Streszczenie Cisplatyna, lek przeciwnowotworowy stosowany w monoterapii jak i terapii skojarzonej wielu nowotworów, zaliczana jest do cytostatyków o działaniu niezależnym od cyklu podziałowego, niszczącym komórki niezależnie od ich stadium rozwoju. Aktywność przeciwnowotworowa cisplatyny jest związana z procesami regulacji cyklu komórkowego, a największe jej wiązanie do DNA ma miejsce podczas fazy S cyklu komórkowego. Stosując technikę mikromacierzy oligonukleotydowych HG-U133A (Affymetrix) porównywano ekspresję genów związanych z regulacją cyklu komórkowego w komórkach białaczki promielocytarnej HL-60 eksponowanych na cisplatynę oraz w komórkach kontrolnych. Analizując sygnały fluorescencji 160 sond, wyselekcjonowanych z bazy NetAffx Analysis Center, reprezentujących ekspresję 84 genów bezpośrednio związanych z fazą G1, przejściem G1/S, syntezą DNA i jego replikacją, fazą G2, przejściem G2/M, punktami kontrolnymi, pozytywną regulacją cyklu komórkowego lub jego zatrzymaniem wykazano, że w badanych komórkach cisplatyna najsilniej stymuluje ekspresję genów BAX, GTSE1, DDX11, SKP2, MAD2L1 oraz hamuje ekspresję NBN i BCL2. Poznanie efektów zmienionej ekspresji tych genów jest szczególnie istotne dla określenia mechanizmu działania leku oraz powstawania oporności. Abstract Cisplatin, an anticancer drug used in monotherapy and combined therapy of various tumors belongs to cytostatics which destroy cells undepending on the phase of their division. Cisplatin antitumour activity is associated with cell cycle regulation processes and its strongest binding to DNA takes place in the S phase of the cell cycle. Using oligonucleotide microarray technique (HG-U133A, Affymetrix) the expression pattern of genes associated with the cell cycle regulation in HL-60 promyelotic leukemia cells exposed to cisplatin and control cells was compared. Analysis of the fluorescence signals of 106 probes selected from NetAffx Analysis Center database, which represent expression of 84 genes directly related to G1 phase, G1/ S transition, DNA synthesis and its replication, G2 phase, G2/M transition, cell cycle checkpoints, and positive regulation of the cell cycle or its arrest, showed that in the tested cells, cisplatin in the greatest extent stimulates expression of BAX, GTSE1, DDX11, SKP2, MAD2L1 and decreases expression of NBN and BCL2 genes. Determination of effects of altered expression of these genes is particularly important for understanding of drug action mechanism, including acquired resistance to cisplatin. Key words: cisplatin, gene expression, cell cycle, promyelocytic leukemia cells, HL-60 Słowa kluczowe: cisplatyna, ekspresja genów, cykl komórkowy, komórki białaczki promielocytarnej, HL-60 Wstęp Cisplatyna jest lekiem przeciwnowotworowym stosowanym zarówno w monoterapii jak i terapii skojarzonej guzów przerzutowych jąder i jajników, szyjki macicy, raka pęcherza moczowego, płasko komórkowego raka głowy i szyi oraz raka płuc często w połączeniu z winblastyną, bleomycyną, etopozydem i doksorubicyną. Cisplatyna, podobnie jak karboplatyna, cyklofosfamid, ifosfamid, melfalan, dakarbazyna, czy antracykliny (doksorubicyna, daunorubicyna, daktynomycyna), zaliczana jest do cytostatyków o działaniu niezależnym od cyklu podziałowego, niszczącym komórki niezależnie od ich stadium rozwoju. Mechanizm działania leku, który jest podobny do działania związków alkilujących polega na hamowaniu replikacji DNA na skutek tworzenia silnych wiązań między- i wewnątrzłańcuchowych w DNA. Tworzenie adduktów Pt DNA jest przyczyną cytotoksyczności cisplatyny [1-3].
Analiza danych dotyczących ekspresji genów w linii ludzkich komórek raka jajnika A2780 poddanych działaniu cisplatyny lub oksaliplatyny wykazała, że leki te wpływają na procesy związane z odpowiedzią komórek na uszkodzenia DNA, cyklem komórkowym, apoptozą i naprawą DNA oraz różnymi ścieżkami przekazywania sygnałów i szlakami metabolicznymi [4]. Działanie cisplatyny nie jest fazowospecyficzne, chociaż największe jej wiązanie do DNA ma miejsce w fazie S cyklu komórkowego [3]. Regulacja cyklu komórkowego odbywa się przez uruchamianie kaskadowych reakcji fosforylacji i defosforylacji białek katalizowanych przez różnorodne kinazy białkowe oraz fosfatazy. Kinazy białkowe układu kontroli cyklu komórkowego, których aktywność zależy od nagromadzenia i rozpadu cyklin, są obecne w komórkach dzielących się podczas całego cyklu. W czasie cyklu komórkowego cykliny A, C, D i E są syntetyzowane w miarę upływu cyklu, zaś cyklina B jest syntetyzowana w fazie G2. Maksymalne stężenie cyklin występuje podczas mitozy, po czym ulega ono obniżeniu na skutek trawienia ich przez proteazy. Aktywacja kinaz zachodzi w dwóch krytycznych przedziałach czasowych tzw. punktach kontrolnych cyklu komórkowego, w fazie G1 prowadzi do przejścia z fazy G1 do S i zapoczątkowania syntezy DNA, natomiast pod koniec fazy G2 prowadzi do przejścia G2 do M i zapoczątkowania mitozy. Przejście z późnej fazy G2 do M następuje w rezultacie aktywacji kinazy MPF, znanej jako czynnik wywołujący dojrzewanie [5, 6]. Jak wynika z badań wykonanych na komórkach hodowanych w warunkach laboratoryjnych, zmiany w ekspresji genów widoczne są w czasie od 2 godzin do nawet 24 godzin ekspozycji na cisplatynę. Zarówno rodzaj jak i liczba genów ulegających nadekspresji lub hamowaniu ekspresji zależy od zastosowanych w eksperymencie linii komórek, a ponadto od czasu narażenia na ten cytostatyk [7, 8]. W przedstawianej pracy, w celu pełniejszego wyjaśnienia mechanizmów molekularnych odpowiedzialnych za odpowiedź komórek nowotworowych na działanie cisplatyny, a przy okazji na mechanizmy decydujące o braku wrażliwości na ten lek, poddaliśmy ocenie zmiany w ekspresji genów związanych z regulacją cyklu komórkowego. Czas ekspozycji na cisplatynę został ograniczony do sześciu godzin, aby nie obserwować wtórnych efektów zmian w ekspresji genów związanych, np. z śmiercią komórki, które utrudniłyby interpretację wyników ze względu na ich nakładanie się z efektami pierwotnej odpowiedzi komórek na ten lek. Do badań wykorzystaliśmy hodowane w warunkach laboratoryjnych komórki ludzkiej linii nowotworowej białaczki promielocytarnej HL-60, które wykazują istotną wrażliwość na cisplatynę [9, 10]. Badania ekspresji genów zostały wykonane z zastosowaniem techniki mikromacierzy oligonukleotydowych firmy Affymetrix. Materiał i metody Hodowle komórkowe Materiał do badań stanowiły hodowane komórki ludzkiej linii nowotworowej białaczki promielocytarnej HL-60. Komórki hodowano, zgodnie z zaleceniami ATCC, w standardowych warunkach (37 C, 5% wysycenie atmosfery CO2), w pożywce hodowlanej RPMI-1640 (Gibco) wzbogaconej 10% bydlęcej surowicy płodowej (FBS; Sigma), 100 μg /ml streptomycyny, 100 U/ml penicyliny (Sigma), 2 mm glutaminy (Sigma), 1 mm pirogronianu sodu (Sigma) i 4,5 g/l glukozy. Po 48 godzinach inkubacji do hodowli dodawano roztwór cisplatyny (Sigma) rozpuszczonej w DMSO (Sigma) tak aby uzyskać stężenie 0,22 μg/ml, odpowiadające wartości ID30 (Inhibitory Dose 30%). Hodowle kontrolne prowadzono w identyczny sposób, dodając po 48 godzinach czystego DMSO, stosowanego ze względu na ograniczoną rozpuszczalność cisplatyny. Po 6 godzinach inkubowania hodowli komórki zbierano i przygotowywano do ekstrakcji RNA. Ekstrakcja całkowitego RNA RNA ekstrahowano z użyciem odczynnika TRIZOL (Invitrogen Life Technologies), zgodnie z protokołem producenta. Ekstrakty całkowitego RNA oczyszczono z wykorzystaniem zestawu RNeasy Mini Kit (Qiagen). Ekstrakty RNA oceniano jakościowo techniką elektroforezy w 1% żelu agarozowym barwionym bromkiem etydyny oraz ilościowo przy użyciu spektrofotometru GeneQuant II (Pharmacia Biotech). Analiza aktywności transkrypcyjnej genów techniką mikromacierzy oligonukleotydowych HG-U133A (Affymetrix) Całkowite RNA (8μg) zostało wykorzystane do syntezy dwuniciowego cdna (Gibco BRL SuperScript Choice system), które stanowiło matrycę do syntezy biotynylowanego crna (reakcja transkrypcji in vitro, Enzo kit). Po fragmentacji biotynylowanego crna przeprowadzono hybrydyzację z mikromacierzą Test3, a następnie po pozytywnej weryfikacji z mikromacierzą HG-U133A (Affymetrix). Znakowanie produktów hybrydyzacji przeprowadzono kilkustopniowo kompleksem streptawidyna fikoerytryna, znakowanymi przeciwciałami przeciw biotynie oraz przeciwciałami przeciw kompleksowi streptawidyna fikoerytryna zgodnie z protokołem EukGEWS2v4 zalecanym dla mikromacierzy oligonukleotydowej HG U133A w przewodniku Gene Expression Analysis Technical Manual (Affymetrix). W następnym etapie płytki mikromacierzy odczytywano używając skanera Agilent GeneArray Scanner G2500A (Agilent Technologies). Otrzymane wyniki intensywności fluorescencji zapisano i zarchiwizowano w programie Microarray Suite oraz specjalnie do tego celu przygotowanej bazie danych. Analizę porównawczą transkryptomów przeprowadzono po normalizacji wyników w programie RMA Express polegającej na przekształceniu logarytmicznym wartości sygnału fluorescencji dla każdego transkryptu (log 2 ) wykorzystując programy komputerowe: Statistica v.7,0, Gnumeric, oraz Microsoft Excel. Wyodrębnienia grup genów związanych z cyklem komórkowym dokonano korzystając z bazy danych Affymetrix NetAffx Analysis Center (http://www. affymetrix.com/ analysis/index.affx) po wpisaniu kwerendy cell cycle, komercyjnie dostępnego zestawu przeznaczonego do badania genów cyklu komórkowego firmy SABiosciences oraz danych literaturowych. Z grupy 22283 sond mrna, obecnych na mikromacierzy HG-U133A, wyfiltrowano za pomocą arkusza programu Gnumeric sygnały fluorescencji charakteryzujące ekspresję wybranych
Tab. I. Ekspresja genów różnicujących związanych z regulacją cyklu komórkowego w komórkach białaczki promielocytarnej HL-60 eksponowanych na cisplatynę względem prób odniesienia (komórki eksponowane na DMSO), (SLR ang. signal log ratio stosunek zlogarytmowanych uśrednionych wartości fluorescencji transkryptu w porównywanych próbach, strzałka á - nadekspresja, strzałka â - spadek ekspresji genu w komórkach HL-60 eksponowanych na cisplatynę, * - geny kandydujące) nazwa sondy symbol genu nazwa kodowanego białka wartość SLR 211833_s_at BAX Białko związane z BCL2 (BCL2-associated X protein) 1,66 204315_s_at GTSE1 Białko 1 ulegające ekspresji w fazach G2 i S (G2 and S-phase expressed 1) 1,39 208478_s_at BAX Białko związane z BCL2 (BCL2-associated X protein) 1,31 210206_s_at DDX11 Zależna od ATP RNA helikaza DDX11 (ATP-dependent RNA helicase DDX11) 1,17 203626_s_at SKP2 * Białko 2 związane z kinazą fazy S (p45) (S-phase kinase-associated protein 2 (p45)) 0,968 203362_s_at MAD2L1 * MAD2 element punktu kontrolnego wrzeciona mitotycznego (MAD2 mitotic arrest deficient-like 1) 0,887 202907_s_at NBN * Nibryna, kompleks naprawy uszkodzeń DsDNA (NBN, Nibrin) -0,758 203685_at BCL2 * Białka rodziny BCL2 (BCL2) -0,799 transkryptów związanych z regulacją cyklu komórkowego. Porównując sygnały fluorescencji tych sond, uzyskane dla komórek kontrolnych oraz eksponowanych na cisplatynę, wyznaczono zbiory genów o ekspresji różniącej się więcej niż ± 2SLR - tzw. genów różnicujących oraz zbiory genów, których ekspresja była większa niż ± 2s, lecz mniejsza niż ± 2SLR tzw. genów kandydujących. Wyniki Analiza zawartości bazy danych Affymetrix NetAffx Analysis Center wykazała 6550 genów (stan na dzień 28.10.2009), których funkcja jest chociaż w najmniejszym stopniu powiązana z regulacją cyklu komórkowego. Spośród tych genów, do oznaczenia zmian w ich aktywności wywoływanych przez cisplatynę w komórkach HL-60 wybrano 84, które wydają się być bezpośrednio związane z tym procesem. Analizie poddano ekspresję genów uczestniczących w fazie G1 cyklu komórkowego oraz w przejściu G1/S: ANAPC2, CCND1, CCNE1, CDC34, CDK4, CDK6, CDKN1B, CDKN3, CUL1, CUL2, CUL3, SKP2, genów fazy S i replikacji DNA: ABL1, MCM2, MCM3, MCM4, MCM5, PCNA, RPA3, SUMO1, UBE1, genów fazy G2 oraz uczestniczących w przejściu G2/M: ANAPC2, DI- RAS3, BCCIP, BIRC5, CCNB1, CCNG1, CCNH, CCNT1, CCNT2, CDK5R1, CDK5RAP1, CDK7, CDKN3, CKS1B, CKS2, DDX11, DNM2, GTF2H1, GTSE1, HERC5, KPNA2, MNAT1, a także genów od których zależy przebieg fazy M: CCNB2, CCNF, CDC2, CDC16, CDC20, MRE11A, RAD51. Ponadto porównano ekspresję genów regulujących punkty kontrolne i zatrzymanie cyklu komórkowego: ATM, ATR, BRCA1, BRCA2, CCNG2, CDC2, CDC34, CDK2, CDK- N1A, CDKN1B, CDKN2A, CDKN2B, CDKN3, CHEK1, CHEK2, CUL1, CUL2, CUL3, GADD45A, HUS1, KNTC1, MAD2L1, NBN, RAD1, RAD17, RAD9A, RB1, RBBP8,P53. Zbiór analizowanych genów uzupełniono o geny regulujące cykl komórkowy: ABL1, ANAPC2, ANAPC4, DIRAS3, ATM, ATR, BCCIP, BCL2, BRCA2, CCNB1, CCNB2, CCNC, CCND1, CCND2, CCNE1, CCNF, CCNH, CCNT1, CCNT2, CDC16, CDC2, CDC20, CDK2, CDK4, CDK5R1, CDK6, CDK7, CDK8, CDKN1A, CDKN1B, CKS1B, DDX11, E2F4, GADD45A, KNTC1, MKI67, PCNA, RAD9A, RB1, SKP2, TFDP1, TFDP2, w tym również odpowiedzialne za negatywną regulację: ATM, BAX, BRCA1, CDKN2B, RBL1, RBL2, P53. Genom tym przyporządkowano 160 sond na mikromacierzy HG U133A. Podczas analizy porównywano wartości sygnałów ekspresji genów uzyskane dla komórek hodowanych w obecności cisplatyny rozpuszczonej w DMSO z sygnałami otrzymanymi dla hodowli, do której dodano tylko DMSO stanowiącej układ odniesienia. Zmierzone wartości sygnałów fluorescencji dla genów różnicujących oraz genów o najbardziej zmienionej ekspresji, tzw. genów kandydujących, które, mimo iż znacznie różnią się ekspresją, nie spełniają kryterium genu różnicującego zestawiono w tabeli I. Cisplatyna, dodana do hodowli komórek HL-60, powoduje stymulację ekspresji BAX, GTSE1, DDX11, SKP2, MAD2L1 oraz hamowanie NBN i BCL2. Geny te pełnią bardzo istotne funkcje w procesach regulujących cykl komórkowy. Dyskusja Analizując wyniki uzyskane w przedstawianej pracy, w pierwszej kolejności należy przypomnieć, jakie funkcje w badanych komórkach pełnią geny, których ekspresja pod wpływem cisplatyny uległa największej stymulacji bądź hamowaniu. Gen BAX, którego ekspresja znacząco wzrosła, jest odpowiedzialny za kodowanie białka powiązanego z Bcl2 (Bax), które jest niezbędne dla inicjacji uwalniania cytochromu c oraz innych czynników proapoptotycznych z zewnętrznej błony mitochondrium i przez to do aktywacji kaspaz podczas apoptozy. Białko supresorowe nowotworów
P53 powoduje wzrost ekspresji BAX. U ssaków rodzinę białek Bcl2 dzieli się na 3 podrodziny: podrodzinę Bcl2 (np. B-, Bcl-xl, Bcl-xs, A1), podrodzinę Bax (Bax, Bak, Bok) oraz podrodzinę BH3 (Bad, Bik, Bid). Białka z podrodziny Bcl2 (z wyjątkiem Bcl-xs) są inhibitorami apoptozy, natomiast białka z podrodziny Bax i BH3 są promotorami aktywnej śmierci komórki [11]. Obserwowana w komórkach HL-60 nadekspresja BAX, może warunkować wrażliwość na cisplatynę. Przypuszczenia te znajdują potwierdzenie w badaniach Perego i wsp., w których zaobserwowano, że komórki oporne na lek charakteryzują się niskim poziomem białka BAX [12]. Wysoka ekspresja genu BCL2 z niską ekspresją białka BAX są przyczyną niskiej śmiertelności i oporności komórek na chemioterapię. Obserwowane w wyniku oddziaływania cisplatyny na komórki HL-60 obniżenie ekspresji BCL2 oraz zwiększenie ekspresji BAX, wynika najprawdopodobniej z niewystarczającego poziomu białka BAX, niezbędnego w komórce podlegającej procesowi apoptozy. Gen GTSE1 bierze udział w syntezie G2 i S enzymatycznego białka 1, ulegającego ekspresji w fazach S oraz G2 cyklu komórkowego, które w odpowiedzi na uszkodzenie DNA gromadzi się w jądrze i wiąże białko P53, powodując jego przemieszczenie z jądra i hamując jego zdolność do indukowania apoptozy. Nagromadzenie się białka GTSE1 powoduje opóźnienie przejścia komórki z fazy G2 do M [13]. Kolejnym z genów, którego ekspresja w komórkach HL-60 uległa zwiększeniu pod wpływem cisplatyny jest DDX11 koduje enzym, zależną od ATP helikazę RNA. Jego funkcja jest najprawdopodobniej związana z utrzymywaniem jakości przekazywania chromosomów i stabilności genomu. W opisywanym eksperymencie zaobserwowano wzrost ekspresji SKP2 genu kodującego białko 2 związane z kinazą fazy S, które specyficznie rozpoznaje fosforylowany zależny od cyklin inhibitor 1B, znany również jako p27, przede wszystkim w fazie S i oddziałuje z białkiem 1 związanym z kinazą fazy S (SKP1, p19). Co ciekawe gen ten określany jest jako proonkogenny i współuczestniczący w patogenezie białaczek [14], biorąc pod uwagę skuteczność działania cisplatyny, wzrost ekspresji tego genu należy uznać za niepożądany. MAD2L1, którego ekspresja w próbach eksponowanych na cisplatynę, również uległa zwiększeniu, koduje białko będące składnikiem punktu kontrolnego tworzenia wrzeciona mitotycznego, który zapobiega przejściu do anafazy do momentu, gdy chromosomy nie są prawidłowo ułożone na płytce metafazowej i w ten sposób uniemożliwia podział komórki [15]. W badanych komórkach HL-60, poza omówionym już obniżeniem ekspresji BCL2, cisplatyna powoduje obniżenie ekspresji NBN, genu, który koduje białko nubrynę (nibrynę). Białko to bierze udział w naprawie pęknięć w dwuniciowym DNA, które w poważnym stopniu uszkadzają genom [16]. Warto zauważyć, że wzrost ekspresji genu nie zawsze przekłada się bezpośrednio na wzrost stężenia kodowanego przez ten gen białka. Ponieważ ekspresja genu za pomocą mikromacierzy oligonukleotydowych mierzona jest na poziomie transkrypcji, a często zależność pomiędzy transkrypcją i translacją regulowana jest na zasadzie sprzężenia zwrotnego, można założyć, że wysoki poziom ekspresji genu może być także odzwierciedleniem obniżonego stężenia białka, np., gdy jego synteza nie zachodzi lub zachodzi wolniej na skutek błędów podczas translacji w rybosomach, na skutek degradacji białka, a nawet jego nieprawidłowej lokalizacji w komórce. Zależność pomiędzy zatrzymaniem cyklu komórkowego i cytotoksycznością jest bardzo złożona. W szeregu opublikowanych prac jednoznacznie potwierdzono, że przeciwnowotworowa aktywność cisplatyny jest związana z procesami regulacji cyklu komórkowego [17-19]. W komórkach raka jajnika cisplatyna powoduje zwiększenie ekspresji genów kodujących białka niezbędne dla prawidłowego funkcjonowania punktu kontrolnego G2/M: WEE1, CDC25C oraz CCNB1, a także genu CDC6 [19]. Indukcja apoptozy przez cisplatynę jest uważana za podstawowy mechanizm jej aktywności przeciwnowotworowej. Ekspozycja na cisplatynę prowadzi do aktywacji wielu szlaków molekularnych, włączając kinazy aktywowane mitogenami oraz P53 [20]. Już 1990 roku odkryto, że wywoływane przez cisplatynę zaburzenia kontroli cyklu komórkowego mogą mieć miejsce zanim komórka wchodzi w fazę S lub po replikacji DNA [21]. Przez to zatrzymanie wzrostu komórki może nastąpić zarówno w fazie G1 jak i G2/M. Gdy uszkodzenie DNA następuje w punkcie kontrolnym G1/S, zatrzymanie cyklu komórkowego jest zwykle zależne od P53. Szlak P53 jest od dawna uważany za kluczowy w odpowiedzi na czynniki genotoksyczne, w tym również cisplatynę [19]. Uszkodzenia DNA prowadzą do nagromadzania P53 poprzez hamowanie degradacji zależnej od ubikwityny. Gen P53 może indukować transkrypcję genów istotnych dla punktów kontroli cyklu komórkowego jak również zaangażowanych w śmierć komórki [22]. Ponadto reguluje on szereg innych specyficznych tkankowo genów, co umożliwia odpowiednio dostosowaną odpowiedź komórek. Cisplatyna powoduje znaczny wzrost aktywności białek P53 i P21 oraz zmniejszenie aktywności białka P27 [23]. Jednakże nie wszystkie aspekty odpowiedzi przez punkt kontrolny G1 na stres genotoksyczny mogą być łączone z szlakiem P53, ponieważ hamowanie CDK2 w odpowiedzi na uszkodzenie DNA zachodzi nawet w komórkach nie syntetyzujących P53 lub P21 [24]. Komórki HL-60 zastosowane w przedstawianej pracy charakteryzują się w znacznym stopniu zmutowaną sekwencją i funkcją TP53 [25]. Istotna jest tu rola cyklin. Badania wykazały, że wywołane przez cisplatynę uszkodzenie DNA może indukować zatrzymanie G1 poprzez dwuetapowy proces: szybkie zatrzymanie G1 niezależne od szlaku P53 spowodowane przez proteolizę cykliny D1 i wolniejsze utrzymywanie zatrzymania, wynikające z wzrostu stabilności P53 [26]. Akumulacja komórek w fazie G1 jest rzadko spotykana, ponieważ komórki najczęściej pozostają zablokowane w punkcie G2/M i to ten właśnie punkt kontrolny odgrywa kluczową rolę w odpowiedzi na uszkodzenie DNA. W fazie G2 komórki są zdolne do zapoczątkowania zatrzymania cyklu komórkowego w obecności jak i nieobecności P53 [27]. Przejście do mitozy jest uniemożliwiane przez utrzymywanie CDK1 (Cdc2) w zahamowanej formie poprzez brak fosforylacji, albo poprzez sekwestrację składników kompleksu CDK1 cyklina B poza jądrem. Aktywacja punktów kontrolnych przez cisplatynę, może czasowo indukować zatrzymanie fazy S, po czym następuje hamowanie kinaz Cdc2 cyklin A i B powodujące długotrwałe zatrzymanie G2/M. Ponadto, chociaż głównym celem P21 jest udział w fazie
G1 cyklu komórkowego, pełni on również funkcję regulacyjną w utrzymaniu zatrzymania w fazie G2 poprzez blokowanie interakcji Cdc25c [28]. Ponieważ hamujący efekt adduktów cisplatyny z DNA na zależne od cyklin kinazy białkowe fazy G1 (CDKs) jest późniejszym wydarzeniem w sekwencji aktywacji tego punktu kontrolnego i jest najprawdopodobniej wspomagany przez p16ink4a - inhibitor CDK4, uważa się, że zatrzymanie cyklu komórkowego, jako konsekwencja uszkodzenia DNA, jest niezbędne dla kompleksu naprawiającego DNA poprzez wycinanie nukleotydów (NER), aby mógł on usunąć addukty i umożliwić przeżycie komórki [29]. Taka naprawa DNA jest jedną z wielu przyczyn powstawania oporności komórek na cisplatynę. Tylko, gdy naprawa DNA nie jest kompletna, co następuje podczas znacznego uszkodzenia DNA po zastosowaniu wyższych stężeń cisplatyny, komórki mogą ulegać apoptozie. Naprawa DNA jest nierozerwalnie związana z aktywacją punktów kontrolnych cyklu komórkowego oraz apoptozą, a wszystkie trzy procesy są w zależny od siebie sposób związane z białkiem supresorowym nowotworu P53. Przedstawione w niniejszej pracy wyniki badań, sugerują, że cisplatyna w znaczący sposób modyfikuje ekspresję genów związanych z regulacją cyklu komórkowego w komórkach HL-60. Dokładne poznanie efektów zmienionej aktywności genów jest niezmiernie istotne dla określenia mechanizmu działania leku oraz sposobu powstawania i przeciwdziałania oporności. Wnioski 1. Dodanie cisplatyny do hodowli komórek HL-60 znacznie wpływa na ekspresję genów związanych z regulacją cyklu komórkowego. 2. Wpływ cisplatyny na ekspresję poszczególnych genów związanych z regulacją cyklu komórkowego w komórkach HL-60 nie jest jednakowy - geny BAX, GTSE1 oraz DDX11 wykazują najbardziej stymulowaną ekspresję, natomiast ekspresja genów NBN i BCL2 jest najbardziej hamowana w porównaniu do komórek hodowli kontrolnych. 3. Poznanie efektów zmienionej aktywności genów jest niezmiernie istotne dla określenia mechanizmu działania leku i prognozowania skuteczności terapii. Piśmiennictwo 1. Einhorn LH. Curing metastatic testicular cancer. Proc Natl Acad Sci 2002; 99: 4592 95. 2. Wang G, Reed E, Li QQ. Molecular basis of cellular response to cisplatin chemotherapy in non-small cell lung cancer (Review). Oncol Rep 2004; 12: 955-65. 3. Lippert B. Cisplatin: Chemistry and Biochemistry of a Leading Anticancer Drug. Wiley-VCH, Weinheim 1999, 111-35. 4. Varma R i wsp. Platinum drug effects on the expression of genes in the polyamine pathway: time-course and concentration-effect analysis based on Affymetrix gene expression profiling of A2780 ovarian carcinoma cells. Cancer Chemother Pharmacol 2007; 59: 711 23. 5. Vermeulen K, Van Bockstaele DR, Berneman ZN. The cell cycle: a review of regulation, deregulation and therapeutic targets in cancer. Cell Prolif 2003; 36: 131-49. 6. Meeran SM, Katiyar SK. Cell cycle control as a basis for cancer chemoprevention through dietary agents. Front Biosci 2008; 13: 2191-202. 7. Previati M i wsp. RNA expression induced by cisplatin in an organ of Corti-derived immortalized cell line. Hear Res 2004; 196: 8-18. 8. Kerley-Hamilton JS i wsp. A p53-dominant transcriptional response to cisplatin in testicular germ cell tumorderived human embryonal carcinoma. Oncogene 2005; 24: 6090 100. 9. Previati M i wsp. Cisplatin-induced apoptosis in human promyelocytic leukemia cells. Int J Mol Med 2006; 18: 511-16. 10. Malinowska K i wsp. Aktywność biologiczna in vitro nowych związków koordynacyjnych platyny(ii) i palladu(ii). Pol Merk Lek 2009; 151: 52-6. 11. Ota T i wsp. Complete sequencing and characterization of 21,243 full-length human cdnas. Nat Genet 2004; 36: 40 5. 12. Perego P i wsp. Association between cisplatin resistance and mutation of p53 gene and reduced bax expression in ovarian carcinoma cell systems. Cancer Res 1996; 56: 556-62. 13. Monte M i wsp. The cell cycle-regulated protein human GTSE-1 controls DNA damage-induced apoptosis by affecting p53 function. J Biol Chem 2003; 278: 30356-64. 14. Méndez J i wsp. Human origin recognition complex large subunit is degraded by ubiquitin-mediated proteolysis after initiation of DNA replication. Mol Cell 2002; 9: 481-91. 15. Privette LM i wsp. Loss of CHFR in human mammary epithelial cells causes genomic instability by disrupting the mitotic spindle assembly checkpoint. Neoplasia 2008; 10: 643-52. 16. Cerosaletti KM, Concannon P. Nibrin forkhead-associated domain and breast cancer C-terminal domain are both required for nuclear focus formation and phosphorylation. J Biol Chem 2003; 278: 21944-51. 17. Mack PC i wsp. Cell cycle-dependent potentiation of cisplatin by UCN-01 in non-small cell lung carcinoma. Cancer Chemother Pharmacol 2003; 51: 337-48. 18. Senderowicz AM. Small-molecule cyclin-dependent kinase modulators. Oncogene 2003; 22: 6609-20. 19. Clarke PA i wsp. Characterisation of molecular events following cisplatin treatment of two curable ovarian cancer models: contrasting role for p53 induction and apoptosis in vivo. Br J Cancer 2004; 91: 1614-23. 20. Siddik ZH. Cisplatin: mode of cytotoxic action and molecular basis of resistance. Oncogene 2003; 22: 7265 79. 21. Sorenson CM, Barry MA, Eastman A. Analysis of events associated with cell cycle arrest at G2 phase and cell death induced by cisplatin. J Natl Cancer Inst 1990; 82: 749-55. 22. Ryan KM, Phillips AC, Vousden KH. Regulation and function of the p53 tumor suppressor protein. Curr Opin Cell Biol 2001; 13: 332 37.
23. Qin LF, Ng IOL. Induction of apoptosis by cisplatin and its effect on cell cycle-related proteins and cell cycle changes in hepatoma cells. Cancer Lett 2002; 175: 27-38. 24. Vogelstein B, Lane D, Levine AJ. Surfing the p53 network. Nature 2000; 408: 307-10. 25. Konac E i wsp. Detection of p53 deletions using FISH values in the HL-60, Daudi, Raji and K-562 cell-lines. Exp Oncol 2003; 25: 33 5. 26. Agami R, Bernards R. Distinct initiation and maintenance mechanisms cooperate to induce G1 cell cycle arrest in response to DNA damage. Cell 2000; 102: 55-66. 27. Taylor WR, Stark GR. Regulation of the G2/M transition by p53. Oncogene 2001; 20: 1803-15. 28. Ando T i wsp. Involvement of the interaction between p21 and proliferating cell nuclear antigen for the maintenance of G2/M arrest after DNA damage. J Biol Chem 2001; 276: 42971-77. 29. Ferry KV, Hamilton TC, Johnson SW. Increased nucleotide excision repair in cisplatin-resistant ovarian cancer cells: role of ERCC1-XPF. Biochem Pharmacol 2000; 60: 1305 13. Adres do korespondencji: dr hab. n. farm. Adam Wilczok Katedra i Zakład Biofarmacji SUM ul. Narcyzów 1 41-200 Sosnowiec tel. 32 364 10 63 e-mail: awilczok@sum.edu.pl