Nowiny Lekarskie 2008, 77, 4, 273 279 JOANNA KOPEĆ-SZLĘZAK, JOLANTA WOŹNIAK STANDARDOWE OZNACZANIE IMMUNOFENOTYPU KOMÓREK BIAŁACZKOWYCH W ROZPOZNAWANIU I MONITOROWANIU OSTREJ BIAŁACZKI SZPIKOWEJ (OBS) STANDARD FOR ACUTE MYELOID LEUKEMIA (AML) IMMUNOPHENOTYPING AT DIAGNOSIS AND MONITORING Pracownia Immunofenotypowania Kierownik: prof. dr hab. Joanna Kopeć-Szlęzak Zakład Diagnostyki Hematologicznej i Transfuzjologicznej Kierownik: doc. dr hab. Magdalena Łętowska Instytut Hematologii i Transfuzjologii w Warszawie Streszczenie Wstęp. Ustalenie immunofenotypu komórek w ostrych białaczkach szpikowych (OBS) ma na celu identyfikację linii komórek i stopnia ich dojrzałości oraz określenie ekspresji nietypowych dla wykrywania choroby resztkowej. Celem pracy było ustalenie standardu oznaczania immunofenotypu komórek białaczkowych w OBS. Materiał i metody. Analizę immunofenotypu komórek białaczkowych szpiku kostnego i/lub krwi obwodowej 116 pacjentów przeprowadzano metodą czterokolorowej cytofluorometrii w cytometrze przepływowym FACS Canto BD. Zastosowano antygen panleukocytarny CD45 dla wyodrębnienia komórek rozrostowych oraz konieczne do ustalenia immunofenotypu OBS antygeny: liniowe i związane z dojrzewaniem komórek linii mieloidalnej oraz antygeny limfoidalne. Wyniki i wnioski. Opracowano zestawy przeciwciał monoklonalnych do przesiewowego oznaczania OBS oraz panele dla ustalenia podtypów OBS: CD14/CD64/CD45, CD19/CD13/CD45/CD3, CD7/CD33/CD45/CD117, CD66/CD16/CD45, CD79a/MPO/CD3/TdT. Dla podtypu OBS M1/M2 charakterystyczna jest ekspresja CD13+CD33+CD1117+ oraz CD34+HLA-DR+, dla M3- brak ekspresji CD34, HLA-DR i CD11b/CD18. W M4- mieloblasty są CD117+CD64-, a komórki monocytoidalne CD117-CD64+. W podtypie M5 komórki CD14- charakteryzuje ekspresja CD117 i słaba ekspresja CD34, natomiast komórki CD14+ nie mają ekspresji CD117 i CD34. W monitorowaniu choroby resztkowej przydatne jest oznaczanie głównie ekspresji asynchronicznych bądź z linii limfoidalnej (np. CD2, CD56). SŁOWA KLUCZOWE: ostra białaczka szpikowa, cytometria, choroba resztkowa. Summary Introduction. Immunophenotype determination of leukemia cell in acute myeloid leukemia (AML) connects with cell line and cell maturity identification as well as aberrant antigen expression, for minimal residue disease (MRD) monitoring. The aim of this study was standardization of AML leukemia cell immunophenotyping. Material and methods. 116 AML patient bone marrow/peripheral blood were tested. Immunophenotype determination was carried out by four-color analysis with FACS Canto BD flow cytometer. To separate leukemia cells pan-leukocyte CD45 antigen and for immunophenotype determination of line-specific antigens, myeloid cells maturation antigens and lymphoid antigens were used. Results and conclusions. We established useful screening kits for four-color flow cytometry: CD14/CD64/CD45, CD19/CD13/CD45/CD3, CD7/CD33/CD45/CD117, CD66/CD16/CD45 and CD79a/MPO/CD3/TdT. In AML M1/M2 myeloblasts are CD13+CD33+CD117+ and CD34+HLA-DR+, in M3 promyelocytes they are CD34, HLA-DR and CD11b/CD18 they a negative. In M4- myeloblasts are CD117+ CD64- and monocytoidal cells are CD64+CD117-. In M5 CD14 negative cells are CD117+CD34+ and CD14+ cells are CD117-CD34-. Determination of asynchronous and non-lineage expressions (CD2, CD56) are mainly useful for MRD monitoring. KEY WORDS: acute myeloid leukemia, cytometry, minimal residual disease. Wstęp Ostra białaczka szpikowa (OBS) to nieograniczony rozrost prekursorowych komórek mieloidalnych z dojrzewaniem zablokowanym na różnych etapach rozwoju. Efektem rozrostu jest akumulacja komórek rozrostowych i zahamowanie normalnej hematopoezy w szpiku, czyli wyparcie prawidłowych elementów szpiku, jak erytroblasty, megakariocyty i granulocyty oraz zajęcie krwi obwodowej i innych organów przez komórki białaczkowe [1]. Cytometria przepływowa jest jedną z istotnych metod diagnostycznych, stosowaną w rozpoznawaniu OBS. Jest to metoda nowoczesna, prosta, specyficzna i czuła, w ostatnich 10 latach szybko rozwijająca się, a dodatkową zaletą tej metody jest stosunkowo krótki czas uzyskania wyników. Ustalenie immunofenotypu komórek w ostrych białaczkach szpikowych ma na celu: identyfikację linii komórek układu krwiotwórczego, która uległa rozrostowi
274 Joanna Kopeć-Szlęzak, Jolanta Woźniak określenie stopnia dojrzałości komórek rozrostowych, istotne w określeniu podtypu OBS. Podtypy ostrej białaczki szpikowej określane są na podstawie klasyfikacji WHO i FAB z uwzględnieniem immunofenotypowania [2, 3] oznaczenie charakterystycznych cech immunofenotypu fenotypu, przydatnych w monitorowaniu choroby, w wykrywaniu choroby resztkowej oraz rokowaniu. Aby analiza cytometryczna fenotypu komórek białaczkowych w OBS była jak najbardziej efektywna i użyteczna w ocenie wielkości choroby resztkowej, zaleca się w momencie diagnozy rozpoznawanie związanych z białaczką aberrantnych immunofenotypów (LAIP Leukemia- Associated Immunophenotypes). Aberrantne immunofenotypy są obecne na wszystkich lub na części komórek białaczkowych, natomiast na prawidłowych komórkach szpiku są obecne z bardzo małą częstotliwością lub w ogóle nie występują. W tym celu podczas diagnozy ustala się charakterystyczny dla danego chorego aberrantny immunofenotyp białaczkowy (LAIP), za pomocą którego w trakcie monitorowania leczenia będzie rozpoznawana minimalna choroba resztkowa (MRD minimal residual disease) oraz oceniany stopień zajęcia szpiku przez komórki białaczkowe [4, 5]. Białaczkowe immunofenotypy aberrantne można podzielić na cztery kategorie ze względu na charakter aberracji: 1. cross-lineage ekspresja limfoidalnych antygenów na mieloidalnych komórkach białaczkowych, takich jak CD2, CD7, CD19 2. underexpression brak ekspresji lub słaba ekspresja antygenów, które występują w trakcie normalnego różnicowania komórek linii granulo- lub monocytarnej, takich jak CD13 i CD33 3. overexpression większa intensywność ekspresji antygenów niż na prawidłowych komórkach szpiku, takich jak CD13, CD33 czy CD34 4. asynchroniczna ekspresja antygenu koekspresja antygenu, który w trakcie normalnej granulo- lub monopezy występuje w ustalonej kolejności, a nie równocześnie, np. koekspresja markerów wczesnego dojrzewania, takich jak CD34 lub CD117 z antygenami związanymi z późniejszym dojrzewaniem komórek linii mieloidalnej takimi jak, CD15, CD11b, CD11c lub wcześniejszym np.: brak CD38 lub obecność TdT [4]. Materiał i metody W latach 2005 2007 przebadano w Instytucie Hematologii i Transfuzjologii, w celu ustalenia rozpoznania, 176 pacjentów z ostrą białaczką szpikową M0-M5. Monitorowanie choroby resztkowej (co najmniej jedno badanie) przeprowadzono u 40 chorych. Metodą stosowaną w immunofenotypowaniu ostrych białaczek jest cytometria przepływowa. Cytometria przepływowa to metoda pomiaru pojedynczych komórek przepływających przed wiązką lasera w strumieniu cieczy. W immunofenotypowaniu przy użyciu cytometru przepływowego ocenia się : rozmiar komórek FSC ziarnistości komórek SSC ekspresję antygenów powierzchniowych i cytoplazmatycznych przy użyciu przeciwciał monoklonalnych związanych z barwnikami fluorescencyjnymi. W oparciu o własne doświadczenia oraz na podstawie danych uzyskanych z 10 laboratoriów prowadzących immunofenotypowanie ostrych białaczek szpikowych opracowano ogólne zasady dotyczące przygotowania materiału, sprzętu, odczynników i analizy stosowanych w immunofenotypowaniu ostrych białaczek szpikowych, zawarto je w tabeli 1. Tab. 1. Podstawowe zasady immunofenotypowania OBS Table 1. Basic principles of AML immunphenotyping Materiał: rodzaj materiału: minimalna ilość sposób przygotowania sposób przechowywania lub/i dostarczenia do laboratorium szpik kostny i krew obwodowa pobrane na EDTA 1 ml komórki liczone w analizatorze hematologicznym (lub w kamerze) przed barwieniem szpik płukany 2x w PBS-ie, do barwienia używana jest zawiesina komórek w ilości 10 20 tys./ml Próbki krwi obwodowej powinny być dostarczone do laboratorium maksimum w ciągu 12 h, a aspirat szpiku w ciągu 6 h od pobrania, przechowywane w temp. pokojowej (optymalnie: 18 0 22 0 C) stosowane urządzenie rodzaj znakowania Metoda: Cytometr przepływowy, laser 488 nm, (+ ewentualnie drugi umożliwiający jednoczesny pomiar większej ilości parametrów) Minimalne wymagania: możliwość pomiaru 5 parametrów, FSC, SSC, 3 fluorescencje (F1, F2, F3) Znakowanie przeciwciałami bezpośrednie w pełnej krwi i/lub aspiracie szpiku
Standardowe oznaczanie immunofenotypu komórek białaczkowych w rozpoznawaniu i monitorowaniu ostrej białaczki 275 cd. tab. 1. firmy stosowanych przeciwciał firma produkująca lizat barwniki fluorescencyjne inkubacja z przeciwciałami liczba analizowanych komórek w rozpoznaniu liczba analizowanych komórek w MRD rodzaj zakładanych bramek Wybór dowolny zastrzeżenia: przy porównawczych oznaczeniach ilościowych oceniających ilość badanego antygenu na komórce lub jego intensywność fluorescencji konieczne jest stosowanie przeciwciał tej samej firmy Wybór dowolny (zalecany lizat najmniej zmieniający morfologię badanych komórek nasze sugestie PharmLyse BD) Nie zaleca się stosowania jednocześnie przeciwciał związanych z PE-Cy5 i APC (niemożliwa kompensacja) Zaleca się odpowiedni dobór fluorochromów do badanych antygenów: jeżeli słaba ekspresja antygenu, to PE l jeżeli pośrednia ekspresja antygenu, to PE-Cy5, PerCPCy5.5, APC, PE-Cy7 jeżeli mocna ekspresja antygenu, to FITC lub PerCP Jeżeli nie ma specjalnych wskazań producenta, obecnie poleca się dwa sposoby: 15 20 min w ciemności w temperaturze pokojowej 30 min w 4 0 C Analiza: 10 000 20 000 50 000 i więcej (20 30 komórek resztkowych ) Bramkowanie komórek blastycznych w OBS na diagramie (dot. plot) SSC/CD45 i/lub FSC/SSC i/lub SSC/charakterystyczny marker (CD117, CD34, CD64) Wyniki Analiza cytometryczna zasady stosowania i wyniki. Panel przeciwciał do immunofenotypowania OBS powinien zawierać: przeciwciała do oznaczenia linii komórkowej rozrostu przeciwciała do oznaczenia stopnia dojrzałości populacji komórek białaczkowych Przeciwciała nieliniowe, charakterystyczne dla komórek mielo- i monocytoidalnych przeciwciała do oznaczania immunofenotypów aberrantnych ekspresja antygenów innych linii komórkowych lub niezgodnych ze stopniem dojrzałości co jest przydatne w ocenie choroby resztkowej kontrole izotypowe odpowiednie dla stosowanych przeciwciał. Obowiązkowe antygeny oceniane przy diagnostyce ostrej białaczki szpikowej to: antygen pan-leukocytarny CD45 do wyodrębnienia populacji komórek rozrostowych antygeny charakterystyczne dla komórek linii mielo- i monoidalnej:cd13, CD14, CD15, CD33, CD64, CD117, GlyA, CD41, CD61, MPO (mieloperoksydaza) antygeny komórek limfoidalnych: CD19, CD7, CD2, ccd79a, ccd3. antygeny związane z dojrzewaniem komórek hematopoetycznych: CD34, CD38, HLA-DR, TdT (terminal deoxynucleotidyl transferase) antygeny do oceny dojrzałości komórek linii mieloidalnej: CD66, CD16. Kolejność wykonywanych czynności: 1. W procesie immunofenotypowania OBS podstawowe znaczenie ma wyodrębnienie populacji komórek rozrostowych. Narzędziem wyznaczającym grupę komórek białaczkowych jest CD45, który na komórkach OBS wykazuje zróżnicowaną i odmienną od prawidłowych komórek linii mielo-monocytoidalnej ekspresję. Jest to uznany w piśmiennictwie gate marker. Po raz pierwszy powinien być użyty w przesiewie ( screening ), następnie w identyfikacji linii i stadium dojrzałości (w postępowaniu różnicującym podtypy OBS). Równolegle oznaczane limfocyty CD45+ służą jako punkt odniesienia dla ułatwienia lokalizacji badanej populacji komórek białaczkowych na cytogramach (ryc. 1 A i B). 2. Ustalenie głównej linii komórek, czyli stwierdzenie rozrostu mielo- lub monocytoidalnego z wykluczeniem rozrostu z komórek linii limfoidalnej. Służą do tego celu tzw. panele przesiewowe z użyciem wielokolorowej fluorescencji (3 8 fluorochromów). Oprócz parametrów dotyczących ekspresji antygenów wyznaczonych przy użyciu przeciwciał monoklonalnych sprzężonych z fluorochromami w cytometrii przepływowej dysponujemy dwoma dodatkowymi parametrami o charakterze morfologicznym: SSC (odzwierciedlającą tzw. ziarnistość komórek) oraz ich wielkość FSC. Proponowany zestaw przesiewowy z zastosowaniem czterech fluorochromów zawiera 15 przeciwciał i znakuje: a. antygeny powierzchniowe: 1) CD14/CD64/CD45/GlyA 2) CD19/CD13/CD45/CD34 3) CD7/CD33/CD45/CD117 4) CD66/CD16/CD45/CD41a, 5) odpowiednie kontrole izotypowe
276 Joanna Kopeć-Szlęzak, Jolanta Woźniak b. antygeny cytoplazmatyczne: CD3/MPO/CD79a/TdT plus odpowiednie kontrole izotypowe Dodatnia ekspresja: CD13, CD33, CD34, CD117, MPO oraz ujemna ekspresja: CD19, CD7, ccd3, CD79a, CD14, CD64 wskazuje na OBS z wczesnych komórek linii mieloidalnej (M1/M2), z jednoczesnym wykluczeniem rozrostu z komórek linii monocytoidalnej i limfoidalnej (ryc. 1 C-I). Ryc. 1. Cytogramy A i B przedstawiają wyodrębnianie populacji komórek blastycznych z wykorzystaniem różnic, pomiędzy subpopulacjami leukocytów, w sile ekspresji CD45 i ziarnistości (SSC). Cytogramy C-I przedstawiają pierwszy krok w immunofenotypowaniu ostrej białaczki czterokolorowy panel składający się z czterech probówek po cztery przeciwciała. Fig. 1. Four-colour screening panel. Cytograms A and B show the separate blast cell populations. We use differences in SSC and CD45 expression intensity between leukocyte subpopulations. Cytograms C-I show the first step pf AML immunophenotyping: Four-colour screening panel consist 4 tubes with 4 monoclonal antibodies every one of them. Jednocześnie zastosowanie takich zestawów przeciwciał umożliwia określenie fenotypów aberrantnych zarówno w przypadkach rozrostów z linii mieloidalnej, jak i limfoidalnej B i T i są to koekspresje: CD13+CD19+, CD33+CD7+CD117+. Określenie podtypu OBS oraz fenotypów aberrantnych (LAIP): Poniższa propozycja stanowi przykład panelu przeciwciał używanego po zastosowaniu czterokolorowego zestawu przesiewowego CD18/HLA-DR/CD45/CD11b/CD117 mieloblasty? CD18 -/dim, DR+, CD11b -/dim monoblasty? CD18 ++, DR+, CD11b dim/+ negatywna expresja: HLA-DR, CD18, CD11b prawdopodobnie AML M3 CD38/CD34/CD45 określenie CD34+CD38 komórek CD15/CD117/CD45/CD34 fenotyp aberrantny CD11c/CD117 komórki monocytoidalne, aberrantny fenotyp dla mieloblastów CD36 komórki monocytoidalne? CD36+; komórki erytroidalne? CD36++ CD2/CD56/CD117 fenotyp aberrantny Poszczególne podtypy charakteryzuje ekspresja: Podtyp OBS M1/M2 CD13+CD33+CD117+, CD34+HLA-DR+ Podtyp OBS M3 CD13+CD33++CD34-/HLA-DR- CD18-CD11b- (konieczne sprawdzenie translokacji t(15;17). Podtyp OBS M4 występują dwie subpopulacje komórek białaczkowych najczęściej wyróżniane w trakcie analizy ekspresji CD45: linia monocytoidalna z mocniejszą siłą ekspresji, mieloblasty ze słabszą siłą ekspresji CD45. Proces odróżniania komórek linii monocytoidalnej od mieloblastów można przeprowadzić również przez oznaczenie odsetka komórek z ekspresją CD117 i CD64; mieloblasty są CD117+CD64- a komórki monocytoidalne CD117 CD64+; różnicowanie linii komórek rozrostowych w OBS M4 w okresie rozpoznania jest przydatne w monitorowaniu efektów leczenia (ryc. 2.). Podtyp OBS M5 CD14 minus: CD13+CD33++CD64+CD36+CD11c+CD15++CD117+ /-CD34-/+ CD14 plus: CD13+CD33++CD64+ CD36+CD11c+CD15+CD117-CD34-. Szczegółową charakterystykę ekspresji molekuł w podtypach OBS przedstawia tabela 2. Aberrantne ekspresje antygenów na komórkach białaczkowych w OBS. Najczęściej spotykanymi aberracjami na komórkach białaczkowych w OBS jest ekspresja obca crosslineage markerów komórek linii limfoidalnej np.: CD7, CD56, CD19 oraz ekspresja asynchroniczna, czyli jednoczesna ekspresja markera charakterystycznego dla komórek z wczesnych etapów dojrzewania linii mieloidalnej oraz markera charakterystycznego dla komórek z późnych etapów dojrzewania linii mieloidalnej, np. występowanie mieloblastów o fenotypie CD15+CD117+CD34+ (ryc. 3.) lub CD11b+CD117+CD34+.
Standardowe oznaczanie immunofenotypu komórek białaczkowych w rozpoznawaniu i monitorowaniu ostrej białaczki 277 Ryc. 3. Fenotyp aberrantny CD34+CD117+CD15+ na mieloblastach w OBS M2 w prawidłowym szpiku komórek o takim fenotypie stwierdza się poniżej 0,8% wśród wszystkich komórek jądrzastych. Fig. 3. Leukemia-associated aberrant immunophenotype (LAIP): CD34+CD117+CD15+ on myeloblasts in AML M2 patient. The cells with such phenotype exist in normal bone marrow at 0,8% WBC level. Ryc. 2. Przedstawia wykorzystanie różnic w sile ekspresji CD45, pomiędzy populacjami komórek monocytoidalnych a mieloblastami do rozróżnienia dwóch populacji komórek białaczkowych. Na rycinie przedstawiono różnice w ekspresji dwóch antygenów CD64 i CD117 na dwóch populacjach komórek rozrostowych a OBS M4. Fig. 2. The differentiation AML M4 leukemic cells: cytograms show CD45 diverse expression intensity on monocytoid cells and myeloblasts. The histograms show different CD64 and CD117 expression on monocytoid cells and myeloblasts. Wynik badania cytometrycznego określającego immunofenotyp komórek białaczkowych w OBS powinien zawierać: odsetek komórek blastycznych wyznaczony na cytogramie SSC/CD45 i wyrażony względem wszystkich jądrzastych komórek szpiku odsetki komórek z ekspresją badanych antygenów w odniesieniu do komórek rozrostowych, wyodrębnionych przy zastosowaniu bramki SSC/CD45. Populację uważa się za pozytywną dla danego antygenu, gdy ponad 20% komórek w wyodrębnionej bramce wykazuje ekspresję danego antygenu. W przypadku poszukiwania choroby resztkowej wynik podawany jest jako odsetek komórek z ekspresją aberrantnego fenotypu wśród wszystkich jądrzastych komórek szpiku w odniesieniu do odsetka aberrantnej subpopulacji komórek w prawidłowym szpiku. Fenotyp komórek białaczkowych może być podawany w formie opisowej, gdy niemożliwe jest wyodrębnienie bramki dla komórek rozrostowych. Dodatkową charakterystyką komórek białaczkowych jest określenie siły ekspresji badanych antygenów, przedstawionej jako intensywność fluorescencji (średni kanał fluorescencji mean fluorescence intensity MFI) lub jako ilość miejsc wiążących przeciwciało np. MESF Molecules of Equivalent Soluble Fluorophores, ABC Antibody Bound per Cell).
278 Joanna Kopeć-Szlęzak, Jolanta Woźniak Tab. 2. Odsetek chorych na OBS, u których ponad 20% blastów wykazywało ekspresję badanego antygenu Table 2. The percentage of AML cases with antigens expression above 20% liniowe antygeny mieloidalne M0/M1 CD13 CD33 CD15 CD117 CD34 HLA-DR CD14 CD64 CD36 M2 t(8;21) CD13 CD33 CD15 CD117 CD34 HLA-DR CD14 CD64 CD36 M2 CD13 CD33 CD15 CD117 CD34 HLA-DR CD14 CD64 CD36 M2/MDS CD13 CD33 CD15 CD117 CD34 HLA-DR CD14 CD64 CD36 M3 t(15;17) CD13 CD33 CD15 CD117 CD34 HLA-DR CD14 CD64 CD36 M4 mieloblasty CD13 CD33 CD15 CD117 CD34 HLA-DR CD14 CD64 CD36 M4 monocyty CD13 CD33 CD15 CD117 CD34 HLA-DR CD14 CD64 CD36 M5 CD14- CD13 CD33 CD15 CD117 CD34 HLA-DR CD14 CD64 CD36 M5 CD14+ CD13 CD33 CD15 CD117 CD34 HLA-DR CD14 CD64 CD36 antygeny cytoplazmatyczne fenotypy aberrantne (cross-lineage) cząsteczki adhezyjne antygeny limfoidalne fenotypy aberrantne asynchroniczne M0/M1 MPO TdT CD11b CD11c CD31 CD56 CD2 CD7 CD19 CD15+34+ CD34+38- M2 t(8;21) MPO TdT CD11b CD11c CD31 CD56 CD2 CD7 CD19 CD15+34+ CD34+38- M2 MPO TdT CD11b CD11c CD31 CD56 CD2 CD7 CD19 CD15+34+ CD34+38- M2/MDS MPO TdT CD11b CD11c CD31 CD56 CD2 CD7 CD19 CD15+34+ CD34+38- M3 t(15;17) MPO TdT CD11b CD11c CD31 CD56 CD2 CD7 CD19 CD15+34+ CD34+38- M4 mieloblasty MPO TdT CD11b CD11c CD31 CD56 CD2 CD7 CD19 CD15+34+ CD34+38- M4 monocyty MPO TdT CD11b CD11c CD31 CD56 CD2 CD7 CD19 CD15+34+ CD34+38- M5 CD14- MPO TdT CD11b CD11c CD31 CD56 CD2 CD7 CD19 CD15+34+ CD34+38- M5 CD14+ MPO TdT CD11b CD11c CD31 CD56 CD2 CD7 CD19 CD15+34+ CD34+38-100% 50% chorych 49% 21% chorych 20% 1% chorych 0% chorych OBS OBS
Standardowe oznaczanie immunofenotypu komórek białaczkowych w rozpoznawaniu i monitorowaniu ostrej białaczki 279 Podsumowanie Oznaczanie immunofenotypów komórek białaczkowych przy użyciu wieloparametrycznej cytometrii przepływowej jest obecnie powszechnie akceptowaną metodą w diagnostyce rozrostów hematologicznych i uważane za ważny i czuły test, szczególnie w rozpoznawaniu ostrych białaczek. Procedura oznaczania ostrej białaczki szpikowej proponowana przez nas oparta jest na opublikowanych wcześniej, przez zespoły międzynarodowe, zaleceniach oraz na doświadczeniach własnych [6, 7, 8, 9, 10]. Dokładne i szczegółowe ustalenie immunofenotypu komórek białaczkowych w momencie rozpoznania jest bardzo pomocne w monitorowaniu leczenia i poszukiwaniu choroby resztkowej u chorych na ostre białaczki. Jest bardzo ważne, aby badanie immunofenotypu komórek przeprowadzane było według uznanych, standardowych procedur, co umożliwia porównywalność uzyskanych wyników pomiędzy laboratoriami. Piśmiennictwo 1. Tavor S., Petit I., Porozov S. et al.: Motility, proliferation, and egress to the circulation of human AML cells are elastase dependent in NOD/SCID chimeric mice. Blood, 2005, 106, 2120-2127. 2. Vardiman J.W., Harris N.L., Brunning R.D.: The World Health Organization (WHO) classification of the myeloid neoplasms. Blood, 2002, 100, 2292-2302. 3. Bennett J.M., Catovsky D., Daniel M.T. et al.: Proposals for the classification of the acute leukemias French-American- British (FAB) co-operative group. Brit. J. Haematol., 1976, 33, 451-458. 4. Kern W., Schnittger S.: Monitoring of AML by flow cyometry. Curr. Oncol. Rep., 2003, 5, 405-12. 5. San Miguel J.F., Vidriales M.B., Lopez-Berges C. et al.: Early immunophenotypical evaluation of minimal residual disease in acute myeloid leukemia identifies different patient risk groups and may contribute to postinduction treatment stratification. Blood, 2001;98:1746-51. 6. Orfao A., Lopez A., Flores J. et al.: Diagnosis of hematological malignancies: new applications for flow cytometry. Hematology, 2006, 2, 6-13. 7. Bain B.J., Barnett D., Linch D. et al.: Revised guideline on immunophenotyping in acute leukemias and chronic lymphoproliferative disorders. Clin. Lab. Hematol., 2002, 24, 1-13. 8. Heilmeier B., Buske C., Spiekermann K. et al.: Diagnostics, classification and prognostic criteria of acute myeloid leukemia. Med. Klin., 2007, 102, 296-308. 9. Ratei R., Karawajew L., Lacombe F. et al.: Discriminant function analysis as decision support system for the diagnosis of acute leukemia with a minimal four color screening panel and multiparameter flow cytometry immunophenotyping. Leukemia, 2007, 21, 1204-1211. 10. Craig F.E., Foon K.A.: Flow cytometric immunophenotyping for hematologic neoplasms. Blood, 2008, 111, 3941-3967. Praca została wykonana w ramach grantu zamawianego PBZ- KBN-119/PO5/02. Adres do korespondencji: prof. dr hab. Joanna Kopeć-Szlęzak Pracownia Immunofenotypowania Instytut Hematologii I Transfuzjologii ul. Indiry Gandhi 14 02-776 Warszawa tel.: 0 22 4396166 fax: 0 22 4396455 e-mail: facsiht@ihi.waw.pl