanie kwasów tłuszczowych. 8

Związki te są odpowiedzialne za osłabienie motoryki jelit i w konsekwencji przeładowanie jelita grubego. Do kolejnych ważnych czynników usposabiających do wystąpienia zaburzeń morzyskowych należy duża wrażliwość wegetatywnego układu nerwowego konia na działanie różnych bodźców tj. bezruch lub nadmierny wysiłek, stres, drażniące działanie substancji zawartych w paszy, nagłe oziębienie powłok brzusznych, czy też zmiana ciśnienia atmosferycznego wpływająca na perystaltykę jelit (Cohen i wsp. 1999, Goncalves i wsp. 2002). Czynniki te powodują zmiany napięcia wegetatywnego układu nerwowego, prowadząc do przewagi układu przywspółczulnego (parasympatycznego) nad układem współczulnym (sympatycznym). Pobudzenie układu przywspółczulnego, tzw. wagotonia, może skutkować wzmożoną perystaltyką oraz tzw. skurczem perystaltycznym jelit. Wspomniane zaburzenia w funkcjonowaniu sprzyjają wystąpieniu przemieszczeń jelit i ich całkowitej, częściowej lub przejściowej niedrożności, czyli zaburzeniu przemieszczania się treści pokarmowej od żołądka do końcowego odcinka przewodu pokarmowego (Fryc 1993, Karleskind i Gluntz 1999, Madej i Riha 2008). Mogą one przybierać różną formę, np. zatkania, przemieszczeń, skrętu, wgłobienia lub uwięźnięcia jelit oraz przebiegać z różnym nasileniem. Wymienionym zaburzeniom kolkowym towarzyszy niepokój i objawy bólowe. Zasadniczo nasilenie bólu jest proporcjonalne do zmian w przewodzie pokarmowym (Madej i Riha 2008). Na podstawie stopnia nasilenia objawów wyróżnia się łagodną, umiarkowaną i ciężką postać kolki (Fryc 1999, Sikora 2008). Postępowanie z koniem w przebiegu morzyska uzależnione jest od nasilenia objawów oraz zmian z przewodzie pokarmowym. W przypadku łagodnej i umiarkowanej postaci morzyska wystarczające jest leczenie zachowawcze (podanie leków rozkurczowych i przeciwbólowych, sondowanie żołądka, dożylna podaż płynów w celu unormowania krążenia oraz wyrównania niedoborów elektrolitowych). Jednakże ciężkie postacie kolek związane ze spowolnieniem perystaltyki i nagromadzeniem gazu prowadzące do przemieszczeń i skrętu jelit (ciężki stopień morzyska), wymagają leczenia operacyjnego (Fryc 1999, Sikora 2008). Według danych źródłowych najczęstszymi zaburzeniami wymagającymi interwencji chirurgicznej są przemieszczenia okrężnicy dużej (29%) oraz jej skręt (14%) (Abutarbush i wsp. 2005), a śmiertelność koni operowanych z tych przyczyn wynosi 30-45% (Dallap i wsp. 2003, Tinker i wsp. 1997). Zagrożenie życia zwierzęcia w przebiegu chorób morzyskowych wynika z postępujących zaburzeń w układzie krążenia, których 9

następstwem są zmiany wtórne, typu odwodnienie oraz zmiany zakrzepowo-zatorowe o różnym nasileniu. Zaburzeniom krążenia bardzo często towarzyszą zmiany w hemostazie (Dallap i wsp. 2003, Dallap-Schaer i Epstein 2009). Sprzyja temu zastój krwi spowodowany uciskiem naczyń przez nadmiernie wypełnione lub skręcone jelita. Na skutek ucisku i rozwijających się zaburzeń hemodynamicznych oraz metabolicznych w ścianie jelita dochodzi do rozwoju procesów zapalnych, natomiast w świetle jelit zaczynają się namnażać patogenne bakterie, głównie z rodziny Enterobacteriaceae, których endotoksyny przenikają do krwi. Uważa się, iż uwalniane endotoksyny poprzez aktywację układu krzepnięcia i fibrynolizy przyczyniają się do zaburzeń hemostazy, niedotlenienia i uszkodzenia narządów (Cook i wsp. 2009, Neuder i wsp. 2009). Wykazano, że uwalniane endotoksyny stymulują komórki tj. monocyty, granulocyty do sekrecji mediatorów zapalnych, które dodatkowo uszkadzają śródbłonek naczyń krwionośnych oraz odpowiadają m.in za zapoczątkowanie procesu wykrzepiania (Brooks i wsp. 2007, Dallap-Schaer i Epstein 2009, Hackett i Hassel 2008, Jarvis i Evans 1994, Krumrych i wsp. 1996, 1997, Levi i wsp. 2003, 2012, Levi 2004, Murray 1998, Smith 1993, Weiss i Rashid 1998). Jak wynika z przedstawionych danych, częstym powikłaniem w przebiegu morzysk są zmiany w hemostazie, zwiększające ryzyko komplikacji zakrzepowych, czy też wystąpienie skazy krwotocznej w następstwie wyczerpania czynników krzepnięcia (Alsaad i wsp. 2009, Dallap-Schaer i Epstein 2009, Danese i wsp. 2007, Monreal i wsp. 2000, Yilmaz i wsp. 2002, Yoshida i Granger 2009). Świadczy to o istotnej roli sprawnego funkcjonowania hemostazy jako czynnika predylekcyjnego w przebiegu morzysk. 1.1. Hemostaza Hemostaza obejmuje zespół procesów zapewniających sprawne hamowanie krwawienia po przerwaniu ciągłości ściany naczyń krwionośnych oraz odpowiadających za utrzymanie płynności krążącej krwi (Alsaad i Abid-albar 2009,Yilmaz i wsp. 2002). Układ ten tworzą ściana naczyń krwionośnych oraz płytki krwi (hemostaza pierwotna), białka osocza tj. czynniki krzepnięcia i fibrynolizy oraz ich inhibitory (hemostaza wtórna - osoczowa). Warunkiem optymalnego funkcjonowania hemostazy jest zachowana równowaga pomiędzy krzepnięciem, a fibrynolizą oraz 10

odpowiednia aktywność regulujących je aktywatorów i inhibitorów. Skutkiem zakłócenia tej równowagi jest nadmierne wykrzepianie krwi z powstawaniem licznych zakrzepów lub też osłabienie krzepliwości, przybierającej postać skazy krwotocznej (Monreal i wsp. 2000, Monreal i Cesarini 2009). Istnieje możliwość wystąpienia obu tych procesów równocześnie, przybierając postać rozsianego wykrzepiania wewnątrznaczyniowego (DIC- disseminated intravascular coagulation). Dowiedziono, iż w przebiegu zaburzeń żołądkowo-jelitowych u koni dochodzi do zakłócenia równowagi pomiędzy krzepnięciem i fibrynolizą, skutkując nadmiernym wykrzepianiem krwi z powstawaniem licznych zakrzepów (Brooks 2008, Cesarini i wsp. 2010, Collatos i wsp. 1995b, Cotovio i wsp. 2007, Dallap i wsp. 2003, Dallap- Schaer i wsp. 2009b, Monreal i wsp. 2000, Monreal i wsp. 2009, Stokol i wsp. 2005, Thomason i wsp. 2006a). Zmiany rozwijające się w opisanych warunkach spełniają wszystkie kryteria, tzw. triady Virchowa, co do okoliczności predysponujących powstawaniu zakrzepów (Byars i wsp. 2003, Kittrell i Berkwitt 2012). Zaleganie zwierzęcia powodowane silnym bólem morzyskowym i towarzyszący ucisk na naczynia skręconych i wzdętych jelit prowadzą do ograniczenia szybkości i ilości przepływającej krwi. Upośledzona wymiana gazowa w obszarze niedokrwionych tkanek i rozwijająca się hipoksja skutkuje uszkodzeniem komórek. Konsekwencją m.in. uszkodzenia śródbłonka jest nie tylko adhezja leukocytów i uwalnianie prozapalnych cytokin. W tych warunkach dochodzi do przenikania do krwi endotoksyn, co stanowi okoliczność wzmagającą powstawanie agregatów leukocytarnopłytkowych. Pojawiające się zaburzenia wodno-elektrolitowe (wzrost lepkości krwi) przy zapoczątkowanej agregacji płytek sprzyjają aktywacji układu krzepnięcia i fibrynolizy. Ostateczny zaś efekt w postaci zakrzepów czy pojawiającej się skazy jest następstwem zaburzonej równowagi dynamicznej uruchomionych procesów. 1.2. Rola naczyń krwionośnych w procesie hemostazy Ściana naczyń krwionośnych tworzy barierę fizyczną i biochemiczną między krwią i tkankami. Zbudowana jest z trzech warstw: warstwy wewnętrznej (intima) tworzonej przez śródbłonek i niewielką ilość tkanki łącznej, warstwy środkowej (media) składającej się głównie z mięśni gładkich oraz z łącznotkankowej warstwy zewnętrznej (przydanka). Wszystkie warstwy ściany uczestniczą w utrzymaniu krążącej krwi 11

w stanie płynnym i w hamowaniu krwawienia po ich uszkodzeniu. Błona wewnętrzna ściany naczyniowej, w skład której wchodzą: pojedyncza warstwa komórek śródbłonka oraz podśródbłonkowa warstwa tkanki łącznej, uczestniczą wspólnie z płytkami krwi w procesach hemostazy pierwotnej. Jednakże najważniejsza rola przypada na śródbłonek, który oprócz funkcji hemostatycznych, jest miejscem wytwarzania szeregu aktywnych biologicznie związków, uczestniczących przede wszystkim w regulacji przepływu krwi, a także w oddziaływaniach między komórkami i ścianą naczyń (Obońska i wsp. 2010, Wnuczko i Szczepański 2007). Hemostatyczna czynność śródbłonka polega na zapewnianiu niekrzepliwości krwi i nietrombogenności ściany naczynia w wyniku przewagi czynników i procesów antykoagulacyjnych nad prokoagulacyjnymi. Ujemnie naładowany glikokaliks pokrywający powierzchnię śródbłonka zapewnia jego niezwilżalność w wyniku elektrostatycznego odpychania również ujemnie naładowanych struktur błon komórkowych składników morfotycznych krwi. Działanie antykoagulacyjne zapewniają wytwarzane przez komórki śródbłonka inhibitory krzepnięcia tj. antytrombina, heparyna, trombomodulina, a także związki inaktywujące płytki krwi tlenek azotu NO, prostacyklina PGI2 (Dallap-Schaer i Epstein 2009, Wnuczko i Szczepański 2007). Komórki śródbłonka uwalniają również dwie grupy substancji o właściwościach zwężających (tromboksan-a2 TXA2, endotelina-1 ET-1, leukotrieny LT, czynnik aktywujący płytki PAF) oraz rozszerzających naczynia (tlenek azotu NO, prostacyklina PGI2, bradykinina, adenozyna). Warstwa podśródbłonkowa, złożona z włókien kolagenu, elastyny, fibronektyny, lamininy i witronektyny, staje się po uszkodzeniu śródbłonka stymulatorem adhezji płytek. W przypadku uszkodzenia naczynia dochodzi do jego skurczu w wyniku uwolnienia z komórek śródbłonka związków naczyniozwężających. Skurcz ten zmniejsza przepływ i utratę krwi. Równocześnie do odsłoniętych włókien kolagenowych zaczynają przylegać płytki krwi, tworząc pierwotny czop płytkowy. Dysfunkcja śródbłonka naczyniowego, niezależnie od przyczyn je wywołujących, może skutkować zwiększonym ryzykiem komplikacji zakrzepowych, jak również występowaniem skaz krwotocznych. Mimo, iż obecnie medycyna ludzka dysponuje biochemicznymi i fizycznymi metodami umożliwiającymi ocenę czynności śródbłonka naczyniowego, to z racji utrudnionego dostępu oraz małej specyficzności testów nadal nie są powszechnie dostępne w codziennej praktyce. 12

1.3. Hemostaza płytkowa Kolejny, obok naczyń krwionośnych, element hemostazy stanowią płytki krwi. Płytki krwi (PLT ang. platelets), czyli trombocyty, są bezjądrowymi fragmentami cytoplazmy megakariocytów, wytwarzanymi głównie w szpiku oraz w mniejszym stopniu w płucach (Szypuła i wsp. 2009). Po opuszczeniu szpiku około 1/3 puli płytek jest sekwestrowana w śledzionie, podczas gdy pozostałe 2/3 krąży we krwi przez 7 do 10 dni w stanie nieaktywnym (Kaushansky 2009, Saluk-Juszczak i Królewska 2010). Płytka ma kształt dyskoidalny. Otoczona jest błoną komórkową złożoną z 2 warstw lipidowych: zewnętrznej i wewnętrznej, wśród których dominują fosfolipidy. W błonie komórkowej znajdują się liczne białka, które mogą przechodzić przez obie warstwy. Zewnętrzne końce cząstek białkowych wiążąc się z oligosacharydami tworzą glikoproteiny (GP), pełniące funkcje receptorów (Sikora i Kostka 2005, Stachowiak i wsp. 2008). Powierzchnia błony płytkowej wykazuje ujemny ładunek na skutek dużej ilości kwasu sjalowego. Mimo, iż płytka ssaków pozbawiona jest jądra komórkowego, w tym DNA, posiada pozostałe organella występujące w innych komórkach tj.: mitochondria, aparat Golgiego, siateczka śródplazmatyczna, peroksysomy czy lizosomy (Sikora i Kostka 2005, Szypuła i wsp. 2009). Obwodową część cytoplazmy płytki stanowi cytoszkielet zbudowany z białek kurczliwych aktyny i miozyny. Odpowiada on za zmianę kształtu płytki w trakcie jej aktywacji (Stachowiak i wsp. 2008, Saluk-Juszczak i Królewska 2010, Sikora i Kostka 2005, Szypuła i wsp. 2009, Tablin i Castro 1992). Płytki okazują się być strukturami niezwykle reaktywnymi, a ich zdolność do odpowiedzi na różne bodźce uwarunkowana jest obecnością ogromnej liczby swoistych receptorów powierzchniowych (ponad 40 typów) oraz wielu biologicznie czynnych substancji zawartych w ziarnistościach, które dzieli się na: (McMichael 2005, Saluk-Juszczak i Królewska 2010, Textor 2010, Wrzyszcz 2003) 1. Ziarnistości alfa, zawierające fibrynogen, czynnik von Willebranda, czynnik płytkowy 4 (PF-4), płytkowy czynnik wzrostu (PDGF - platelet-derived growth factor), beta-tromboglobulinę, trombospondynę, czynniki krzepnięcia V, VIII, XI i XIII, kininogen, białko S, czynniki wzrostowe (ułatwiające wzrost fibroblastów, komórek endotelialnych i mięśniowych naczyń), P-selektynę 13

(McMichael 2005, Saluk-Juszczak i Królewska 2010, Śliwińska-Stańczyk 2005). 2. Ziarnistości delta (gęste), które są źródłem ADP, ATP, GDP, GTP, histaminy, epinefryny, serotoniny (nie jest ona produkowana przez płytki, a jedynie inkorporowana z osocza krwi), jony wapnia i magnezu (McMichael 2005, Saluk-Juszczak i Królewska 2010, Śliwińska-Stańczyk 2005). 3. Ziarnistości gamma, wydzielające głównie kwaśne hydrolazy (Szypuła i wsp. 2009). Jakkolwiek przyjmuje się, iż opisana morfologia płytki jest podobna u wszystkich ssaków, to istnieją pewne cechy specyficzne dla konia. Dotyczy to m.in. średniej liczby płytek krwi, która u koni mieści się w dość szerokich granicach od 90 000 do 400 000 w l i stanowi najniższą koncentrację płytek krwi spośród wszystkich ssaków. Mimo, iż objętość większości płytek konia jest mniejsza w porównaniu do człowieka, to w jego krwi obwodowej zaznacza się obecność płytek o zróżnicowanej wielkości (tzw. anizocytoza), tzn.występują płytki o średnicy 2-3 m, jak również 12-20 m (Feldman i wsp. 2000). Kolejną charakterystyczną cechą tego gatunku jest to, że ziarnistości alfa konia są dwukrotnie większe niż u człowieka, jak również ich struktura jest bardziej zorganizowana (uporządkowana) (Brunso i wsp. 2010, Gader i wsp. 2008, Segura i wsp. 2006). Odmienna jest także architektura wewnętrznej błony komórkowej, która u człowieka posiada liczne wgłębienia skierowane ku cytoplazmie, tworząc tzw. układ otwartych kanalików (OCS open canalicular system). Służą one jako drogi transportu różnych substancji do wnętrza płytek, jak również przez te kanaliki dochodzi do uwolnienia do osocza składników zawartych w ziarnistościach cytoplazmatycznych (Łuksza i Mantur 2009, Feldman i wsp. 2000, White i Escolar 1991). Badania z użyciem kwasu taninowego (ang. tannic acid) przeprowadzone przez Brunso i wsp. 2010, Gader i wsp. 2008, Segura i wsp. 2006 wykazały, iż w płytkach konia brak jest OCS, a mechanizm sekrecji ziarnistości jest całkowicie odmienny w porównaniu do człowieka i innych gatunków zwierząt. Podstawową funkcją płytek jest ich udział w utrzymywaniu hemostazy (Arguelles i wsp. 2006, Fullard 2004, Piccione i wsp. 2010, Dallap-Schaer i Epstein 2009) poprzez: regulowanie przepływu krwi, tworzenie czopa płytkowego, 14

aktywację krzepnięcia i wytwarzanie fibryny stabilizującej czop płytkowy, inicjowanie procesu fibrynolizy Główną rolą trombocytów jest tworzenie płytkowego czopa hemostatycznego, w którym wyróżnia się kilka etapów: a) adhezję płytek do warstwy śródbłonkowej, b) aktywację, zmianę kształtu, sekrecję zmagazynowanych substancji c) agregację (Borowska i wsp. 2006, Dallap-Schaer i Epstein 2009, Stachowiak i wsp. 2008). Procesy te uzależnione są od przekazywania sygnałów z wyspecjalizowanych receptorów błonowych do wnętrza komórki. Możliwe jest to dzięki sprzężeniu receptorów z enzymatycznymi układami przekazywania sygnału (Fullard 2004, Olas 2001). Ze względu na budowę i mechanizm działania receptorów płytkowych wyróżnia się dwie grupy: a) receptory transbłonowe, sprzężone z białkami G, są zbudowane z siedmiu transbłonowych domen tzw. receptorów serpentynowych. Do tej grupy należą receptory dla trombiny, ADP, prostanoidów (TXA2, PGE2, PGI2) oraz fosfolipidów. Za pośrednictwem tych receptorów aktywację płytek mogą również powodować serotonina i adrenalina (epinefryna), które określane są mianem tzw. słabych agonistów (Feldman i wsp. 2000, Olas 2001, Sikora i Kostka 2005). b) receptory dla białek adhezyjnych, których struktura pozwala zaliczyć je do rodzin: integryn, selektyn i immunoglobulin. Receptory integrynowe (np. integryna IIb 3 - GP IIb/IIIa) występują w największej ilości na płytkach krwi i stanowią grupę o największym znaczeniu w aktywacji płytek krwi (Sikora i Kostka 2005, Feldman i wsp. 2000, Fullard 2004). Płytki krwi mogą być pobudzone przez szereg agonistów, tj. trombinę, tromboksan A2 (TXA2), ADP, epinefrynę czy też kolagen, co skutkuje zmianą ich kształtu, sekrecją zmagazynowanych substancji oraz agregacją (Olas 2001, Piccione i wsp. 2010, Yeaman 1997). Aktywacja ta może być hamowana poprzez inhibitory cyklooksygenazy (np. niesteroidowe leki przeciwzapalne). Ze względu na to, że pobudzenie płytek pod wpływem trombiny jest niezależne od inhibicji cyklooksygenazy, trombina zaliczana jest do tzw. silnych agonistów płytek. Natomiast ADP i epinefryna (adrenalina) należy do grupy słabych płytkowych aktywatorów 15

(McMichael 2005, Michalak i wsp. 2010, Yeaman 1997). W tym zakresie obserwuje się pewne zróżnicowanie gatunkowe. Badania przeprowadzone przez Segura i wsp. 2005 dowiodły, iż epinefryna jest słabym aktywatorem płytek krwi konia, w związku z czym nie wykazuje efektu agregacyjnego u tego gatunku zwierząt. Przyłączenie agonisty do specyficznego receptora błonowego sprzężonego z białkiem G inicjuje przekazywanie sygnału aktywacyjnego do wnętrza komórki. Zachodząca wówczas hydroliza fosfolipidów błonowych uruchamia dwa podstawowe, powiązane ze sobą szlaki metaboliczne szlak fosfolipazy C oraz kaskadę kwasu arachidonowego (AA) (Olas i Wachowicz 1995, Feldman i wsp. 2000, Saluk-Juszczak i Królewska 2010, Stachowiak i wsp. 2008). Fosfolipaza C poprzez rozkład PIP2 (difosforan fosfatydyloinozytolu) prowadzi do powstania wtórnych przekaźników : diacyloglicerolu (DAG) oraz trójfosforanu inozytolu (IP3), pośredniczącego w przenoszeniu jonów wapnia Ca 2+ do cytoplazmy płytek. IP3 wraz z DAG stymulują fosforylację białek cytoszkieletu, co skutkuje przemieszczeniem i uwalnianiem ziarnistości oraz zmianą kształtu płytek (Feldman i wsp. 2000, Saluk-Juszczak 2007, Stachowiak i wsp. 2008, Szumiło i Rahden-Staroń 2008, Wrzyszcz 2003). Uwolnienie jonów Ca 2+ odgrywa kluczową rolę w procesie aktywacji fosfolipazy A2 i uruchomieniu kaskady kwasu arachidonowego (AA) (Feldman i wsp. 2000, Komosa i wsp. 2010, Kuwahara i wsp. 2002). Kwas arachidonowy jest metabolizowany w dwóch odmiennych układach. W układzie zależnym od 12-lipooksygenazy dochodzi do powstania głównie hydroksykwasów (kwas 12-hydroperoksyeikozatetraenowy (12-HPETE) i kwas 12-hydroksyeikozatetraenowy (12-HETE)), a także hepoksylin A3 i B3. Natomiast w układzie zależnym od cyklooksygenazy kwas arachidonowy ulega przemianie w nadtlenki prostaglandyn (PGG2, PGH2), które następnie są przekształcane przy udziale syntazy tromboksanu w tromboksan A2 (TXA2). TXA2 jest metabolitem o dużej aktywności i krótkim, około 30-sekundowym, okresie półtrwania. Szybko ulega rozpadowi do nieaktywnego tromboksan B2 (TXB2) (Feldman i wsp. 2000, McMichael 2005, Stachowiak i wsp. 2008, Szypuła i wsp. 2009). Wspomniany TXA2 jest silnym agonistą płytek, który stymuluje ich agregację i uwalnianie ziarnistości. Powoduje równocześnie silnie zwężenie naczyń krwionośnych (Feldman i wsp. 2000, Murray i Fitzgerald 1989, Olas i Wachowicz 1995, Stachowiak i wsp. 2008, Szypuła i wsp. 2009, Textor 2010). Przeciwstawne do tromboksanu działanie wykazuje inny produkt metabolizmu kwasu arachidonowego komórek śródbłonka, jakim jest prostacyklina (PGI2). Hamuje ona aktywność płytek oraz wywołuje rozszerzenie naczyń 16

krwionośnych (Feldman i wsp. 2000, Komosa w wsp. 2010, Wnuczko i Szczepański 2007, Szypuła i wsp. 2009). Rola płytek krwi nie ogranicza się tylko do układu hemostazy. Wykazano, że płytkopochodne czynniki odgrywają istotną rolę także w wielu innych procesach toczących się w organizmie m.in. w procesach zapalnych, wpływając na wytwarzanie cytokin, chemokin, cząsteczek adhezyjnych, co wpływa na procesy gojenia. Wskazuje się na szczególną ich rolę w procesach odpornościowych poprzez indukcję dojrzewania komórek dendrytycznych, jak również wytwarzania przeciwciał i wzmacnianie odpowiedzi immunologicznej (Arguelles i wsp. 2006, Iwaszko-Simonik i wsp. 2012a, Ważna 2006, Yeaman 1997, 2010). Podkreślany jest także udział płytek w metastazie komórek nowotworowych, a u człowieka również powstawaniu i rozwoju stanów miażdżycowych (Chen i Geng 2006, Kaushansky 2009, Kralisz 2008, Michalak i wsp. 2010, Wrzyszcz 2003). Okazuje się, że płytki krwi, podobnie jak leukocyty, posiadają zdolność pochłaniania różnego rodzaju cząstek nieorganicznych (cząsteczek lateksu, złota), bakterii (np. Staphylococcus aureus), wirusów, czy też grzybów (np. Candida albicans) (Boukour i Cramer 2005, Escolar i wsp. 1989, Kamocki i wsp. 2005, Male i wsp. 1992, Matowicka-Karna i Kemona 2002, Saluk-Juszczak 2007, White 2005, Yeaman 1997, Yeaman 2010, Youssefian i wsp. 2002). Zdolność pochłaniania różnorodnych cząsteczek (np. oranż akrydyny, czerwień obojętna) posiadają komórki żywe, co z powodzeniem wykorzystuje się jako test dla określenia żywotności komórek w testach na cytotoksyczność różnych substancji (Antal i wsp. 1995, Ciapetti i wsp. 1996, Iwaszko-Simonik i wsp. 2010b, Repetto i wsp. 2008, Roland i Birrenkott 1998). Jak dotąd nie wyjaśniono definitywnie, czy jest to proces aktywny, czy tylko bierny efekt sekwestracji obcych cząsteczek (Escolar i wsp. 1989, Male i wsp. 1992, White 1972, White 2005, White 2006a, White i Escolar 1991, Youssefian i wsp. 2002). W badaniach z użyciem trombocytów ptaków Roland i Birrenkott 1998 wykazali, że ilość pochłoniętej czerwieni obojętnej zależy od stanu czynnościowego tych komórek. Znalazło to potwierdzenie w przeprowadzonych badaniach własnych. Zróżnicowaną zdolność pochłaniania czerwieni obojętnej wykazywały płytki szczurów w zależności od pochodzenia podawanych szczurom ekstrahowanych z roślin substancji polifenolowo-polisacharydowych (Iwaszko-Simonik i wsp. 2010b). 17

1.3.1. Adhezja Jak już wspomniano wcześniej, tworzenie pierwotnego czopu hemostatycznego jest procesem wieloetapowym, który rozpoczyna się adhezją płytek do uszkodzonego śródbłonka. Jakiekolwiek naruszenie jego integralności skutkuje odsłonięciem włókien kolagenu oraz uwolnienia z ciałek Weibel-Pallade go czynnika von Willebranda vwf (ang. von Willebrand Factor), który ułatwia adhezję płytek do miejsca uszkodzenia (Kobusiak-Prokopowicz i wsp. 2006, Kralisz 2008, Michalak i wsp. 2010). W adhezji płytek do śródbłonka biorą udział receptory rozmieszczone zarówno na powierzchni płytek, a także cząstki adhezyjne na śródbłonku, szereg cytokin uwalnianych z płytek, komórek śródbłonka i leukocytów oraz liczne białka adhezyjne uwalniane z warstwy podśródbłonkowej lub obecne we krwi. Istotną rolę w tym procesie odgrywa P-selektyna, a także integryna 2 1 oraz kompleks GP Ib/IX/V (Kobusiak-Prokopowicz i wsp. 2006). P-selektyna (CD62P) P-selektyna jest białkiem adhezyjnym umiejscowionym w α-ziarnistościach płytek oraz w ciałkach Weibela-Pallade a komórek śródbłonka (Gawaz i wsp. 1999, Massaguer i wsp. 2003, Merten i Thiagarajan 2004, Polek i wsp. 2009, Xu i wsp. 2007). Jest glikoproteiną o masie cząsteczkowej 140 kda, zbudowaną z trzech części: domeny zewnątrzkomórkowej, części międzybłonowej (transbłonowej) oraz domeny wewnątrzkomórkowej (cytoplazmatycznej). Część zewnątrzkomórkowa zbudowana jest z N-końcowej domeny lektynowej wiążącej jony wapnia, leżącej za nią domeny podobnej do czynnika wzrostu naskórka (EGF epidermal growth factor) oraz serii krótkich, powtarzających się domen przypominających białka regulacyjne układu dopełniacza (Polek i wsp. 2009, Massaguer i wsp. 2003, Ważna 2006, Merten i Thiagarajan 2004, Schmitt-Sody i wsp. 2007). Podczas aktywacji płytek (np. trombiną, ADP, kolagenem czy LPS-em), -ziarnistości ulegają przemieszczeniu i fuzji z błoną komórkową, podczas której dochodzi do uwolnienia do osocza mikropęcherzyków (PMV platelet-derived microvesicles), zwanych inaczej mikrocząsteczkami (PMP platelet-derived microparticles) (Merten i Thiagarajan 2004, Polek i wsp. 2009, Smith 2009, Stenberg i wsp. 1985, Ważna 2006). 18

Wykazano, że PMV (PMP) są fragmentami błon komórkowych aktywowanych płytek, które na drodze egzocytozy są uwalniane do osocza (Łuksza i Mantur 2009, Smith 2009, Ważna 2006). Na swojej powierzchni zawierają szereg białek prokoagulacyjnych tj. czynnik von Willebranda, P-selektynę, czy też czynnik tkankowy (TF - tissue tactor). Zjawisko uwalniania PMV z aktywowanych płytek zostało dobrze udokumentowane (Łuksza i Mantur 2009, Smith 2009, Ważna 2006). Towarzyszy temu szybka translokacja P-selektyny na powierzchnię płytek (w ciągu kilkunastu sekund) (Lalko i wsp. 2003, Massaguer i wsp. 2003, Merten i Thiagarajan 2004, Michelson i wsp. 1999, Xu i wsp. 2007). Wykazano, że aktywne płytki człowieka mają na swojej powierzchni około 10 000 cząsteczek P-selektyny (Merten i Thiagarajan 2004, Polek i wsp. 2009, Stenberg i wsp. 1985). Ma ona jednak krótki okres półtrwania i utrzymuje się na powierzchni aktywowanych komórek około jednej godziny od maksymalnej ekspresji. Następnie złuszczana jest do osocza na powierzchni mikropęcherzyków (mikrocząstek) (Merten i Thiagarajan 2004, Polek i wsp. 2009, Stenberg i wsp. 1985, Ważna 2006). Uwolniona do osocza P-selektyna nazywana jest rozpuszczalną formą P-selektyny (sp-selektyna soluble P-selectin, scd62p) uznawana jest jako marker aktywacji płytek i śródbłonka. Jednakże ze względu na brak możliwości rozróżnienia źródła pochodzenia rozpuszczalnej P-selektyny (płytki czy śródbłonek), wiarygodniejszą formą oceny aktywności płytek jest cytometryczna analiza ekspresji CD62P na powierzchni wyizolowanych trombocytów (Merten i Thiagarajan 2004). W badaniach klinicznych u człowieka udowodniono, że wzrost ekspresji P-selektyny na powierzchni płytek, a zarazem wzrost jej stężenia w osoczu jest głównym czynnikiem predykcyjnym powikłań zakrzepowo-zatorowych (Polek i wsp. 2009). Można przypuszczać, że podobny mechanizm może mieć miejsce u koni. Powierzchniowa P-selektyna pełni rolę białka receptorowego CD62P, pośrednicząc w adhezji płytek krwi do śródbłonka naczyń krwionośnych oraz do komórek układu białokrwinkowego (Polek i wsp. 2009, Dunkel i wsp. 2009, Śliwińska-Stańczyk 2005). Oddziaływanie P-selektyny z ligandem PSGL-1 (P-Selectin Glycoprotein Ligand 1) obecnym na leukocytach powoduje powstawanie agregatów płytek krwi z leukocytami (Furie 2009, Merten i Thiagarajan 2004, Peters i wsp. 1997, Pawlus i wsp. 2010, Polek i wsp. 2009, Weiss i wsp. 1998a, Xu i wsp. 2007). Wspomniana selektyna uczestniczy również w toczeniu się płytek po powierzchni śródbłonka (Chen i Geng 2006, Furie i Furie 2004, Lalko i wsp. 2003, Merten i Thiagarajan 2004, Pawlus i wsp. 2010, Polek i wsp. 2009, Schmitt-Sody i wsp. 2007, Vandendries i wsp. 2004). W czynności tej 19

udział bierze P-selektyna oraz jej ligand PSGL-1, które odpowiadają za luźny i odwracalny kontakt płytek z komórkami śródbłonka. Ścisła adhezja, a następnie agregacja wymaga zaangażowania integryn płytek krwi i komórek śródbłonka, zwłaszcza integryny IIb 3 (inaczej receptor GP IIb/IIIa lub CD41/61) (Borowska i wsp. 2006, Kralisz 2008). Adhezja płytek do składników podśródbłonkowej tkanki łącznej jest również zależna od warunków przepływu krwi oraz od obecności na powierzchni płytek specyficznych receptorów glikoproteinowych (McMichael 2005, Stachowiak i wsp. 2008). Przy przepływie o niskim module ścinania (ang. low shear rate), charakterystycznym dla dużych tętnic i żył, płytki wiążą się bezpośrednio z kolagenem za pośrednictwem receptora GPIa/IIa (integryna 2 1). Natomiast w warunkach przepływu o wysokim module ścinania (ang. high shear rate), w małych tętnicach lub zwężonych naczyniach krwionośnych, adhezja płytek do kolagenu odbywa się za pośrednictwem vwf. W łączeniu się płytek z vwf uczestniczy kompleks receptorowy GP Ib/IX/V oraz integryna IIb 3 (McMichael 2005, Michelson i Barnard 1987, Kralisz 2008, Stachowiak i wsp. 2008, Sikora i Kostka 2005). Adhezja płytek skutkuje ich aktywacją, z następującą zmianą kształtu, sekrecją zmagazynowanych substancji, a w późniejszym okresie agregacją (Borowska i wsp. 2006, Dallap Schaer i Epstein 2009, Stachowiak i wsp. 2008). 1.3.2. Aktywacja Zmiana kształtu płytek krwi W procesie aktywacji dochodzi do zmian metabolizmu płytek, zmiany struktury cytoszkieletu oraz translokacji białek. Reorganizacja cytoszkieletu skutkuje zmianą kształtu płytki z dyskoidalnego na sferyczny, a następnie wytworzeniem licznych wypustek (filopodiów i lamellipodiów) (Kuwahara i wsp. 2002, Saluk-Juszczak i Królewska 2010, Wrzyszcz 2003). Wypustki te wraz ze znajdującymi się na nich receptorami umożliwiają adhezję płytek do ściany naczynia krwionośnego i kontakt z innymi płytkami, a także przemieszczenie ziarnistości i sekrecję zmagazynowanych w nich związków (Olas 2001) 20

Sekrecja Na skutek wspomnianych zmian strukturalnych dochodzi do uwolnienia zawartości ziarnistości płytek do osocza. Uwalnianie ich zawartości następuje na skutek fuzji poszczególnych ziarnistości (Brunso i wsp. 2010, Gader i wsp. 2008, Segura i wsp. 2006). Z ziarnistości gęstych uwalniane są wapń, serotonina i dwufosforan adenozyny (ADP), a z ziarnistości alfa czynnik von Willebranda, fibronektyna, trombospondyna, płytkowopochodny czynnik wzrostu (PDGF - platelet-derived growth factor) i białko neutralizujące heparynę (PF-4 - płytkowy czynnik 4). Uwolnione substancje aktywne łączą się z odpowiednim receptorami powierzchniowymi, wzmacniając adhezję oraz agregację (McMichael 2005, Olas i Wachowicz 1995). 1.3.3. Agregacja Integryna IIb 3 - GP IIb/IIIa (CD 41/61) Końcowa faza powstawania płytkowego czopa hemostatycznego agregacja - polega na łączeniu się płytek ze sobą za pomocą fibrynogenu. Zasadniczą rolę w tym procesie odgrywa integryną IIb 3 nazywana inaczej kompleksem glikoproteinowym GP IIb/IIIa, czy też receptorem CD 41/61. Integryna IIb 3 jest heterodimerem zbudowanym z dwóch podjednostek: alfa ( ) i beta ( ) połączonych ze sobą niekowalencyjnie. W wiązaniu tych podjednostek biorą udział dwuwartościowe kationy tj. jony wapnia i magnezu, które są niezbędne do utrzymania prawidłowej struktury przestrzennej tego receptora, a tym samym zapewnienia zdolności wiązania ligandów (Borowskaiwsp.2006, Dominguez-Jimenez i wsp. 1999, Ma i wsp. 2007, Fullard 2004, Topol i wsp. 1999). Wspomniany receptor składa się z fragmentu zewnątrzkomórkowego (N-koniec), odcinka przezbłonowego oraz krótkiej sekwencji cytoplazmatycznej (C-koniec). Podjednostka jest odpowiedzialna za swoiste wiązanie z ligandem. Swoistość ligandu jest determinowana sekwencją aminokwasową argininaglicyna-asparagina (tzw. kompleks RGD) fragmentu zewnątrzkomórkowego, rozpoznawanego przez integrynę. Przedstawiona sekwencja aminokwasowa jest składową fibrynogenu i czynnika von Willebranda, dla których integryna IIb 3 jest receptorem (Borowska i wsp. 2006, Ma i wsp. 2007, Fullard 2004). 21

Wykazano, iż receptor GP IIb/IIIa charakteryzuje się dwukierunkowym przekazywaniem sygnału do wnętrza komórki i na zewnątrz (ang. outside-in signaling). Aktywacja receptora skutkuje przekazaniem sygnału pobudzającego do wnętrza komórki, a następnie inicjowane jest przekazanie sygnału na zewnątrz, co skutkuje zmianą powinowactwa receptora do ligandu (Ryc. 1) (Cierniewski 2000, Feldman i wsp. 2000, Fullard 2004). Ryc. 1. Aktywacja płytek krwi pod wpływem agonistów, skutkująca ekspresją receptorów powierzchniowych (CD62P - P-selektyna, GPIIb/IIIa CD41/61) oraz uwolnieniem ziarnistości i mikrocząsteczek (PMP) (wg Gawaz i wsp. 1999, modyfikacja własna). Thr - trombina; Col kolagen; ADP adenozynotrójfosforan; Epi epinefryna (adrenalina); Fg - fibrynogen Kompleks glikoproteiny płytkowej IIb/IIIa jest najliczniejszym receptorem na powierzchni płytek (Olas i Wachowicz 1995, Olas 2001, Wrzyszcz 2003). Szacuje się, iż jeden trombocyt w stanie spoczynku zawiera około 50 000-80 000 kopii tej integryny. Dodatkowa ilość tych receptorów jest eksponowana podczas aktywacji, na skutek przesunięcia z puli wewnątrzkomórkowej (Fullard 2004, Topol i wsp. 1999, Varga-Szabo i wsp. 2008). Podczas aktywacji płytek dochodzi do zmiany konformacji glikoproteiny ze zwiniętej formy spoczynkowej, w rozwiniętą formę aktywną (Cierniewski 2000, Feldman i wsp. 2000, Ma i wsp. 2007). W procesie tym uczestniczy kinaza białkowa C, która fosforyluje cytoplazmatyczne domeny receptora. 22

Ta transformacja zwiększa powinowactwo receptora do fibrynogenu i czynnika von Willebrandta (Feldman i wsp. 2000, Ma i wsp. 2007). Związanie się fibrynogenu z receptorami GP IIb/IIIa (CD41/61) znajdującymi się na powierzchni pobudzonych płytek prowadzi do ich połączenia i powstania agregatu płytkowego (Sorensen i wsp. 2012). Płytki te uwalniają substancje biologicznie aktywne, które stymulują inne trombocyty przepływające obok uszkodzonego obszaru. Przyłączają się one do tworzonego agregatu, prowadząc do powstania pierwotnego czopa płytkowego. Jest on jednak nietrwały i utrzymuje się zaledwie kilka godzin, dopóki mechanizmy hemostazy wtórnej (osoczowej) nie doprowadzą do jego wzmocnienia poprzez wytworzenie sieci fibryny (McMichael 2005). W badaniach przeprowadzonych u człowieka za pomocą cytometrii przepływowej dostrzeżono, iż używając przeciwciał łączących się z aktywną formą integryny można określić stopień aktywności płytek (Dunkel i wsp. 2009, Lalko i wsp. 2003, Michelson 2009, Saluk-Juszczak 2007, Wang i wsp. 1999). Ze względu, że receptor ten jest kluczowy dla agregacji trombocytów, stał się on celem efektywnej terapii antypłytkowej u ludzi (Dominguez-Jimenez i wsp. 1999, Komosa i wsp. 2010, Michalak i wsp. 2010). Na skutek zmian strukturalnych podczas aktywacji płytek oprócz ekspresji opisanych receptorów dochodzi również do ekspresji fosfolipidów tj. fosfatydyloseryny i fosfatydyletanoloaminy. Zwiększona ekspresja fosfatydyloseryny w zewnętrznej warstwie błony komórkowej płytek doprowadza do wytworzenia się powierzchni prokoagulacyjnej dostępnej dla czynników krzepnięcia. W ten sposób realizuje się kolejna funkcja płytek, jaką jest aktywacja osoczowej kaskady krzepnięcia, tzw. hemostazy wtórnej (Feldman i wsp. 2000, Łuksza i Mantur 2009, Radziwon i wsp. 2004, Smith 2009). 1.4. Hemostaza osoczowa W hemostazie osoczowej udział biorą białkowe czynniki krzepnięcia, ich kofaktory oraz inhibitory. Najczęściej wyróżnia się 12 osoczowych czynników krzepnięcia, które w większości produkowane są w wątrobie i oznaczane w nomenklaturze międzynarodowej cyframi rzymskimi. Czynniki te krążą w osoczu w postaci nieaktywnych proenzymów, a ich aktywacja zapoczątkowuje szereg 23

uporządkowanych reakcji wtórnej hemostazy, której istotą jest przekształcenie fibrynogenu w fibrynę pod wpływem enzymu trombiny (Dallap-Schaer i Epstein 2009, Levi i wsp. 2003, Raszeja-Specht 2008). Powstawanie fibryny w miejscu uszkodzenia naczynia krwionośnego jest wynikiem cyklu reakcji, definiowanych powszechnie jako kaskada krzepnięcia. W klasycznym modelu kaskady krzepnięcia, odnoszącym się do warunków in vitro, wyróżnia się drogę zewnątrz- i wewnątrzpochodną oraz tor wspólny (Ryc. 2). W rzeczywistości trudno jest wyodrębnić poszczególne drogi aktywacji procesów krzepnięcia, gdyż są one ze sobą ściśle powiązane i zazwyczaj przebiegają równocześnie (Dallap-Schaer i Epstein 2009, Raszeja-Specht 2008, Smith 2009, Wheeler i Rice 2010). Jednakże model ten najprościej obrazuje przemiany zachodzące podczas aktywacji krzepnięcia oraz stanowi proste zaplecze teoretyczne dla laboratoryjnej diagnostyki układu hemostazy (Raszeja-Specht 2008, Smith 2009, Wheeler i Rice 2010). Obecnie klasyczny model kaskady krzepnięcia uległ pewnym modyfikacjom i uwzględnia pojęcia fazy: inicjacji, wzmocnienia oraz fazy efektorowej. Dowiedziono, iż w inicjacji procesów krzepnięcia in vivo odpowiedzialny jest głównie układ zewnątrzpochodny, natomiast układ wewnątrzpochodny, jako modulator układu zewnątrzpochodnego, pełni rolę pomocniczą (Radziwon i wsp. 2004). Głównym aktywatorem zewnątrzpochodnego toru krzepnięcia w ustroju jest czynnik tkankowy (TF tissue factor) pochodzący z uszkodzonych tkanek. Jakiekolwiek uszkodzenie śródbłonka (uraz, zabieg operacyjny, endotoksyny) powoduje ekspozycję czynnika tkankowego oraz jego bezpośredni kontakt z krwią. Umożliwia to połączenie TF z czynnikiem VII w obecności jonów wapnia, tworząc kompleks TF/VIIa, który aktywuje czynnik X do Xa. Alternatywnie kompleks może pośrednio aktywować czynnik X przez inicjację czynnika IX, który następnie aktywuje czynnik X. Aktywacja czynnika IX może również zachodzić przy pomocy czynnika XI, rozpoczynając fazę wzmocnienia (Dallap-Schaer i Epstein 2009, Levi i wsp. 2003, Radziwon i wsp. 2004). Aktywacja czynników IX i X prowadzi do połączenia pomiędzy wewnątrzi zewnątrzpochodnym torem układu krzepnięcia, nazywanego torem wspólnym. Czynnik X tworzy kompleks ze swoimi kofaktorami czynnikiem Va i VIIIa, aktywowanymi przez niewielką ilość trombiny, powstającą w pierwszych sekundach krzepnięcia (Dallap-Schaer i Epstein 2009, Levi i wsp. 2003, Raszeja-Specht 2008). Trombina inicjuje uwolnienie czynnika VIII z jego połączenia z czynnikiem von Willebranda. Aktywne czynniki krzepnięcia Xa, Va i VIIIa, są wiązane z ujemnie naładowanymi fosfolipidami powierzchni płytek za pomocą 24

jonów wapnia. Powstały kompleks proteolitycznie przekształca protrombinę do trombiny (Dallap-Schaer i Epstein 2009, Levi i wsp. 2003, Radziwon i wsp. 2004, Raszeja-Specht 2008). Początkowo stężenie trombiny jest zbyt niskie, aby wytworzyć dostateczną ilość fibryny, wystarcza jednak do aktywacji płytek krwi, czynników: V, VIII oraz pośrednio IX, tworząc układ dodatnich sprzężeń zwrotnych zwielokratniających jej generowaną ilość (Dallap-Schaer i Epstein 2009, Michelson i Barnard 1987, Radziwon i wsp. 2004). W fazie efektorowej trombina rozszczepia cząsteczki fibrynogenu na fibrynopeptydy A i B oraz monomery fibryny jak również aktywuje czynnik XIII (czynnik stabilizujący fibrynę). Monomery fibryny ulegają polimeryzacji, tworząc siatkę fibryny, które są wzmacniane i stabilizowane dwusiarczkowymi wiązaniami przy udziale czynnika XIIIa (Radziwon i wsp. 2004, Raszeja-Specht 2008, Sorensen i wsp. 2012). Dowiedziono, iż wewnątrzpochodny szlak krzepnięcia pełni tylko podrzędną rolę w układzie hemostazy w warunkach in vivo. Szlak ten jest aktywowany poprzez kontakt czynnika XII (czynnika Hagemana) z prekalikreiną oraz wysokocząsteczkowym kininogenem (HMWK - high molecular weight kininogen). Białka te nazywane czynnikami kontaktu aktywując się wzajemnie (sprzężenie zwrotne dodatnie), biorą udział przede wszystkim w inicjacji procesu zapalnego (w tym kininogenezy). Z krążącej we krwi prekalikreiny pod wpływem czynnika XII powstaje kalikreina osoczowa, która jest kofaktorem reakcji przejścia wysokocząsteczkowego kininogenu w kininy (bradykinina, kalidyna). Kininy są aktywnymi peptydami regulującymi proces zapalny, które oddziaływują na naczynia prowadzą do ich rozszerzenia oraz zwiększonej przepuszczalności (Levi i wsp. 2003). Czynniki kontaktu stanowią ważne ogniwo łączące proces zapalny z krzepnięciem krwi. Kompleks tych czynników prowadzi do przejścia czynnika XI w jego aktywną formę (XIa), który dalej aktywuje czynnik IX. Czynnik IX może również zostać aktywowany przez czynnik VIIa, co stanowi przykład powiązania szlaku wewnątrz- i zewnątrzpochodnego. Czynniki kontaktu nie są konieczne do aktywacji procesów krzepnięcia, co potwierdza, iż wrodzone niedobory czynnika XII nie prowadzą do skaz krwotocznych. Widoczne jest to u konia, którego cechą gatunkową jest mniejsza aktywność czynnika XII w porównaniu z człowiekiem oraz innymi gatunkami, co nie powoduje występowania krwawień (Byars i wsp. 2003). 25

Czynniki kontaktu uczestniczą również w regulacji procesów fibrynolitycznych, np. czynnik XII aktywuje rozkład plazminogenu do plazminy. Jak już wspomniano, istotą krzepnięcia krwi jest powstanie fibryny w miejscu uszkodzenia. Natomiast procesem, który na skutek rozpuszczenia złogów fibryny przywraca drożność naczyń jest fibrynoliza. 26

UKŁAD KRZEPNIĘCIA UKŁAD ANTYKOAGULACYJNY XII XIIa Tor zewnątrzpochodny XI XIa TF Ca 2+ IX IXa TF/VIIa VII Tor Ca 2+ VIII VIIIa wewnątrzpochodny PL Białko C X Xa Tor wspólny AT V Va Ca 2+ PL Protrombina Trombina AT XIIIa XIII Fibrynogen Fibryna FIBRYNOLIZY Plazmina t-pa u-pa Plazminogen UKŁAD Ryc. 2. Schemat kaskady krzepnięcia (Szułdrzyński 2008, modyfikacja własna) PL fosfolipidy; TF czynnik tkankowy; AT antytrombina; t-pa tkankowy aktywator plazminogenu; u-pa urokinazowy aktywator plazminogenu; Ca 2+ - wapń. 27

1.5. Fibrynoliza Podobnie jak układ krzepnięcia, układ fibrynolizy stanowi system powiązanych ze sobą enzymów proteazowych, aktywatorów oraz ich inhibitorów (Ryc 2) (Raszeja- Specht 2008). Aktywatory plazminogenu, tj. tkankowy aktywator plazminogenu (t-pa) i urokinazowy aktywator plazminogenu (u-pa) przekształcają plazminogen do aktywnego enzymu plazminy (Dallap-Schaer i Epstein 2009). Plazmina rozkłada fibrynogen i fibrynę, prowadząc do powstania tzw. produktów degradacji FDPs (ang. fibrinogen-fibrin degradation products) fragmentów X, Y, D i E. Natomiast w wyniku działania plazminy na ustabilizową przez czynnik XIIIa fibrynę powstają specyficzne produkty degradacji fibryny, zwane D-dimerami (Brooks 2008, Dallap- Schaer i Epstein 2009, Dąbrowska 2000, Levi i wsp. 1997, 2003, Tapper i Herwald 2000). Obecność tych ostatnich świadczy o wtórnej aktywacji fibrynolizy, poprzedzonej aktywacją krzepnięcia i generacją fibryny, typowej dla przebiegu procesu rozsianego wykrzepiania wewnątrznaczyniowego (DIC - disseminated intravascular coagulation) (Dąbrowska 2000). Hamowanie procesów fibrynolitycznych odbywa się głównie wskutek działania inhibitorów, tj. inhibitorów aktywacji plazminogenu (PAI - plasminogen activator inhibitor) oraz antyplazmin (alfa2 - antyplazmina), unieczynniających plazminę (Brooks 2008, Dallap-Schaer i Epstein 2009, Dąbrowska 2000, Levi i wsp. 1997, 2003, Tapper i Herwald 2000). Zaburzenia procesów fibrynolizy mogą prowadzić zarówno do nadkrzepliwości, jak i krwawień (Brooks 2008, Byars i wsp. 2003, Dolente i Wilkins 2002, Dąbrowska i wsp. 1995, Murray i Fitzgerald 1989, Raszeja-Specht 2008, Sawicka 2000, Wisniewski i wsp. 1991). 1.6. Inhibitory procesu krzepnięcia Przebieg krzepnięcia krwi kontroluje i ogranicza szereg inhibitorów (Ryc. 2). Przy ich pomocy utrzymywana jest płynność krwi. Do najważniejszych inhibitorów należą antytrombina (AT), białko C i S (Couto 1999, Raszeja-Specht 2008). Antytrombina - AT (dawniej antytrombina III AT III) jest głównym inhibitorem trombiny i czynnika X, a także innych aktywowanych czynników krzepnięcia (Xa, XIIa, XIa, i IXa). Podstawowy mechanizm działania 28

antykoagulacyjnego opiera się na połączeniu AT z heparyną. Interakcja ta prowadzi do zmiany konformacyjnej cząsteczki AT, zwiększając jej powinowactwo do trombiny. Kompleks heparyna - AT inaktywuje wspomniany szereg enzymów krzepnięcia. Aby unieczynnić trombinę, heparyna musi związać się zarówno z enzymem, jak i z AT, natomiast inaktywacja czynnika Xa wymaga jedynie połączenia się heparyny z antytrombiną (Borawski i Myśliwiec 2009, Dąbrowska i Wiśniewski 1996, Hirsh i wsp. 2001, Scott i wsp. 2009). Unieczynnienie trombiny za pomocą AT odbywa się na powierzchni śródbłonka naczyniowego. Szybkość inaktywacji wspomnianych czynników wzrasta pod wpływem heparyny, co stało się podstawą terapii przeciwzakrzepowej (Brooks 2008, Couto 1999, Dallap-Schaer i Epstein 2009, Darien i wsp. 1991, Raszeja-Specht 2008). Obecność AT jest niezbędna do działania heparyny, stąd w stanach jej niedoboru lub zmniejszonej aktywności poniżej 70% może być przyczyną oporności na działanie heparyny i skutkować zwiększonym ryzykiem wystąpienia zakrzepów (Brooks 2008, Dąbrowska 2000). Do drugiego układu inhibitorowego, działającego na zasadzie ujemnego sprzężenia zwrotnego, należy układ białka C z jego kofaktorem białkiem S. Białko C jest glikoproteiną zależną od witaminy K, która w kompleksie z białkiem S inaktywuje aktywne czynniki Va i VIIIa. Aktywatorem białka C jest trombina wiążąca się z powierzchniowym białkiem nieuszkodzonych komórek śródbłonka trombomoduliną. Aktywne białko C działa również profibrynolitycznie poprzez inaktywację inhibitorów fibrynolizy. Niedobory białka C, czy też antytrombiny, sprzyjają wystąpieniu powikłań zakrzepowo-zatorowych (Brooks 2008, Dallap-Schaer i Epstein 2009, Dąbrowska 2000, Kittrell i Berkwitt 2012). Jak wcześniej wspomniano, proces zapalny spowodowany np. endotoksemią lub zabiegiem chirurgicznym w przebiegu ostrej postaci morzyska, wpływa na procesy krzepnięcia i fibrynolizy. W celu określenia zaburzeń hemostazy wykonuje się diagnostyczne badania koagulologiczne. 29

1.7. Diagnostyka hemostazy Diagnostyka zaburzeń układu krzepnięcia opiera się w pierwszej kolejności na wynikach badań przesiewowych, stanowiących punkt wyjścia dla dalszej diagnostyki szczegółowej opartej na ukierunkowanym oznaczaniu aktywności czynników osoczowych. (Couto 1999, Dąbrowska 2000, Iwaszko-Simonik i wsp. 2011, 2012b) (Ryc. 3). Wywiad +cechy krwawienia Badania przesiewowe Ocena hemostazy płytkowej Ocena hemostazy osoczowej Liczba płytek Czas okluzji Rozmaz krwi APTT, PT, TT Fibrynogen Badania uzupełniające Ocena hemostazy płytkowej Ocena fibrynolizy Ocena hemostazy osoczowej Ocena adhezji i agregacji płytek, ocena degranulacji, ocena receptorów powierzchniowych D-dimery Plazminogen Czynniki krzepnięcia, Inhibitory Ryc. 3. Schemat badania pacjenta z zaburzeniami hemostazy (wg. Raszeja-Specht 2008, modyfikacja własna). 30

Przesiewowe badania układu hemostazy Dla wstępnego rozpoznania zaburzeń hemostazy stosuje się zakres badań (Brooks 2008, Byars i wsp. 2003, Couto 1999, Dąbrowska 2000, Dallap-Schaer i wsp. 2009a, Dallap-Schaer i Epstein 2009, Iwaszko-Simonik i wsp. 2011, 2012b, Levi i wsp. 2011, Wheeler i Rice 2010, Yilmaz i wsp. 2002), obejmujących określenie: liczby płytek krwi PLT (platelets) wraz z oceną morfologii i funkcji; czasu protrombinowego PT (prothrombin time); czasu trombinowego TT (thrombin time); czasu częściowej tromboplastyny po aktywacji APTT (activated partial thromboplastin time); stężenia fibrynogenu. Ocena morfologii i funkcji płytek krwi W ocenie hemostazy pierwotnej stosuje się szereg badań ilościowych i jakościowych. Niektóre analizatory hematologiczne oprócz określenia liczby płytek pozwalają na wstępną ocenę ich jakości (średnia objętość płytek MPV (mean platelet volume). Wartość diagnostyczną zwiększa ocena morfologii płytek w rozmazie krwi. Pozwala ona wykluczyć zjawisko małopłytkowości rzekomej wynikającej z formowania się agregatów płytkowych lub opłaszczania przez płytki leukocytów we krwi pobranej na EDTA (Dąbrowska 2000, Dietz i Huskamp 2005, Raszeja-Specht 2008, Szczepiński 2006). Płytki krwi odgrywają kluczową rolę w procesie hemostazy. Zatem niezwykle ważne są badania, za pomocą których można w sposób szybki ocenić czynność płytek. Badania funkcji płytek obejmują najczęściej ocenę ich zdolności do adhezji i agregacji, jako wykładnik formowania pierwotnego czopu płytkowego. Do niedawna w ocenie pierwotnej hemostazy wykorzystywano czas krwawienia po standardowym nacięciu błony śluzowej przedsionka jamy ustnej (BMBT- buccal mucosal bleeding time), tj. czas od rozpoczęcia wypływu krwi po nacięciu błony śluzowej do chwili jego ustania (Dąbrowska 2000, Dietz i Huskamp 2005). Wydłużenie tego czasu wynika z niezdolności płytek do formowania czopu płytkowego, co przy prawidłowej liczbie PLT jest wynikiem zaburzeń funkcji płytek (trombopatii). Pomiar ten jest obarczony dużym błędem wynikającym z różnej głębokość nacięcia, różnic w ukrwieniu tkanek 31

oraz domieszki tromboplastyny tkankowej. Obecnie BMBT zastępowany jest metodami automatycznymi, przesiewowymi badaniami czynności płytek, np. czasem okluzji (CT ang. closure time) w aparacie PFA-100 (ang. the platelet function analyzer-100), który pozwala na szybką ocenę adhezji i agregacji tych komórek w krwi pełnej cytrynianowej (Michelson 2009, Segura i wsp. 2005). Wiele przeprowadzonych doświadczeń wykazało, iż jest to metoda przydatna w wykrywaniu dysfunkcji płytek nie tylko u ludzi, ale także psów, świń oraz koni (Brooks i wsp. 2009, Callan i Giger 2001, Clancel i wsp. 2009, Wuillemin i wsp. 2002). Czas okluzji jest metodą czułą, ale niespecyficzną, gdyż wpływ na niego ma wiele czynników tj. liczba płytek, hematokryt, leki, zaburzenia funkcjonowania receptorów, czy też reakcji uwalniania (Brooks i wsp. 2009, Harrison 2005a, 2005b). Ocenę aktywności i czynności płytek można również przeprowadzić z wykorzystaniem cytometrii przepływowej. W tej technice stosuje się specyficzne przeciwciała skierowane przeciwko antygenom powierzchniowym (Macey i wsp. 1999, Michelson i wsp. 2000, Ratomski i wsp. 2010). Jak wspomniano wcześniej, w tym celu z powodzeniem wykorzystuje się znakowanie P-selektyny (CD62P) oraz integryny IIb 3 - GP IIb/IIIa (CD 41/61). W ocenie żywotności, jak również funkcji płytek wykorzystuje się test pochłaniania czerwieni obojętnej (NR - neutral red). Czerwień obojętna jest kationowym barwnikiem, który łatwo przenika przez błony komórkowe na zasadzie dyfuzji niejonowej i gromadzi się w lizosomach. Na podstawie ilości pochłoniętego barwnika można wnioskować nie tylko o żywotności, ale również o czynności komórek (Antal i wsp. 1995, Ciapetti i wsp. 1996, Iwaszko-Simonik i wsp. 2010b, Repetto i wsp. 2008). Przesiewowe badania hemostazy osoczowej Sprawność układu krzepnięcia może być badana za pomocą czasów krzepnięcia w celu stwierdzenia, która z dróg kaskady krzepnięcia została aktywowana: Czas PT (czas protrombinowy) Pozwala ocenić sprawność zewnątrzpochodnego toru krzepnięcia, uruchamianego przez czynnik tkankowy TF, zwany też tromboplastyną tkankową. Jest szczególnie czuły na niedobory protrombiny, fibrynogenu i czynników V, VII i X 32

a całkowicie niezależny od czynników toru wewnątrzpochodnego. Obecność zwiększonej ilości inhibitorów krzepnięcia (np. heparyny) wpływa na wydłużenie czasu protrombinowego (Brooks 2008, Byars i wsp. 2003, Couto 1999, Dąbrowska 2000, Dallap-Schaer i wsp. 2009a, Dallap-Schaer i Epstein 2009, Levi i wsp. 2011, Raszeja- Specht 2008, Wheeler i Rice 2010, Yilmaz i wsp. 2002). Czas APTT (czas częściowej tromboplastyny po aktywacji) Jest to czas upływający od momentu aktywacji czynników wewnątrzpochodnego układu krzepnięcia do chwili powstania fibryny. Jest szczególnie wrażliwy na niedobory czynników VII, IX, XI, XII, prekalikreiny i wysokocząsteczkowego kininogenu oraz działanie inhibitorów krzepnięcia. Nie zależy od jakościowych i ilościowych zmian płytkowych (Brooks 2008, Byars i wsp. 2003, Couto 1999, Dąbrowska 2000 Dallap-Schaer i wsp. 2009a, Dallap-Schaer i Epstein 2009, Levi i wsp. 2011, Raszeja-Specht 2008, Skotnicki i Sacha 1997, Wheeler i Rice 2010, Yilmaz i wsp. 2002). Czas TT (czas trombinowy) Wskazuje na czas przekształcania fibrynogenu w fibrynę pod wpływem trombiny (tor wspólny). Jest zależny głównie od stężenia i właściwości fibrynogenu, aktywności trombiny, stymulatorów lub inhibitorów procesów polimeryzacji fibryny (Brooks 2008, Byars i wsp. 2003, Couto 1999, Dąbrowska 2000 Dallap-Schaer i wsp. 2009a, Dallap-Schaer i Epstein 2009, Levi i wsp. 2011, Raszeja-Specht 2008, Wheeler i Rice 2010, Winnicka 2003, Yilmaz i wsp. 2002). Fibrynogen (Fb) Rutynowym badaniem ilościowym w kontroli układu krzepnięcia jest oznaczanie stężenia fibrynogenu (czynnika I), który z postaci płynnej pod wpływem enzymu-trombiny, zmienia się w fibrynę stanowiącą konstrukcję skrzepliny. Stężenie fibrynogenu może być oznaczane bezpośrednio metodą chronometryczną Clauss'a lub metodą turbidymetryczną (podczas oznaczania czasu PT) (Brooks 2008, Byars i wsp. 2003, Couto 1999, Dąbrowska 2000, Dallap-Schaer i wsp. 2009a, Dallap-Schaer i Epstein 2009, Levi i wsp. 2011, Raszeja-Specht 2008, Wheeler i Rice 2010, Winnicka 2003, Yilmaz i wsp. 2002). 33

Badania szczegółowe układu hemostazy Ocena aktywności czynników krzepnięcia Obok wymienionych wskaźników hemostazy, odzwierciedlających przebieg poszczególnych etapów krzepnięcia, do dyspozycji lekarza weterynarii są również badania szczegółowe tj. ocena aktywności poszczególnych czynników krzepnięcia, a także aktywatorów i inhibitorów tego procesu (Winnicka 2003). Istotne znaczenie mają oznaczenia aktywności takich inhibitorów krzepnięcia jak antytrombina i białko C, gdyż ich niedobór stanowi zwiększone ryzyko wystąpienia zakrzepicy. Ocena przebiegu fibrynolizy Do oceny aktywności układu fibrynolitycznego służyć może określanie stężenia produktów rozkładu fibrynogenu i fibryny (FDP s) oraz D-dimerów. U koni największe znaczenie ma oznaczanie stężenia D-dimerów, zwłaszcza w diagnozowaniu zespołu DIC (Cesarini i wsp. 2010, Matyszczak i wsp. 2008, Monreal 2003, Stokol i wsp 2005). 34

2. ZAŁOŻENIA I CELE PRACY Z przedstawionego przeglądu piśmiennictwa wynika, że zmiany ustrojowe w przebiegu ostrych morzysk sprzyjają naruszeniu równowagi pomiędzy procesem krzepnięcia a fibrynolizy. Skutkiem zakłócenia tej równowagi może być nadmierne wykrzepianie krwi z powstawaniem licznych zakrzepów lub też osłabienie krzepliwości, przybierające postać skazy krwotocznej. Zmiany te warunkują nie tylko pogłębienie zaburzeń czynnościowych narządów, ale również mogą stanowić czynnik decydujący o przebiegu i skuteczności leczenia zespołu morzyskowego. Większość badań dotyczących hemostazy u koni wykonywana jest głównie przed zabiegami chirurgicznymi w celu oceny ryzyka krwawień, jak również powikłań zakrzepowo-zatorowych. W okresie pooperacyjnym natomiast kontroluje się skuteczność leczenia, m.in. inhibitorami krzepnięcia (np. heparyną). Opublikowane dotychczas prace dotyczące hemostazy w przebiegu morzysk koncentrowały się głównie na zmianach hemostazy osoczowej oraz towarzyszącemu im zespołowi wewnątrznaczyniowego wykrzepiania - DIC. Nieliczne są badania dotyczące roli i czynności płytek konia w trakcie rozwoju ostrych zaburzeń kolkowych oraz w późniejszym okresie terapii, zwłaszcza po operacyjnym leczeniu niedrożności jelit. Biorąc pod uwagę powyższe, jak również wykorzystując fakt, iż Katedra i Klinika Chirurgii Uniwersytetu Przyrodniczego we Wrocławiu stanowi jeden z kilku ośrodków w kraju, w którym przeprowadza się chirurgiczne leczenie niedrożności jelit u koni, postanowiono prześledzić dynamikę procesów związanych z hemostazą u koni w trakcie rozwoju ostrej postaci morzyska, w zestawieniu ze zmianami zachodzącymi w kolejnych dniach po zabiegu laparotomii. Zaplanowane badania oparto na ocenie wybranych wykładników hemostazy pierwotnej w zestawieniu z wykładnikami hemostazy osoczowej, obejmującej układ krzepnięcia i fibrynolizy. Za wykładniki funkcji płytek przyjęto oprócz parametrów morfologicznych (liczba płytek, średnia objętość płytek) także wskaźniki czynnościowe tj. czas okluzji czy ekspresja wybranych receptorów powierzchniowych. Postanowiono przy tym sprawdzić czy płytki krwi u konia, jako struktury bezpośrednio uczestniczące i kooperujące z komórkami biorącymi udział w odporności nieswoistej, posiadają zdolność pochłaniania (internalizacji) obcych cząsteczek oraz czy zdolność ta zmienia się w przebiegu kolki, co mogłoby posłużyć jako jeden z prostych i tanich testów 35

czynnościowych płytek u konia. W tym celu wykorzystano czerwień obojętną (NR), barwnik od lat stosowany w ocenie żywotności komórek. Ocenę hemostazy osoczowej oparto na testach przesiewowych tj. czasach krzepnięcia PT, APTT i TT, stężeniu fibrynogenu oraz ocenie aktywności wybranych inhibitorów krzepnięcia antytrombiny i białka C, a także określeniu poziomu produktów fibrynolizy - D-dimerów. Uwzględnienie w badaniach koni leczonych operacyjnie z powodu ostrych niedrożności jelit winno dostarczyć nie tylko informacji dotyczących zmian w hemostazie, ale także ukazać ich dynamikę w trakcie postępującego procesu zdrowienia. Przyjęto bowiem, że tak przeprowadzone doświadczenie posłuży nie tylko lepszemu poznaniu patogenezy zaburzeń morzyskowych u koni, ale może w przyszłości być wykorzystane jako punkt wyjścia dla wypracowania metod diagnostycznych, służących ocenie stanu zdrowia pacjenta przez lekarzy weterynarii, zajmujących się praktyką kliniczną koni. Zaproponowany układ doświadczalny winien przyczynić się do: 1) Wyjaśnienia czy i w jakim stopniu ostre zaburzenia morzyskowe u koni wpływają na funkcje płytek oraz procesy krzepnięcia i fibrynolizy; 2) Przybliżenia dynamiki zaburzeń hemostazy w przebiegu ostrej postaci morzyska oraz w pierwszym okresie po zabiegu laparotomii; 3) Określenia profilu czasowego reaktywności płytek w przebiegu morzyska oraz ich reakcji na uraz operacyjny; 4) Określenia zdolności płytek do internalizacji obcych substancji. 36

3. MATERIAŁ I METODY 3.1. Zwierzęta Badania przeprowadzono w okresie od października 2009 do czerwca 2011 roku. Objęto nimi 50 koni gorącokrwistych podzielonych na dwie grupy: doświadczalną (n = 30) i kontrolną (n = 20). Grupę doświadczalną stanowiły konie hospitalizowane i leczone chirurgicznie z powodu niedrożności jelit w Katedrze i Klinice Chirurgii Uniwersytetu Przyrodniczego we Wrocławiu. Konie w okresie hospitalizacji były utrzymywane w boksach Kliniki, karmione mieszanką musli z dodatkiem meszu (siemię lniane) oraz sianem i wyprowadzane na krótkie spacery. Grupa badana obejmowała konie gorącokrwiste w wieku 5-15 lat, różnej płci, rasy polski koń szlachetny półkrwi (n= 23), pełnej krwi angielskiej (n=3), śląskiej (n=2) oraz wielkopolskiej (n=2). Z uwagi na urozmaiconą etiopatogenezę morzysk, a w konsekwencji różny przebieg, w badaniach uwzględniono tylko te konie, które pomyślnie przeszły zabieg chirurgiczny oraz dalszą hospitalizację. W doświadczeniu nie uwzględniono koni poddanych pozorowanej laparotomii. Kierowano się przy tym nie tylko względami technicznymi i finansowymi, ale opinią prezentowaną przez Feige i wsp. (2003a), iż sam zabieg chirurgiczny nie wpływa znacząco na hemostazę. Grupę kontrolną stanowiło 20 koni w wieku 5-15 lat, różnej płci, rasy polski koń szlachetny półkrwi (n=10) oraz śląskiej (n=10), które nie wykazywały żadnych klinicznych objawów chorobowych. Wszystkie konie z tej grupy pochodziły z prywatnej hodowli, gdzie większość czasu przebywały na padokach. Zwierzęta karmiono zgodnie z normami żywienia koni, gdzie podstawę stanowiło siano i owies. Miały one zapewnioną stałą opiekę weterynaryjną, poddawane były regularnej profilaktyce przeciwpasożytniczej (wiosna i lato Antiverm, Biowet Drwalew S.A., Polska; jesień i zima Paramectin, ScanVet Poland Sp. z o. o., Polska) oraz szczepieniom przeciwko grypie i tężcowi (Equilis Prequenza Te, Intervet International B.V., Holandia). W przeciągu ostatniego miesiąca przed pobraniem materiału do badań w tej grupie nie przeprowadzano żadnych zabiegów ani też nie stosowano środków terapeutycznych. 37

Badania przeprowadzono po uzyskaniu zgody II Lokalnej Komisji Etycznej do Spraw Doświadczeń na Zwierzętach (Uchwała Nr 72/2009). 3.2. Układ doświadczalny Materiał do badań stanowiła krew pobierana z żyły szyjnej zewnętrznej (vena jugularis externa). Od każdego osobnika jednorazowo pobierano maksymalnie 30 ml krwi. W badaniach pilotowych wykazano, że czterokrotne pobranie 30 ml krwi od konia bez objawów klinicznych w odstępach 24 godzinnych nie wpływa na wartości badanych parametrów. W związku z tym w badaniach własnych postanowiono ograniczyć się do jednokrotnego pobrania krwi od koni z grupy kontrolnej. Od koni z grupy doświadczalnej materiał do badań pobierano w trakcie rutynowych badań przeprowadzanych przez personel medyczny Kliniki, na które właściciel zwierzęcia wyraził pisemną zgodę. Przyjmując, iż pierwsze doby po zabiegu chirurgicznego leczenia niedrożności jelit są decydujące o dalszym postępowaniu terapeutycznym i rokowaniu oraz w celu oceny dynamiki zmian zachodzących w tym okresie, postanowiono od każdego osobnika z grupy doświadczalnej pobrać materiał czterokrotnie. Utworzono w ten sposób następujące grupy doświadczalne: Konie przed zabiegiem operacyjnym grupa D-0 Konie 24 godziny po zabiegu grupa D-1 Konie 48 godzon po zabiegu grupa D-2 Konie 72 godziny po zabiegu grupa D-3 Zaproponowany układ doświadczalny ilustruje poniższy schemat: 38

W grupie doświadczalnej starano się pobierać krew od każdego osobnika w poszczególnych dniach obserwacji (od D-0 do D-3). Nie zawsze, ze względów technicznych, pobrano krew we wszystkich przedziałach czasowych. Braki w próbobraniu były spowodowane m.in. operacjami w godzinach nocnych lub w dni świąteczne, jak również zbyt małą ilością pobranej krwi, niezbędnej przede wszystkim do rutynowych oznaczeń rekonwalescentów. U wybranej grupy koni wykonano badania cytometryczne. 3.3. Kryteria kwalifikowania koni do zabiegu laparotomii Konie do zabiegu laparotomii kwalifikowano na podstawie wyników badania klinicznego obejmującego badanie układu sercowo-naczyniowego i pokarmowego, w którym uwględniano: - liczbę uderzeń serca oraz jakość tętna, - czas wypełniania naczyń kapilarnych ocenianych poprzez uciśnięcie błony śluzowej w jamie ustnej (CRT capillary refill time), - ukrwienie błon śluzowych jamy ustnej, - objawy bólowe, nie ustępujące po podaniu niesteroidowych leków przeciwzapalnych (NSAIDs - nonsteroidal inflammatory drugs), -zaburzenia perystaltyki jelit, jak również przemieszczenie jelit wyczuwalne podczas badania rektalnego, -obecność refluksu żołądkowo-jelitowego po założeniu zgłębnika nosowożołądkowego. 3.4. Postępowanie przed-, śród- i pooperacyjne Po przyjęciu do Kliniki u wszystkich koni rutynowo zakładano kateter do żyły szyjnej zewnętrznej, pobierano krew do badań hematologicznych, biochemicznych oraz gazometrycznych. Na podstawie wyników tych badań, jeszcze przed zabiegiem operacyjnym korygowano zaburzenia w gospodarce wodno-elektrolitowej oraz równowadze kwasowo-zasadowej. Po ustabilizowaniu stanu ogólnego, konie poddawano sedacji przy użyciu romifidyny 0,04-0,06 mg/kg iv. (Sedivet, Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH, Ingelheim, Niemcy), butorfanolu 0,03 0,05 mg/kg i.v. (Torbugesic Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH, Ingelheim, Niemcy, ScanVet 39

Poland). Narkozę indukowano podaniem propofolu 0,5mg/kg (Propofol 1% MCT/LCT Fresenius, Fresenius Kabi Deutschland GmbH, Bad Homburg, Niemcy), ketaminy (1,5 mg/kg i.v.; VetaKetam, Vet-Agro Sp. z o.o., Lublin, Polska) i diazepamu (0,08 mg/kg i.v; Relanium Warszawskie Zakłady Farmaceutyczne Polfa S.A., Warszawa, Polska), a następnie podtrzymywano halotanem (Narcotan, Zentiva N.V.) administrowanym drogą wziewną, a także stałym wlewem propofolu i ketaminy. Optymalne ciśnienie krwi utrzymywano za pomocą ciągłego wlewu dobutaminy (1 10 µg/kg, Dobuject, Bayer Sp. z o. o., Warszawa,Polska), w dawkach zależnych od stopnia hipotensji. Po ustabilizowaniu stanu pacjenta wykonywano zabieg laparotomii, podczas którego przez ranę operacyjną wydobywano poszczególne partie jelit. Podczas eksploracji jamy brzusznej dokonywano odgazowywania jelita ślepego w przypadku jego wzdęcia, przeprowadzano repozycję jelit cienkich i grubych oraz przemasowywania treści jelitowej od początkowego odcinka jelit do jelita ślepego. W przypadku przeładowania okrężnicy masami kałowymi wykonywano enterotomię (przecięcie ściany jelita) w zgięciu miednicznym i usuwano zalegającą treść. W przypadku skrętu jelit cienkich z ich niedokrwieniem i martwicą, przeprowadzano enterektomię (usunięcie części jelita) i zespolenie jelit. W trakcie zabiegu jelita były regularnie płukane 0,9% roztworem soli fizjologicznej, w celu zapobiegnięcia zrostom. W okresie pooperacyjnym prowadzono rutynową terapię, obejmującą podaż niesteroidowych leków przeciwzapalnych - fluniksyny (Finadyne, Intervet International B.V., Boxmeer, Holandia) w dawce 0,25 mg/kg co 6 godzin przez minimum trzy doby, antybiotyków - penicyliny krystalicznej (22 000 j.m./kg co 6 godz., i.v., Penicillin G Sodium Sandoz, Sandoz GmbH, Kundl, Austria) i gentamycyny (6,6 mg/kg co 24 godz., i.v., Gentamycyna 5% Inj., Biowet Puławy Sp. z o.o., Polska), antykoagulantów heparyny sodowej w dawce 50 j.m./kg co 8 godz., s.c. (Heparinum WZF, Warszawskie Zakłady Farmaceutyczne Polfa S.A., Warszawa, Polska). U wszystkich koni prowadzono terapię nawadniającą, obejmującą infuzję: roztworu Ringera z mleczanami (10-20 ml/kg/h, i.v., Ringer Lactate, Baxter Healthcare S.A., Zurich, Szwajcaria), Plasmalyte (4-8 ml/kg/h, i.v., Baxter Healthcare S.A., Zurich, Szwajcaria), 0,9% roztworu soli fizjologicznej (4-8 ml/kg/h, i.v., Natrium Chloratum 0,9%, Baxter Healthcare S.A., Zurich, Szwajcaria) oraz Duphalyte (2 ml/kg/h, i.v., Fort Dodge Animal Health Holland, Weesp, Holland, ScanVet Poland Sp. z o.o.). W razie konieczności (pooperacyjna niedrożność porażenna jelit cienkich, tzw. illeus) 40

podawano lignokainę (Lignocainum Hydrochloricum WZF 2%, Warszawskie Zakłady Farmaceutyczne Polfa S.A., Warszawa, Polska) we wlewie ciągłym, administrowanym przez 24 h przy pomocy pompy infuzyjnej (bolus 1,3 mg/kg, kontynuacja 0,05 mg/kg/min). Konie były hospitalizowane przez okres 10-14 dni po zabiegu, po którym opuszczały klinikę w stanie dobrym (bez nawrotów objawów morzyskowych), co wskazywało na właściwy sposób leczenia i powrót do zdrowia. 3.5. Badania hematologiczne Krew przeznaczoną do badań hematologicznych od zwierząt objętych obserwacjami (n=89) pobierano w ilości 2 ml,do probówek zawierających K3EDTA. Badania wykonywano za pomocą automatycznego analizatora hematologicznego (PE - 6800 vet, Procan Electronics INC, China). W analizie uwzględniono: a) liczbę erytrocytów RBC, b) hematokryt Ht, c) zawartość hemoglobiny Hb, d) liczbę leukocytów WBC, e) liczbę płytek krwi PLT, f) średnią objętość płytek MPV, g) leukogram. W celu wykonania leukogramu sporządzano po dwa rozmazy krwi, które po wybarwieniu według metody May Grünwalda-Giemzy (MGG), analizowano pod mikroskopem (Leitz, Biomed, Niemcy, pow. 1800 x). W rozmazie liczono 200 napotkanych leukocytów, które różnicowano na poszczególne populacje tj. granulocyty obojętnochłonne (neutrofile), limfocyty, monocyty, granulocyty kwasochłonne (eozynofile), granulocyty zasadochłonne (bazofile). Na te tej podstawie ustalano odsetek komórek zaliczanych do: granulocytów: obojętnochłonnych (neutrofile) ze zróżnicowaniem na formy dojrzałe (z jądrem segmentowanym) oraz formy młodociane (mielocyty, metamielocyty i formy pałeczkowate), 41

kwasochłonnych (eozynofile), zasadochłonnych (bazofile), agranulocytów: limfocytów, monocytów. Zestawiając wartości procentowe z ogólną liczbą leukocytów wyliczano bezwględną liczbę poszczególnych komórek. Z wyliczonych wartości bezwzględnych neutrofilów (N) i limfocytów (L) ustalano wskaźnik N/L, czyli stosunek neutrofilów do limfocytów. Dodatkowo w osoczu oznaczano stężenie białka całkowitego TP (total protein) przy użyciu refraktometru (Atago SPR-NE, Atago Co LTD, Japan). 3.6. Badania koagulologiczne Krew do badań koagulologicznych (25 ml) mieszano w stosunku 9:1 z 3,8% roztworem cytrynianu sodu. 3.6.1. Ocena hemostazy pierwotnej-płytkowej Oceny hemostazy pierwotnej płytkowej wstępnie dokonywano na podstawie: -liczby płytek i ich średniej objętości, -czasu okluzji. Natomiast z uzyskanego osocza bogatopłytkowego (PRP) sporządzano zawiesinę płytek wykorzystywaną dla oceny: - ekspresji P-selektyny (CD62P) - ekspresji integryny IIb 3 - GP IIb/IIIa (CD 41/61) - zdolności pochłaniania czerwieni obojętnej. a) Czas okluzji (CT - closure time) Czas okluzji określano za pomocą aparatu PFA-100 (The Platelet Function Analyzer-100, Siemens Healthcare, USA), postępując zgodnie z zaleceniami producenta. Aparat określa czas od rozpoczęcia aspiracji krwi do momentu zatkania kapilary przez tworzący się czop płytkowy (tzw. okluzja). Pomiar trwa maksymalnie 42

300 sekund. Badanie było wykonywane w ciągu godziny od pobrania krwi. W tym celu 0,8 ml krwi cytrynianowej umieszczano w przeznaczonej do tego kasetce. Następnie krew jest aspirowana przez kapilarę pokrytą kolagenem oraz odpowiednim agonistą (ADP). Izolacja płytek krwi: W celu uzyskania osocza bogatopłytkowego (PRP), krew pobraną na 3,8% cytrynian sodu odwirowywano przy 150 g przez 10 minut. Tak uzyskane PRP zagęszczano przez wirowanie przy 12 000 g w ciągu 3 minut. Wyizolowane płytki krwi zawieszano w płynie RPMI 1640 (IIiTD PAN we Wrocławiu), a następnie sporządzano zawiesinę o odpowiedniej koncentracji komórek. Wyizolowane płytki sprawdzano pod względem: a) żywotności z użyciem błękitu trypanu, b) obecności innych komórek, ocenianej za pomocą analizatora hematologicznego (PE - 6800 vet, Procan Electronics INC, China) i weryfikacji na sporządzonych rozmazach. b) Fenotypizacja płytek krwi Od każdego badanego osobnika sporządzano po cztery próbki zawiesiny płytek. Każda próbka wynosiła 100 µl i zawierała 1 x 10 6 komórek. Dwie z tych prób aktywowano dodatkiem trombiny (1U/1ml) (Bio-Ksel System TT, Bio-Ksel, Grudziądz, Polska). Stężenie trombiny przyjęto za Michelson i wsp. (1999), którzy wykazali, iż przy tej koncentracji następuje maksymalna aktywacja płytek. Po 3 minutowej inkubacji z trombiną w 37 o C, płytki przemywano dwukrotnie medium hodowlanym RPMI 1640 (2ml), a następnie odwirowywano 5 minut przy 1200 g. Po zlaniu nadsączu, odwirowane płytki zawieszano w 100 µl RPMI 1640. Pozostałe próby bez dodatku aktywatora stanowiły kontrolę. Tak przygotowane próbki (jedną stymulowaną i jedną niestymulowaną) poddawano znakowaniu odpowiednimi przeciwciałami. Fenotypizacja płytek krwi została przeprowadzona wg. procedury zalecanej przez producenta (AbD Serotec, Oxford, UK). Zgodnie z informacją podaną przez producenta użyte przeciwciała wykazują reakcję krzyżową z płytkami konia. Poziom ekspresji receptorów powierzchniowych oceniano w ciągu jednej godziny od zakończenia znakowania płytek, dokonując odczytu w cytometrze przepływowym FACS Calibur (Becton Dickinson). Płytki krwi bramkowano w układzie FSC 43

(ang. forward scatter channel), obrazujący ich wielkość oraz SSC (ang. side scatter channel) granularność. Następnie w obrębie bramki określano intensywność fluorescencji (IF), która była miarą ekspresji antygenów w przeliczeniu na 10 000 płytek. Analizę cytometryczną przeprowadzono przy użyciu programu WinMDI 2.9 (J. Trotter, The Scripps Research Institute, La Jolla, CA, USA). Badanie ekspresji P-selektyny (CD62P): Próbki zawierające po 100 µl zawiesiny płytek o koncentracji 1 x 10 6 komórek inkubowano z 10 µl przeciwciała monoklonalnego mysiego przeciw ludzkiemu CD62P skoniugowanym z fikoerytryną (PE) (AbD Serotec, Oxford, UK), przez 30 minut w ciemności w temperaturze 37 o C. Po tym czasie płytki dwukrotnie odpłukiwano płynem RPMI 1640 i zawieszano w objętości 0,5 ml. Kontrolę negatywną stanowiły komórki inkubowane wyłącznie w RPMI 1640 bez dodatku przeciwciał. Badanie ekspresji integryny IIb 3 - GP IIb/IIIa (CD 41/61) W celu wykrycia receptora CD 41/61, płytki krwi inkubowano najpierw z 10 µl przeciwciała mysiego przeciw owczemu CD41/61 przez 30 minut. Po tym czasie do próbki dodawano 2ml RPMI 1640 i odwirowywano. Po odpłukaniu, zawiesinę płytek zawieszano w 100 µl RPMI 1640, a następnie znakowano drugim poliklonalnym przeciwciałem kozim przeciw mysiemu IgG1 (10 µl), skoniugowanym z fluoresceiną (FITC) (AbD Serotec, Oxford, UK). Po 30 minutowej inkubacji w 37 o C w ciemności próbki przemywano dwukrotnie płynem RPMI 1640 i zawieszano w objętości 0,5 ml. Kontrolę negatywną (ocena niespecyficznego wiązania przeciwciał z płytkami) stanowiły płytki inkubowane z poliklonalnym przeciwciałem IgG1 FITC. a) Ocena zdolności pochłaniania czerwieni obojętnej przez płytki krwi Zawiesinę płytek liczącą 4 x 10 7 komórek zawieszano w 2 ml płynu RPMI 1640, a następnie inkubowano w łaźni wodnej o temperaturze 37 o C z dodatkiem 20 µl roztworu czerwieni obojętnej (1mg/ml PBS bez Ca i Mg) (Neutral Red; Poch S.A., Gliwice, Polska). Postępowano zgodnie z metodą zaproponowaną przez Roland i wsp. (1998), którą zmodyfikowano dla potrzeb własnych. Optymalną gęstość zawiesiny płytek, optymalne stężenie czerwieni obojętnej oraz czas inkubacji ustalono w badaniach pilotowych. 44

Celem określenia dynamiki pochłaniania czerwieni obojętnej przez płytki krwi koni, próbki inkubowano przez okres 15, 30, 45 i 60 minut. Po zakończeniu inkubacji próbki odwirowywano, a nadsącz zlewano. Osad trombocytów poddawano lizie za pomocą roztworu kwaśnego alkoholu (3% HCl w 95% etanolu). Stopień pochłaniania czerwieni obojętnej oznaczano kolorymetrycznie za pomocą spektrofotometru (Epoll-20, Poll LTD Sp. z o. o., Warszawa, Polska). Ekstynkcję mierzono przy długości fali 533 nm wobec próby ślepej, którą był kwaśny alkohol. Ilość pochłoniętego barwnika w g była wyliczana z krzywej kalibracyjnej (standardowej). 3.6.2. Ocena hemostazy wtórnej osoczowej Materiał do badań stanowiło osocze pozyskane z krwi cytrynianowej odwirowanej przy 1200 g przez 10 minut w ciągu 30 minut od pobrania. Do czasu wykonywania oznaczeń uzyskane osocze zamrażano i przechowywano w temperaturze 20 o C. Oznaczenia wykonywano za pomocą koagulometru Coag Chrom 3003 firmy BioKsel, przy użyciu reagentów zalecanych przez producenta (Bio-Ksel System). Oceny hemostazy osoczowej dokonywano na podstawie: testów przesiewowych oznaczanych metodą chronometryczną., tj.: czas częściowej tromboplastyny po aktywacji APTT, który jest miarą wewnątrzpochodnego układu krzepnięcia. Dla oznaczenia czasu APTT jako aktywatora używano odczynnika zawierającego koloidalny krzem z syntetycznymi fosfolipidami. czas protrombinowy PT, pozwalający ocenić sprawność zewnątrzpochodnego toru krzepnięcia. Dla oznaczenia czasu PT jako reagent służyła tromboplastyna królicza. czas trombinowy TT, który jest badaniem oceniającym wspólną drogę kaskady krzepnięcia. Dla oznaczenia czasu TT jako reagent stosowano trombinę wołową. stężenie fibrynogenu określano pośrednio na podstawie krzywej PT. Badanie to jest miarą ostatniego etapu wspólnej drogi w kaskadzie krzepnięcia. badań układu antykoagulacyjnego, czyli aktywności inhibitorów krzepnięcia, tj. antytrombiny (AT) i białka C. 45

Aktywność AT w % oznaczano metodą kinetyczną (z krzywej kalibracyjnej) po inkubacji osocza z trombiną w obecności nadmiaru heparyny. Dodanie chromogennego substratu powoduje uwalnianie paranitroaniliny w ilości proporcjonalnej do poziomu antytrombiny. Aktywność białka C w % oznaczano metodą jakościową poprzez dodanie aktywatora liofilizatu zawierającego jad węża (Agkistrodon c. contortrix). Dodanie syntetycznego substratu chromogennego powoduje uwalnianie paranitroaniliny w ilości proporcjonalnej do poziomu białka C. badań układu fibrynolitycznego - produktów wtórnej fibrynolizy, tj. D-dimerów powstających w wyniku degradacji ustabilizowanej fibryny. Stężenie D-dimerów w g/l oznaczano metoda ilościową, przy użyciu zawiesiny latexu pokrytego przeciwciałami monoklonalnymi. D-dimery zawarte w osoczu łączą się z latexem, powodując zmętnienie próbki proporcjonalne do ich koncentracji. 3.7. Analiza statystyczna Uzyskane wyniki poddano analizie statystycznej za pomocą programu Statistica 9,1 PL (Stat Soft Inc., Tulsa, OK) metodą jednoczynnikowej analizy wariancji (ANOVA) w układzie orto- bądź nieortogonalnym, co wynikało z liczby analizowanych dla każdego parametru prób. W układzie nieortogonalnym istotność różnic oszacowano testem Tukeya dla nierównych liczebności, przy dwóch poziomach istotności: p 0,05 oraz p 0,01. Zdolność pochłaniania czerwieni obojętnej przez płytki krwi oszacowano metodą dwuczynnikowej analizy wariancji uwzględniając podstawowy czynnik doświadczalny (czyli podział koni na grupy doświadczalne) na oraz czas trwania inkubacji. Istotność różnic (przy dwóch poziomach istotności: p 0,05 oraz p 0,01) między grupami doświadczalnymi koni oszacowano testem Tukeya dla nierównych liczebności zaś wpływ czasu inkubacji w obrębie każdej grupy oszacowano testem Duncana. Dla oceny ekspresji receptorów powierzchniowych płytek istotność różnic uzyskanych wyników z jednoczynnikowej analizy wariancji oszacowano testem Tukeya (RIR) przy równych liczebnościach w grupach. Dodatkowo w układzie 46

nieparametrycznym wykorzystując test znaku oszacowano istotność różnic dla wyników otrzymanych w zależności od tego czy płytki były wcześniej pobudzone. Otrzymane wyniki zestawiono w postaci średnich i standardowego odchylenia w tabelach bądź na rycinach (wykresach). Przy średnich dużymi różnymi literami oznaczono różnice wysoko istotne statystycznie przy p 0,01, a małymi różnymi literami przy p 0,05. 47

4. WYNIKI W grupie 30 koni zakwalifikowanych do zabiegu, śródoperacyjnie stwierdzono: skręt okrężnicy dużej u 12 koni, przemieszczenie okrężnicy dużej u 8 koni, zatkanie jelita biodrowego u 3 koni, skręt jelit cienkich u 3 koni, u 2 koni zatkanie jelita ślepego, u jednego konia zatkanie okrężnicy dużej oraz obecność kamieni jelitowych u jednego osobnika. 4.1. Wskaźniki hematologiczne Wyniki badań hematologicznych z przeprowadzonych łącznie 89 oznaczeń, zestawiono w tabeli 1 i 2. Średnia liczba erytrocytów (RBC) odnotowana u koni grupy kontrolnej wynosiła 6,89 T/l. U koni przed zabiegiem (D-0) zanotowano zwiększoną liczbę erytrocytów w porównaniu z końmi pochodzącymi z grupy kontrolnej oraz pozostałymi grupami koni. W okresie pooperacyjnym zaobserwowano nieznaczne obniżenie liczby erytrocytów. Jednakże różnicę statystycznie istotną (p 0,05), w porównaniu do grupy przed zabiegiem (D-0) odnotowano tylko w trzecim dniu po operacji (D-3) (Tab.1). Omawiane zmiany liczby erytrocytów następowały równolegle ze zmianami wartości hematokrytu (Ht). W okresie przed zabiegiem (D-0) zaobserwowano wyraźny wzrost Ht do 0,39 l/l, a następnie stopniowe obniżenie jego wartości w okresie pooperacyjnym. Najniższą wartość Ht odnotowano w drugiej dobie po zabiegu (D-2), a wynik ten różnił się istotnie (p 0,05) z grupą D-0 (Tab.1). U koni grupy doświadczalnej zanotowano sukcesywne obniżenie stężenia hemoglobiny przez cały okres obserwacji. Statystycznie istotną różnicę zaobserwowano między grupą kontrolną, a końmi w drugiej dobie po zabiegu (D-2). Wartości te wynosiły odpowiednio 8,44 mmol/l vs 6,15 mmol/l (Tab.1). Zmianom liczby erytrocytów, wartości hematokrytu oraz hemoglobiny towarzyszyły zmiany stężenia białka całkowitego. Średnia zawartość białka w osoczu koni kontrolnych wynosiła 74,80 g/l. Konie w okresie przed zabiegiem (D-0) wykazywały wyższe stężenie TP (o 5,00 g/l), w porównaniu z grupą kontrolną. 48

W pierwszej dobie po zabiegu (D-1) odnotowano istotne obniżenie się stężenia TP aż o 9,30 g/l względem grupy D-0 (p 0,05). W kolejnych dniach obserwacji poziom białka całkowitego był zbliżony do notowanego w grupie koni kontrolnych (Tab.1). Liczba leukocytów (WBC) u koni grupy kontrolnej wynosiła 8,99 G/l. U koni przed zabiegiem zanotowano nieznacznie zwiększoną liczbę WBC w porównaiu do grupy K. Następnie w okresie pooperacyjnym stwierdzono niewielkie obniżenie ogólnej liczby leukocytów w grupach D-1 i D-2, a w trzeciej dobie powolny wzrost wartości tego parametru do 7,61 G/l. Pomimo zaznaczających się tendencji różnic średnich wartości liczby leukocytów u badanych koni, nie znalazły one potwierdzenia w przeprowadzonej analizie statystycznej (Tab. 2). Wyniki analizy sporządzonych leukogramów wskazują, że w grupie koni kontrolnych dominującą, bo ok. 50 % populację stanowią granulocyty obojętnochłonne (neutrofile) - formy segmentowane. Przy czym nie zaobserwowano obecności we krwi form młodocianych. Drugą równie liczną, bo prawie 45 % populację stanowią limfocyty. U koni doświadczalnych, przy braku różnic w ogólnej liczbie leukocytów w kolejnych dniach obserwacji, odnotowano znaczne przesunięcia we wzajemnych relacjach poszczególnych form leukocytów (Tab. 2). Równocześnie w obrazie krwi obwodowej zauważono pojawienie się młodocianych postaci granulocytów obojętnochłonnych (neutrofilów) tj. form pałeczkowatych, metamielocytów i mielocytów. U koni przed zabiegiem (D-0) nastąpiło wyraźne przesunięcie w proporcji dominujących populacji leukocytów, polegające na zwiększeniu udziału granulocytów obojętnochłonnych (neutrofilów) (83,52%), kosztem prawie trzykrotnego obniżenia odsetka limfocytów (14,77%). Zmianom tym towarzyszyło wyraźne przesunięcie obrazu białokrwinkowego w lewo. Zwiększoną ilość form pałeczkowatych (20,57%) oraz metamielocytów (4,72%) zaobserwowano zwłaszcza w pierwszym dniu po zabiegu (D-1), a wyniki te różniły się istotnie względem grupy kontrolnej (p 0,01). W drugim (D-2) i trzecim dniu (D-3) po operacji nadal utrzymywało się wyraźne zwiększenie odsetka granulocytów obojętnochłonnych (odpowiednio 73,84% i 70,44%) przy równoczesnym spadku odsetka limfocytów (odpowiednio 26,14% i 29,80%). Zaobserwowano przy tym pojawienie się we krwi najmłodszej populacji granulocytów, tj. mielocytów. 49

Parametrem dobrze obrazującym przedstawione zmiany w leukogramie stanowi wyliczony wskaźnik N/L, będący ilorazem liczby granulocytów obojętnochłonnych (neutrofilów) do limfocytów. Wskaźnik ten u koni kontrolnych kształtuje się na poziomie 1,15. Natomiast u koni przed zabiegiem (D-0) wartość tego wskaźnika wzrosła prawie pięciokrotnie. W kolejnych dniach po operacji zanotowano obniżenie wskaźnika N/L, jednakże w porównaniu do koni kontrolnych wartość ta była nadal dwukrotnie wyższa, aż do końca okresu obserwacji (Ryc. 6). 7 6 5 N/L 4 3 2 1 0 D-0 D-1 D-2 D-3 grupa doświadczalna grupa kontrolna Ryc. 6. Wskaźnik N/L u koni leczonych chirurgicznie z powodu niedrożności jelit. Objaśnienia: K konie kontrolne (n=9); D-0 konie przed zabiegiem chirurgicznym (n=5); D-1 konie 24 godziny po zabiegu (n=8); D-2 konie 48 godzin po zabiegu (n=5); D-3 konie 72 godziny po zabiegu (n=5); x ± SD. 50

4.2. Wskaźniki hemostazy pierwotnej (płytkowej) 4.2.1. Płytki krwi Przeprowadzona analiza ilościowo-jakościowa podstawowych elementów hemostazy pierwotnej wykazała, że średnia liczba płytek krwi u koni w grupie kontrolnej, przy dużym zróżnicowaniu osobniczym, wynosi 417,36 G/l. U koni z grupy doświadczalnej zaobserwowano sukcesywne obniżanie się liczby płytek krwi przez cały okres obserwacji Istotny statystycznie spadek PLT (p 0,05) w porównaniu z grupą kontrolną odnotowano u koni w 24, 48 oraz 72 godzinie po operacji (Tab. 3, Ryc. 7). 600,00 500,00 400,00 G/l 300,00 200,00 100,00 0,00 D-0 D-1 D-2 D-3 grupa doświadczalna grupa kontrolna Ryc 7. Średnia liczba płytek krwi (PLT) u koni poddanych chirurgicznemu leczeniu niedrożności jelit. Objaśnienia: K konie kontrolne (n=20); D-0 konie przed zabiegiem chirurgicznym (n=17); D-1 konie 24 godziny po zabiegu (n=22); D-2 konie 48 godzin po zabiegu (n=15); D-3 konie 72 godziny po zabiegu (n=15); x ± SD. 51

Obniżenie liczby płytek w grupie badanej korelowało ze zmniejszeniem ich objętości (MPV). Średnia objętość płytek u koni grupy kontrolnej wynosiła 9,83 fl, natomiast u koni w grupie doświadczalnej w kolejnych dniach obserwacji uległa znacznemu obniżeniu, a różnice te okazały się wysoko istotne statystycznie (p 0,01) względem grupy kontrolnej (Tab.3, Ryc. 8). 12,00 10,00 8,00 fl 6,00 4,00 2,00 0,00 D-0 D-1 D-2 D-3 grupa doświadczalna grupa kontrolna Ryc. 8. Średnia objętość płytek krwi (MPV) u koni poddanych chirurgicznemu leczeniu niedrożności jelit. Objaśnienia: K konie kontrolne (n=20); D-0 konie przed zabiegiem chirurgicznym (n=17); D-1 konie 24 godziny po zabiegu (n=22); D-2 konie 48 godzin po zabiegu (n=15); D-3 konie 72 godziny po zabiegu (n=15); x ± SD. 52

4.2.2. Czas okluzji Czas okluzji, pozwalający ocenić zdolność płytek do adhezji i agregacji, w grupie kontrolnej mieścił się w granicach 81-116 sekund. U koni w okresie przed operacją (D-0) średni CT uległ nieznacznemu skróceniu o 4,93 s, natomiast w okresie pooperacyjnym zaobserwowano wyraźne, ponad dwukrotne jego wydłużenie. Odnotowano wysoko istotne różnice między grupami K i D-0 a D-2 i D-3 (Tab. 3, Ryc. 9). Ponadto zaobserwowano, iż wydłużenie czasu okluzji następowało równocześnie ze zmniejszeniem liczby płytek i ich objętości (MPV) u badanych koni. 400,00 350,00 300,00 250,00 (s) 200,00 150,00 100,00 50,00 0,00 D-0 D-1 D-2 D-3 grupa doświadczalna grupa kontrolna Ryc.9. Średni czas okluzji (CT) u koni poddanych chirurgicznemu leczeniu niedrożności jelit. Objaśnienia: K konie kontrolne (n=7); D-0 konie przed zabiegiem chirurgicznym (n=6); D-1 konie 24 godziny po zabiegu (n=6); D-2 konie 48 godzin po zabiegu (n=6); D-3 konie 72 godziny po zabiegu (n=6); x ± SD. 53

4.2.3. Ekspresja P-selektyny (CD62P) oraz Integryny IIb 3 GP IIb/IIIa (CD 41/61) na powierzchni płytek krwi P-selektyna - CD62P Uzyskane wyniki w postaci średniej intensywności fluorescencji (IF) oraz odchylenia standardowego (SD) przedstawiono w tabeli 4a. Zanotowano, że ekspresja P-selektyny na płytkach koni z grupy kontrolnej zarówno aktywowanych, jak i niestymulowanych nie różni się statystycznie między sobą. Natomiast ekspresja tego receptora na aktywowanych płytkach w grupie doświadczalnej była istotnie większa w porównaniu do płytek nieaktywowanych (p 0,01). U koni przed zabiegiem (D-0) oraz w pierwszej dobie po zabiegu (D-1) ekspresja P-selektyny na aktywowanych płytkach była prawie sześciokrotnie wyższa w porównaniu do płytek niestymulowanych, a u koni w drugiej (D-2) i trzeciej dobie (D-3) po zabiegu aż szesnastokrotnie wyższa względem nieaktywowanych (Tab. 4a). Analiza intensywności fluorescencji P-selektyny na aktywowanych płytkach wykazała znaczący wzrost (p 0,01) ekspresji tego receptora u koni w 48 (D-2) i 72 godzinie (D-3) po operacji. Ponadto ekspresja ta była ponad pięciokrotnie większa w porównaniu z wartościami tej molekuły na płytkach pochodzących od koni w okresie przed zabiegiem (D-0) oraz w 24 godziny po zabiegu (D-1) i prawie dziesięciokrotnie większa od ekspresji na płytkach grupy kontrolnej (Ryc. 10). Natomiast ekspresja P-selektyny na płytkach nieaktywowanych u koni w grupie doświadczalnej była wyraźnie zmniejszona (p 0,01) w porównaniu do grupy kontrolnej. Najniższe jej wartości zanotowano w grupie u koni przed zabiegiem (D-0) oraz w pierwszej dobie po operacji (D-1), a wyniki te różniły się istotnie względem grupy kontrolnej oraz D-2 i D-3 (p 0,01). 54

600,00 500,00 400,00 IF 300,00 200,00 100,00 0,00 K D-0 D-1 D-2 D-3 K D-0 D-1 D-2 D-3 nieaktywowane aktywowane Ryc. 10. Ekspresja P-selektyny (CD62P) na powierzchni płytek krwi przed (kolor zielony) i po aktywacji trombiną (kolor pomarańczowy) u koni leczonych chirurgicznie z powodu niedrożności jelit. Objaśnienia: K konie kontrolne, n=7; D-0 konie przed zabiegiem chirurgicznym, n=7; D-1 konie 24 godziny po zabiegu, n=7; D-2 konie 48 godzin po zabiegu, n=7; D-3 konie 72 godziny po zabiegu, n=7; IF intensywność fluorescencji; x ± SD odchylenie standardowe. 55

Analiza cytometryczna wykazała, iż aktywowane płytki koni, zarówno grupy doświadczalnej, jak i kontrolnej, wykazują zwiększoną wielkość (wskaźnik FSC > 10 2 ) i granularność (wskaźnik SSC > 10 2 ) w porównaniu do płytek nieaktywowanych. Zmiany tych wskaźników skutkują pojawieniem się charakterystycznego ogona na cytogramie. Natomiast niestymulowana populacja płytek przyjmuje kształt dyskoidalny (sferyczny) na cytogramie (Ryc.11). Ryc.11. Przykładowy obraz analizy cytometrycznej obrazujący zmianę wielkości (FSC forward scatter) oraz granularności (SSC side scatter) wyizolowanych płytek krwi po aktywacji trombiną (0,1 U/10 6 płytek). Na cytogramie płytki niestymulowane przyjmują kształt dyskoidalny (sferyczny). Aktywacja trombiną skutkuje wzrostem wskaźnika FSC i SSC, co prowadzi do pojawienia się charakterystycznego ogona na cytogramie. Płytki krwi oceniane w przestrzeni dwuwymiarowej przy użyciu cytometru przepływowego, wskaźnik SSC/FSC wyrażony za pomocą skali logarytmicznej. 56