Katedra Chemii Analitycznej Analityka Zanieczyszczeń Środowiska Oznaczanie Pestycydów w Wodach (GC) Prowadzący: mgr inż. Monika Kosikowska Gdańsk, 2010 1
1. Wprowadzenie Pestycydy to liczna i zróżnicowana grupa związków chemicznych, ich zastosowanie celnie określa nazwa postała z połączenia dwóch łacińskich słów pestis szkodnik i cedeo niszczyć. Pestycydy stanowią grupę zanieczyszczeń środowiska bardzo często występujących w wodach powierzchniowych i gruntowych. Największe ich stężenia stwierdza się w okresie spływu wód roztopowych oraz wykonywania zabiegów agrochemicznych. Ważną drogą transportu pestycydów są opady atmosferyczne, za pośrednictwem których zanieczyszczeniu ulegają zbiorniki wodne znajdujące się w dużej odległości od terenów rolniczych. Wybór sposobu przygotowania próbek zależy od postaci próbki, rodzaju matrycy i analitów oraz dostępnych metod instrumentalnych. Sposób pobierania próbek wody w dużym stopniu zależy od składu chemicznego zanieczyszczeń wody i celu analizy. Stężenia pestycydów w wodach 0,001 ug/l nie są zagrożeniem. NSD dla sumy wszystkich pestycydów (obejmuje wszystkie oznaczone w analizie pestycydy) wynosi 0,50 ug/l. Określa to dyrektywa, która powinna być wdrożona do stosowania w listopadzie 2003 roku. Problem zagrożenia pestycydami fauny i flory wód powierzchniowych jest na tyle skomplikowany, że dotychczas opracowano na ten temat bardzo mało norm i przepisów prawnych. Polskie przepisy dotyczą jakości wód powierzchniowych i obejmują tylko trzy grupy pestycydów: insektycydy z grupy węglowodorów chlorowcoorganicznych - 0,05 ug/l, insektycydy fosforoorganiczne i karbaminianowe - dopuszczalne stężenie 1,0 ug/l. Pestycydy są związkami o średniej lotności. Ich aktywność może być klasyfikowana w rozmaity sposób: w zależności od struktury chemicznej: o pestycydy nieorganiczne, o pestycydy organiczne; w zależności od typu organizmów, na które działają: o zoocydy (insektycydy, rodentycydy, bakteriocydy, larwicydy, itd.), o herbicydy, o fungicydy, 2
o odnośnie roślin (regulatory wzrostu, synergetyki, desykanty, defloranty); w zależności od grupy chemicznej: o chloroorganiczne, o fosforoorganiczne, o pochodne kwasu karbaminowego (uretany), o pochodne kwasów fenoksykarboksylowych, o pochodne triazynowe. 2. Ogólne zasady postępowania przy oznaczaniu pestycydów w wodach Pestycydy występują w wodach na stosunkowo niskich poziomach stężeń. Dlatego niezbędny jest etap izolacji pestycydów ze skomplikowanej matrycy wodnej oraz etap wzbogacania przed ostatecznym oznaczeniem końcowym. Etapy postępowania przy analizie śladowych ilości pestycydów: 3
Podstawowe źródła zanieczyszczenia próbki w składniki śladowe to: zanieczyszczenia wtórne z powietrza, wtórne zanieczyszczenie próbki na skutek kontaktu z naczyniami, zanieczyszczenie próbki przez składniki mieszanin do mycia naczyń laboratoryjnych, zanieczyszczenie próbki przez odczynniki stosowane w analizie pestycydów. 3. Metody izolacji (wzbogacania) pestycydów z próbek wody Mikroekstrakcja do fazy stacjonarnej (SPME) - jest odmianą ekstrakcji do fazy stałej. Różnica, w porównaniu z ekstrakcją do fazy stałej, polega na modyfikacji sorbentu. Sorbent nanoszony jest na cienkie włókno szklane lub kwarcowe. Najczęściej stosowanymi sorbentami są: polidimetylosiloksan (PDMS), poliakryl (PA) i różne ich mieszaniny, np. polidimetylosiloksan - polidiwinylobenzen (PDMS / DVB), Carbowax, Carboxen. Takie osadzenie warstwy sorbentu powoduje, że zewnętrzna powierzchnia włókna ma cylindryczny kształt. Ułatwia to wymianę masy podczas wzbogacania i uwalniania zatrzymanych związków oraz eliminuje problemy związane z zatykaniem złoża. Analiza techniką mikroekstrakcji do fazy stacjonarnej składa się z dwóch etapów: pierwszym jest podział związków organicznych pomiędzy fazą stacjonarną osadzoną na włóknie i matrycę - jest to etap adsorpcji. O ilości związku w fazie stacjonarnej decyduje współczynnik podziału. Drugim etapem jest desorpcja termiczną (gorący dozownik). Wysoka temperatura powoduje znaczną zmianę współczynnika podziału związków zatrzymanych na fazie stacjonarnej w kierunku desorpcji do fazy gazowej (gaz nośny). Uwolnione w ten sposób cząsteczki analitów są porywane przez gaz nośny i przenoszone do kolumny chromatograficznej, w której następuje ich rozdzielenie, a następnie oznaczenie ilościowe. Mikroekstrakcja do fazy stacjonarnej łączy w jednym etapie izolację i wzbogacanie analitów. Zaletą metody jest całkowite wyeliminowanie rozpuszczalników i brak wrażliwości na zawiesiny obecne w próbce. SPME może być stosowana do wielu rodzajów próbek: ciekłych, gazowych i stałych. Ekstrakcja w układzie ciecz-ciecz - polega na wykorzystaniu korzystnego współczynnika podziału analizowanych związków między rozpuszczalnik organiczny, którym ekstrahuje się oznaczane anality a fazę wodną. Metody te są łatwe w wykonaniu i nie wymagają skomplikowanej aparatury, jednak wymagają stosowania dużych objętości drogich i toksycznych rozpuszczalników. Najczęściej stosowanymi rozpuszczalnikami są: aceton i acetonitryl, które dobrze mieszają się z wodą. Do ekstrakcji mogą być również stosowane 4
takie rozpuszczalniki organiczne jak heksan, dichlorometan czy eter naftowy. Są to rozpuszczalniki nie mieszające się z wodą, które efektywnie i selektywnie ekstrahują pestycydy, np. eter naftowy stosuje się przede wszystkim do ekstrakcji niepolarnych pestycydów. Metody izolacji wykorzystujące membrany membrana to selektywna przegroda między dwiema fazami. Ekstrakcja do fazy stałej (SPE) - zasada ekstrakcji polega na wykorzystaniu zjawiska podziału związków między dwie fazy: stałą i ciekłą. W pierwszym etapie anality są zatrzymywane na powierzchni złoża sorbentu przy czym muszą mieć większe powinowactwo do fazy stałej niż do matrycy próbki. Ekstrakcja do fazy stałej umożliwia przechowywanie analitów niestabilnych lub o dużej lotności na powierzchni stałego sorbentu oraz wykonywanie reakcji derywatyzacji między aktywnymi grupami analitu i sorbentu. Właściwy proces ekstrakcji analitów do fazy stałej jest zwykle poprzedzony etapem kondycjonowania złoża sorbentu. Proces ten polega na przygotowaniu powierzchni sorbentu do efektywnej izolacji i wzbogacania analitów z wody. W wyniku kondycjonowania sorbentu centra aktywne złoża ulegają aktywacji np. w przypadku żelu krzemionkowego modyfikowanego fazą oktadecylową skręcone łańcuchy ulegają rozprostowaniu, tworząc na powierzchni sorbentu swego rodzaju szczotkę o znacznie powiększonej powierzchni aktywnej. Należy zwrócić uwagę, aby ten sam rozpuszczalnik był stosowany zarówno do kondycjonowania, jak i do elucji analitów z powierzchni sorbentu po wzbogaceniu. W praktyce kondycjonowanie przeprowadza się przez przepłukanie złoża niewielką objętością rozpuszczalnika lub rozpuszczalników organicznych oraz rozpuszczalnika o właściwościach najbardziej zbliżonych do właściwości matrycy badanej próbki (wody dejonizowanej w przypadku próbek wodnych). Oddzielenia analitów od zanieczyszczeń w trakcie SPE można dokonać trzema następującymi sposobami, prowadząc: ekstrakcje selektywną - na sorbencie w trakcie wzbogacania są zatrzymywane jedynie oznaczane związki organiczne, a pozostałe przechodzą przez złoże bez zatrzymywania, 5
selektywne wymywanie zanieczyszczeń - w trakcie płukania złoża sorbentu są wymywane zanieczyszczenia, a oznaczane anality pozostają na złożu i są wymywane innymi rozpuszczalnikami, selektywne wymywanie analitu - wymywanie oznaczanych związków przy jednoczesnym pozostawaniu na złożu sorbentu związków stanowiących zanieczyszczenie. Najczęściej stosuje się ekstrakcję takimi rozpuszczalnikami, jak: dichlorometan, pentan, aceton, metanol, izopropanol, octan etylu, heksan, acetonitryl, izooktan lub ich mieszaniny. Najbardziej skutecznym rozpuszczalnikiem do wymywania zaadsorbowanych pestycydów ze złoża sorbentu jest dichlorometan ze względu na swoją dużą siłę eluotropową. Do izolacji pestycydów najczęściej używane są sorbenty węglowe, polimerowe oraz modyfikowane żele krzemionkowe. Historia SPE wytrząsanie z sorbentem - początkowo ekstrakcja do fazy stałej była wykonywana przez dodanie sorbentu do fazy ciekłej badanej próbki i wytrząsanie przez określony czas. Następnie fazy były rozdzielane przez filtrację lub dekantację.) kolumienki - dostępny w handlu sorbent jest upakowany w kolumienkach między dwoma dyskami filtracyjnymi, a faza ciekła jest przepuszczana przez kolumienkę pod wpływem sił grawitacji lub podciśnienia (met. dynamiczna). Jako sorbentów używa się żelu krzemionkowego modyfikowanego fazą oktylową (C8) lub oktadecylową (C18) oraz polimeru diwinylobenzenu (DVB). zestaw Empore - Do oznaczania próbek o dużej objętości oraz zawiesin wprowadzono krążki ekstrakcyjne - przypominające zewnętrznie krążki filtracyjne - w których sorbent jest umieszczony w szkielecie teflonowym. Krążki ekstrakcyjne typu Empore składają się w 90% z ziaren krzemionki o średnicy 10 μm pokrytych chemicznie związaną fazą C18 spojonych włóknami teflonowymi (PTFE). Materiały te ze względu na małą pojemność sorpcyjną i trudności w uzyskaniu wysokiej odtwarzalności odzysków, zalecane są do stosowania w praktyce laboratoryjnej z dużym wyczuciem analitycznym. 6
Współcześnie Speeddisk - Modyfikacją krążków ekstrakcyjnych są tzw. szybkie dyski ekstrakcyjne (ang. speeddisk), w których warstwa złoża sorpcyjnego jest w szkielecie teflonowym pomiędzy filtrami z włókna szklanego (szczególnie przydatne do ekstrakcji analitów z próbek mętnych zawierających zawiesinę materii organicznej i nieorganicznej). Właściwości: są odporne na zatykanie (w odróżnieniu od kolumienek) prosta budowa pozwala na podłączenie ich do niemal wszystkich systemów ekstrakcyjnych, konstrukcja dysków umożliwia przepływ próbki wodnej o dużym natężeniu (250 ml/min.), dzięki temu uzyskuje się zaskakująco wysokie odzyski. Najnowszym osiągnięciem firmy J.T. Baker jest produkt nazwany SPEEDISK COLUMN. Jest to połączenie klasycznej kolumienki i Speedisku. Speedisk Column składa się z kolumienki, w której umieszczono kolejno od dołu: siatkę, filtr, złoże mikrocząsteczkowe, kolejny filtr oraz sito chroniące złoże przed zanieczyszczeniami. Konwencjonalne kolumienki SPE zawierają sorbenty o średniej średnicy ziaren około 40 μm, co skutkuje m.in. koniecznością stosowania dużej ilości rozpuszczalników stosowanych do elucji w SPE. Speedisk Columns zawierają mikroziarniste złoże na bazie żelu krzemionkowego (o średniej średnicy ziarna 10 μm) lub polimerowe (o średniej średnicy ziarna 15 μm). Nowe złoża mają bardzo dużą powierzchnię właściwą. Unikalna budowa zapewniająca laminarny przepływ przez kolumienki Speedisk umożliwia efektywne działanie przy zmniejszonej objętości rozpuszczalnika oraz zachowaniu wysokiej pojemności sorpcyjnej. Stosowane są złoża o małej średnicy ziarna, co jest możliwe dzięki unikalnej konstrukcji kolumny wykorzystującej filtr ochronny i cienką warstwę złoża. Czas przepływu jest krótszy, końcowe stężenie analitu wyższe i można uniknąć konieczności wzbogacania próbki po ekstrakcji. Natomiast wbudowany filtr stanowi dodatkową ochronę przed zatykaniem się kolumny oraz pozwala na ominięcie etapu filtracji próbki. 7
Przygotowanie zestawu do wzbogacania techniką SPE (Solid Phase Extraction) Procedura 1. Przeprowadzamy badania modelowe na kolumienkach ze złożem sorbentów RP18 przepuszczając przez nie wodę destylowaną z dodatkiem wzorców. 2. Kondycjonowanie złoża 1x3 ml DCM 2x3 ml metanolu 1x3 ml wody dejonizowanej. 3. Przepuszczamy przez kolumienki 200ml przygotowanej próbki z dodatkiem wzorca (prędkość przepływu 8-17 ml/min.). 4. Suszymy złoże sorbentu (ok. 0,5 h). 5. Eluujemy anality ze złoża porcjami DCM (3x2 ml) do jednej fiolki. 6. Usuwamy nadmiar rozpuszczalnika w strumieniu azotu i wymieniamy go na metanol (0,5 ml). 7. Dozujemy do kolumny chromatograficznej pojedyncze wzorce i mieszaninę pestycydów w celu określenia czasów retencji i powierzchni pod pikami dla poszczególnych substancji. 8. Dozujemy próbki do kolumny chromatograficznej. 8
Sprawozdanie Każda grupa wykonuje sprawozdanie i oddaje w przeciągu tygodnia do prowadzącego ćwiczenie. W przypadku zwrotu należy odebrać sprawozdanie i poprawić je także w przeciągu tygodnia od dnia odebrania zwrotu. Wytyczne do przygotowania sprawozdania: 1. Ogólne wiadomości o pestycydach 2. Ogólne wiadomości o SPE 3. Rodzaje złóż i krótka charakterystyka 4. Przebieg ćwiczenia wg instrukcji 5. Wyniki Odczytać z chromatogramów powierzchnie pod pikami odpowiadające poszczególnym pestycydom z mieszaniny wzorcowej. Odczytać z chromatogramów powierzchnie pod pikami odpowiadające poszczególnym pestycydom w ekstraktach otrzymanych z kolumienek. Obliczenia Powierzchnia piku danej substancji w mieszaninie stanowi 100%, natomiast powierzchnia piku danej substancji w ekstrakcie z kolumienki to x %. 9. Wnioski Od czego zależy wielkość odzysku pestycydów Literatura: Pestycydy, występowanie, oznaczanie i unieszkodliwianie, (red.) Biziuk M., WNT, Warszawa 2001. 9