PRACA POGLĄDOWA Review Article Acta Haematologica Polonica 2010, 41, Nr 4, str. 493 500 JAROSŁAW DYBKO, KAZIMIERZ KULICZKOWSKI Białko Bmi-1 i jego rola w procesie samoodnowy i starzenia się komórek macierzystych. Znaczenie Bmi-1 w białaczkach Bmi-1 protein in stem cells self-renewal and senescence. Bmi-1 significance in leukemias Katedra i Klinika Hematologii, Nowotworów Krwi i Transplantacji Szpiku AM we Wrocławiu Kierownik: Prof. dr hab. Kazimierz Kuliczkowski STRESZCZENIE Jednym z ważniejszych narzędzi nadzoru epigenetycznego, a tym samym regulacji transkrypcji, są sprzężone z chromatyną kompleksy białkowe grupy Polycomb (PcG). Tworzą kompleksy hamujące ekspresję wielu genów poprzez metylację histonów H3 w zależności od stopnia zróżnicowania komórki i fazy jej podziału. Białko Bmi-1 należy do rodziny białek Polycomb (PcG), hamuje ekspresje genów p16 Ink4a oraz p19 Arf zahamowuje starzenie się komórek i apoptozę. Poprzez supresję głównych stymulatorów różnicowania zapewnia tożsamość i samoodnawianie się komórki. Komórce nowotworowej zapewnia przetrwanie i oporność na leczenie. SŁOWA KLUCZOWE: Białka grupy Polycomb Bmi-1 Komórki macierzyste Samoodnowa SUMMARY Polycomb group proteins (PcG) are the most significant transcription suppressors performing by H3 methylation. They inhibit most of genes controlling cell differentiation with an effect of enhanced self-renewal. Bmi-1 protein as a member of Polycomb family is the main suppressor of the p16 Ink4a and p19 Arf genes with the result of self-renewal supported by apoptosis and senescence pathways inhibition. Since Bmi-1 is engaged in cells self- renewal and inhibition of apoptotic and senescence pathways it could be the main immortalizer of neoplastic stem cells. KEY WORDS: Polycomb group proteins Bmi-1 Stem cells Self-renewal Białka grupy Polycomb Białka grupy Polycomb (PcG) to duża rodzina białek sprzężonych z chromatyną, współtworzących ważny epigenetyczny mechanizm, który determinuje los komórki w czasie jej prawidłowego i patologicznego rozwoju. Tworzą kompleksy hamujące ekspresję wielu genów poprzez metylację histonów H3 w zależności od stopnia zróżnicowania komórki i fazy jej podziału. Poprzez supresję głównych stymulatorów różnicowania zapewniają tożsamość i samoodnawianie się komórki. Te mechanizmy, dziedziczone w czasie podziałów komórkowych, stają się swoistą pamięcią komórki. Ponadto odgrywają rolę w inaktywacji chromosomu X oraz tzw. imprintingu genetycznym [1]. Mechanizm działania białek grupy PcG oparty jest na dwóch podstawowych kompleksach wielobiałkowych: PRC1 (Pc repressive complex 1) i PRC2 (Pc repressive complex 2). PRC1 zawiera czterobiałkowy rdze: bezpośrednio sprzężone z chromatyną białka HPC (HPC1-HPC3), ponadto białka BMI- 1, MEL 18, grupę HPH oraz dring. Kompleks PRC2 składa się z białek EZ o aktywności metylotransferazy H3K27, ponadto białek SUZ12, EED i ESCL. Trzeci, nie zawsze obecny kompleks, jedyny wią-
494 J. DYBKO, K. KULICZKOWSKI żący się bezpośrednio z DNA to PhoRC. Istnieją doniesienia, że współdziała bezpośrednio z PRC1 [2] i PRC2 [3], ale jego funkcja nie jest w pełni poznana. Najważniejsze składowe kompleksu PRC2 to: białka EZH o aktywności metylotransferazy H3K9 i H3K27 (tylko w obecności pozostałych składowych kompleksu), białka ESCL i EED kofaktory metylacji, oraz białka SUZ12 o jeszcze nie poznanej funkcji w kompleksie [4]. Fragmenty DNA, do których przyłączany jest PhoRC (tzw PREs Polycomb specific elements) nie mają stałej sekwencji nukleotydowej, jedynie fragment GAGAG jest powtarzalny i z nim wiąże się tzw. czynnik GAGA (GAF), który umożliwia przyłączenie PRC1 [4]. Strukturę kompleksów na nici DNA przedstawiono schematycznie na Rycinie 1. Ryc. 1. Struktura i biochemiczna aktywność kompleksów grupy Polycomb* Fig. 1. Polycomb complexes structure and biochemical activity *Na podstawie: Schwartz YB, Pirrotta V. Polycomb complexes and epigenetic states. Curr Opin Cell Biol. 2008 Jun;20(3):266-73. Mechanizmy hamowania transkrypcji przez kompleksy PcG i jego skutki biologiczne Wspomniana reakcja potrójnej metylacji stanowi jeden z głównych mechanizmów aktywacji kompleksów PcG, z uwagi na duże powinowactwo białek zawierających chromodomenę do metylowanej H3K27. Obecnie uważa się, że białka bezpośrednio związane z PREs aktywują PRC2, który metyluje H3K27, co implikuje przyłączeniem PRC1 [4]. Dotychczas uważano, że metylacja H3K27 powoduje kondensację chromatyny i tym samym nieodstępność genów dla czynników inicjujących transkrypcję. Ten mechanizm, obserwowany in vitro nie został jednak potwierdzony in vivo. W ostatnich doświadczeniach zauważono, że aktywacja PRC1 nie hamuje przyłączenia polimerazy II RNA do blokowanego fragmentu DNA, zahamowana natomiast zostaje synteza RNA [5]. Nie jest zatem jasne, czy kondensacja chromatyny powoduje zahamowanie transkrypcji, czy brak aktywności transkrypcyjnej skutkuje kondensacją (Rycina 2). Kompleksy PcG regulują transkrypcję wielu genów, ich aktywność jest niezbędna w procesie spermatogenezy [6] samoodnowy neuronalnych i hematopoetycznych komórek macierzystych [7, 8] oraz prawdopodobnie w regulacji cyklu komórkowego [9]. Większość wyciszanych genów koduje
Białko Bmi-1 i jego rola 495 Ryc. 2. Schematyczne przedstawienie mechanizmu hamowania transkrypcji przez kompleksy Polycomb w poszczególnych etapach przyłączenia do DNA i blokowania genu docelowego (a, b, c). PRC1, PRC2, PhoRC składowe kompleksu, PRE specyficzny fragment DNA przyłączający kompleks PhoRC* Fig. 2. The scheme of transcription inhibition by Polycomb complexes binding to DNA and repressing target genes (a, b, c). PRC1 Polycomb repressive complex 1, PRC2 Polycomb repressive complex 2, PhoRC Pleiohomeotic repressive complex, PRE Polycomb response elements *Na podstawie Schwartz YB, Pirrotta V. Polycomb silencing mechanisms and the management of genomic programmes. Nat Rev Genet. 2007 Jan;8(1):9-22. czynniki inicjujące i regulujące transkrypcję oraz receptory i białka przekaźnikowe zaangażowane w rozwój i różnicowanie komórki [4]. W badaniach nad embrionalnym komórkami macierzystymi (ESC) wykazano, że stan wyciszenia genów odpowiedzialnych za różnicowanie i zapewnienie samoodnowy odbywa się przy udziale kompleksów PcG oraz czynników hamujących transkrypcję (OCT4, SOX2, NANOG) [10]. W doświadczeniach na myszach usunięcie składowej BMI-1 z PRC1 powoduje zanik układu krwiotwórczego i mikrośrodowiska szpiku kostnego [11], natomiast brak składowej EED w PRC2 skutkuje różnicowaniem ESC [10]. Gen bmi-1 i jego rola w regulacji samoodnowy i starzenia się komórek macierzystych Bmi-1, należący do grupy genów Polycomb, zlokalizowany na chromosomie 10p13 [12], bierze udział w regulacji cyklu komórkowego i starzenia się poprzez hamowanie ekspresji genów locus
496 J. DYBKO, K. KULICZKOWSKI Ink4a i Arf, odpowiednio p16 i p19 [13]. Brak ekspresji p16 Ink4a prowadzi do powstania kompleksu kinazy zależnej od Cykliny D (Cdk4,6), która fosforyluje białko genu retinoblastomy (prb). Wysokofosforylowana forma prb nie ma zdolności wiązania i hamowania aktywności czynnika transkrypcyjnego E2F, który tym samym umożliwia transkrypcję genów (polimerazy II DNA, Cykliny E, p19 i in.) niezbędnych do utrzymania ciągłości cyklu komórkowego. Mała ekspresja bmi-1 powoduje odblokowanie p16 Ink4a, związanie czynnika E2F przez niskofosforylowaną formę prb, zahamowanie transkrypcji, zatrzymanie cyklu komórkowego i w rezultacie starzenie się komórki [14]. Brak ekspresji p19 Art sprzyja nagromadzeniu czynnika MDM2, powodującego rozkład białka p53, którego niski poziom w komórce hamuje apoptozę. Tym samym odblokowanie p19 Art, przy małej ekspresji bmi-1, prowadzi do zatrzymania cyklu komórkowego i apoptozy [15]. Duża ekspresja bmi-1 w komórce powoduje więc na drodze obu mechanizmów jej unieśmiertelnienie. Postulowany jest także pośredni wpływ bmi-1 na aktywację telomerazy i czynników hamujących apoptozę (inhibitor apoptozy 6, czynnik aktywujący płytki acetylohydrolaza G) [13] (Ryciny 3 i 4). Ryc. 3. Docelowe miejsca działania genu bmi-1 w komórce. Ai6 inhibitor apoptozy 6, PAF-AHγ czynnik aktywujący płytki - acetylohydrolaza G Fig. 3. Bmi-1 target genes and effectors. Ai6 apoptosis inhibitor-6, PAF-AHγ platelet-activating factor acetylhydrolase
Białko Bmi-1 i jego rola 497 Ryc. 4. Regulacja cyklu komórkowego, apoptozy i starzenia przez gen bmi-1. Ścieżki sygnałowe aktywne przy dużej ekspresji bmi-1 w komórce zaznaczono na czarno, przy niskiej na czerwono. Fig. 4. Regulation of cell cycle, apoptosis, and senescence by bmi-1gene. Proteins affected by high and low levels of bmi-1 are shown by black and red arrows, respectively Brak ekspresji bmi-1 powoduje głębokie zaburzenia w całym układzie hematopoetycznym, z zahamowaniem proliferacji i deplecją wszystkich linii komórkowych we krwi obwodowej [8]. Przypadki mysiej AML bez ekspresji bmi-1 (bmi-1 / ) charakteryzowały się znaczną leukopenią, a komórki
498 J. DYBKO, K. KULICZKOWSKI białaczkowe (blasty) wykazywały skłonność do akumulacji w fazie G1 cyklu komórkowego i apoptozy [11]. Bmi-1 jest również regulatorem samoodnowy i aktywności proliferacyjnej ludzkich HSCs [16]. W oparciu o obserwacje prawidłowych komórek, zwrócono uwagę na regulację procesów proliferacji i samoodnowy w patologicznych komórkach nowotworowych u ludzi. Nadekspresja genu bmi-1 lub zwiększona aktywność jego produktu białkowego została potwierdzona w wielu nowotworach litych m.in. gruczołu piersiowego [17], okrężnicy [18], regionu głowy i szyi [19] oraz pęcherza moczowego [20]. Podobnie w badaniach nad nowotworami układu krwiotwórczego wykazano wzrost aktywności białka BMI-1 m.in. w chłoniakach nieziarniczych [21], ziarnicy złośliwej [22], a także przewlekłej białaczce szpikowej [23] i ostrych białaczkach szpikowych [24]. Wielotorowe działanie Bmi-1 zapewniające samoodnowę, przy jednoczesnym zahamowaniu starzenia i apoptozy może stanowić potężny mechanizm obronny komórek nowotworowych i jednocześnie stać się celem do skutecznej walki z nowotworem. Białko BMI-1, model leukemogenezy i ostre białaczki Kluczową rolę w leukemogenezie, czyli rozwoju białaczki, odgrywają białaczkowe komórki macierzyste (LSCs). Nie jest jasne czy powstają bezpośrednio z hematopoetycznych komórek macierzystych (HSCs) czy ze zdeklarowanych progenitorów, które odzyskały zdolność samoodnowy, być może obie te drogi są w leukemogenezie aktywne [25], co tłumaczyłoby zarówno zdolność do samoodnowy jak i wyższy od HSCs potencjał proliferacyjny tych komórek. Ten sam mechanizm samoodnawiania się, życiodajny w utrzymywaniu puli HSCs, aktywowany w LSCs, staje się dla organizmu zabójczy. U podstaw tego procesu leży, jak wspomniano, aktywność białka BMI-1. Jak wynika z dotychczasowych doświadczeń na skutek zewnętrznego sygnału do samoodnowy w komórkach macierzystych wzrasta ekspresja genu bmi-1 [26]. Białko BMI-1 w hematopoetycznych i białaczkowych komórkach macierzystych utrzymuje zdolność samoodnowy, hamuje apoptozę i starzenie się komórek. W dotychczasowych doświadczeniach wykazano większą ekspresję genu bmi-1 w komórkach ostrej białaczki szpikowej w porównaniu z HSCs [11], a także znacznie wyższy odsetek komórek Bmi- 1 + w populacji LSCs niż HSCs [27]. Może to oznaczać, że białaczkowe komórki macierzyste są w znacznie większym stopniu unieśmiertelnione niż prawidłowe komórki hematopoetyczne. W doświadczeniach in vitro opisujących właściwości i fenotyp LSCs, wysoki poziom transkryptu bmi-1, szczególnie we frakcji CD34 + był bezpośrednio odpowiedzialny za utrzymywanie samoodnowy przy zahamowaniu różnicowania i apoptozy [25]. W pierwszych badaniach dotyczących ostrych białaczek u ludzi zauważono wysoki odsetek komórek Bmi-1 + w populacji białaczkowych blastów, szczególnie prymitywnych, bez cech różnicowania i był związany ze skróceniem czasu całkowitego przeżycia [28]. Niski wskaźnik podziałowy LSCs oraz istnienie ich tzw. form uśpionych [29], czynią tę populację komórek niedostępną dla konwencjonalnej chemioterapii, nawet wspieranej allogenicznym przeszczepieniem szpiku. Białaczkowe komórki macierzyste są najprawdopodobniej odpowiedzialne za pierwotną oporność ostrych białaczek na leczenie oraz nawroty choroby. W badaniach dotyczących zespołów mielodysplastycznych, wysoki odsetek komórek Bmi-1 + w populacji CD34 + wiązał się z szybka progresją choroby i krótkim czasem rozwoju wtórnej ostrej białaczki szpikowej [30]. Z kolei badania dotyczące przewlekłej białaczki szpikowej wykazały, że wysoki odsetek komórek Bmi-1 + w populacji CD34 + pacjentów z CML w fazie przewlekłej leczonych. Imatynibem był znacznie wyższy niż w komórkach CD34 + zdrowych ochotników. Progresja choroby do fazy akceleracji lub kryzy blastycznej była związana ze znacznym wzrostem odsetka komórek Bmi- 1 + w populacji CD34 + [23]. Białko BMI-1, jak już wspomniano, jest głównym elementem białkowych kompleksów. Polycomb odpowiedzialnym za samoodnowę komórek i zablokowanie szlaków apoptozy i różnicowania i starzenia się. Zatem duża ekspresja tego białka w komórkach nowotworowych może wiązać się z szybką progresją i brakiem odpowiedzi na leczenie, tym samym stanowić, niezależny od innych czynników
Białko Bmi-1 i jego rola 499 biologicznych czy odpowiedzi na leczenie, wskaźnik prognostyczny. Ponieważ aktywność tego białka jest znacząco wyższa w LSCs niż w HSCs [64], może być ono potencjalnym celem dla terapii dającej szansę na eradykację klonu białaczkowego, uzyskanie trwałej remisji i wyleczenie. PIŚMIENNICTWO 1. Gil J, Bernard D, Peters G. Role of Polycomb Group Proteins in Stem Cell Self- Renewal and Cancer. DNA Cell Biol. 2005; 24: 117-125. 2. Levine SS, Weiss A, Erdjument-Bromage H, Shao Z, Tempst P, Kingston RE. The core of the polycomb repressive complex is compositionally and functionally conserved in flies and humans. Mol Cell Biol. 2002; 22(17): 6070-8. 3. Satijn DP, Hamer KM, den Blaauwen J, Otte AP. The polycomb group protein EED interacts with YY1, and both proteins induce neural tissue in Xenopus embryos. Mol Cell Biol. 2001; 21(4): 1360-9. 4. Schwartz YB, Pirrotta V. Polycomb silencing mechanisms and the management of genomic programmes. Nat Rev Genet. 2007; 8(1): 9-22. 5. Dellino GI, Schwartz YB, Farkas G, McCabe D, Elgin SC, Pirrotta V. Polycomb silencing blocks transcription initiation. Mol Cell. 2004; 13(6): 887-93. 6. Chen X, Hiller M, Sancak Y, Fuller MT. Tissue-specific TAFs counteract Polycomb to turn on terminal differentiation. Science. 2005; 310(5749): 869-72. 7. Molofsky AV, Pardal R, Iwashita T, Park IK, Clarke MF, Morrison SJ. Bmi-1 dependence distinguishes neural stem cell self-renewal from progenitor proliferation. Nature. 2003; 425(6961): 962-7. 8. Lessard J, Sauvageau G. Bmi-1 determines the proliferative capacity of normal and leukaemic stem cells. Nature. 2003; 423: 255-260. 9. Martinez AM, Colomb S, Déjardin J, Bantignies F, Cavalli G. Polycomb group- dependent Cyclin A repression in Drosophila. Genes Dev. 2006; 20(4): 501-13. 10. Boyer LA, Plath K, Zeitlinger J i wsp. Polycomb complexes repress developmental regulators in murine embryonic stem cells. Nature. 2006; 441(7091): 349-53. 11. Park I-K, Qian D, Kiel M, i wsp. Bmi-1 is required for maitenance of adult self-renewing haematopoietic stem cells. Nature. 2003; 423: 302-305. 12. Alkema MJ, Wiegant J, Raap AK, Berns A, van Lohuizen M. Characterization and chromosomal localization of the human proto-oncogene BMI-1. Hum Mol Genet. 1993; 2: 1597-1603. 13. Jacobs JJ, Kieboom K, Marino S, DePinho RA, Lohuizen M. The oncogene and Polycomb group gene bmi-1regulates cell proliferation and senescence through the ink4a locus. Nature. 1999; 397: 164-168. 14. Cammenga J. Gatekeeper pathways and cellular background in the pathogenesis and therapy of AML. Leukemia. 2005; 19: 1719 1728. 15. Sauvageau M, Sauvageau G. Polycomb Group genes: Keeping Stem Cell Activity in Balance. PloS Bilo. 2008; 6: 0678-0681. 16. Iwama A, Oguro H, Negishi M i wsp. Enhanced self-renewal of hematopoietic stem cells mediated by the polycomb gene product Bmi-1. Stem Cells. 2007; 25(7): 1635-44. 17. Dimri GP, Martinez JL, Jacobs JJ i wsp. The Bmi-1 oncogene induces telomerase activity and immortalizes human mammary epithelial cells. Cancer Res. 2001; 61: 2409-2412. 18. Reinisch C, Kandutsch S, Uthman A, Pammer J. BMI-1: a protein expressed in stem cells, specialized cells and tumors of the gastrointestinal tract. Histol Histopathol. 2006; 21(11): 1143-9. 19. Vormittag L, Thurnher D, Geleff S i wsp. Co-expression of Bmi-1 and podoplanin predicts overall survival in patients with squamous cell carcinoma of the head and neck treated with radio(chemo)therapy. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 2009; 73(3): 913-8. 20. Qin ZK, Yang JA, Ye YL i wsp. Expression of Bmi-1 is a prognostic marker in bladder cancer. BMC Cancer. 2009; 9: 61. 21. Raaphorst FM, Vermeer M, Fieret E i wsp. Site-specific expression of polycomb- group genes encoding the HPC- HPH/PRC1 complex in clinically defined primary nodal and cutaneous large B-cell lymphomas. Am J Pathol. 2004; 64: 533-542. 22. Raaphorst FM, van Kemenade FJ, Blokzijl T i wsp. Coexpression of BMI-1 and EZH2 polycomb group genes in Reed-Sternberg cells of Hodgkin's disease. Am J Pathol. 2000; 157: 709-715. 23. Mohty M, Szydlo R, Yong Asm i wsp. Association between BMI-1 expression, acute graft-versus-host disease, and outcome following allogeneic stem cell transplantation from HLA-identical siblings in chronic myeloid leukemia. Blood. 2008; 112: 2163-2166.
500 J. DYBKO, K. KULICZKOWSKI 24. Chowdhury M, Mihara K, Yasunaga S, Ohtaki M, Takihara Y, Kimura A. Expression of Polycomb-group (PcG) protein BMI-1 predicts prognosis in patients with acute myeloid leukemia. Leukemia. 2007; 21: 116-1122. 25. Jordan CT. The leukemic stem cell. Best Pract Res Clin Haematol. 2007; 20(1): 13-18. 26. Park I-K, Morrison SJ, Clarke MF. Bmi1, stem cells, and senescence regulation. J Clin Invest. 2004; 113: 175-179. 27. Passegué E, Jamieson CHM, Ailles LE, Weissman IL. Normal and leukemic hematopoiesis: Are leukemias a stem cell disorder or a reacquisition of stem cell characteristics? Proc Natl Acad Sci U S A. 2003; 100: 11842-11849. 28. Hosen N, Yamane T, Muijtjens M, Pham K, Clarke MF, Weissman IL. Bmi-1- Green Fluorescent Protein-Knock-In Mice Reveal the Dynamic Regulation of Bmi-1 Expression in Normal and Leukemic Hematopoietic Cells. Stem Cells. 2007; 25: 1635-1644. 29. Hope KJ, Jin L, Dick JE. Acute myeloid leukemia originates from a hierarchy of leukemic stem cell classes that differ in self-renewal capacity. Nat Immunol. 2004; 5(7): 738-43. 30. Mihara K, Chowdhury M, Nakaju N, i wsp. Bmi-1 is useful as a novel molecular marker for predicting progression of myelodysplastic syndrome and prognosis of the patients. Blood. 2005; 107: 305-308. Praca wpłynęła do Redakcji 18.06.2010 r. i została zakwalifikowana do druku 27.09.2010 r. Adres Autora: Dr n. med. Jarosław Dybko Katedra i Klinika Hematologii, Nowotworów Krwi i Transplantacji Szpiku AM we Wrocławiu ul. Pasteura 4 50-367 Wrocław Tel. 71 784 25 87 e-mail: dybko@post.pl