Zestaw SIT InHaVi Szybki Identyfikacyjny Test Szczepów Salmonella Infantis, Hadar oraz Virchow W związku z wprowadzeniem w 2011 roku przez Komisję UE zmian w rozporządzeniach nr 2160/3003 i 200/2010 w odniesieniu do ograniczenia częstości występowania serotypów Salmonella w dorosłych stadach hodowlanych gatunku Gallus gallus 1, które kładą szczególny nacisk na wykrywanie i identyfikację serowarów Salmonella, m.in.: S.Infantis, S.Hadar oraz S.Virchow, przygotowaliśmy dla Państwa skrócony zestaw surowic do serologicznej identyfikacji wymienionych szczepów. W skład zestawu wchodzą surowice, które służą do szczegółowej identyfikacji zalecanych szczepów. Istotnym jest rozpoznanie i potwierdzenie serologiczne bakterii Salmonella przy jednoczesnym wykluczeniu innych typów serologicznych o podobnym składzie antygenów rzęskowych (skrócony schemat Kauffmann-White-Le Minor znajduje się na stronie internetowej naszej Firmy www.immunolab.com.pl, w zakładce: do pobrania ). Informacje dla użytkownika Wprowadzenie Bakterie Salmonella są jedną z głównych przyczyn zatruć pokarmowych. Pośród bakterii z gatunku Salmonella enterica można wyróżnić 2579 różnych serotypów. Bakterie Salmonella posiadają antygeny somatyczne (O), otoczkowe Vi oraz rzęskowe (H). Ich identyfikacja jest niezbędna do prawidłowego serologicznego zakwalifikowania badanego szczepu. Antygen somatyczny (O) jest lipopolisacharydem, który można określać u bakterii pobranych z agarowego podłoża 1,5%. Natomiast antygeny rzęskowe (H) są białkami. Antygeny te są najlepiej wykształcone, gdy bakterie rosną na podłożu miękkim wg Garda. Istotną cechą bakterii Salmonella jest posiadanie jednej lub dwóch faz antygenów rzęskowych. W danym momencie tylko jedna faza ulega ekspresji, dlatego aby móc zidentyfikować drugą fazę często potrzebne jest zahamowanie ekspresji obecnej fazy dominującej. Pozwoli to na ujawnienie drugiej fazy (więcej: Hamowanie fazy dominującej). Wyprodukowane przez nas surowice zawierają przeciwciała przeciwko specyficznym antygenom somatycznym lub rzęskowym. Aglutynacja szkiełkowa przebiega na zasadzie przyłączania się przeciwciał do antygenów bakterii i tworzenia tzw. agregatów/strątów (Rys.1), które są widoczne gołym okiem. Tworzenie się aglutynatów jednocześnie powoduje zwiększanie przejrzystości kropli, w której zostały zawieszone bakterie. Rys. 1 Bakterie z zaznaczonymi antygenami Przeciwciała 1
Zastosowanie Surowice produkowane w Zakładzie Immunolab są króliczymi surowicami poliklonalnymi. Surowice w przygotowanym zestawie pozwalają na pełną identyfikację serologiczną szczepów Salmonella Infantis, Salmonella Hadar oraz Salmonella Virchow zgodnie z zaleceniami 1). Skład Surowice do aglutynacji pałeczek Salmonella są wykonane z surowic królików szczepionych inaktywowanymi szczepami bakterii. Są one kontrolowane z zestawami szczepów Salmonella i preparowane w rozcieńczeniach pozwalających na uzyskanie czytelnego odczytu w krótkim czasie. Surowice są rozcieńczone w 0,85% NaCl i konserwowane 0,01% mertiolatem w postaci gotowej do użycia. Zestaw SIT InHaVi zawiera 15 buteleczek surowic wraz z zakraplaczami: HM; OC po 5 ml, O:6,7; O:7; O:8; H:z 10 ; H:enx; H:x; H:nz 15 ; H:r; H:2; H:5, H:6, H:7 po 3 ml każda oraz H:r 2 ml do hamowania reakcji niepożądanych. Dodatkowo dołączamy buteleczkę 3% roztworu soli NaCl oraz podłoże Garda do przygotowania 5x0,5l Podłoża miękkiego wg Garda, którego skład wspomaga rozwój antygenów rzęskowych bakterii Salmonella. Instrukcja szczegółowa Sposób postępowania Po przeprowadzeniu testów biochemicznych, których wyniki sugerują, że badane szczepy należą do rodzaju Salmonella należy: 1. Badane szczepy hodować w temperaturze 37 0 C przez 20 godzin na podłożu stałym (dla określenia antygenów somatycznych 1,5% agar odżywczy, dla antygenów rzęskowych podłoże miękkie wg Garda). 2. Wykonać test aglutynacji szkiełkowej (więcej: Schemat kolejności postępowania) Przed użyciem doprowadzić surowice do temperatury pokojowej (18-24ºC). W przypadku zmętnienia surowice odwirować przy 4000-5000 RPM przez 30 min. Wykonywanie identyfikacji należy zacząć od sprawdzenia szczepu z 3% roztworem NaCl. Jeśli wystąpi aglutynacja, oznacza to, że szczep jest w fazie szorstkiej i wykazuje auto-aglutynację. Takiego szczepu nie można identyfikować serologicznie. Następnie przeprowadza się aglutynację z poliwalentną surowicą HM. Pozytywny wynik potwierdza, że badany szczep należy do rodzaju Salmonella. Wykonanie: I. Na odtłuszczonym szkiełku podstawowym umieścić kroplę NaCl lub surowicy. II. Opaloną, ostudzoną ezą lub jałową bagietką pobrać szczep z podłoża i umieścić obok kropli. Rozcierać szczep na szkiełku łącząc z surowicą tak, aby powstała jednolita zawiesina o mlecznym kolorze. Eza 2
III. Kołysząc lekko szkiełkiem ruchem kolistym przez 10 30 sekund (najdłużej do 1 minuty!) obserwować wynik reakcji. Uważać, aby kropla nie ściekła ze szkiełka. Aglutynacja +++ Brak aglutynacji aglutynaty zwiększanie się przezroczystości kropli brak strątów mleczna kropla Aglutynacja jest lepiej widoczna, jeśli wynik reakcji obserwuje się nad ciemnym tłem. NIE DOPUSZCZAĆ DO WYSCHNIĘCIA KROPLI, GDYŻ DAJE TO WYNIK FAŁSZYWIE POZYTYWNY. Wykonać badanie z surowicą OC. Pozytywna reakcja pozwala na wstępne określenie grupy serologicznej. [Brak reakcji wskazuje ma konieczność prowadzenia badań z dalszymi surowicami dla antygenów grupowych. Oznacza to, że w badanym materiale nie ma bakterii S. Infantis, S. Hadar ani S. Virchow, ale mogą być inne szczepy Salmonella]. Do przeprowadzenia pełnej identyfikacji antygenów rzęskowych należy posiać bakterie na podłoże z agarem miękkim 0,5% wg Garda i inkubować w 37 0 C przez 20 godzin. Materiał do aglutynacji pobiera się z obrzeży porośniętego obszaru płytki.! Należy pamiętać o tym, że samo potwierdzenie obecności pożądanych antygenów nie wystarczy. Trzeba wykluczyć możliwe występowanie innych antygenów, które odróżniają szczepy Salmonella od S. Infantis, S. Hadar oraz S. Virchow. Poniżej przedstawione są właściwe wyniki reakcji potwierdzające obecność Salmonella Infantis (Tabela 1), Salmonella Hadar (Tabela 2) oraz Salmonella Virchow (Tabela 3): Tabela 1 Salmonella Infantis [6,7:r:1,5] Faza I Faza II Sól/surowica 3% NaCl HM OC O:6,7 O:7 O:8 H:r H:2 H:5 H:6 H:7 Wynik - +++ +++ +++ +++ - +++ - +++ - - +++ reakcja dodatnia, aglutynacja widoczna gołym okiem - reakcja ujemna, brak aglutynacji, mleczna zawiesina 3
Tabela 2 Salmonella Hadar [6,8:z 10 :enx] Faza I Faza II Sól/surowica 3% NaCl HM OC O:6,7 O:7 O:8 H:z 10 H:enx H:x H:nz 15 Wynik - +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++/++ +++/++ +++ reakcja dodatnia, aglutynacja widoczna gołym okiem - reakcja ujemna, brak aglutynacji, mleczna zawiesina Tabela 3 Salmonella Virchow [6,7:r:1,2] Faza I Faza II Sól/surowica 3% NaCl HM OC O:6,7 O:7 O:8 H:r H:2 H:5 H:6 H:7 Wynik - +++ +++ +++ +++ - +++ +++/++ - - - +++ reakcja dodatnia, aglutynacja widoczna gołym okiem - reakcja ujemna, brak aglutynacji, mleczna zawiesina Dodatkowe informacje potrzebne do identyfikacji szczepu Salmonelli Jeśli można wykryć aglutynację tylko z jedną fazą, oznacza to, że faza ta dominuje. W związku z tym należy zahamować fazę dominującą, żeby sprawdzić drugą fazę. Hamowanie fazy dominującej polega na dodaniu do miękkiego agaru 0,5% wg Garda surowicy z przeciwciałami przeciwko antygenom silnej fazy. Hamowanie fazy dominującej Hamowanie przeprowadza się na płytkach z agarem miękkim wg metody S. Garda, w sytuacji, gdy silne występowanie jednej z faz uniemożliwia wykrycie drugiej fazy szczepu. Warto zwrócić uwagę, że szczepy S. Virchow oraz S. Infantis różnią się tylko jedną fazą. Z tego powodu bardzo ważne jest zidentyfikowanie fazy H:1,2 (dla S. Virchow) lub H:1,5 (dla S. Infantis). W sytuacji, gdy badany szczep wykazuje silną aglutynację z surowicą H:r i jednocześnie nie można wykryć drugiej fazy, należy zahamować fazę H:r wg poniżej procedury. Sposób postępowania: 1. Upłynnić przygotowany wg przepisu agar miękki 0,5% wg Garda w kuchence mikrofalowej i schłodzić do temperatury 45 C. 2. Nakropić zakraplaczem na środek dna małej, sterylnej płytki Petriego (Ø ok.5 cm) 5 kropli surowicy H:r do hamowania. 3. Do nakropionej surowicy dodać ok. 10 ml agaru miękkiego 0,5% wg Garda i wymieszać delikatnie kołysząc płytką. 4. Pozostawić płytki w temperaturze pokojowej, aż do stężenia agaru. (Nie suszyć!) 5. Za pomocą ezy pobrać hodowlę z płytki agarowej i zaszczepić na podłożu agarowym w centralnej części płytki. 6. Inkubować przez noc w temperaturze 37 C. 7. Materiał z peryferyjnych części płytki jest odpowiedni do wykonania aglutynacji szkiełkowej. Jeśli dominująca faza H nie została zahamowana, należy powtórzyć procedurę. (Materiał do zaszczepienia należy pobrać z płytki, na której przeprowadzano wcześniejsze hamowanie). 4
Przechowywanie i środki ostrożności Surowice należy przechowywać w temperaturze od 2 0 C do 8 0 C. - NIE ZAMRAŻAĆ!. Chronić od światła. Czasami po przedłużonym okresie przechowywania widoczna jest mętność spowodowana wytrąceniem lipoprotein, które można usunąć poprzez poddanie surowicy wirowaniu (4000-5000 RPM przez 30 min). Nie stosować po upływie terminu ważności zamieszczonego na opakowaniu. 1) ROZPORZĄDZENIE KOMISJI (UE) NR 517/2011 z dnia 25 maja 2011 r. w sprawie wykonania rozporządzenia (WE) nr 2160/2003 Parlamentu Europejskiego i Rady w odniesieniu do unijnego celu ograniczenia częstości występowania niektórych serotypów Salmonelli w stadach kur niosek gatunku Gallus gallus oraz zmieniające rozporządzenie (WE) nr 2160/2003 i rozporządzenie Komisji (UE) nr 200/2010 (Tekst mający znaczenie dla EOG) Artykuł 4 Zmiana w rozporządzeniu (UE) nr 200/2010 W art. 1 ust. 1 akapit pierwszy otrzymuje brzmienie: 1. Od dnia 1 stycznia 2010 r. cel unijny, o którym mowa w art. 4 ust. 1 rozporządzenia (WE) nr 2160/2003, dotyczy ograniczenia występowania serotypów salmonelli spp. w stadach hodowlanych gatunku Gallus gallus (cel unijny) do poziomu nieprzekraczającego 1 % maksymalnego udziału procentowego dorosłych stad hodowlanych gatunku Gallus gallus z wynikiem dodatnim w odniesieniu do Salmonelli Enteritidis, Salmonelli Infantis, Salmonelli Hadar, Salmonelli Typhimurium, w tym jednofazowej Salmonelli Typhimurium o wzorze antygenowym 1,4,[5],12:i:- i Salmonelli Virchow (przedmiotowe serotypy salmonelli).. 26.5.2011 Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej L 138/45 Producent Zakład Badawczo-Wdrożeniowy Ośrodka Salmonella IMMUNOLAB Sp. z o.o. Adres: 81-451 Gdynia, Al. Zwycięstwa 96/98 Tel./Fax: 058 781-44-91 E-mail: info@immunolab.com 5
Schemat kolejności wykonywania testu aglutynacji szkiełkowej Szczep bakteryjny po przeprowadzeniu szeregu biochemicznego podejrzewany o przynależność do rodzaju Salmonella (posiany na agar 1,5%) Aglutynacja wstępna z 3% NaCl [+++] [ - ] Aglutynacja obecna - - szczep szorstki; Szczep nie może zostać zidentyfikowany. Brak aglutynacji Aglutynacja wstępna z surowicą HM [ - ] [+++/++] Brak aglutynacji - - szczep nie należy do rodzaju Salmonella Aglutynacja obecna Identyfikacja z surowicą OC [ - ] [+++/++] Brak aglutynacji - - szczep nie należy do grupy OC Aglutynacja obecna Identyfikacja z surowicami O O:6,7 ; O:7 ; O:8 wg tabeli 1, 2 i 3 O:6,7 O:7 O:8 O:6,7 O:7 O:8 +++ - +++ +++ +++ - Przesianie bakterii na podłoże miękkie wg Garda (pobieranie materiału z obrzeży porośniętej strefy) Identyfikacja z odpowiednimi surowicami H wg tabeli 1, 2 i 3 H:z 10 H:enx H:nz 15 H:x H:r H:2 H:5 H:6 H:7 H:r H:2 H:5 H:6 H:7 +++ +++ +++/++ +++/++ +++ +++/++ - - - +++ - +++ - - Salmonella Hadar Salmonella Virchow Salmonella Infantis 6