PRACA ORYGINALNA Original Article Acta Haematologica Polonica 2007, 38, Nr 4, str. 457 462 DONATA URBANIAK-KUJDA 1,2, KATARZYNA KAPELKO-SŁOWIK 1, DARIUSZ WOŁOWIEC, 1 IWONA PRAJS 1, JAROSŁAW DYBKO 1, MAREK KIEŁBIŃSKI 1 STANISŁAW POTOCZEK 1, KAZIMIERZ KULICZKOWSKI 1 Ekspresja receptorów NKG2A i NKG2D w subpopulacji limfocytów T u chorych na indolentne chłoniaki złośliwe nieziarnicze Expression of NKG2A and NKG2D receptors on lymphocytes T in patients with indolent non-hodgkin lymphomas 1 Z Katedry i Kliniki Hematologii, Nowotworów Krwi i Transplantacji Szpiku A.M. we Wrocławiu Kierownik: Prof. dr hab. med. Kazimierz Kuliczkowski 2 Z WyŜszej Szkoły Fizjoterapii we Wrocławiu Kierownik: Dr Andrzej Czamara STRESZCZENIE Komórki NK-CTLs (Natural-killer-cytotoxic T lymphocytes) stanowią frakcję cytotoksycznych limfocytów CD8 + krwi obwodowej, których aktywność moŝe być skierowana przeciwko komórkom zainfekowanym wirusem lub stransformowanym nowotworowo. Ich funkcja cytotoksyczna jest modulowana poprzez receptory aktywujące lub hamujące obecne na ich powierzchni. Do receptorów aktywujących zalicza się NKG2D, do hamujących zaś NKG2A. Nie jest znana rola cząsteczek NKG2D i NKG2A obecnych na limfocytach T CD8+ w regulacji odpowiedzi przeciwnowotworowej u chorych na nieziarnicze chłoniaki złośliwe. Celem badań była ocena ekspresji cząsteczki NKG2A i NKG2D komórek NK na limfocytach T CD8 + krwi obwodowej pacjentów chorych na indolentne chłoniaki złośliwe nieziarnicze, uprzednio nie leczonych oraz w fazie oporności na leczenie cytostatyczne. Badaniami objęto 27 pacjentów 17 kobiet i 10 męŝczyzn w wieku od 19 do 70 lat oraz 10 osób zdrowych. Średni odsetek limfocytów CD8 + wykazujących ekspresję NKG2A był istotnie wyŝszy w grupie pacjentów z chłoniakiem nieziarniczym opornym na leczenie, w porównaniu z chorymi badanymi w chwili rozpoznania oraz z grupą kontrolną (p=0,002, p=0,001), nie wykazano natomiast róŝnic pomiędzy grupą pacjentów nie leczonych oraz osobami zdrowymi. Średni odsetek komórek CD8 + wykazujących ekspresję NKG2D był istotnie wyŝszy w grupie chorych badanych w chwili rozpoznania niŝ w grupie kontrolnej (p=0,003). Wykazane zwiększenie ekspresji receptora NKG2A w zaawansowanych chłoniakach złośliwych indolentnych moŝe być przedmiotem celowanej immunoterapii dla wzmocnienia efektu leczniczego podawanej chemioterapii. SŁOWA KLUCZOWE: Receptor NKG2A Receptor NKG2D Limfocyty T Chłoniak złośliwy nieziarniczy indolentny SUMMARY NK-CTLs cells (Natural killer-cytotoxic T lymphocytes) are a subset of cytotoxic CD8+ lymphocytes. The main targets of their activity are virus infected or tumor cells. This cytotoxic activity can be regulated by specific expression of stimulatory surface receptors NKG2D and inhibitory ones NKG2A. The role of the expression and activity of those receptors in antitumor re-
458 D. URBANIAK-KUJDA i wsp. sponse in lymphoid malignancies remains unclear. We undertook then the study of the significance of the expression of molecules NKG2D and NKG2A on CD8 + lymphocytes in patients with indolent lymphomas: untreated and chemiotherapy resistant. Twenty-seven patients: 17 females and 10 males, aged 19-70 years and 10 healthy controls were enrolled in the study. Mean percentage of CD8 + lymphocytes displaying NKG2A expression was significantly higher in patients with resistant lymphomas as compared to untreated patients and controls (p=0,002, p=0,001, respectively). No difference of NKG2A expression between untreated patients and controls was found. Mean percentage of CD8 + cells with NKG2D expression was significantly higher in untreated patients than in controls (p=0,003). Overexpression of NKG2A receptor found in patients with indolent lymphomas could be potently the aim for specific immunotherapy. KEY WORDS: NKG2A receptor NKG2D receptor Lymphocytes T Indolent non-hodgkin lymphoma WSTĘP Aktywacja limfocytów krwi obwodowej moŝe być modyfikowana za pośrednictwem ekspresji występujących na ich powierzchni cząsteczek przekazujących sygnał. Przykładowo, aktywacja lub zahamowanie limfocytów T zachodzi w zaleŝności od ekspresji cząsteczek powierzchniowych CD28 lub CD152, modulowanych pod wpływem kontaktu z wirusem, cytokinami zapalnymi lub komórkami nowotworowymi (1, 2). W odpowiedzi przeciwnowotworowej istotną rolę odgrywają komórki NK (natural killer) posiadające właściwości cytotoksyczne. Ich funkcja jest zaleŝna od reakcji odpowiednich ligandów z obecnymi na ich powierzchni dwoma typami receptorów: aktywujących i hamujących. Do receptorów aktywujących naleŝy m.in. NKG2D, którego ekspresję stwierdzano równieŝ na limfocytach CD8 +. Ligandami dla tego receptora są cząsteczki MHC klasy I (2, 3). Receptorem hamującym jest NKG2A, obecny na aktywowanych limfocytach pamięci CD45RO/CD8 +. NKG2A jest heterodimerem sprzęŝonym z antygenem CD94 o działaniu hamującym aktywność cytotoksyczną limfocytów i komórek NK. Zwiększenie ekspresji CD94/NKG2A obserwowano u zwierząt w przebiegu niektórych infekcji bakteryjnych i wirusowych (4). Stwierdzono teŝ, Ŝe limfocyty CD8 + krwi obwodowej oraz obecne w nacieku czerniaka pod wpływem IL-12 wykazują zwiększoną ekspresję NKG2A. Podobny wpływ na zwiększenie ekspresji NKG2A wykazywały takŝe TGF beta (transforming growth factor, transformujący czynnik wzrostu) i IL-15 (5, 6). Zaobserwowano równieŝ, Ŝe znaczny odsetek limfocytów T CD8 + naciekających tkankę nowotworową czerniaka i gwiaździaka wykazywał wysoką ekspresję receptora CD94/NKG2A, a jego zablokowanie za pomocą przeciwciał monoklonalnych przywracało ich przeciwnowotworową aktywność cytotoksyczną (7). Badania nad rolą cząsteczek NKG2 w odpowiedzi przeciwnowotworowej w rozrostach hematologicznych były prowadzone głównie w szpiczaku mnogim. W szczególności wykazano, Ŝe zablokowanie receptora NKG2D prowadziło do zmniejszenia zdolności rozpoznawania plazmocytów szpiczakowych przez komórki NK (8). Nie jest natomiast znana rola cząsteczek NKG2D i NKG2A obecnych na limfocytach T CD8 + w regulacji odpowiedzi przeciwnowotworowej u chorych na nieziarnicze chłoniaki złośliwe. Dlatego teŝ celem przedstawionych badań była ocena ekspre-
Ekspresja receptorów NKG2A I NKG2D 459 sji cząsteczki hamującej CD94/NKG2A i cząsteczki stymulującej NKG2D komórek NK na limfocytach T CD8 + krwi obwodowej pacjentów chorych na chłoniaki złośliwe nieziarnicze indolentne w chwili rozpoznania oraz przy stwierdzeniu oporności na leczenie cytostatyczne. MATERIAŁ I METODY Pacjenci: Badaniami objęto 27 pacjentów: 17 kobiet i 10 męŝczyzn w wieku od 19 do 70 lat, (mediana 58 lat) chorych na chłoniaka złośliwego indolentnego (7 pacjentów z chłoniakiem immunocytowym, 6- z małych komórek B i 14 z chłoniakiem grudkowym). U 12 pacjentów rozpoznano III, a u 15 - IV stadium zaawansowania choroby wg klasyfikacji Ann Arbor. U 14 chorych (6 w stadium III, 8 w stadium IV) badanie wykonano w chwili rozpoznania, u pozostałych 13 natomiast (6 w stadium III, 7 w stadium IV) po stwierdzeniu oporności na leczenie cytostatyczne za pomocą dwóch linii chemioterapii. Średni poziom hemoglobiny wynosił 11.5 g/dl (9.8g/dl do 13.2g/dl), liczba leukocytów 8.5 G/l (5.0 G/l do 11.0G/l), płytek krwi 155.0 G/l (180.0 G/l do 300.0G/l), surowicza aktywność LDH wynosiła 551 U/l (350 U/l do 750 U/l). Grupę kontrolną stanowiło 10 zdrowych osób, wiekiem i płcią odpowiadającym grupie badanej. METODY Badania przeprowadzono na limfocytach krwi obwodowej uzyskanych od chorych w celu przeprowadzenia rutynowych badań diagnostycznych. Po przeprowadzeniu lizy erytrocytów w środowisku zawierającym chlorek amonu komórki jądrzaste krwi obwodowej były znakowane przeciwciałami anty-cd8 sprzęŝonymi z izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC) (DAKO Cytomation, Dania), anty-cd94/nkg2a sprzęŝonymi z fikoerytryną (PE) (Becton Dickinson, USA) lub anty-nkg2d sprzęŝonymi z PE (Beckman Coulter, Francja). Znakowanie komórek wykonywano za pomocą zestawów przeciwciał: anty-cd8-fitc/anty-cd94-pe oraz anty-cd8-fitc/anty-nkg2d-pe. Kontrolami izotopowymi były barwienia zestawami przeciwciał anty-cd8- FITC/IgG1-PE oraz anty-cd8-fitc/igg2b-pe. Analizę cytofluorometryczną tak znakowanych komórek wykonywano z uŝyciem cytometru przepływowego Daco-Galaxy (Partec, Niemcy) wyposaŝonym w laser argonowy o mocy 20 mw i program do akwizycji/analizy danych FloMax 2,4b. KaŜdorazowo analizie poddawano 20000 komórek i oceniano odsetek komórek CD8 + wykazujących ekspresję badanych receptorów (NKG2A lub NKG2D) w stosunku do całej populacji limfocytów CD8 +. Analizę statystyczną wyników przeprowadzono przy pomocy testu U Manna Whitney`a. WYNIKI Odsetek limfocytów CD8 + wykazujących ekspresję CD94/NKG2A był istotnie wyŝszy w grupie pacjentów z chłoniakiem złośliwym nieziarniczym opornym na le-
460 D. URBANIAK-KUJDA i wsp. czenie cytostatyczne w porównaniu z chorymi na chłoniaka badanymi w chwili rozpoznania (p= 0,002) oraz z grupą kontrolną (p= 0,001). Nie wykazano natomiast róŝnic w tym zakresie pomiędzy grupą pacjentów przed leczeniem a osobami zdrowymi. Odsetek komórek CD8 + wykazujących ekspresję NKG2D był istotnie wyŝszy w grupie Tabela 1. Odsetek limfocytów CD8 + z ekspresją NKG2A i NKG2D w grupach badanych i w grupie kontrolnej Table 1. Percentage of CD8 + lymphocytes displaying NKG2A and NKG2D expression in patients and in controls Grupa I (n=14) Grupa II (n=16) Grupa kontrolna (III) (n=10) NKG2A 4.24±2.12 11.97±2.90 4.65±1.17 II vs I = 0.002 II vs III= 0.001 NKG2D 22.45±9.92 15.99±12.13 12.25±6.03 I vs III = 0.003 Grupa I: pacjenci ze świeŝo rozpoznanym chłoniakiem badani w chwili rozpoznania, grupa II: pacjenci z chłoniakiem nieziarniczym opornym na leczenie, grupa III grupa kontrolna. Podano wartość średnią i odchylenie standardowe. Group I patients with newly diagnosed lymphoma, group II patients with resistant lymphoma, group III controls. Mean value and standard deviation are indicated. p 25 p=0,003 Odsetek komórek pozytywnych 20 15 10 5 p=0,002 p=0,001 0 NKG2A NKG2D Grupa I Grupa II Kontrola Ryc. 1. Porównanie ekspresji NKG2A i NKG2D w populacji CD8+ grup badanych (I i II) i grupy kontrolnej (III) Grupa I pacjenci ze świeŝo rozpoznanym chłoniakiem nieziarniczym; Grupa II pacjenci z chłoniakiem nieziarniczym opornym na leczenie; Grupa III grupa kontrolna osób zdrowych Fig. 1. Comparison of NKG2A and NKG2D expression in CD8 + population of patients groups (I and II) and controls (III) Group I patients with newly diagnosed Non-Hodgkin Lymphoma; Group II patients with resistant Non-Hodgkin Lymphoma; Group III healthy subjects
Ekspresja receptorów NKG2A I NKG2D 461 chorych badanych w chwili rozpoznania niŝ w grupie kontrolnej (p=0,003). U tych chorych ekspresja NKG2D na limfocytach CD8 + była równieŝ wyŝsza w stosunku do pacjentów opornych na leczenie cytostatyczne, lecz róŝnica nie osiągnęła progu istotności statystycznej (p=0,061). Ekspresja omawianej cząsteczki była natomiast podobna u chorych po nieskutecznym leczeniu przeciwnowotworowym i w grupie kontrolnej. Nie wykazano zaleŝności pomiędzy ekspresją cząsteczek NKG2A i NKG2D a wiekiem chorych, podstawowymi parametrami hematologicznymi, typem histopatologicznym chłoniaka, stopniem zaawansowania choroby ani aktywnością LDH. Wyniki przedstawiono w Tabeli 1 i na Rycinie 1. OMÓWIENIE Istotną rolę w odpowiedzi gospodarza przeciwko komórkom nowotworowym odgrywa aktywność limfocytów T cytotoksycznych i komórek NK. Ta aktywność zaleŝy z kolei od ekspresji receptorów pobudzających czynność tych komórek, w tym NKG2D, oraz receptorów hamujących, do których naleŝy NKG2A. Receptor NKG2D ma zdolność wiązania się z adaptacyjnymi cząsteczkami DAP-10, DAP-12 obecnymi w limfocytach T i działa jako kostymulator ich funkcji (9, 10, 11, 12). Wykazano, Ŝe w niektórych nowotworach narządowych, np. raku płuca i jelita grubego dochodzi do osłabienia ekspresji receptora NKG2D na powierzchni komórek nowotworowych, co z kolei prowadzi do zmniejszenia odpowiedzi immunologicznej gospodarza na ich antygeny (5,13). Receptor NKG2A z kolei wykazuje działanie hamujące aktywność cytotoksyczną limfocytów T i komórek NK. Zwiększenie jego ekspresji obserwowano w niektórych infekcjach bakteryjnych i wirusowych u zwierząt oraz na limfocytach ludzkich CD8 + obecnych w nacieku czerniaka złośliwego i gwiaździaka, a zablokowanie tego receptora specyficznym przeciwciałem przywracało przeciwnowotworową aktywność cytotoksyczną własnych limfocytów (7). Pomimo licznych badań wykazujących zaburzenia odporności zaleŝne od zmienionej ekspresji receptorów rodziny NKG2 w chorobach nowotworowych, niewiele prac poświęcono temu zagadnieniu w rozrostach hematologicznych. Jak wspomniano wy- Ŝej, zaburzenia odporności zaleŝne od receptora NKG2D wykazano w szpiczaku mnogim, nie wiadomo jednak, jakie jest miejsce nieprawidłowej regulacji ich ekspresji i/lub aktywności w innych chłoniakach złośliwych nieziarniczych (8,11). Dlatego teŝ celem przedstawionych badań była ocena ekspresji receptora hamującego NKG2A i pobudzającego NKG2D na limfocytach T CD8 + chorych na indolentne chłoniaki złośliwe przy rozpoznaniu oraz w fazie choroby zaawansowanej i opornej na leczenie cytostatyczne. Wykazaliśmy, Ŝe u pacjentów z zaawansowaną chorobą ekspresja receptorów hamujących NKG2A jest istotnie wyŝsza w stosunku do osób zdrowych jak równieŝ, choć statystycznie niezmiennie, w porównaniu z grupą chorych badanych w chwili rozpoznania. PoniewaŜ nie zaobserwowaliśmy róŝnic pomiędzy pacjentami przed leczeniem a osobami zdrowymi wydaje się moŝliwe, Ŝe omawiane cząsteczki odgrywają istotną chorobę w progresji choroby i nabyciu oporności na leczenie cytostatyczne. Z kolei ekspresja cząsteczki stymulującej NKG2D była najwyŝsza u chorych
462 D. URBANIAK-KUJDA i wsp. na chłoniaka w chwili rozpoznania, natomiast u pacjentów z chorobą zaawansowaną wykazywała poziom porównywalny z osobami zdrowymi. Niniejsze obserwacje wymagają potwierdzenia badaniami na większej grupie chorych i uwzględniającymi czynnościową ocenę limfocytów T i komórek NK. Pozwalają one jednak na sformułowanie hipotezy, Ŝe rozwój chłoniaka uruchamia mechanizmy obrony immunologicznej angaŝujące cząsteczki NKG2D, w związku z czym ich ekspresja na limfocytach T cytotoksycznych się zwiększa. W miarę postępu choroby ten mechanizm obronny ulega wyczerpaniu co, przy równoczesnym zwiększeniu ekspresji cząsteczek hamujących aktywność limfocytów T i komórek NK, prowadzi do progresji chłoniaka i jego oporności na leczenie cytostatyczne. Ponadto, wykazane w naszych badaniach zwiększenie ekspresji receptora NKG2A w zaawansowanych chłoniakach moŝe być przedmiotem celowanej immunoterapii dla wzmocnienia efektu leczniczego podawanej chemioterapii. PIŚMIENNICTWO 1. Labonte M., Letvin M. Variable NKG2 expression in the peripheral blood lymphocytes of rhesus monkeys. Clin Exp Immunol 2004;138: 205-212. 2. Moser J., Gibs J., Jensen PE., Lukacher AE. CD94/NKG2A receptors regulate antiviral CD8+ T cells responses. Nature Immunol 2002; 3: 189-195. 3. Moretta L., Romagnani C., Pietra G., Moretta A., Mingari MC. NK CTLs novel HLA-E restricted T cell subset. Trends Immunol 2003; 24:136-143. 4. Braud V., Aldemir H., Breart B., Ferlin WG. Expression of CD94/NKG2A inhibitory receptor is restricted to a subset CD8+ T cells. Trends Immunol 2003; 2: 162-165. 5. Lee JC., Lee KM., Kim DW., Heo DS. Elevated TGF β1 secretion and down-modulation of NKG2D underlies impaired NK cytotoxicity in cancer patients. J Immunol 2004; 172: 7335-7340. 6. Derre L., Corvaisier M., Pandolfino MC.,Diez E., Jotereau F., Gervois N. Expression of CD94/NKG2-A oh human T lymphocytes is induced by IL-12: Implications for adoptive immunotherapy. J Immunol 2002; 168: 4864-4870. 7. Lukacher A.: IFN- gamma suspends the killing license of anti-tumor CTLs. J Clin Investig 2002; 110: 1407-1409. 8. Carbone E., Neri P., Mesuraca M i wsp. HLA class I, NKG2D, and natural cytotoxicity receptors regulate multiple myeloma cell recognition by natural killer cells. Blood 2005; 105: 251-258. 9. Jabri B., Selby J., Negulescu H. i wsp. TCR specificity dictates CD94/NKG2A expression by human CTL. Immunity 2002; 17: 487-499. 10. Costello RT., Fauriat C., Sivori S., Marcenaro E., Olive D. NK cells: innate immunity against hematological malignancies. Trends Immunol 2004; 25: 328-333. 11. Lanier LL. Natural killer cell receptor signaling. Curr Opin Immunol 2003;15: 308-314. 12. Bottino C, Castriconi R, Moretta L, Moretta A. Cellular ligands of activating NK receptors. Trends Immunol 2005; 26: 221-225. 13. Speiser DE, Pittet MJ., Valmori D. i wsp. In vivo expression of NK cell inhibitory receptors by human melanoma specific cytolitic T lymphocytes. J Exp Med 1999; 190: 775-782. Praca wpłynęła do Redakcji 12.10.2007 r. i została zakwalifikowana do druku 19.11.2007 r. Adres Autora Dr n.med. Donata Urbaniak-Kujda Katedra i Klinika Hematologii Nowotworów Krwi i Transplantacji Szpiku A. M. we Wrocławiu 50-367 Wrocław, ul. Pasteura 4