Zakład Mikrobiologii Krajowe Referencyjne Laboratorium Prątka Gruźlicy

Transkrypt

1 I NSTYTUT GRUŹLICY I CHORÓB PŁUC Zakład Mikrobiologii Krajowe Referencyjne Laboratorium Prątka Gruźlicy Kierownik Prof. dr hab. n. med. Ewa Augustynowicz-Kopeć Warszawa ul. Płocka 26 Tel./ fax , e- mail: e.kopec@igichp.edu.pl Warszawa, r. Prof. dr hab. n. med. Ewa Augustynowicz-Kopeć Kierownik Zakładu Mikrobiologii IGiCHP Warszawa ul. Płocka 26 Recenzja pracy doktorskiej magister Izabeli Waśko pt.: Charakterystyka populacji izolatów Neisseria meningitidis z kompleksu klonalnego ST-11 odpowiedzialnych za zakażenia inwazyjne w Polsce Przedstawiona mi do oceny praca doktorska dotyczy bardzo istotnego problemu zdrowotnego jakim są zakażenia wywołane przez szczepy Neisseria meningitidis. Zakażenie Neisseria meningitidis może skutkować różnymi objawami klinicznymi, począwszy od gorączki, przejściowej bakteriemii do piorunującej choroby kończącej się śmiercią, w ciągu kilku godzin od wystąpienia objawów. Obecnie jest zidentyfikowanych 12 grup serologicznych, ale za ponad 95% zakażeń inwazyjnych u ludzi odpowiada 5 z nich, A, B, C i w mniejszym stopniu W-135 i Y. Poszczególne grupy występują z różną częstością, w rejonach geograficznych i sezonach epidemicznych. W Europie identyfikuje się przede wszystkim meningokoki z grupy B i C. które stanowią przyczynę 90 proc. wszystkich zachorowań w Europie. Jednak to meningokoki z grupy C częściej wywołują epidemie i są odpowiedzialne za groźniejsze przypadki choroby menigokokowej, powodując sepsę, a co za tym idzie wiążą się z wysoką śmiertelnością. Na zakażenie meningokokami narażeni są wszyscy, niezależnie od wieku i płci. Jednak, jak wskazują dane opracowane przez KOROUN, Krajowy Ośrodek Referencyjny ds. Diagnostyki Bakteryjnych Zakażeń Ośrodkowego Układu Nerwowego, na zakażenia meningokokami najbardziej narażone są dzieci < 5r. ż- głównie z powodu nie w pełni dojrzałego układu 1

2 immunologicznego oraz młodzi ludzie w wieku lata - ze względu na prowadzenie aktywnego trybu życia. Diagnoza zakażeń wywołanych przez meningokoki niestety jest bardzo trudna, a pierwsze objawy zakażenia nie różnią się zwykle od objawów towarzyszących przeziębieniu lub grypie. Choroba meningokokowa rozwija się szybko i ma bardzo ciężki przebieg. Obszary, na których stwierdza się występowanie zakażeń meningokokowych, stanowią bardzo poważny problem w zakresie ochrony zdrowia. Powstawanie epidemii jest nieprzewidywalne i niesie ze sobą ofiary śmiertelne zanim zostanie podjęta jeszcze jakakolwiek akcja zapobiegawcza. Aktualnie jedyną drogą zapobiegania epidemiom jest szczepienie populacji największego ryzyka. Pomimo rozwoju medycyny i badań diagnostycznych chorób zakaźnych, wciąż istnieją miejsca gdzie występują ogniska epidemiczne. W krajach uprzemysłowionych szczepieni są ludzie, którzy na co dzień przebywają w dużych skupiskach, jak studenci czy wojskowi. W krajach rozwijających się, szczególnie w Afryce, gdzie wybuchy epidemii N.meningitidis zabijają lub powodują uszkodzenia neurologiczne wielu tysięcy osób, szeroko zakrojona akcja szczepienia całej populacji jest niemożliwa ze względów finansowych. W rejonach tych podejmowane są działania mające na celu zmniejszenie rozprzestrzeniania się infekcji meningokokowych, natomiast szczepieni są tylko ci, którzy stanowią największą grupę ryzyka. W rejonach Afryki Subsaharyjskiej, co roku odnotowuje się około zachorowań i zgonów z powodu IChMw tym głównie zakażenia opon mózgowo-rdzeniowych. Chociaż w skali globalnej meningokoki w przeważającej liczbie przypadków odpowiadają za zachorowania sporadyczne, to warto zwrócić uwagę na fakt, że ten drobnoustrój jest zdolny do wywoływania ognisk epidemicznych i epidemii. Potencjalnie epidemiczny charakter infekcji meningokokowych stanowi zagrożenie dla zdrowia publicznego i wraz z różnorodnością serologiczną szczepów, przy braku możliwości pełnej immunoprofilaktyki, wymaga ciągłego monitorowania tego zjawiska. Praca mgr Izabeli Waśko należy do grupy badań z zakresu molekularnej epidemiologii, które pozwalają na szybkie ustalenie czynnika etiologicznego zakażeń. Poza tym umożliwiają identyfikację epidemicznych szczepów od rozprzestrzeniania się plazmidowej oporności. Badania zastosowane przez Doktorantkę w pracy mieszczą się w głównym nurcie badań prowadzonych na świecie i związanych z opracowaniem nowych, wiarygodnych metod 2

3 genetycznego typowania drobnoustrojów. Populacja Neisseria meningitidis jest zróżnicowana genetycznie i antygenowo, jednak większość IChM jest wywołana przez ograniczoną liczbę hiperwirulentnych kompleksów klonalnych. Podjęte przez Doktorantkę badania dotyczące szczegółowej analizy molekularnej Neisseria meningitidis należącego do hiperepidemicznego, hiperwirulentnego kompleksu klonalnego cc11 wydają się niezwykle ważne z punktu widzenia polityki prozdrowotnej w zakresie decyzji dotyczących szczepień oraz algorytmu postępowania w przypadku wystąpienia epidemii. Badania zaplanowane przez Autorkę doskonale wpisują się w główny nurt badań KORUN, który od 1997 roku zajmuje się monitorowaniem zakażeń meningokokowych w Polsce. Organizowane przez Zespół tego ośrodka pod kierownictwem dr hab. Anny Skoczyńskiej liczne akcje edukacyjnoinformacyjne przyczyniły się do wzrostu wykrywalności IChM w Polsce oraz umożliwiły szybsze podejmowanie leczenia i działań przeciwepidemicznych. Układ pracy jest typowy, zawiera wszystkie rozdziały przyjęte zwyczajowo w pracach doktorskich. We wstępie Autorka opisuje szczegółowo wiele aspektów dotyczących zakażeń wywołanych przez Neisseria meningitidis poprzez chorobotwórczość i nosicielstwo, zjawiska w patogenezie i immunologii, klasyfikację oraz zagadnienia dotyczące epidemiologii zakażeń meningokokowych w tym kompleksu klonalnego cc11. Celem pracy mgr Izabeli Waśko była charakterystyka struktury klonalnej klinicznych szczepów Neisseria meningitidis izolowanych od polskich chorych należących do kompleksu klonalnego cc11 oraz adaptacja metody VNTR do określenia pokrewieństwa genetycznego tych szczepów i ocena przydatności tej metody w molekularnych dochodzeniach epidemiologicznych. Cele pracy zostały sformułowane w sposób przejrzysty i jasno wytyczają kierunek prowadzenia badań. Charakterystyka fenotypowa szczepów Neisseria meningitidis przeprowadzona przez Autorkę obejmowała określenie: grupy serologicznej, typu i podtypu serologicznego, oraz oznaczenie MIC dla: penicyliny, cefotaksymu, chloramfenikolu, ciprofloksacyny, rifampicyny i kotrimoksazolu. Analiza molekularna obejmowała określenie geno grupy Neisseria meningitidisz z wykorzystaniem reakcji PCR, identyfikację typu sekwencyjnego metodą MLST( Multi Locus Sequence Typing) oraz sekwencjonowanie ustalające profil alleliczny. 3

4 Pokrewieństwo miedzy szczepami Neisseria meningitidis należących do kompleksu klonalnego cc11 Autorka badała metodą VNTR. Materiał do badań stanowiło 1527 szczepów Neisseria meningitidis odpowiedzialnych za zakażenia inwazyjne, izolowanych od chorych w Polsce w latach i nadesłanych do KOROUN (Krajowego Ośrodka referencyjnego ds. Diagnostyki Bakteryjnych Zakażeń Ośrodkowego Układu Nerwowego). W wyniku typowania serologicznego zidentyfikowano 468 szczepów Neisseria meningitidis podejrzanych o przynależność do kompleksu klonalnego cc11.na podstawie typowania molekularnego wyłoniono 120 szczepów należących do Men/cc11.Dalsza charakterystyka szczepów w badaniach zaplanowanych przez Doktorantkę obejmowała charakterystykę szczepów poprzez sekwencjonowanie zmiennych regionów genów, kodujących białka błony zewnętrznej PorA i FetA oraz identyfikację typu sekwencyjnego ST. Przeprowadzona przez Autorkę analiza wykazała, że szczepy Neisseria meningitidis do kompleksu klonalnego cc11 wywołują zakażenia inwazyjne w naszym kraju, co najmniej od 1997 roku. Wzrost zapadalności na IChM wywołaną Men/cc11 zarejestrowano w latach 2007 i 2008 roku, kiedy w Polsce zarejestrowano ogniska epidemiczne choroby. W badanej grupie chorych najwyższy wskaźnik zapadalności na Men/cc11 stwierdzono u dzieci < 1r.żoraz nastolatków w wieku lat. Zakażenia wywołane przez Men/cc11 charakteryzował wyższy wskaźnik śmiertelności niż w przypadku zakażeń wywołanych innymi kompleksami klonalnymi 20,4 vs 8,5%. Najwyższy wskaźnik śmiertelności Men/cc11 odnotowano w grupie wiekowej dorosłych lata 28,6% i u dzieci < 1 r.ż 27,3%. Zakażenia IChM/cc11 zakończone zgonem chorego miały głównie postać sepsy, nie odnotowano ani jednego przypadku zomr zakończonego zgonem. Wśród 120 szczepów Neisseria meningitidis należących do kompleksu klonalnego cc11 większość 80,8% należała do serogrupy MenC. Analiza polimorfizmu wybranych fragmentów genów, metabolizmu podstawowego Mulilocus Seqence Typing MLST, wykazała, że najliczniej w badanej puli szczepów reprezentowany był typ sekwencyjny ST-11-79,2%, który stwierdzono wśród 93% szczepów reprezentujących serogrupę MenC. Mam pytanie do Doktorantki. Czy w Europie również szczepy należące do kompleksu klonalnego cc11 reprezentują w większości serogrupę MenC? 4

5 Wszystkie szczepy Neisseria meningitidis należące do kompleksu klonalnego cc11 wykazywały wrażliwość na chloramfenikol, ciprofloksacynę oraz cefalosporyny 3 generacji, natomiast 80% szczepów było opornych na kotrimoksazol. W analizowanej puli 120 szczepów nie zarejestrowano oporności na penicylinę -MIC> 0,25 mg/l,natomiast wśród 28 szczepów 23,4% z obniżoną opornością na penicyliny MIC w zakresie 0,09 0,12 mg/l około 50 % stanowiły szczepy reprezentujące typ sekwencyjny ST-11. Czy na świecie zostały zarejestrowane szczepy Neisseria meningitidis oporne na penicylinę MIC>25mg/L. Jaki odsetek w Europie stanowią szczepy Neisseria meningitidis o obniżonej wrażliwości na penicyliny i oporne na RMP MIC> 32 mg/l? W sześciu przypadkach IChM wywołanych przez szczepy o obniżonej wrażliwości na penicylinę zakończyło się zgonem. Analiza molekularna pokrewieństwa pomiędzy 120 szczepami Men/cc11 wykazała, że zastosowana przez Autorkę metoda analizy polimorfizmu tandemowo powtarzających się fragmentów DNA hv- MLVA Multilocus High Variable Number Tandem Repeat jest metodą wysoce użyteczną w typowaniu meningokoków w sytuacji podejrzenia ogniska epidemicznego. Proszę Doktorantkę o odpowiedź, czy przypadki IChM/cc11 zarejestrowane w Polsce korelowały z wyższym wskaźnikiem śmiertelności w tej grupie chorych? Jak przedstawiają się wyniki pomiędzy wskaźnikiem śmiertelności a kompleksami klonalnymi Neisseria meningitidis w innych badaniach? Proszę Doktorantkę o wyjaśnienie Jej stanowiska, że szczepy niepatogenne Neisseria meningitidis mają większą zdolność do transmisji miedzy ludźmi? Wyniki oceniono statystycznie - w rozdziale Analiza statystyczna podano szczegółowo zastosowane testy i interpretację wyników. Cele pracy zostały zrealizowane, i podsumowane w 8 dobrze zredagowanych wnioskach. Dyskusja wyników zawarta jest w 20 stronnicowym omówieniu. Doktorantka w sposób dojrzały odnosi własne wyniki do badań innych autorów. Pracę mgr Izabeli Waśko kończy bogaty spis cytowanego piśmiennictwa (161 pozycji). Jest to nowe, wartościowe, dobrze wybrane piśmiennictwo, pochodzące głównie z ostatnich lat. 5

6 Przed przygotowaniem przez Doktorantkę pracy do druku proponuję wprowadzenie kilku zmian merytorycznych i redakcyjnych. Proszę Autorkę o ujednolicenie terminów lekooporny niewrażliwy w mikrobiologii mówimy zawsze o szczepach opornych O obniżonej wrażliwości średnio wrażliwy Wstęp Str 20,5 wiersz od dołu pęcherzyki błony zewnętrznej chyba nie pochodzą ze szczepionki Str 22, 7 wiersz od góry hodowla - nie jest ani dodatnia ani ujemna albo uzyskano hodowle albo nie. Str 24 wiersz od góry 3-4 i 12 sprzeczne informacje Materiały tabela nr 2 proponuję rozdzielić w kolumnach informacje zawarte w tytule pierwszej kolumny Wyniki Pod niektórymi rycinami i tabelami brakuję podsumowania wyników na przykład rycina 5 Dlaczego wskaźnik śmiertelności ma angielski skrót Case Fatality Ratio CFR???? Na przykład Tabela 13 brak wyjaśnienia skrótów tytułujących kolumnę numer 2,3,4,5,6,7,8 Tabela 18 kolumna 2 i 3 takiego opisu danych nie stosujemy Dyskusja Str 89 korelacja pomiędzy CFR a cc11 jak notatki Doktorantki CFR w ogniskach?????? Str 92 brak opisu tabeli 23 Str 97 brak literatury na przykład badania z Kanady Rozprawa doktorska spełnia warunki określone w art. 13 Ustawy z dnia 14 marca 2003 r. o stopniach naukowych i tytule naukowym oraz o stopniach i tytule w zakresie sztuki ( Dz.U. nr 65, poz. 5 z późn. zm. ). 6

7 Pracę przedstawioną mi do recenzji oceniam bardzo pozytywnie i zwracam się do Wysokiej Rady Naukowej Centrum Biostruktury WUM o dopuszczenie Doktorantki mgr Izabeli Waśko do dalszych etapów przewodu doktorskiego. Z poważaniem prof. dr hab. n. med. Ewa Augustynowicz-Kopeć 7