Anna Rodziewicz, Katarzyna Baranowska, Wojciech Łaba, Justyna Sobolczyk

Acta Sci. Pol., Biotechnologia 5(1-2) 2006, 61-73 WŁAŚCIWOŚCI KERATYNOLITYCZNE ORAZ TWORZENIE BIOFILMU PRZEZ BAKTERIE BACILLUS SUBTILIS 1 Anna Rodziewicz, Katarzyna Baranowska, Wojciech Łaba, Justyna Sobolczyk Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu 2 Streszczenie. Bakterie Bacillus subtilis B3 na podłoŝu syntetycznym z dodatkiem keratyny piór syntetyzują pozakomórkowe proteazy o aktywności keratynolitycznej. Wydzielane pozakomórkowo enzymy uczestniczą w degradacji keratyny, efektem czego jest wzrastająca ilość peptydów i aminokwasów, w tym takŝe zawierających grupy tiolowe. Całkowite upłynnienie piór kurzych następowało po 5-7 dobach trwania hodowli. Badany szczep bakterii w niesprzyjających warunkach środowiska tworzy biofilm. Skład egzopolimerycznej macierzy powstającego biofilmu w duŝym stopniu zaleŝy od składu podłoŝa. Zawierał on 1,3-9,2 mg% białek oraz 1-5 mg% polisacharydów. Na podłoŝu z keratyną piór, jako trudno dostępnym źródłem węgla i azotu, szczep B. subtilis B3 tworzył biofilm składający się w 84% z polisacharydów oraz w 16% z białka. Słowa kluczowe: keratynazy, proteazy, biofilm, Bacillus subtilis WSTĘP Bakterie z rodzaju Bacillus są znanymi producentami enzymów proteolitycznych, w tym równieŝ keratynaz. Keratynolityczne uzdolnienia wykazują takie gatunki, jak: B. licheniformis, B. pumilus, B. pseudofirmus, B. polymyxa, B. halodurans. Wydzielane pozakomórkowo enzymy naleŝą do alkalicznych proteaz serynowych oraz cysteinowych, a ich optymalna temperatura działania mieści się w przedziale 50-90 ºC [Rodziewicz i Łaba 2006]. Większość tych enzymów syntetyzowanych jest w wyniku indukcyjnego działania białek keratynowych obecnych w środowisku. W mechanizmie Praca finansowana w ramach projektu p.t. System stypendialny dla doktorantów Akademii Rolniczej we Wrocławiu, współfinansowany przez Unię Europejską z Europejskiego Funduszu Społecznego oraz budŝetu państwa w ramach Zintegrowanego Programu Operacyjnego Rozwoju Regionalnego. Adres do korespondencji Corresponding author: Anna Rodziewicz, Katedra Biotechnologii i Mikrobiologii śywności, Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu, ul. C.K. Norwida 25, 50-375 Wrocław, e-mail: arod@wnoz.ar. wroc.pl

62 A. Rodziewicz in. keratynolizy oprócz endopeptydaz uczestniczą równieŝ reduktazy dwusiarczkowe lub inne czynniki redukujące, takie jak cysteina, siarczek, siarczan (IV) czy glutation. W pierwszym etapie redukują one siarkę ze zrywanych mostków S-S cystyny do cysteiny i tiocysteiny: Cys-SS-Cys + H 2 S Cys-SH + Cys-SSH. W dalszym etapie odrywane są grupy aminowe z aminokwasów oraz siarka, która następnie jest wydzielana po uprzednim jej utlenieniu do siarczanu (VI) lub tiosiarczanu [Kunert 1989, 1992, Ramnani i in. 2005]. Redukcja mostków dwusiarczkowych cystyny poprzedza proteolizę, w której uczestniczą keratynazy i inne proteazy. Metabolizm siarki nie jest całkowicie jasny, ponadto przebiega odmiennie u organizmów pro- i eukariotycznych. Najbardziej efektywna keratynoliza zachodzi u dermatofitów, dla których jest ona podstawą ich wirulencji. Mikroorganizmy saprofityczne intensywniej degradują keratynę w warunkach tworzenia biofilmu. Bakterie z gatunku B. subtilis w odpowiednich warunkach zarówno syntetyzują keratynolityczne proteazy, jak i formują biofilm. Gatunek ten znany jest z tworzenia korzystnych biofilmów. Stwarza to moŝliwość zastosowania kontroli infekcji patogenów roślin, redukcji korozji stali, zastosowanie bioreaktorów biofilmowych w oczyszczaniu wody oraz do otrzymywania nowych substancji [Morikawa 2006]. Wtórna adhezja oraz dojrzewanie komórek bakterii w obrębie biofilmu są najwaŝniejsze w procesie jego tworzenia. W tych dwóch etapach następuje intensyfikacja wydzielania wszystkich składników egzopolimerycznej macierzy, a przede wszystkim białek oraz polisacharydów. Skład wydzielanej przez mikroorganizmy macierzy jest zaleŝny od wielu czynników, między innymi od składu środowiska, w którym powstaje biofilm [Tsuneda i in. 2003, Prakash i in. 2003]. Celem badań w prezentowanej pracy była ocena zdolności keratynolitycznych i proteolitycznych szczepu bakterii Bacillus subtilis B3 oraz charakterystyka składników pozakomórkowej macierzy biofilmu tworzonego przez te bakterie. MATERIAŁY I METODY Mikroorganizmy: Materiałem badawczym był pochodzący z kolekcji własnej Katedry Biotechnologii i Mikrobiologii śywności Akademii Rolniczej we Wrocławiu szczep B. subtilis B3 wyizolowany z gleby. Hodowle wgłębne bakterii prowadzono w kolbach Erlenmayera o pojemności 250 cm 3, w 50 cm 3 podłoŝa, w temperaturze 30 o C, przy wstrząsaniu 170 obr./min. Stosowano podłoŝe mineralne o składzie (%): MgSO 4 0,1; KH 2 PO 4 0,01; FeSO 4 7H 2 O 0,001; CaCl 2 0,01; wzbogacone ekstraktem droŝdŝowym 0,05. Podstawowym źródłem węgla i azotu były odtłuszczone pióra kurze koloru białego (1%). Inokulum stanowiła 24 h hodowla bakterii na bulionie z glukozą, którą dodawano w ilości 1 cm 3 na kolbę. Oznaczenia wykonywano w płynie pohodowlanym po odwirowaniu biomasy i składników nierozpuszczalnych przy 10000 g. Zdolność bakterii do degradacji keratyny oceniano na podstawie biosyntezy enzymów keratynolitycznych i proteolitycznych oraz wydzielania do środowiska wolnych grup tiolowych i aminowych. Aktywność keratynolityczną oznaczano przy uŝyciu keratyny rozpuszczalnej [Wawrzkiewicz i in. 1987]. Reakcję prowadzono w ph 7,5, w czasie 20 minut w temp. 40 o C. Jednostkę aktywności (AK) definiowano jako wzrost absorbancji (A 280 ) o 0,01 w przeliczeniu na 1 cm 3 płynu pohodowlanego na 1 minutę. Aktywność proteolityczną oznaczano na kazeinie (BDH). Reakcję prowadzono w ph 7,5, w czasie 20 minut, w temperaturze 30 o C. Jednostkę aktywności (JP) definiowano jako wzrost absorbancji (A 280 ) o 0,01 w Acta Sci. Pol.

Właściwości keratynolityczne... 63 przeliczeniu na 1 cm 3 płynu pohodowlanego na 1 minutę [Łaba i Rodziewicz 2004]. Obecność związków sulfhydrylowych oznaczano kolorymetrycznie, według metody Ellmana za pomocą DTNB (kwasu 5,5 -ditio-bis-2-nitrobenzoesowego) z cystaminą [Riener i in. 2002]. Uwalnianie aminokwasów oceniano na podstawie przyrostu wolnych grup aminowych w płynie hodowlanym, z uŝyciem kwasu trójnitrobenzenosulfonowego (TNBS) [Snyder i Sobociński 1975]. Tworzenie biofilmów przez bakterie: Powierzchnią adhezji dla bakterii były płytki szklane (2 x 2 cm) lub promienie piór strusich, znajdujące się w podłoŝu syntetycznym zawierającym 5 lub 20 g dm -3 glukozy [Ratto i in. 2001], a takŝe bulion z glukozą (10 g dm -3 ). Hodowle wstrząsane bakterii prowadzono przez 5 dób w temperaturze 28 C. Po kaŝdej dobie płytki szklane lub pióra strusie przemywano wodą destylowaną, a następnie poddawano obserwacji w mikroskopie świetlnym przy 400-krotnym powiększeniu. Obrazy utworzonych na płytkach szklanych biofilmów utrwalano kamerą CCD przy udziale oprogramowania komputerowego MS ELF. Z hodowli bakterii na tych samych podłoŝach izolowano składniki macierzy egzopolimerycznej po uprzednim wydzieleniu biomasy komórek. W celu wydzielenia sacharydów dodawano do płynu pohodowlanego roztworu NaCl do końcowego stęŝenia 0,9%, wstrząsano przez 20 min i wirowano przy 5 500 rpm przez 15 minut. Polisacharydy wytrącano z supernatantu etanolem o końcowym stęŝeniu 70%. Próby pozostawiano przez 1 dobę w temp +4 C, a następnie wirowano. Uzyskany osad zawieszano w wodzie destylowanej. Ilość polisacharydów oznaczano na podstawie ilości cukrów redukujących uzyskanych po kwaśnej hydrolizie metodą Dubois [Dubois i in. 1956]. Kwasy uronowe badano przy uŝyciu metody boranowej z 0,125% roztworem karbazolu wobec standardu kwasu galakturonowego [Bitter i Muir 1962]. Pomiary absorbancji wykonywano przy długości fali 530 nm. Białka, po odwirowaniu biomasy komórkowej, wytrącano z płynu pohodowlanego za pomocą TCA o stęŝeniu końcowym 2%, po czym pozostawiano w temp. 4 C przez 30 min, a następnie wirowano. Osad dwukrotnie przemywano 70% etanolem, zawieszano w wodzie destylowanej. Ilościowo białka oznaczono metodą Lowry ego [Lowry i in. 1951]. WYNIKI I DYSKUSJA Saprofityczne, przetrwalnikujące laseczki z gatunku B. subtilis zdolne są do degradacji róŝnych biopolimerów. RównieŜ włókienkowe białka keratynowe mogą być dla nich źródłem węgla i azotu [Kim i in. 2001]. Uzdolnienia proteolityczne tych bakterii niezbędne są w procesie keratynolizy. W badaniach wcześniejszych wykazano, Ŝe zdolność do degradacji keratyny piór nie jest cechą gatunkową drobnoustrojów, ale charakteryzuje mikroorganizmy o wysokich uzdolnieniach proteolitycznych [Rodziewicz i Łaba 2005]. Aktywność proteolityczna pozakomórkowych enzymów wydzielanych przez bakterie B. subtilis B3 do środowiska była na poziomie 11,25 JP po drugiej dobie i utrzymywała się, z niewielkim obniŝeniem, do siódmej doby (rys. 1). RównieŜ keratynazy, które specyficznie degradują keratynę, obecne były w środowisku przez pierwsze dwie doby, odpowiednio 3,9 i 3,35 AK, jednak ich poziom obniŝał się po kilku dniach trwania procesu (rys. 1). MoŜe to sugerować sekwencję działalności keratynaz i proteaz, co potwierdzają teŝ wydzielane do środowiska wolne grupy aminowe i tiolowe (rys. 2). NajwyŜszy poziom grup SH był w siódmej dobie i wynosił 5,5 µg cm -3, a grup amino- Biotechnologia 5(1-2) 2006

64 A. Rodziewicz in. wych odpowiednio 267 µg cm -3. W trakcie trwania siedmiodobowej hodowli w podłoŝu syntetycznym z keratyną jako źródłem węgla i azotu bakterie całkowicie degradowały keratynę piór, której struktury ulegały dezintegracji. Wysoka odporność keratyny na biodegradację jest spowodowana występowaniem w strukturze tego białka duŝej ilości sieciujących mostków dwusiarczkowych. Skuteczność rozkładu białka zaleŝy więc od stopnia ich redukcji z wytworzeniem cysteiny i tiocysteiny [Kunert 1989, 1992]. Wzrastająca w środowisku ilość grup SH i NH 2 jest symptomem keratynolizy zachodzącej z udziałem bakterii. Rys. 1. Biosynteza proteaz (A) i keratynaz (B) przez bakterie B. subtilis B3 Fig. 1. Biosynthesis of proteases (A) and keratinases (B) by bacteria B. subtilis B3 Acta Sci. Pol.

Właściwości keratynolityczne... 65 Rys. 2. Wydzielanie grup sulfhydrylowych (A) i aminowych (B) przez szczep B. subtilis B3 Fig. 2. Thiol (A) and amino (B) groups released by B. subtilis B3 strain Zdolność do tworzenia biofilmu przez bakterie jest jedną z najstarszych strategii ich rozwoju oraz przetrwania. Jest to jednocześnie proces złoŝony, zaleŝny od wielu róŝnych czynników. Bakterie B. subtilis B3 w podłoŝu mineralnym zawierającym 0,5% glukozy na powierzchni płytek szklanych utworzyły większe skupisko w porównaniu z podłoŝem bogatszym w ten związek. Obserwacje mikroskopowe przylegania komórek B. subtilis B3 do szklanych płytek w podłoŝu mineralnym z glukozą (2%) wykazały niewielkie skupiska nawet po 5 dobach (rys. 3 C, D). Pogorszenie warunków środowiska w poŝywce bulionowej skutkowało zmianą fenotypu mikrokolonii (rys. 3 A, B). Obecność keratyny piór strusich w podłoŝu zwiększała adhezję bakterii do tych powierzchni, czego następstwem było upłynnienie struktur keratynowych w kolejnych dobach hodowli (rys. 3 E, F). Niska zawartość przyswajalnego źródła węgla w środowi- Biotechnologia 5(1-2) 2006

66 A. Rodziewicz in. sku wzrostu mikroorganizmów indukowała adhezję do powierzchni płytek szklanych lub fragmentów piór strusich oraz wytworzenie egzopolimerycznych substancji (EPS) utrzymujących strukturę biofilmu [Castellans i in. 2002]. Egzopolimeryczna macierz poza mikrokoloniami stanowi główną masę biofilmu. Mogą ją tworzyć róŝne makromolekuły, tj.: polisacharydy, białka, kwasy nukleinowe, fosfolipidy i inne, jednak polisacharydy i białka są najwaŝniejsze. Polimery sacharydów odgrywają istotną rolę w kohezji i adhezji komórek, utrzymują integralność oraz odpowiadają za niezwykłą oporność bakterii. Często są to heteropolisacharydy o charakterze kwaśnym. Egzopolisacharydy drobnoustrojowe zabezpieczają komórki przed destrukcyjnym działaniem osmotycznych oraz oksydatywnych czynników [Czaczyk i Wojciechowska 2003, Myszka i Czaczyk 2006]. W dalszej części pracy w odrębnym postępowaniu izolowano z uzyskanej macierzy polisacharydy i białka oraz oceniano ich ilości i wzajemne proporcje. Badany szczep B. subtilis B3 tworzył biofilm, w którym zawartość polisacharydów była w granicach 1-5 mg%, co zaleŝało od składu podłoŝa i czasu trwania hodowli. W podłoŝu ubogim oraz w obecności piór strusich polisacharydy były wydzielane wcześniej (rys. 4). NajniŜsze ich ilości wykazano w podłoŝu bulionowym. Kwasy uronowe, zaliczane do polisacharydów kwaśnych, stanowiły niewielką część ogólnej ilości sacharydów w granicach do 1 mg%. W podłoŝach z 2% zawartością glukozy wykazano ich 0,6-0,92 mg%, natomiast w podłoŝach białkowych (bulion, pióra strusie) tylko 0,2-0,43 mg% (rys. 5). Ujemny ładunek kwasów uronowych sprzyja agregacji polisacharydów z innymi komponentami EPS, np. z białkami. Niektórzy autorzy twierdzą, Ŝe polisacharydy odgrywają istotną rolę w tworzeniu warstwy kondycjonującej, stwarzają korzystne warunki do adhezji. Nazywane są więc polisacharydami adhezyjnymi. Ich synteza odbywa się przy udziale specyficznego aparatu enzymatycznego charakterystycznego dla danego rodzaju mikroorganizmu oraz polisacharydu [Sutherland 2001]. W genomie bakterii z rodzaju Bacillus wykryto około 4100 genów kodujących białka, w tym pozakomórkowe [Hirose i in. 2000]. Rola białek w biofilmie jest inna i bardziej róŝnorodna: inicjują one i uczestniczą w adhezji poprzez adhezyny, pełnią funkcje enzymatyczne, informacyjne (autoinduktory) oraz w mniejszym stopniu strukturalne. Początkowo białka akumulowane są na powierzchni komórki, a później adsorbują się na powierzchni docelowej. Wzrost koncentracji białek w strefie międzyfazowej inicjuje pierwsze etapy adhezji. W kolejnych stadiach, gdy czas kontaktu między tymi powierzchniami wydłuŝa się, następuje sekrecja białek in situ, co prowadzi z jednej strony do nasilenia adhezji, a z drugiej zapewnia stabilne zakotwiczenie komórek na powierzchni docelowej [Czaczyk i Wojciechowska 2003]. W biofilmie występują unikatowe białka, których nie obserwuje się w hodowlach na podłoŝach kompleksowych. Bakterie B. cereus wytwarzały 10 nowych frakcji białek, z czego 4 charakterystyczne dla biofilmu [Oosthuizen i in. 2001, 2002]. Tjalsma i in [2000] pozakomórkowe białka podzielili na dwie grupy; do pierwszej zaliczyli enzymy takie jak: proteazy, lipazy, glikozydazy, DNA-zy, RNA-zy i inne, a do drugiej relatywnie małe cząsteczki białek regulujących gęstość komórek w biofilmie oraz sporulację mikroorganizmów. W warunkach niskiej podaŝy źródeł azotu bakterie dąŝą do minimalizacji wydatku energetycznego, a więc zahamowana jest synteza DNA, rrna, a co za tym idzie białka. W tych warunkach syntetyzowane są de novo białka specyficzne. Acta Sci. Pol.

Właściwości keratynolityczne... 67 1 doba (day) 5 doba (day) Rys. 3. Mikroskopowy obraz tworzenia biofilmu przez B. subtilis B3 na róŝnych podłoŝach. A, B bulion z glukozą; C F podłoŝe syntetyczne z glukozą (2%); A D przyleganie bakterii do płytek szklanych; E, F przyleganie bakterii do piór strusich Fig. 3. Microcopy picture of biofilm formation by B. subtilis B3 in different culture media. A, B nutrient broth with glucose; C F synthetic medium with glucose (2%); A D adhesion of bacterial cells to a glass plate surface; E, F adhesion of bacterial cells to a surface ostrich feather rachis Biotechnologia 5(1-2) 2006

68 A. Rodziewicz in. Rys. 4. Wydzielanie polisacharydów przez bakterie B. subtilis B3 w podłoŝach o róŝnym składzie, w obecności dodatkowych powierzchni. 1, 3, 4 podłoŝe syntetyczne z glukozą 2%; 2 podłoŝe syntetyczne z glukozą 0,5%; 5 bulion z glukozą 1%. W podłoŝach 2, 3, 5 obecne płytki szklane, w podłoŝu 4 pióra strusie Fig. 4. Release of polysaccharides by B. subtilis B3 strain in media of different composition, in the presence of additional surfaces. 1, 3, 4 synthetic medium with glucose 2%; 2 synthetic medium with glucose 0,5%; 5 nutrient broth with glucose 1%. Glass plates were present in media no 2, 3, 5; ostrich feathers were present in the medium no 4 Poziom białek zawartych w macierzy bakterii B. subtilis B3 w wysokim stopniu uzaleŝniony był od składu podłoŝa oraz dostępności węgla i azotu. W poŝywkach syntetycznych wykazano 3,7 mg% białek, podczas gdy na bulionie było ich 9,2 mg%, natomiast w poŝywce syntetycznej z dodatkiem piór strusich tylko 1,3 mg% (rys. 6). Wzajemne stosunki poszczególnych składników macierzy EPS po pierwszej dobie hodowli równieŝ wykazały znaczne róŝnice w zaleŝności od składu podłoŝa. Na podło- Ŝach syntetycznych z glukozą równowaŝne były ilości polisacharydów i białek, na bulionie dominowały białka (81,6%) a w podłoŝu syntetycznym z keratyną piór przewaŝały polisacharydy obojętne (77,1%) (rys. 7). Acta Sci. Pol.

Właściwości keratynolityczne... 69 Rys. 5. Kwasy uronowe obecne w biofilmie szczepu B. subtilis B3. 1, 3, 4 podłoŝe syntetyczne z glukozą 2%; 2 podłoŝe syntetyczne z glukozą 0,5%; 5 bulion z glukozą 1%. W podłoŝach 2, 3, 5 obecne płytki szklane, w podłoŝu 4 pióra strusie Fig. 5. Uronic acids in biofilm of B. subtilis B3 strain. present. 1, 3, 4 synthetic medium with glucose 2%; 2 synthetic medium with glucose 0,5%; 5 nutrient broth with glucose 1%. Glass plates were present in media no 2, 3, 5; ostrich feathers were present in the medium no 4 Tworzenie biofilmu przez bakterie B. subtilis B3 jest najczęściej odpowiedzią na pogorszenie warunków tlenowych, a takŝe odŝywczych. Ekspresja genów związanych z tym procesem obejmuje wiele róŝnych białek enzymatycznych, regulacyjnych, a takŝe charakterystycznych dla gatunku, np. gamma D,L glutaminianu (gamma PGA), który jest egzopolimerem podwyŝszającym interakcje powierzchni komórek [Morikawa 2006]. Głównym mechanizmem regulacji genów zaleŝnym od zagęszczenia komórek bakterii jest sygnalizator zagęszczenia (QS, ang. Quorum Sensing). Gdy poziom cząsteczek sygnałowych przekroczy wartość progową (wartość quorum), indukowana jest ekspresja genów, a następnie wywoływany efekt metaboliczny we wszystkich komórkach populacji [Czajkowski i Jafra 2006]. Biotechnologia 5(1-2) 2006

70 A. Rodziewicz in. Rys. 6. Białka zawarte w biofilmie bakterii B. subtilis B3. 1, 3, 4 podłoŝe syntetyczne z glukozą 2%; 2 podłoŝe syntetyczne z glukozą 0,5%; 5 bulion z glukozą 1%. W podłoŝach 2, 3, 5 obecne płytki szklane, w podłoŝu 4 pióra strusie Fig. 6. Concentration of soluble proteins formed in biofilm structure by B. subtilis B3 strain. 1, 3, 4 synthetic medium with glucose 2%; 2 synthetic medium with glucose 0,5%; 5 nutrient broth with glucose 1%. Glass plates were present in media no 2, 3, 5; ostrich feathers were present in the medium no 4 Acta Sci. Pol.

Właściwości keratynolityczne... 71 Rys. 7. Skład procentowy poszczególnych składników macierzy egzopolimerycznej biofilmu bakterii B. subtilis po pierwszej dobie hodowli. 1, 3, 4 podłoŝe syntetyczne z glukozą 2%; 2 podłoŝe syntetyczne z glukozą 0,5%; 5 bulion z glukozą 1%. W podłoŝach 2, 3, 5 obecne płytki szklane, w podłoŝu 4 pióra strusie Fig. 7. Composition of exopolymeric matrix of biofilm formed by B. subtilis B3 after one-day culture. 1, 3, 4 synthetic medium with glucose 2%; 2 synthetic medium with glucose 0,5%; 5 nutrient broth with glucose 1%. Glass plates were present in media no 2, 3, 5; ostrich feathers were present in the medium no 4 WNIOSKI 1. Szczep bakterii B. subtilis B3 syntetyzuje pozakomórkowe keratynazy i proteazy, które specyficznie degradują struktury białek keratynowych. 2. Obecność keratyny w środowisku hodowlanym indukuje bakterie B. subtilis B3 do tworzenia biofilmu o wysokiej zawartości polisacharydów, w którym degradacja tych trudno degradowalnych białek moŝe być bardziej efektywna. LITERATURA Bitter T., Muir H.M., 1962. A modified uronic acid carbazole reaction. Anal. Biochem., 4, 330 334. Castellans T., Ascencio F., Bashen Y., 2002. Starvation inducted changes in the cell surface of Azospirillum lipofeum. FEMS Microbiol. Ecol., 2000, 33, 1-9. Czaczyk K., Wojciechowska K., 2003. Tworzenie biofilmów bakteryjnych istota zjawiska i mechanizmy oddziaływań. Biotechnologia, 3(62) 180-192. Czajkowski R., Jafra S., 2006. Enzymatyczna degradacja laktonów acylo-l-homoseryny i jej potencjalne wykorzystanie w biokontroli i hamowaniu rozwoju infekcji. Biotechnologia, 2 (73), 49-64. Dubois M, Giles KA, Hamilton JK., 1956. Colorimetric method for determination of sugars and related substances. Anal. Chem., 28, 350-356. Biotechnologia 5(1-2) 2006

72 A. Rodziewicz in. Hirose I., Sano K., Shioda I., Kumano M., Nakamura K., Łamane K., 2000. Proteome analysis of Bacillus subtilis extracellular proteins: a two-dimensional protein electrophoretic study. Microbiology, 146, 65-75. Kim J.M., Lim W.J., Suh H.J., 2001. Feather degrading Bacillus species from poultry waste. Process Biochem., 37, 287. Kunert J., 1989. Biochemical mechanism of keratin degradation by the actinomycete Streptomyces fragies and the fungus of Microsporum gypseum: a comparison. J. Basic. Microbiol., 29, 597. Kunert J., 1992. Effect of reducing agents on proteolytic and keratinolytic activity of en zymes of Microsporum gypseum. Mycoses, 35, 343. Łaba W., Rodziewicz A., 2004. Biodegradacja odpadów keratynowych z przemysłu drobiowego przy udziale bakterii z rodzajów Bacillus i Sarcina. Acta Sci. Polon: Biotechnologia, 3 (1-2), 2004, 109-120. Lowry O.H., Rosenbrough N.J., Farr A.L., Randall R.J., 1951. Protein measurement with the folin phenol reagent. J. Biol. Chem., 193: 265-275. Morikawa M., 2006. Beneficial biofilm formation by industrial bacteria Bacillus subtilis and related species., J. Bioscen. Bioeng., 101, 1, 1-8. Myszka M., Czaczyk K., 2006. Ograniczona dostępność składników odŝywczych w środowisku wzrostu jako induktor zmian metabolicznych u bakterii heterotroficznych. Post. Mikrobiol., 45 (2), 87-95. Oosthuizen M. C., Steyn B., Theron J., Cosette P., Lindsay D., von Holy A., Brozel V. S., 2002. Proteome analysis reveals differential protein expression by Bacillus cereus during biofilm formation. Appl. Environ. Microbiol., 68 (6), 2770-2780. Oosthuizen M.C., Steyn B., Lindsay D., Brozel V.S., von Holy A., 2001. Novel method for proteomic investigation of a dairy associated Bacillus cereus Biofilm. FEMS Microbiol. Lett., 194, 47-51. Prakash B., Veeregownia B.M., Krishnappa G., 2003. Biofilms: a survival statery of bacteria. Curr. Sci., 85 (9), 1299-1304. Ramnani P., Singh R., Gupta R., 2005. Keratinolytic potential of Bacillus licheniformis RG1: structural and biochemical mechanism of feather degradation. Can. J. Microbiol., 51, 191-196. Rättı M., Murstrata A., Sikka-aho M., 2001. Strains degrading polysaccharides produced by bacteria from paper machines. Appl. Microbiol. Biotechnol., 57, 182-185. Riener C.R., Kada G., Gruber H.J., 2002. Quick measurement of protein sulfhydryl with Ellman s reagent and with 4,4 dithiodipyridine. Anal. Bioanal. Chem., 373, 266-276. Rodziewicz A., Łaba W., 2005 Biological degradation of feather keratin by saprophytic bacteria, Pol. J. Chem. Technol., 7 (2), 46-49. Rodziewicz A., Łaba W., 2006. Keratyny i ich biodegradacja. Biotechnol., 2 (73), 130-147. Snyder S.L., Sobociński P.Z., 1975. An improved 2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid method for the determination of amines. Anal. Biochem., 64, 284-288. Sutherland I.W., 2001. Polysacharides bacterial and fungal. Microbiology, 147, 3-9. Tsuneda S., Aikawa H., Hayashi H., Yuasa A., Hirata A., 2003. Extracellular polymeric substance responsible for bacterial adhesion onto solid surface. FEMS Microbiol. Lett., 223, 287-292. Tjalsma H., Bolhuis A., Jongbloed J.D.H., Bron S.,van Dijl J.M., 2000. Signal peptide- dependent protein transport in Bacillus subtilis: a genome-based survey of the secretome. Microbiol. Mol. Biol. Rev., 64, 515-547. Wawrzkiewicz K., Łobarzewski J., Wolski T., 1987. Intracellular keratinase of Trichophyton gallinae, J. Med. Vet. Mycol., 25, 261-268. Acta Sci. Pol.

Właściwości keratynolityczne... 73 KERATINOLYTIC ABILITES OF BIOFILM-FORMING BACILLUS SUBTILIS BACTERIA Abstract. Bacillus subtilis B3 strain during growth in a synthetic medium with feather keratin synthesize extracellular proteases exhibiting keratinolytic activity. These extracellular enzymes take part in biodegradation of keratin, which results in the rise of concentration of peptides, free amino acids and thiol groups. Complete liquification of chicken feathers was observed within 5-7 days of bacterial culture. The tested strain in disadvantageous conditions formed a biofilm. The composition of biofilm s exopolymeric matrix depends mainly on medium ingredients and contains 1,3-9,2 mg% of proteins and 1-5 mg% of polysaccharides. In a medium containing feather keratin as a hardly accessible source of carbon and nitrogen, the strain B.subtilis B3 formed biofilm composed of polysaccharides and proteins in 84% and 16%, respectively. Key words: keratinases, proteases, biofilm, Bacillus subtilis Zaakceptowano do druku Accepted for print: 20.11.2006 Biotechnologia 5(1-2) 2006