METODOLOGIA I METODY STOSOWANE W FARMAKOGENETYCE I FARMAKOGENOMICE Mgr Małgorzata Semik Politechnika Rzeszowska
JAK SIĘ ZACZĘŁO? Sukcynylocholina lek stosowany pomocniczo w narkozach, zwiotcza mięśnie Okres jej działania wynosi tylko kilka minut, po czym jest rozkładana przez cholinoesterazę (esteraza cholinowa) U pewnej grupy ludzi sukcynylocholina wywołuje długotrwały, kilkugodzinny efekt blokady nerwowo-mięśniowej (zdarza się tylko raz na 3000 osób) W surowicy tych osób znajduje się enzym o nieprawidłowej funkcji (pseudoesteraza cholinowa) metabolizująca sukcynylocholinę, ale o znacznie mniejszym powinowactwie do sukcynylocholiny. Kodowana jest ona autosomalnym allelem recesywnym, a ludzie wrażliwi na sukcynylocholinę są homozygotami recesywnymi pod względem tego genu, Różna reakcja na lek ma podłoże genetyczne
ZMIENNOŚĆ ODPOWIEDZI NA LEK Zmienność odpowiedzi na lek ma dwa źródła: Zmienność u osób z tym samym, najczęstszym w populacji genotypem, taka zmienność jest zależna jest od: zewnętrznych czynników środowiskowych rożnego rodzaju czynników endogennych Zmienność wynikająca z różnego genotypu osobników populacji
DEFINICJE Termin FARMAKOGENETYKA (pharmacogenetics) został wprowadzony przez F. Vogela w 1959 i zdefiniowany jako badanie roli genetyki w odpowiedzi na leki FARMAKOGENETYKA bada genetycznie uwarunkowane różne reakcje organizmu na leki. Dwie dziedziny z pogranicza farmakologii i genetyki: FARMAKOGENETYKA FARMAKOGENOMIKA Badania farmakogenetyczne mają istotne znaczenie dla prowadzenia prawidłowej i bezpiecznej farmakoterapii. W tych badaniach ocenia się: skuteczność, bezpieczeństwo leków (działania niepożądane), a także interakcje lekowe.
FARMAKOGENETYKA I FARMAKOGENOMIKA FARMAKOGENOMIKA badanie genetycznego zróżnicowania cel wrażliwości na leki wpływ genotypu i fenotypu człowieka na działanie i losy leków w organizmie FARMAKOGENETYKA
FARMAKOGENETYKA Zajmuje się badaniem wpływu pojedynczego genu na odpowiedź organizmu na leki, Bada wpływ mutacji pojedynczego genu na odpowiedź na lek Bada więc zależność: GEN LEK REAKCJA ORGAZNIZMU Zmiany te dotyczące genu są niezależne od badanej tkanki i stanowią dziedziczną cechę danej osoby.
FARMAKOGENOMIKA Bada genetyczną zmienności odpowiedzi na lek która jest spowodowana zróżnicowaniem ekspresji wielu genów polimorfizm genów, Bada wpływ zmian w kilku genach na odpowiedź na lek Bada zależność: KILKA GENÓW LEK REAKCJA ORGANIZMU Zmiany dotyczą struktury całego genomu, farmakogenomika sumuje wszystkie zminny farmakogenetyczne. Obejmuje również badanie genomu w celu wykrycia nowych potencjalnych punktów uchwytu dla leków, działania leków
KIERUNKI BADAŃ FARMAKOGENETYCZNYCH Czynniki genetyczne decydujące o odpowiedzi na lek: zmienność genów kodujących enzymy metaboliczne zmienność genów kodujących receptory zmienność genów kodujących transportery i inne białka Dlatego też odpowiedź na lek może wynikać ze zmienności: FARMAKOKINETYKI FARMAKODYNAMIKI Odpowiedź organizmu na lek która wynika z tych zmienności może powodować: Brak odpowiedzi na lek Toksyczne działanie leku
ODMIENNOŚĆ FARMAKOGENETYCZNA ZMIENNOŚĆ FARMAKOKINETYKI ZMIENNOŚĆ FARMAKODYNAMIKI przez wpływ na WCHŁANIANIE DYSTRYBUCJE METABOLIZM WYDALANIE RECEPTORY KANAŁY JONOWE TRANSPORTERY NEUROPRZEKAŹNIKÓW
MOLEKULARNE MECHANIZMY POLIMORFIZMU Polimorfizm SNP (Single Nucleotid Polymorphism) mutacje dotyczące pojedynczego nukleotydu, zmiana pojedynczych nukleotydów w DNA na skutek insercji, delecji, substytucji. Mutacje dotyczące pojedynczego genu (np. delecje, podwojenie nukleotydów) Efekt mutacji punktowych to zmiana ekspresji genu = zmiana fenotypu białka POLIMORFIZM GENETYCZNY oznacza występowanie w populacji dwóch lub więcej alleli tego samego genu i jest efektem mutacji sekwencji DNA
ZMIENNOŚĆ FARMAKOKINETYCZNA Różne są skutki mutacji i wynikającego stąd polimorfizm genów dla działania leków. Najczęściej skutki te dotyczą metabolizmu leków POLIMORFIZM GENETYCZNY METABOLIZMU LEKÓW osobnicza zmienność genów kodujących enzymy metabolizmu leków
GRUPY FENOTYPOWE Stwierdzenie polimorfizmu w obrębie genów odpowiedzialnych za metabolizm leków pozwala na wyodrębnienie kilku fenotypów: PM (Poor Metabolizers) osoby z defektem enzymatycznym, źle lub słabo metabolizują niektóre leki objawy przedawkowania leku (leki niezmetabolizowane są wolniej wydalane) EM (Extensive Metabolizers) osoby szybko metabolizujące leki najczęściej brak efektu terapeutycznego IM osoby z jednym allelem zmutowanym, średni czas metabolizmu leków UM osoby bardzo szybko metabolizujące niektóre leki
POLIMORFIZM GENETYCZNY W METABOLIŹMIE Polimorfizm genetyczny różnorodnych enzymów biorących udział w metabolizmie leków, doprowadza do zmiany funkcji jak i liczby cząsteczek enzymu; Metabolizm wielu leków odbywa się głównie w wątrobie, w której zachodzą podstawowe reakcje biotransformacji leku - utlenianie i acetylacja. Stwierdzono, że proces acetylacji leków w wątrobie przebiega w różnym tempie. Odkrycie to poprzedziły obserwacje gruźlików, którym podawano przeciwbakteryjny lek - izoniazyd U niektórych chorych niezmetabolizowany lek dłużej utrzymywał się w surowicy krwi, pojawiły się objawy niepożądane, łączyły się z dużym stężeniem leku we krwi, Zauważono u nich zaburzenia neurologiczne (mrowienia, osłabienie rak i nóg). Pozostali pacjenci nie odczuwali takich dolegliwości. Badania wykazały istnienie dwóch dziedzicznych typów metabolizmu izoniazydu, tzw. wolnego i szybkiego. I były jednym z pierwszych zjawisk, które zadecydowały o powstaniu farmakogenomiki
POLIMORFIZM GENETYCZNY W METABOLIŹMIE Od tego czasu opisano wiele odmian enzymów których polimorfizm wiąże się z odmienną odpowiedzią na lek. enzymy i liczne izoenzymy cytochromu P450 (CYP) N-acetylotransferazy (NAT) S-transferazy glutationu metylotransferazy (TPMT, TMT, COMT) dehydrogenaza aldehydowa (ALDH), alkoholowa (ADH)
N-ACYLOTRANSFERAZA (NAT) Enzym N-acetylotransferaza wątrobowa, kodowana przez gen kodujący - NAT należy do enzymów wątrobowych odpowiada za procesy acetylacji w wątrobie Substratami dla tego enzymu są: izoniazyd, sulfonamidy, Zmienność w obrębie genu NAT jest przyczyna polimorfizmu obserwowanego w reakcji acetylacji różnego rodzaju substratów,
POLIMORFIZM NAT Polimorfizm w obrębie genów kodujących enzym N-acetylotransferazę wątrobową odpowiadającą za procesy acetylacji pozwolił na wyodrębnienie dwóch rodzajów fenotypów: SA (slow acelerators) WOLNI ACELERATORZY osoby u których acetylacja przebiega wolno, u osób z takim fenotypem częściej występują niepożądane skutki działania leków, standardowo zalecane dawki leków są dla nich zbyt duże, RA (rapid acelerators) SZYBCY ACELERATORZY osoby u których procesy acetylacji zachodzą bardzo szybko, standardowe dawki leków są zbyt małe, a przez to nieskuteczne Populacja rasy białej zawiera mniej więcej jednakową ilość osób wolno i szybko acetylujących
CYTOCHROM P - 450 Duża cześć leków jest metabolizowana przy użyciu cytochromu P-450, CYTOCHROM P-450 (CYP) enzym występujący powszechnie w niemal wszystkich tkankach, największą aktywność wykazując jednak w wątrobie i rdzeniu nadnerczy, Odpowiada głównie za reakcje oksydacji/redukcji licznych substancji (leków) Istnieje wiele typów cytochromu P-450 (izoenzymów), określanych jako różne rodziny CYP, kodowanych prze różne geny Do klasycznych należą: CYP 2C9 CYP 2D6 CYP 2C19 Mutacje w genach kodujących cytochromy powodować mogą wytwarzanie mniej aktywnych ich odmian co prowadzić może do osłabienia metabolizmu
POLIMORFIZM IZOENZYMU CYP 2D6 Najlepiej poznanym jest polimorfizm CYP 2D6. Izoenzym CYP 2D6 katalizuje oksydacje ponad 40 klinicznie ważnych leków (20%). Substratami dla tego izoenzymu są: -adrenolityki - -blokery adrenergiczne leki antyarytmiczne, leki przeciwdepresyjne, opioidy morfina i jej pochodne, kodeina, heroina neuroleptyki
POLIMORFIZM IZOENZYMU CYP 2D6 Konsekwencja upośledzonego utleniania leków spowodowana polimorfizmem CYP 2D6 jest różna, i jest zależna od fenotypu: u osób powoli metabolizujących (PM) - polimorfizmu CYP 2D6, powoduje wzrost toksyczności leku po podaniu nawet standardowej dawki, i do nasilenia działania leków a co się z tym wiążę i skutków ubocznych leki antyarytmiczne: propafenonu (skurcz oskrzeli), flekainidu (arytmie serca) leki β-adrenolityczne: metoprolol utrata kardioselektywnego działania, tymolol niepożądane działania na układ krążenia i oddechowy, sparteina (skurcze tężcowe macicy, odklejanie się łożyska, zwiększoną śmiertelność płodu) u osób szybko metabolizujących (EM) może dojść do utraty działania wielu leków, których metabolizm jest zależny od tego izoenzymu np. kodeiny
POLIMORFIZM IZOENZYMU CYP 2C9 Substratami dla tego izoenzymu są: leki przeciwzakrzepowe (pochodne warfaryny) leki pzreciwcukrzycowe (talbutamid) leki przeciwzapalne (ibuprofen) Konsekwencje kliniczne: u osób powoli metabolizujących (PM) - polimorfizmu CYP 2C9, powoduje nasilone działanie niepożądane tj. (krwawienia, hipoglikemia, czasem zmniejszoną skuteczność działania) konieczne jest zmniejszenie dawki leku u osób szybko metabolizujących (EM) utratę działania niektórych leków
POLIMORFIZM DEHYDROGENAZY ALKOHOLOWEJ (ADH) Polimorfizm genetyczny jest odpowiedzialny także za zmienność odpowiedzi na lek ze względu na populację, Najważniejszym narządem metabolizującym alkohol jest wątroba. Alkohol jest metabolizowany głównie przy udziale dwóch enzymów: dehydrogenazy alkoholowej (ADH), przekształca etanol w aldehyd octowy, (występuje w formie 5 izoenzymów najaktywniejsza jest forma B). dehydrogenezy aldehydowej (ALDH), przekształca aldehyd octowy w kwas octowy Dysfunkcja ALDH (całkowita lub częściowa), zmniejszenie aktywności spowodowana jest przez zastąpienia jednej cząsteczki kwasu glutaminowego cząsteczką lizyny) Prowadzi do zwiększonego poziomu aldehydu octowego, co powoduje upośledzony metabolizm alkoholu etylowego, aldehyd octowy kumuluje się we krwi i dochodzi do zatrucia alkoholowego organizmu. 85% Japończyków i Chińczyków posiada bardzo wysoką aktywność ADH, zaś 45-53% populacji Japonii i Chin pozbawionych jest aktywności ALDH
DEHYDROGENAZA GLUKOZO-6- FOSFORANOWA - G6PD Dehydrogenaza glukozo -6-fosforanowa (G6PD) jest kluczowym enzymem odpowiedzialnym za powstawanie NADPH, zasadniczego czynnika redukującego we wszystkich komórkach, Jest pierwszym enzymem szlaku pentozowego, gdzie odpowiada za przekształcanie NADP w NADPH, Prawidłowe krwinki czerwone maja zdolność utrzymywania takiego stężenia NADPH, które zapewni im właściwą obronę przed stresem oksydacyjnym, Do utrzymania prawidłowej struktury erytrocytu potrzebny jest zredukowany glutation GSH powstający w dalszej konsekwencji działania G6PD. Za syntezę enzymu odpowiedzialny jest gen zlokalizowany na chromosomie X.
POLIMORFIZM G6PD Polimorfizm w obrębie genów kodujących G6PD może doprowadzić do zahamowania syntezy enzymu. Niedobór G6PD prowadzi do hemolizy krwinek czerwonych, brak zredukowanego glutationu powoduje łatwą hemolizę erytrocytów W przypadkach niedoboru lub defektu G6PD i równoczesnym narażeniu na czynniki wywołujące (sulfonamidy, chloramfenikol), może wystąpić przedłużająca się żółtaczka noworodkowa albo niedokrwistość hemolityczna. FAWIZM genetycznie uwarunkowania, dziedziczna choroba związana z niedoborem enzymu G6PD Dotyczy ponad 200 milionów ludzi na świecie, (Polska zaliczana jest do krajów o niższej częstości (0.1%) występowania niedoboru G6PD u ludzi
GENETYCZNIE UWARUNKOWANE ZABURZENIE WCHŁANIANIA LEKÓW Genetycznie uwarunkowane zaburzenia wchłaniania leków mogą być przyczyną zwiększonej ekspresji genu MDR1 kodującego białko glikoproteina P (P- gp) GLIKOPROTEINA P (P-gp) jest jednym z ważnych białek uczestniczącym w transporcie leków przez błony, występuje w błonach komórek nabłonka jelit, nerek oraz wątroby, gdzie wpływa na absorpcję i eliminację leków, wiążąc ATP na zasadzie transportu aktywnego umożliwia usuwanie leków z wnętrza komórek, zapobiegając ich kumulacji występuje też w błonach komórek śródbłonka mózgu pokonuje barierę krew-mózg, gdzie może decydować o transporcie leków do OUN.
POLIMORFIZM GLIKOPROTEINY P - ga Leki będące substratami podlegającymi transportowi przez białko transportujące - P-glikoproteinę to: leki sercowo-naczyniowe (digoksyna, werapamil, chinidyna, talinolol, leki przeciwnowotworowe (winblastyna, aktynomycyna D), leki immunosupresyjne (cyklosporyna A) steroidy (aldosteron, hydrokortyzon), opioidy (morfina, metadon) leki przeciwgruźlicze wieli innych (erytromycyna, operamid, tamoksyfen) Mutacje w obrębie genu MDR1 prowadzą do zmiany funkcjonowanie P-ga w wielu komórkach, (także w limfocytach) i mogą zmieniać transport leków do ich wnętrza, W komórkach nowotworowych często występuje nadekspresja genu MDR1, w efekcie czego jest zbyt dużo P-ga, co stanowi przyczynę niepowodzeń terapii. Glikoproteina P jest dobrze poznanym białkiem, ze względu na jej rolę w zjawisku oporności wielolekowej - (MDR multidrug resistance)
ZMIENNOŚĆ FARMAKODYNAMICZNA Genetycznie uwarunkowane zmiany w zakresie farmakodynamiki dotyczą głownie: mutacji genów kodujących białka transportujące mutacji genów kontrolujących ekspresją kanałów jonowych mutacji genów kodujących receptory Najlepiej przebadano polimorfizm związany z astmą, depresją i arytmiami serca. Polimorfizm promotora genu kodującego białko transportujące serotoninę, zmniejsza ilość serotoniny w tkance mózgowej i determinuje reakcje organizmu na lek fluwoksaminę - lek przeciwdepresyjny Polimorfizm genu receptora 5-HT 2A serotoninowego, wpływa na zmianę konformacji tego receptora, zmniejsza jego ekspresję, co zmniejsza z kolei odpowiedź na lek - klozapinę,
POLIMORFIZM RECEPTORÓW Mutacja punktowa genu ADRB2, kodującego receptor β 2 adrenergiczny (polega na zamianie Arg16 w Gly16), powoduje powstanie u homozygot receptora o zmienionej strukturze. Zmieniony receptor adrenergiczny słabiej reaguje na leki adrenergiczne np. salbutamol stosowany w leczeniu astmy Inny polimorfizm prowadzi do zaburzeń podczas translacji i w konsekwencji do jego zmniejszonej ekspresji (mniejsza liczba cząsteczek), i zmniejszonej reakcji. Równoczesna obecność obu mutacji znacznie utrudnia terapeutyczne rozszerzanie oskrzeli.
BADANIE PROFILU FARMAKOGENETYCZNEGO DZIEDZICZNIE ZDETERMINOWANE OSOBNICZE RÓZNICE W DZIAŁANIU LEKÓW MOGĄ BYĆ ROZPOZNAWANE NA PODSTAWIE BADANIE AKTUALNEJ AKTYWNOŚCI ORGANIZMU BADANIE ZAPISANEJ W DNA PREDYSPOZYCJI ORGANIZMU OCENA FENOTYPU OCENA GENOTYPU
OZNACZANIE FENOTYPU W celu oznaczenia fenotypu pacjenta należy wyznaczyć współczynnik metaboliczny: WSPÓŁCZYNNIK METABOLICZNY (Metabolic Ratio-MR) ilość wydalonej z moczem substancji macierzystej ilość wydalonych z moczem metabolitów Substancje modelowe (substraty) izoniazyd, sparteiny, debrizochiny czy sulfadimidyny
OZNACZANIE GENOTYPU W oznaczaniu genotypu stosuje się różnorodne metody biologii molekularnej: sekwencjonowanie DNA metodę polimerazowej reakcji łańcuchowej (Polymerase Chain Reaction - PCR) metodą analizy polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych (Restriction Fragment Length Polymorphism RFLP) nowoczesna metoda genotypowania chipy genowe (matryce genowe)
IZOLACJA DNA Izolacja całkowitego DNA jest zasadniczym etapem wielu eksperymentów biologii molekularnej, takich jak PCR, hybrydyzacja, RFLP. Izolacja DNA obejmuje następujące etapy. Fizyczne zniszczenie struktury tkankowej i komórkowej materiału biologicznego, tzw. homogenizacja. Uwolnienie DNA - DNA chroniony jest w komórce w różnych błonowych strukturach subkomórkowych, takich jak np.: jądro, mitochondria. W celu degradacji błon komórkowych i białek, do buforów ekstrakcyjnych dodawane są różne detergenty, Usunięcie zdegradowanych elementów komórkowych. Oddzielenie DNA od związków użytych na wcześniejszych etapach izolacji, (detergentów, soli). Przygotowanie DNA do przechowywania.
SEKWENCJONOWANIE DNA Do określenia sekwencji nukleotydów w DNA opracowano dwie zasadnicze metody: metodę chemiczną (metoda Maxama Gilberta), wykorzystująca specyficzną, chemiczną degradację DNA. metodę opartą na terminacji syntezy łańcuchów (metoda dideoksy Sangera) Obecnie najczęściej stosowana jest metoda Sangera, ze względu na jej prostotę. Znaczny postęp osiągnięto poprzez wprowadzenie automatycznych aparatów do sekwencjonowania, których funkcjonowanie oparte jest na fluorescencji wzbudzonej laserem.
METODA SANGERA (ang, chain-termination method, Sanger method) polega na kopiowaniu badanej cząsteczki DNA w warunkach in vitro, enzym katalizujący polimeraza DNA. Przebieg reakcji można podzielić na pięć etapów: Preparatywny PCR otrzymanie homogennego DNA Denaturacja otrzymanie jednoniciowej matrycy Synteza nowych nici z użyciem dntp i ddntp oraz primera Elektroforeza na żelu poliakrylamidowym ze stałym stężeniem środka denaturującego Analiza prążków.
REAKCJA PCR Reakcja łańcuchowa polimerazy, PCR (ang. Polymerase Chain Reaction) łańcuchowa reakcja polimerazy, metoda powielania łańcuchów DNA w warunkach laboratoryjnych, umożliwia uzyskanie niezwykle dużej liczby kopii danej sekwencji DNA. PCR ma ogromne znaczenie dla biologii molekularnej oraz ma zastosowanie w takich dziedzinach jak: klonowanie DNA, sekwencjonowanie, diagnostyka medyczna. PCR jest obecnie bezcenną metodą, umożliwiającą charakterystykę próbek DNA, ważnych ze względów medycznych np. w testowych badaniach genetycznych schorzeń człowieka, gdzie szybko wypiera metodę RFLP.
REAKCJA PCR SKŁAD MIESZANINYREAKCYJNEJ: -matryca DNA -polimeraza termostabilna - para specyficznych starterów (primers), krótkie fragmenty DNA komplementarne do fragmentów matrycy -trójfosforany deoksyrybonukleotydów (dntp) -bufor (zawierający Mg2+) -H2O
REAKCJA PCR ETAPY CYKLU PCR 1. DENATURACJA podwójnej nici DNA - 92-94 o C 2. PRZYŁĄCZANIE STARTERÓW ~ 60 o C 3. ELONGACJA - 72 o C Obecnie istnieje wiele modyfikacji metody PCR
ANALIZA RLFP RFLP (ang. Restriction Fragments Length Polymorphism polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych). Technika służy do wykrywa różnic pomiędzy rozmiarami fragmentów DNA pociętych restryktazami. Różnice długości fragmentów DNA powstają w wyniku mutacji, Sekwencje polimorficzne RFLP, które wykrywa się tą metodą, są używane jako znaczniki zarówno w mapach fizycznych jak i genetycznych. RFLP jest kluczowym narzędziem w rozpoznawaniu DNA, określaniu obecności różnych alleli u osobników.
CHIPY DNA (MIKROMACIERZ) Płytka szklana lub plastikowa z naniesionymi w regularnych pozycjach mikroskopowej wielkości polami, zawierającymi różniące się od siebie sekwencją fragmenty DNA. Fragmenty te są sondami, które wykrywają przez hybrydyzację komplementarne do siebie cząsteczki DNA lub RNA. Różnego typu mikromacierze mają wiele zastosowań, z których najczęstsze to badanie ekspresji genów. Dzięki miniaturyzacji możliwe jest jednoczesne badanie wielu genów w próbce. na powierzchni kilku cm 2, w mikrometrowych odstępach, umieszczone są sondy pozwalające badać ekspresję nawet kilkudziesięciu tysięcy sekwencji jednocześnie.
FARMAKOGENETYKA a FARMAKOGENOMIKA FARMAKOGENETYKA wychodzi od nietypowej reakcji na lek, aby przez badanie fenotypu dotrzeć do odpowiedzialnej za tę reakcję mutacji genu. FARMAKOGENOMIKA jest próbą odwrócenia podejścia do problemu odmienności osobniczych. Wychodzi od odkrytych wielu różnic genetycznych, takich jak liczne SNP, aby poprzez analizę DNA, RNA (transkryptomika) i powstającego białka (proteomika) dotrzeć do osobniczych reakcji będących sumą tych wszystkich czynników.
ZASTOSOWANIE KLINICZNE FARMAKOGENETYKI I FARMAKOGENOMIKI WYKORZYSTANIE TESTÓW FARMAKOGENETYCZNYCH W CELU ZWIEKSZENIA SKUTECZNOŚCI I BEZPIECZEŃSTWA FARMAKOTERAPII W BADANIACH NAD NOWYMI LEKAMI
DZIĘKUJĘ ZA UWAGĘ