Zastosowanie metody MLVA do genotypowania Corynebacterium diphtheriae. Badania wstępne 1

MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2011, 63: 209-218 Aleksandra A. Zasada, Marek Jagielski,Magdalena Rzeczkowska, Aleksandra Januszkiewicz Zastosowanie metody MLVA do genotypowania Corynebacterium diphtheriae. Badania wstępne 1 Zakład Bakteriologii NIZP-PZH w Warszawie Kierownik: prof. dr hab. M. Jagielski Poddano analizie sekwencję nukleotydów w genomie szczepu NCTC 13129 C. diphtheriae w celu zidentyfikowania sekwencji powtórzonych (VNTR). Spośród 75 zidentyfikowanych potencjalnych loci VNTR wybrano 14, dla których zaprojektowano oligonukleotydy starterowe i dobrano warunki reakcji amplifikacji PCR. Wstępne badania przydatności wybranych loci VNTR do genotypowania C. diphtheriae przeprowadzono na grupie 28 szczepów. Za potencjalnie przydatne do różnicowania uznano 8 loci. Uzyskane zróżnicowanie w obrębie każdego z markerów wahało się od 1 do 6 alleli (indeks Simpsona od 0 do 0,746). Indeks zróżnicowania Simpsona dla całego panelu markerów badanego na 28 szczepach wyniósł 0,87. Toksynotwórcze szczepy Corynebacterium diphtheriae (maczugowca błonicy) stanowią czynnik etiologiczny błonicy poważnej, potencjalnie śmiertelnej choroby zakaźnej. Drobnoustroje zwykle kolonizują górne drogi oddechowe tworząc pseudobłony, a wytwarzana przez nie toksyna przenika do układu krwionośnego i powoduje m. in. uszkodzenie włókien mięśnia sercowego, demielinizację komórek układu nerwowego oraz lokalne zmiany martwicze. Drobnoustroje są przenoszone z człowieka na człowieka przez bezpośredni kontakt oraz drogą kropelkową. Istnieją doniesienia, iż nosicielami szczepów C. diphtheriae mogą być również zwierzęta m. in. konie i koty (9, 10, 12). Na skutek powszechnych szczepień szczepionką zawierającą toksoid błoniczy relatywnie wzrosła częstość izolacji nietoksynotwórczych szczepów C. diphtheriae w stosunku do szczepów toksynotwórczych. Szczepy nietoksynotwórcze mogą powodować infekcje skóry, septyczne zapalenie stawów, ropnie, sepsę oraz zapalenie wsierdzia (5, 20, 21). Ostatnie odnotowane przypadki błonicy na terenie Polski wystąpiły w 1996 roku 9 przypadków oraz w 2000 roku jeden przypadek. Tym niemniej ryzyko wystąpienia tej choroby wciąż istnieje. W 2007 roku 4190, a w 2008 7088 przypadków błonicy zostało zgłoszonych do Światowej Organizacji Zdrowia (WHO) (6, 19). Na terenie Unii Europejskiej w 2008 roku odnotowano 47 przypadków błonicy: 29 na Łotwie, 6 w Wielkiej Brytanii, 5 1 Badania finansowane przez grant nr 4/4/VIII/2009 Naukowej Fundacji Polpharmy

210 A.A. Zasada i inni Nr 3 we Francji, 2 na Litwie i 1 w Szwecji (6). Za endemiczne tereny tej choroby uznaje się m.in. Egipt, Brazylię, Republikę Dominikany, Haiti, Afganistan, Chiny, Indie, Indonezję, Nepal, Filipiny, Tajlandię, Wietnam, Iran, Irak, Turcję, Rosję i kraje byłego Związku Radzieckiego (3). Ponadto w ostatnich latach w wielu krajach, w tym również w Polsce, jest coraz więcej odnotowywanych inwazyjnych zakażeń powodowanych przez nietoksynotwórcze szczepy C. diphtheriae (5, 8, 16, 18, 21). Multiple-Locus Variable-Number Tandem Repeat Analysis (MLVA) jest stosunkowo nową metodą molekularnego typowania mikroorganizmów, której przydatność w badaniach epidemiologicznych w mikrobiologii medycznej została wielokrotnie potwierdzona. Metodę tę z powodzeniem zastosowano do typowania wielu drobnoustrojów patogennych dla człowieka, m. in. Bacillus anthracis, Yersinia pestis, Francisella tularensis, Staphylococcus aureus, Enterococcus faecium, Bordetella pertussis, Haemophilus influenzae, Salmonella enterica, Salmonella Typhi, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium leprae (13, 17). Metoda MLVA opiera się na zmianach zachodzących w sekwencji powtórzeń nukleotydowych, które podlegają dużej zmienności na skutek ślizgania się polimerazy lub rekombinacji, czego skutkiem są zmiany w długości fragmentów DNA zawierających powtórzenia. Mechanizm ten jest również wykorzystywany przez wiele mikroorganizmów do szybkiej zmienności fenotypowej, jak na przykład różne mechanizmy regulacji ekspresji genów czy zmiany w powstającym transkrypcie na skutek przesunięcia ramki odczytu. Przykładem może tu być regulacja ekspresji genów biosyntezy lipooligosacharydu u Haemophilus influenzae. Wyżej opisane zmiany zachodzące w genomach drobnoustrojów często prowadzą do zmienności antygenowej, dzięki czemu patogen nie jest rozpoznawany przez układ immunologiczny gospodarza (13). VNTRs (variable number tandem repeats) występują często również w genach wirulencji, jak np. geny kodujące hemolizyny, co może mieć bezpośredni wpływ na zjadliwość szczepów oraz ich zmienność ewolucyjną (17). W niniejszej pracy podjęto próbę wykorzystania metody MLVA do genotypowania szczepów C. diphtheriae. MATERIAŁ I METODY Szczepy bakteryjne. Użyte w badaniach szczepy bakteryjne przedstawiono w tabeli I wraz z informacją o czasie izolacji oraz materiale klinicznym, z którego zostały wyizolowane. Szczepy były przechowywane w głębokim zamrożeniu (temp. -65⁰C), co zapewnia stabilność genomu. Szczepy ożywiano wysiewając na podłoże agarowe z krwią baranią. Izolacja DNA. Z badanych szczepów izolowano DNA stosując zestaw DNeazy Tissue Kit (Qiagen) zgodnie z procedurą dla bakterii Gram-dodatnich załączoną przez producenta zestawu. Dobór markerów VNTR. Fragmenty DNA zawierające tandemowe powtórzenia zostały zidentyfikowane przy użyciu programu Tandem Repeats Finder Version 4.00 (1) w genomie szczepu C. diphtheriae NCTC 13129, którego całkowita sekwencja nukleotydowa jest dostępna w GenBank (accession no. BX248353) (4). Amplifikacja wybranych markerów VNTR metodą PCR. Zaprojektowane startery do amplifikacji wybranych markerów VNTR zostały przedstawione w tabeli II. PCR prowadzono w objętości 25 µl. Mieszanina reakcyjna zawierała 200 µm każdego z dntp,

Nr 3 Genotypowanie C. diphteriae 211 Tabela I. Szczepy C. diphtheriae użyte w prezentowanych badaniach. Oznaczenie Rok Wytwarzanie biotyp Rejon szczepu izolacji toksyny Materiał kliniczny 23/E gravis 2008 Warszawa - Wymaz z rany 22/E gravis 2008 Gdynia - Wymaz z gardła 21/E gravis 2008 Gdynia - krew 20/E gravis 2008 Bydgoszcz - krew 19/E gravis 2008 Rzeszów - krew 18/E gravis 2007 Gdynia - krew 17/E gravis 2007 Bydgoszcz - Wymaz z rany 16/E gravis 2007 Warszawa - Wymaz z przetoki 15/E gravis 2007 Bydgoszcz - Wymaz z rany 14/E gravis 2007 Gdynia - krew 13/E gravis 2006 Bydgoszcz - krew 12/E gravis 2004 Warszawa - krew 11/D belfanti 2001 Suwałki - Wymaz z nosa 10/C belfanti 2000 Suwałki - Wymaz z nosa 9/B mitis lata 90. bd + Wymaz z gardła 8/B intermedius lata 90. bd + Wymaz z gardła 7/B mitis lata 90. bd + Wymaz z gardła 6/B gravis 1997 Otmuchów - bd 5/A gravis lata 60. bd + bd 4/A intermedius lata 60. bd + bd 3/A mitis lata 60. bd + bd 2/A mitis lata 60. bd + bd 1/A mitis lata 60. bd + bd NCTC 10356 belfanti nd nd - nd NCTC 10648 gravis nd nd + nd NCTC 3984 gravis nd nd + nd NCTC 13129 gravis nd nd nd nd bd brak danych nd nie dotyczy 0,25 µm każdego z pary oligonukleotydów starterowych, polimerazę DNA DSF-Taq (BIO- RON, Niemcy) w ilości jednej jednostki na reakcję oraz bufor reakcyjny dołączony przez producenta do polimerazy, zawierający MgCl 2 w ilości 25mM. Reakcję amplifikacji prowadzono w termocyklerze Mastercycler (Eppendorf). Warunki reakcji: wstępna denaturacja w temperaturze 95⁰C przez 5 min, następnie 35 cykli składających się z trzech etapów kolejno denaturacji, przyłączania starterów oraz elongacji odpowiednio w temp. 95⁰C przez 1 min, 57⁰C przez 45 sek i 72⁰C przez 1 min. Końcowe wydłużanie przez 5 min w temp. 72⁰C. Analiza elektroforetyczna. Uzyskane amplifikaty DNA poddawano elektroforezie w 4% żelu agarozowym (agaroza typu high-resolution, Sigma-Aldrich) w buforze 1xTBE. Jako wzorzec wielkości DNA stosowano GeneRuler 100 bp DNA Ladder Plus oraz Gene- Ruler 50 bp DNA Ladder (Fermentas, Litwa).

212 A.A. Zasada i inni Nr 3 Tabela II. Charakterystyka markerów VNTR analizowanych w niniejszej pracy. Marker VNTR Oznaczenie startera Sekwencja oligonukleotydowa (5 3 ) Wielkość w szczepie NCTC 13129 Wielkość pojedynczego powtórzenia Indeks Simpsona (D) V1 V1f cccagtgcggttcaacactc 415 pz 64 pz nb V1r ctacggctcatctccgctgg V2 V2f agtatcacgagaacttgcgg 454 pz 54 pz nb V2r cgtgaactcatacgacaacgg V3 V3f ctttgcatgctgttgaggcg 368 pz 36 pz 0 V3r tagcaaccacgacaaagtcg V4 V4f ttatccgtcctggcttcacg 1096 pz 61 pz nb V4r tcctcgaagacggaaatacc V5 V5f aggtatttccgtcttcgagg 659 pz 61 pz nb V5r tcagaccacagcatcacacg V6 V6f tctgcattgcgtcagactcg 151 pz 27 pz 0,198 V6r aagatgacctccgagacaagc V7 V7f ttgagtgcgtagtaggtacg 157 pz 24 pz 0,735 V7r cagacattatcgctggcagg V8 V8f acccctcactcgtcgacatc 257 pz 42 pz 0 V8r tccgactgcttggtcgatgc V9 V9f tgaggaagatgacaccgtag 848 pz 336 pz 0,516 V9r tgacgtaagggacgttctcg V10 V10f ggcgtagaagacccacaagc 724 pz 166 pz 0,746 V10r ccagcgatgactgttgcacc V11 V11f gacagcgcaatatacgcacg 1240 pz 411 pz nb V11r tggagcggagaactagtacg V12 V12f ttccagcagggattgactcg 153 pz 30 pz 0,524 V12r tcgtcaaggaactgttgggc V13 V13f taggagcagaagattcagcc 253 pz 30 pz 0 V13r aagcactatgagtcgctcgg V14 V14f gtatttccaggtggttaccg 479 pz 61 pz nb V14r tgcggagaagactttctcg nb nie badano Sekwencjonowanie DNA. Reakcję sekwencjonowania DNA wybranych amplifikatów uzyskanych metodą PCR zlecano firmie zewnętrznej (Genomed, Warszawa, Polska). Indeks Simpsona. Indeks Simpsona (D), który określa siłę różnicującą metody wyliczano przy użyciu programu opracowanego przez Gierczyńskiego (7). Wartość D wynosząca 1 oznacza, że metoda typowania jest w stanie zróżnicować wszystkie badane izolaty. Wartość D wynosząca 0 wskazuje, że wszystkie izolaty są identyczne. Analiza stopnia podobieństwa. Analizę stopnia podobieństwa genotypów MLVA badanych szczepów C. diphtheriae przeprowadzono przy użyciu współczynnika Pearsona zgodnie z metodyką opisaną przez Gierczyńskiego (7). Dendrogram tworzono z wykorzystaniem metody klasteryzacji UPMGA.

Nr 3 Genotypowanie C. diphteriae 213 Tabela III. Wielkość poszczególnych markerów VNTR u badanych szczepów C. diphtheriae oraz uzyskany genotyp MLVA Szczep V3 V6 V7 V8 V9 V10 V12 V13 Genotyp MLVA 23/E 368 151 157 257 848 724 153 253 1 22/E 368 151 157 257 848 724 153 253 1 21/E 368 151 157 257 848 724 153 253 1 20/E 368 151 157 257 1181 724 153 253 2 19/E 368 151 157 257 848 724 153 253 1 18/E 368 151 157 257 848 724 153 253 1 17/E 368 151 157 257 1181 724 153 253 2 16/E 368 151 157 257 848 724 153 253 1 15/E 368 151 157 257 1181 724 153 253 2 14/E 368 151 157 257 848 724 153 253 1 13/E 368 151 157 257 1181 724 153 253 2 12/E 368 151 157 257 848 724 153 253 1 11/D 368 187 139 257 539 366 153 253 3 10/C 368 187 163 257 539 366 560 253 5 6/B 368 151 163 257 539 366 153 253 4 7/B 368 151 145 257 848 408 183 253 6 8/B 368 151 145 257 848 408 183 253 6 9/B 368 151 145 257 848 408 183 253 6 PW8 368 151 139 257 848 394 186 253 7 NCTC 10356 (-) 368 187 139 257 539 366 1190 253 8 NCTC 10648 (+) 368 151 139 257 848 394 186 253 7 NCTC 3984 (+/-) 368 151 151 257 848 563 186 253 9 5/A 368 151 163 257 848 563 186 253 10 4/A 368 151 151 257 818 366 153 253 11 1/A 368 151 151 257 848 610 153 253 12 2/A 368 151 151 257 848 610 153 253 12 3/A 368 151 151 257 848 610 153 253 12 NCTC 13129 368 151 157 257 848 724 153 253 1 WYNIKI W genomie szczepu C. diphtheriae NCTC 13129 zidentyfikowano 75 fragmentów zawierających tandemowe powtórzenia. Do dalszych badań wybrano 14 z nich. Oznaczono je kolejno od v1 do v14 (Tabela II). W wyborze kierowano się tym, aby możliwe było zaobserwowanie zróżnicowania wielkości amplifikowanych fragmentów DNA w elektroforezie w żelu agarozowym. Do amplifikacji wybranych markerów VNTR zaprojektowano startery oraz dobrano warunki PCR tak, aby amplifikacja wszystkich markerów przebiegała w takich samych warunkach. Po przeprowadzeniu amplifikacji wyselekcjonowanych markerów VNTR z DNA wszystkich badanych szczepów stwierdzono potencjalną przydatność do genotypowania 8 z nich: v3, v6, v7, v8, v9, v10, v12 i v13. W grupie badanych szczepów stwierdzono 2

214 A.A. Zasada i inni Nr 3 Ryc. 1. Przykładowy elektroforegram markera v10 w żelu agarozowym. M wzorzec wielkości DNA GeneRuler 100bp DNA Lauder Plus, ścieżki 1, 2, 3 i 8 wielkość markera 366 pz, ścieżki 4, 5 i 6 wielkość markera 408 pz, ścieżka 7 i 9 wielkość markera 394 pz, ścieżka 10 wielkość markera 563 pz. allele markera v6 o wielkości 151 pz i 187 pz, 5 alleli markera v7 o wielkości 157 pz, 139 pz, 163 pz, 145 pz oraz 151 pz, 4 allele markera v9 o wielkości 848 pz, 539 pz, 818 pz i 1181 pz, 6 alleli markera v10 o wielkości 724 pz, 366 pz, 408 pz, 394 pz, 563 pz i 610 pz oraz 5 alleli markera v12 o wielkości 153 pz, 560 pz, 183 pz, 186pz i 1190pz (Tabela III). Wielkość wszystkich alleli została potwierdzona drogą sekwencjonowania DNA. Dla markerów v3, v8 i v13 nie zaobserwowano różnic wielkości pomiędzy szczepami, jednakże grupa badanych szczepów była niewielka. Pozostałe sześć markerów (v1, v2, v4, v5, v11 i v14) uznano za nieprzydatne, ze względu na to że nie dla wszystkich badanych szczepów uzyskano produkt PCR lub uzyskano amplifikaty różnej wielkości dla pojedynczego szczepu wskazujące na występowanie podobnych sekwencji nukleotydowych w różnych miejscach w genomie. Obserwowane zróżnicowanie wielkości alleli VNTR przykładowo przedstawiono dla markera v10 na rycinie 1. Indeks zróżnicowania Simpsona został wyliczony dla każdego z 8 markerów MLVA indywidualnie oraz dla wszystkich 8 markerów razem przebadanych z użyciem 28 szczepów C. diphtheriae. Indeks dla pojedynczych markerów wyniósł od 0 do 0,756 (Tabela II). Największym stopniem zróżnicowania charakteryzowały się markery v10 0,746 i v7 0,735. Dla markerów v3, v8 i v13 uzyskano indeks zróżnicowania 0, co wskazuje na brak zróżnicowania. Jednakże markery te należy przetestować na zdecydowanie większej grupie szczepów. Indeks Simpsona dla całego panelu markerów wyniósł 0,87. Dla grupy 28

Nr 3 Genotypowanie C. diphteriae 215 Ryc. 2. Dendrogram prezentujący stopień podobieństwa 12 genotypów MLVA wyróżnionych wśród 28 badanych szczepów C. diphtheriae. badanych szczepów uzyskano 12 genotypów, które oznaczono kolejnymi cyframi arabskimi (Tabela III). Przeprowadzoną analizę pokrewieństwa przedstawiono graficznie na rycinie 2. Na uwagę zasługuje fakt, że szczepy C. diphtheriae nie wytwarzające toksyny izolowane w latach 2004-2008 zostały zgrupowane razem (genotyp MLVA 1 i 2 różniące się tylko markerem v9), pomimo że nie są powiązane epidemiologicznie. Ponadto razem zostały zgrupowane trzy spośród pięciu szczepów izolowanych w latach 60. i trzy spośród czterech szczepów izolowanych w latach 90. Najwięcej, bo aż 9 szczepów C. diphtheriae z badanej grupy 28 szczepów należało do genotypu MLVA 1. Natomiast do genotypów 3, 4, 5, 8, 9, 10 i 11 zaliczono tylko po jednym szczepie. DYSKUSJA Stosowanie odpowiednich metod typowania drobnoustrojów chorobotwórczych pomaga zrozumieć mechanizmy ich rozprzestrzeniania się i zmienności genetycznej. Pozwala na identyfikowanie ognisk zakażeń oraz ustalenie ich źródła. Co więcej, niejednokrotnie pozwala zidentyfikować szczepy o zwiększonej zjadliwości. Wybór metody typowania zależy od informacji jakie chce się uzyskać, ale także od wyposażenia i możliwości laboratorium.

216 A.A. Zasada i inni Nr 3 Dotychczas do typowania szczepów C. diphtheriae stosowano zarówno metody molekularne jak i tradycyjne. Do metod tradycyjnych należy fagotypowanie, typowanie serologiczne oraz biotypowanie opierające się na wykrywaniu właściwości biochemicznych szczepów w połączeniu z morfologią kolonii. W ostatnim przypadku opisano cztery biotypy: mitis, gravis, belfanti i intermedius. Wśród metod molekularnych do typowania epidemiologicznego szczepów C. diphtheriae zastosowano rybotypowanie, RAPD (Randomly Amplified Polymorphic DNA), PFGE (Pulsed Field Gel Electrophoresis), MEE (Multilocus Enzyme Electrophoresis) oraz SDS PAGE (SDS Polyacrylamide Gel Electrophoresis). W 2005 roku została opisana metoda genotypowania C. diphtheriae z wykorzystaniem mikromacierzy (14), a w ubiegłym roku opublikowano zastosowanie metody MLST (Multilocus Sequence Typing) do genotypowania tego drobnoustroju (2). W prezentowanej pracy podjęto próbę zastosowania metody MLVA do genotypowania C. diphtheriae z wykorzystaniem 8 markerów VNTR. Wybrane markery charakteryzowały się różnym stopniem zróżnicowania. Największe zróżnicowanie zaobserwowano w przypadku markera v10 i v7. Natomiast brak zróżnicowania wśród markerów v3, v8 i v13 może wiązać się z ich wyjątkową stabilnością lub faktem, że pula badanych szczepów była bardzo ograniczona. Różnice wielkości pomiędzy allelami pozostałych wybranych markerów VNTR były na tyle duże, że można je było łatwo zaobserwować podczas elektroforezy w żelu agarozowym. Umożliwia to stosowanie zaproponowanej metody w laboratoriach wyposażonych jedynie w podstawowy sprzęt do biologii molekularnej. Ponadto metoda ta jest szybka i charakteryzuje się dużą siłą różnicującą. W metodzie MLVA amplifikowane są konkretne loci, co oznacza, że w przeciwieństwie do większości innych metod genotypowania, analizowany fragment DNA jest znany. Pozwala to uniknąć problemów jakie pojawiają się na przykład przy zastosowaniu metody PFGE, gdzie uzyskuje się obraz fragmentów DNA o nieznanej sekwencji. Istnieje możliwość uzyskania fragmentów DNA identycznej wielkości, ale zawierających zupełnie inne geny, co prowadzi do błędnego uznania szczepów za identyczne. Zaprojektowanie wysoce swoistych starterów do reakcji amplifikacji wybranych VNTR pozwala na uniknięcie takich błędów. Dodatkowo wynik uzyskany metodą MLVA może zostać potwierdzony przez sekwencjonowanie (18). Ze względu na to, że wynik genotypowania metodą MLVA ma postać liczbową możliwe jest utworzenie internetowej bazy danych, która ułatwi porównywanie wyników uzyskiwanych w różnych laboratoriach na świecie, bez ryzyka błędnej interpretacji wynikającej np. z zastosowania różnej aparatury lub różnych warunków reakcji. Z dotychczas stosowanych do genotypowania C. diphtheriae metod tylko MLST daje taką możliwość (2). Należy jednak podkreślić, że metoda MLVA jest szybsza i tańsza niż MLST. Co więcej, możliwa jest całkowita automatyzacja metody, a także stosowanie różnych technik rozdziału fragmentów DNA (13). Wyniki genotypowania metodą MLVA grupy szczepów C. diphtheriae izolowanych w Polsce pokazały, że wszystkie szczepy nietoksynotwórcze izolowane z zakażeń w latach 2004-2008 należą do dwóch genotypów MLVA różniących się wielkością tylko jednego markera. Według zalecanej przez Noller i wsp. (15) interpretacji wyników MLVA wszystkie te szczepy należy traktować jako pochodzące z jednego źródła. Jednakże nie stwierdzono powiązania epidemiologicznego pomiędzy zakażeniami, z których wyizolowano te szczepy. Uzyskany wynik może wskazywać na krążenie w populacji polskiej tylko dwóch blisko spokrewnionych genotypów szczepów C. diphtheriae. Innym wyjaśnieniem tego zjawiska

Nr 3 Genotypowanie C. diphteriae 217 może być założenie, że tylko szczepy o tych genotypach są w stanie wywoływać zakażenia w populacji zaszczepionej szczepionką przeciwbłoniczą, dlatego są izolowane z materiału klinicznego. Obecnie w Polsce nie wykonuje się rutynowo badań na bezobjawowe nosicielstwo C. diphtheriae, a tym samym brak jest izolatów pochodzących od osób zdrowych. Zaliczenie do pojedynczego genotypu MLVA większości szczepów izolowanych w latach 60. (genotyp MLVA 12), jak również większości szczepów izolowanych w latach 90. (genotyp MLVA 6), nie jest zaskoczeniem, ponieważ szczepy te zostały wyizolowane w okresie epidemii błonicy i tym samym mogły pochodzić z jednego ogniska. Przedstawione w niniejszej pracy badania mają charakter wstępny, ponieważ pomimo zróżnicowania, pula badanych szczepów była stosunkowo niewielka. Jednakże ich wyniki wskazują na przydatność metody MLVA do genotypowania C. diphtheriae. Dla potwierdzenia użyteczności oraz wiarygodności metody należy ją zastosować do badania dużej grupy szczepów. Badania takie zostaną przeprowadzone we współpracy z Instytutem Pasteura w Paryżu, który dysponuje ogromną kolekcją szczepów C. diphtheriae izolowanych na całym świecie przez okres wielu lat. A.A. Zasada, M. Jagielski, M. Rzeczkowska, A. Januszkiewicz The use of MLVA for Corynebacterium diphtheriae genotyping preliminary studies SUMMARY The complete genome sequence of strain NCTC 13129 C. diphtheriae were investigated in order to identify tandem repeats (VNTR). From 75 VNTR loci identified in the genome 14 were selected. Primers were designed and PCR conditions were optimized for amplification of the selected VNTR markers. Preliminary studies of usefulness of selected VNTR markers were conducted using a group of 28 C. diphtheriae strains. From 14 markers 8 were regarded as potentially useful. The diversity of individual markers ranged from 1 to 6 alleles (Simpson index from 0 to 0,746). No diversity were observed for 3 VNTR markers but it could be a results of too small group of strains analyzed in the tests. Simpson diversity index calculated for all the markers tested on 28 strains was 0,87. Results of the preliminary studies showed usefulness of MLVA for C. diphtheriae genotyping. Nevertheless, confirmation of reliability of the method should be done using a large group of strains. Moreover, the method should be compared with other genotyping methods. PIŚMIENNICTWO 1. Benson G. Tandem repeats finder: a program to analyze DNA sequences. Nucl Acid Res 1999; 27: 573-80. 2. Bolt F, Cassiday P, Tondella ML i inni. Multilocus sequence typing identifies evidence for recombination and two distinct lineages of Corynebacterium diphtheriae. J Clin Microbiol 2010; 48: 4177-85. 3. Centers for Disease Control and Prevention. Travelers Health Yellow Book. http://wwwnc. cdc.gov/travel/yellowbook/2010/chapter-2/diphtheria.aspx 4. Cerdeño-Tárraga AM, Efstratiou A, Dover LG i inni. The complete genome sequence and analysis of Corynebacterium diphtheriae NCTC13129. Nucl Acid Res 2003; 31: 6516-32.

218 A.A. Zasada i inni Nr 3 5. DeWinter LM, Bernard KA, Romney MG. Human clinical isolates of Corynebacterium diphtheriae i Corynebacterium ulcerans collected in Canada from 1999 to 2003 but not fitting reporting criteria for cases of diphtheria. J Clin Microbiol 2005; 43: 3447-9. 6. European Centre for Disease Prevention and Control. Annual Epidemiological Report on Comunicable Diseases in Europe 2010. ECDC, Stockholm 2010. 7. Gierczyński R. Genetyczna struktura populacji i determinanty chorobotwórczości pałeczek Yersinia enterocolitica izolowanych z materiału klinicznego od ludzi w Polsce w larach 1996-2008. Rozprawa habilitacyjna, NIZP-PZH, Warszawa 2010. 8. Gubler J, Huber-Schneider C, Gruner E i inni. An outbreak of nontoxigenic Corynebacterium diphtheriae infection: single bacterial clone causing invasive infection among Swiss drug users. Clin Infect Dis 1998; 27: 1295-8. 9. Hall AJ, Cassiday PK, Bernard KA i inni. Novel Corynebacterium diphtheriae in domestic cats. Emerg Infect Dis 2010; 16: 688-91. 10. Henricson B, Segarra M, Garvin J i inni. Toxigenic Corynebacterium diphtheriae associated with an equine wound infection. J Vet Diagn Invest 2000; 12: 253-7. 11. Kuszewski K. Błonica. W: Zakażenia i zarażenia człowieka. Red. W. Magdzik, D. Naruszewicz- -Lesiuk, PZWL, Warszawa 2001, 44-9. 12. Leggett BA, De Zoysa A, Abbott YE i inni. Toxigenic Corynebacterium diphtheriae isolated from a wound in a horse. Vet. Rec. 2010; 166: 656-8. 13. Lindstedt B-A. Multiple-locus variable number tandem repeats analysis for genetic fingerprinting of pathogenic bacteria. Electrophoresis 2005; 26: 2567-82. 14. Mokrousov I, Narvskaya O, Limeschenko E i inni. Efficient discrimination within a Corynebacterium diphtheriae epidemic clonal group by a novel microarray-based method. J Clin Microbiol 2005; 45: 1662-8. 15. Noller AC, McEllistrem MC, Shutt KA i inni. Locus-specific mutational events in a Multilocus Variable-Number Tandem Repeat Analysis of Escherichia coli O157:H7. J Clin Micorbiol 2006; 44: 374-7. 16. Patey O, Bimet F, Riegel P i inni. Clinical and molecular study of Corynebacterium diphtheriae systemic infections in France. J Clin Microbiol 1997; 35: 41-5. 17. van Belkum A. Tracing isolates of bacterial species by multilocus variable number of tandem repeat analysis (MLVA). FEMS Immunol Med Microbiol 2007; 49: 22-7. 18. von Hunolstein C, Alfarone G, Scopetti F i inni. Molecular epidemiology and characteristics of Corynebacterium diphtheriae and Corynebacterium ulcerans strains isolated in Italy during the 1990s. J Med Micorbiol 2003; 52: 181-8. 19. WHO. World Health Statistics 2010. http://www.who.int/whosis/whostat/en_whs10_full.pdf 20. Zasada AA, Baczewska-Rej M, Wardak S. An increase in non-toxigenic Corynebacterium diphtheriae infections in Poland molecular epidemiology and antimicrobial susceptibility of strains isolated from past outbreaks and those currently circulating in Poland. Int J Infect Dis 2010; 14: e907-12. 21. Zasada AA, Zaleska M, Podlasin RB i inni. The first case of septicemia due to nontoxigenic Corynebacterium diphtheriae in Poland: case report. Ann Clin Microbiol Antimicrob 2005; 4: 8 (http://www.ann-clinmicrob.com/content/4/1/8). Otrzymano: 27 VII 2011 r. Adres Autora: 00-791 Warszawa, ul. Chocimska 24, Zakład Bakteriologii Narodowego Instytutu Zdrowia Publicznego Państwowego Zakładu Higieny e-mail:azasada@pzh.gov.pl