Komórki macierzyste mają potencjał do samoodnowy i różnicowania we wszystkie tkanki

Komórki macierzyste a starzenie STRESZCZENIE Komórki macierzyste mają potencjał do samoodnowy i różnicowania we wszystkie tkanki organizmu. W dorosłym organizmie są odpowiedzialne za utrzymanie homeostazy oraz regenerację uszkodzonych narządów. Najnowsze badania sugerują, że komórki macierzyste ulegają starzeniu. Zarówno starzenie jak i apoptoza komórek macierzystych ma na celu przeciwdziałanie ich transformacji nowotworowej. Z drugiej jednak strony, spadek liczby i funkcjonalności komórek macierzystych postępujący wraz z wiekiem wpływa niekorzystnie na kondycję całego organizmu i wydaje się mieć bezpośredni wpływ na jego starzenie. Upośledzenie zdolności do samoodnowy i różnicowania komórek macierzystych jest wynikiem zachodzących w nich zmian genetycznych i epigenetycznych. Ogromny wpływ na tempo i rodzaj tych zmian ma mikrośrodowisko (nisza), w jakim rezyduje komórka macierzysta, a także wzajemne oddziaływania: komórka macierzysta - mikrośrodowisko. Z kolei nisza kształtowana jest w dużej mierze przez zmiany ogólnosystemowe, które zachodzą w starzejącym się organizmie. Co ciekawe, zmiany te mogą być odwracalne. Zarówno modyfikacje środowiskowe (np. dieta niskokaloryczna, hipoksja), jak i genetyczne mogą doprowadzić do uzyskania tzw. indukowanej pluripotencji. Przedstawione w niniejszej pracy najnowsze odkrycia dotyczące starzenia komórek macierzystych mogą mieć istotne znaczenie nie tylko w poznaniu biologii komórek macierzystych oraz mechanizmów starzenia, zarówno komórkowego, jak i starzenia organizmu, ale także w związku z wielkimi nadziejami, jakie wiąże się z wykorzystaniem komórek macierzystych w medycynie regeneracyjnej oraz w leczeniu chorób związanych z wiekiem. WPROWADZENIE Termin,,komórki macierzyste został po raz pierwszy użyty przez rosyjskiego histologa Aleksandra Maksimova w 1908 roku w odniesieniu do hematopoetycznych komórek macierzystych (HSC, ang. hematopoietic stem cells). Według klasycznej definicji za komórki macierzyste (SC, ang. stem cells) uznaje się prymitywne, niewyspecjalizowane komórki, które mają zdolność do samoodnowy oraz do różnicowania w bardziej wyspecjalizowane komórki potomne, które budują tkanki i narządy [1]. Komórki macierzyste dzielą się w sposób asymetryczny lub symetryczny. W wyniku podziału asymetrycznego powstaje komórka potomna, która zachowuje zdolność do samoodnowy oraz bardziej zróżnicowana komórka progenitorowa. Z kolei rezultatem podziału symetrycznego są albo dwie komórki macierzyste albo dwie komórki progenitorowe [2]. Istnieją dwa systemy klasyfikacji SC. Można je podzielić w oparciu o pochodzenie i wtedy wyróżniamy SC: embrionalne, płodowe, somatyczne (tkankowo specyficzne), komórki macierzyste z krwi pępowinowej oraz indukowane pluripotentne komórki macierzyste (ipsc, ang. induced pluripotent stem cells). Drugi system klasyfikacji oparty jest na potencjale SC do różnicowania i wtedy dzielimy je na komórki: totipotentne, pluripotentne, multipotentne i unipotentne. Źródłem komórek totipotentnych jest zarodek od etapu zygoty do etapu moruli. Takie komórki zdolne są do wytworzenia całego organizmu, także tkanek pozazarodkowych, czyli łożyska i błon płodowych. Komórki pluripotentne można wyizolować z węzła zarodkowego 5 6-dniowej blastocysty. W trakcie rozwoju węzeł zarodkowy tworzy dwie warstwy: hipoblast, z którego powstaje pęcherzyk żółtkowy i epiblast. W epiblaście znajdują się właśnie komórki pluripotentne, które mogą różnicować we wszystkie rodzaje komórek wywodzących się z trzech listków zarodkowych: endodermy, ektodermy i mezodermy. Komórką multipotentną nazywa się taką, która może różnicować w obrębie więcej niż jednej linii komórek. Przykładem takiej komórki jest HSC. W końcu, tkankowo ukierunkowane dojrzałe komórki macierzyste, które są unipotentne, mogą specjalizować się w ramach jednej tkanki [3]. Halina Waś Joanna Czarnecka Pracownia Molekularnych Podstaw Starzenia, Instytut Biologii Doświadczalnej im. Marcelego Nenckiego PAN, Warszawa Pracownia Molekularnych Podstaw Starzenia, Instytut Biologii Doświadczalnej im. Marcelego Nenckiego PAN, ul. Pasteura 3, 02-093 Warszawa; tel.: (22) 589 24 36, e-mail: h.was@nencki.gov.pl Artykuł otrzymano 30 marca 2014 r. Artykuł zaakceptowano 10 kwietnia 2014 r. Słowa kluczowe: komórka macierzysta, starzenie komórkowe, nowotworowa komórka macierzysta, reprogramowanie komórkowe Wykaz skrótów: CSC (ang. cancer stem cell) nowotworowa komórka macierzysta; DDR (ang. DNA damage response) ścieżka odpowiedzi na uszkodzenie DNA; ipsc (ang. induced pluripotent stem cell) indukowana pluripotentna komórka macierzysta; SC (ang. stem cell) komórka macierzysta; SP (ang. side population) populacja boczna; TGF-β (ang. transforming growth factor β) transformujący czynnik wzrostu typu beta; Wnt (ang. Wingless/ integration signaling pathway) szlak sygnałowy Wnt; VSEL (ang. very small embryonic like stem cell) bardzo małe komórki macierzyste o cechach komórek embrionalnych Podziękowania: Badania prowadzone przez autorów niniejszej pracy przeglądowej są finansowane ze środków na naukę przyznanych na realizację projektów przez: Ministerstwo Nauki i Szkolnictwa Wyższego IP2012/062172 i Fundację na rzecz Nauki Polskiej 125/UD/ SKILLS/2013. W trakcie badań nad embrionalnymi komórkami macierzystymi (ESC, ang. embryonic stem cells) wykazano istnienie specyficznych dla nich znaczników molekularnych. Ta wiedza wykorzystywana jest obecnie podczas identyfikacji i izolacji komórek macierzystych. Do markerów tych należą czynniki transkryp- Postępy Biochemii 60 (2) 2014 161

cyjne: Oct-4 (ang. octamer-binding transcription factor-3/4, inaczej zwany POU5F1, ang. POU domain, class 5, transcription factor 1) i Nanog, które odgrywają istotną rolę nie tylko we wczesnych etapach rozwoju embrionalnego, ale także w utrzymaniu pluripotencji komórek macierzystych [4]. Białka TRA-1-60 oraz TRA-1-81 również występują na powierzchni ludzkich embrionalnych i pluripotentych komórek macierzystych. Wykorzystuje się je także do identyfikacji ipsc. Z kolei, obecność białek z rodziny SSEA (ang. stage specific embryonic antigen), SSEA-3 i SSEA-4 wykazano na powierzchni embrionalnych komórek macierzystych, ludzkich embrionalnych komórek rozrodczych i w ludzkich potworniakach [5]. Komórki macierzyste charakteryzują się występowaniem na swojej powierzchni również kompletu specyficznych białek CD (ang. cluster of differentiation), na przykład HSC wykazują obecność antygenów: CD34, CD59, CD117 oraz CD133 [6]. Identyfikację komórek macierzystych można zatem przeprowadzać potwierdzając obecność markerów macierzystości lub wykluczając obecność markerów komórek zróżnicowanych danej tkanki. Poza syntezą specyficznych białek, komórki macierzyste wykazują aktywację szczególnych ścieżek sygnałowych takich jak Wnt, Notch, czy Hedgehog. Aktywacja tych ścieżek konieczna jest do utrzymania zdolności SC do samoodnowy oraz różnicowania [7]. Białka z rodziny Frizzled również są syntetyzowane w ludzkich i mysich ESC. Są to receptory, które są elementem ścieżki Wnt/ β-katenina [5]. Ścieżka Wnt (ang. wingless/ integration signaling) podobnie jak oś czynnika wzrostu pochodzenia stromalnego oraz jego receptora, SDF-1/ CXCR- 4 (ang. stromal derived factor-1/ C-X-C chemokine receptor type 4) reguluje zdolność komórek macierzystych szpiku do migracji. W oddziaływaniu SC z mikrośrodowiskiem bierze udział także transformujący czynnik wzrostu typu beta (TGF-β, ang. transforming growth factor) [8]. Cripto-1, należący do grupy receptorów TGF-β, pełni ważną rolę nie tylko w rozwoju embrionalnym, ale także w utrzymaniu niezróżnicowanego stanu ludzkich i mysich SC [5]. Z kolei, ścieżka Notch bierze udział w utrzymaniu somatycznych komórek macierzystych w stanie spoczynkowym np. komórek satelitarnych w nieuszkodzonym mięśniu [9]. W końcu, techniką wykorzystywaną do identyfikacji komórek macierzystych i ich lokalizacji jest określenie długości telomerów metodą telomappingu (ang. confocal telomere quantitative fluorescence in situ hybridization). W ten sposób scharakteryzowano mysie komórki macierzyste skóry, jelita cienkiego, jąder, rogówki i mózgu jako komórki o najdłuższych telomerach [10]. Komórki macierzyste można identyfikować również na podstawie testów funkcjonalnych. Zarówno mysie jak i ludzkie komórki embrionalne charakteryzuje wysoka aktywność alkalicznej fosfatazy (AP, ang. alkaline phosphatase) [11]. Z kolei, dzięki podwyższonej aktywności transporterów błonowych ABCG2 (ang. ATP-binding cassette sub-family G member 2), komórki macierzyste mają zdolność do pozbywania się toksyn oraz leków [12]. Cecha ta leży u podstaw tzw. oporności wielolekowej (MDR, ang. multidrug resistance) komórek macierzystych i znajduje praktyczne zastosowanie w ich identyfikacji. Wykorzystuje się w tym celu technikę polegającą na wyznaczeniu przy użyciu cytometru przepływowego tzw. populacji bocznej (SP, ang. side population), która charakteryzuje się zwiększoną zdolnością do usuwania barwnika fluorescencyjnego Hoechst 33342 [13]. Kolejny test stosowany w celu wykazania pluripotentnej natury SC to różnicowanie w obrębie tzw. ciał embrionalnych (EB, ang. embryoid bodies). Są to agregaty komórek SC, które tworzą się w warunkach, w których komórki nie przylegają do podłoża, a są zmuszone do wzrostu w zawiesinie. W tworzeniu tych agregatów bierze udział przede wszystkim E-kadheryna. Jest to białko zależne od Ca 2+, które jest istotne dla połączeń międzykomórkowych. E-kadheryna ulega nasilonej syntezie w nieróżnicowanych SC. W obrębie ciał embrionalnych dochodzi następnie do różnicowania w komórki pochodzące ze wszystkich trzech listków zarodkowych, czyli ekto-, endo- i mezodermy. W sytuacji, kiedy agregaty nie są hodowane w obecności dodatkowych czynników, SC najchętniej różnicują w kierunku ektodermy i linii neuronalnej. Odpowiedni skład pożywki hodowlanej powoduje, że komórki różnicują także do komórek wywodzących się z mezodermy i endodermy. W końcu, aby wykazać pluripotentne właściwości komórek in vivo podaje się je do myszy o upośledzonej odporności. Tworzą się wtedy potworniaki. Potworniaki są to łagodne nowotwory, które charakteryzują się bardzo szybkim wzrostem i są zbudowane z tkanek pochodzących ze wszystkich trzech listków zarodkowych. W obrębie takich guzów można znaleźć tkankę mięśniową, chrząstkę, włosy, zęby, czy nawet kości [14]. Przełomowym odkryciem w historii SC było opracowanie metod pozwalających na rutynowe uzyskiwanie linii mysich komórek zarodkowych [15,16]. Ludzkie embrionalne komórki macierzyste (hesc, ang. human embryonal stem cells) początkowo uzyskiwane były z blastocyst [17], bądź z pierwotnych komórek płciowych [18]. Obecnie hesc można otrzymać z jednego blastomeru pobranego na drodze mikromanipulacji, podczas której nie dochodzi do zniszczenia zarodka [19]. Znaczne nadzieje w ostatnich latach rozbudziły prace zespołu prof. Ratajczaka opisujące istnienie bardzo małych komórek macierzystych podobnych do komórek embrionalnych (VSEL, ang. very small embryonic- -like stem cells), które można wyizolować ze szpiku kostnego dorosłych myszy [20], a także z ludzkiej krwi pępowinowej [21]. VSEL mają średnicę ok. 2 4 μm, relatywnie duże jądro zawierające dużo euchromatyny, posiadają fenotyp CD45- - Lin - SCA-1 + i wykazują ekspresję genów Oct-4, Nanog, i Rex-1/ Zfp-42. VSEL, podczas hodowli na mioblastach linii C2C12 tworzą sfery podobne do ciał embrionalnych, a następnie mogą różnicować m.in. w kardiomiocyty, komórki nerwowe i komórki trzustki [20]. W ostatnich latach pojawiły się kontrowersje dotyczące VSEL. Według niektórych badaczy populacja komórek izolowanych ze szpiku kostnego dorosłych myszy [22,23], jak i z ludzkiej krwi pępowinowej [24,25] nie wykazuje cech komórek pluripotentnych. Wyizolowane komórki nie tworzą sferoidów podobnych do ciał embrionalnych, nie wykazują także potencjału do różnicowania w komórki linii hematopoetycznych. Natomiast badania innych zespołów potwierdzają potencjał VSEL do różnicowania w komórki nabłonka płuc [26], czy komórki kości [27]. Wymagane są dalsze badania w tym zakresie. Komórki macierzyste mają potencjał do samoodnowy i różnicowania we wszystkie tkanki organizmu. W dorosłym organizmie komórki macierzyste są odpowiedzialne za utrzymanie homeostazy oraz regenerację uszkodzonych tkanek. Stan równowagi organizmu ulega zaburzeniu w 162 www.postepybiochemii.pl

miarę starzenia, spada też jego zdolność do regeneracji 1. Starzenie komórek macierzystych jest niewątpliwie jedną z przyczyn starzenia się organizmu. Z drugiej strony, stanowi bardzo istotną barierę przeciwnowotworową. Poniżej zostały opisane losy komórek macierzystych w starzejącym się organizmie, mechanizmy starzenia, które ich dotyczą, a także nadzieje na odwrócenie tego procesu, jakie stwarza technologia indukowanej pluripotencji. Jednocześnie poruszono kwestie transformacji nowotworowej komórek macierzystych, a także ryzyka jakie niesie ze sobą reprogramowanie komórek prawidłowych i nowotworowych. STARZENIE REPLIKACYJNE I CHRONOLOGICZNE SOMATYCZNYCH KOMÓREK MACIERZYSTYCH Somatyczne komórki macierzyste są narażone na działanie tych samych czynników zewnątrz- i wewnątrzkomórkowych, które w komórkach bardziej zróżnicowanych i postmitotycznych prowadzą do zmian związanych z wiekiem. Komórki macierzyste wykształciły jednak mechanizmy, które powodują, że są one bardziej odporne na wszelkiego typu uszkodzenia. W połączeniu ze zdolnością do samoodnowy gwarantuje to utrzymanie homeostazy w organizmie również w okresie dojrzałości [28]. Generalnie somatyczne komórki macierzyste pozostają w stanie spoczynku (ang. quiescence). Jedynie okresowo wykazują nasiloną proliferację w odpowiedzi na uszkodzenie czy czynniki stresowe. Ostatnie doniesienia opisują nawet współistnienie dwóch subpopulacji somatycznych komórek macierzystych w przedziałach tkankowych mieszków włosowych, krypt jelita i szpiku kostnego. Jedna z tych subpopulacji jest stale aktywna, podczas gdy druga pozostaje w stanie spoczynku. Na przykładzie HSC wykazano, że subpopulacja aktywnych komórek macierzystych jest odpowiedzialna za codzienną odnowę komórek krwi. Z kolei subpopulacja komórek spoczynkowych pełni rolę rezerwuaru uzupełniającego straty w puli aktywnych komórek macierzystych, które są następstwem ich nasilonej proliferacji i różnicowania. Jak to możliwe, że dwie tak różne subpopulacje istnieją obok siebie? Okazuje się, że może to być kwestią przebywania SC w określonych niszach, które charakteryzują się odmiennym składem czynników wzrostowych. W przypadku komórek macierzystych mieszków włosowych, krypt jelita, czy szpiku wydaje się, że kluczową rolę odgrywają czynniki aktywujące ścieżkę Wnt, białka morfogenetyczne kości (BMP, ang. bone morphogenetic protein), czynnik wzrostu fibroblastów (FGF, ang. fibroblast growth factor), czy osteopontyna (OPN, ang. osteopontin). W strefie spoczynkowych komórek macierzystych szlak Wnt ulega zahamowaniu, a poziom białek BMP utrzymuje się na wysokim poziomie. W strefie komórek aktywnych sytuacja jest odwrotna. Mechanizm, który umożliwia współistnienie dwóch subpopulacji SC ma przynajmniej dwa zastosowania. Pula komórek spoczynkowych, w związku z niskim tempem proliferacji jest bardziej odporna nie tylko na starzenie replikacyjne, ale również transformację nowotworową. Zapewnia zatem długowieczność organizmu. Natomiast subpopulacja ak- 1 Tematyka ta została szerzej omówiona w artykułach Ewy Sikory Starzenie i długowieczność oraz Anny Bielak-Żmijewskiej, Wiolety Grabowskiej i Doroty Przybylskiej Rola starzenia komórkowego w starzeniu organizmu i chorobach związanych z wiekiem, zamieszczonych w niniejszym zeszycie Postępów Biochemii. tywna odpowiada za bieżącą odbudowę organizmu. Jednocześnie obie subpopulacje stanowią dla siebie swoisty rezerwuar przeciwdziałający wyczerpaniu którejkolwiek z puli (szczególnie subpopulacja spoczynkowa dla subpopulacji aktywnej) [2]. Występowanie subpopulacji SC spoczynkowych i aktywnych może mieć bardzo istotne implikacje w kontekście ich starzenia. W długożyjących organizmach, somatyczne komórki macierzyste przechodzą wiele rund podziałowych, szczególnie w stale odnawiających się tkankach takich jak krew, czy nabłonek jelit [29]. Replikacja DNA, która wiąże się ze skracaniem telomerów, rearanżacjami chromosomów i mutacjami punktowymi, nieuchronnie prowadzi do starzenia komórkowego [30]. Doświadczenia polegające na seryjnych transplantacjach szpiku, wyraźnie potwierdzają, że dorosłe komórki macierzyste mają ograniczony potencjał replikacyjny. Wykazano, że taka procedura prowadzi do spadku zdolności do samoodnowy, a także funkcjonalności HSC. Jednakże najnowsze badania zwracają uwagę na fakt, że doświadczenia tego typu narażają SC na nadmierny stres replikacyjny, związany chociażby z przeszczepianiem bardzo niewielkiej liczby komórek. Dodatkowo pozbawienie HSC ich naturalnego mikrośrodowiska może mieć istotny wpływ na ich multipotencjalność [7]. Doświadczenia wykonane przez Kamminga i wsp. potwierdzają jednak, że potencjał HSC izolowanych ze starszych myszy jest faktycznie niższy niż tych pobranych z młodszych zwierząt. Co ciekawe, przeszczepienie komórek macierzystych z młodszych osobników do starszych nie wpływa istotnie na wydłużenie ich życia [31]. Dorosłe komórki macierzyste są podatne również na zmiany związane z gromadzeniem się uszkodzeń, czyli starzenie chronologiczne. Takie starzenie zachodzi głównie w komórkach niedzielących się, takich jak neurony czy kardiomiocyty [32]. Agregaty białkowe, lipidowe, czy takie, które zawierają kwasy nukleinowe, mogą tworzyć stabilne kompleksy, które są toksyczne dla komórek [33]. Jak wspomniano powyżej, somatyczne komórki macierzyste wykazują wydłużone okresy spoczynku w większości tkanek ssaczych, a szczególnie w mózgu, mięśniach czy wysepkach trzustkowych [2]. W związku z tym mogą akumulować uszkodzone makrocząsteczki, zupełnie jak komórki postmitotyczne. Co więcej, specyficzne makrocząsteczki lub ich konglomeraty mogą wybiórczo akumulować się w komórkach macierzystych, jako że ich zdolność do samoodnowy wiąże się z podziałami asymetrycznymi [34]. Przykładem tkanki postmitotycznej są mięśnie szkieletowe, które wykazują bardzo znikomy potencjał proliferacyjny w warunkach homeostazy. Jednocześnie dzięki komórkom satelitarnym posiadają ogromną zdolność do regeneracji w odpowiedzi na uszkodzenie, czy stan chorobowy. W związku z tym, komórki satelitarne są świetnym przykładem spoczynkowych SC, które podlegają starzeniu chronologicznemu. Analiza komórek satelitarnych spoczynkowych i aktywnych pochodzących od myszy młodych i starych wykazała wyraźnie, że wraz z wiekiem dochodzi do represji chromatyny w spoczynkowych SC mięśni, co ma związek z modyfikacjami histonów. Z jednej strony spada transkrypcja genów histonowych, a z drugiej rośnie metylacja typu H3K27me3. Wyniki tych badań, jak i badań przeprowadzonych na drożdżach Postępy Biochemii 60 (2) 2014 163

Rycina 1. Dwa modele opisujące funkcjonowanie komórek macierzystych. A. Pojedyncza populacja komórek macierzystych zlokalizowana jest w niszy. Podziały asymetryczne i symetryczne zapewniają równowagę pomiędzy subpopulacją samoodnawiającą się a różnicującą. B. Dwie subpopulacje komórek macierzystych: spoczynkowa i aktywna rezydują w sąsiadujących niszach. Unikatowy skład mikrośrodowiska, a szczególnie czynników wzrostowych definiuje właściwości każdej z subpopulacji. Pula spoczynkowych komórek macierzystych stanowi rezerwuar na wypadek wyczerpania się puli komórek aktywnych. W rzadkich przypadkach subpopulacja komórek aktywnych może odnowić pulę komórek spoczynkowych. Aktywne komórki macierzyste i komórki potomne hamują aktywację komórek spoczynkowych. Subpopulacja spoczynkowych komórek macierzystych narażona jest głównie na starzenie chronologiczne związane z gromadzeniem uszkodzonego DNA i białek. W związku z nasiloną aktywnością proliferacyjną subpopulacja aktywna ulega przede wszystkim starzeniu replikacyjnemu. sugerują, że mechanizmy epigenetyczne mogą mieć szczególny udział w starzeniu chronologicznym [35]. Wydaje się, że komórki macierzyste współistnieją w organizmie w postaci dwóch subpopulacji: spoczynkowej i aktywnej. Subpopulacja aktywna odpowiada za bieżącą odnowę i odbudowę tkanek, podczas gdy subpopulacja spoczynkowa stanowi swoisty rezerwuar SC. Najnowsze badania sugerują, że subpopulacja aktywna narażona jest bardziej na starzenie replikacyjne, podczas gdy spoczynkowa na chronologiczne (Ryc. 1). OGRANICZENIE PULI KOMÓREK MACIERZYSTYCH W WYNIKU STARZENIA Starzenie komórek macierzystych i komórek progenitorowych ma niewątpliwie niekorzystny wpływ na utrzymanie homeostazy w organizmie. Dowiedziono, że obecność markerów starzenia takich jak SA-β-galaktozydazy (SA-βgal, ang. senescence associated β-galactosidase), skupisk HP-1 (ang. heterochromatin protein-1) i p16 INK4a (p16) wzrasta w wielu tkankach ssaczych wraz z wiekiem [36]. Występowanie starych komórek macierzystych naskórka, trzustki, HSC i nerwowych komórek macierzystych (NSC, ang. neural stem cells) wykazano w mysich modelach zespołów segmentowego przyspieszonego starzenia oraz w innych modelach zwierzęcych, w których geny krytyczne dla zachowania homeostazy komórek macierzystych zostały wyłączone [7]. Nerwowe komórki macierzyste mają zdolność do samoodnowy i różnicowania we wszystkie komórki układu nerwowego, czyli: neurony, astrocyty i oligodendrocyty. W dorosłym mózgu neurogeneza zachodzi rzadko. Ma to miejsce podczas takich procesów jak: uczenie się, zapamiętywanie czy rozpoznawanie zapachów. Liczba NSC spada wraz z wiekiem, a produkcja nowych neuronów słabnie. Przekłada się to na upośledzenie funkcji poznawczych mózgu [37,38]. Jak pokazały wyniki badań in vitro z wykorzystaniem neurosfer oraz z użyciem modeli zwierzęcych, NSC izolowane ze starszych osobników cechuje spadek zdolności do samoodnowy w porównaniu do komórek pobranych od młodych zwierząt [38]. Dla kontrastu, pula NSC, neurogeneza oraz zdolności poznawcze pozostają zachowane na wysokim poziomie u myszy Ames dwarf i Snell dwarf. Są to myszy, które w wyniku genetycznych manipulacji pozbawione są hormonu wzrostu, prolaktyny oraz hormonu stymulującego tarczycę. Wykazano, że takie zwierzęta żyją dłużej i starzeją się później [39]. Badania kilku zespołów sugerują, że spadek liczby NSC wraz z wiekiem związany jest bezpośrednio z ich starzeniem. Spadek liczby i tempa proliferacji progenitorów w strefie podkomorowej mózgu, ich zdolności do samoodnowy, a także neurogenezy w opuszkach węchowych koreluje ze wzrostem poziomu p16 w starzejącym się mysim mózgu [40]. Co więcej, białko Bmi-1 należące do grupy białek PcG (ang. polycomb-group proteins) odgrywa istotną rolę w podtrzymaniu zdolności NSC do samoodnowy ponieważ negatywnie reguluje p21 WAF1/ CIP1 (p21) w embrionalnych NSC oraz p16 i p19 ARF (p19) w dorosłych NSC [40]. Co ciekawe, mechanizm regulacji p16 i p19 w NSC pochodzących z płodów lub młodych zwierząt jest inny. Wydaje się, że jest on kontrolowany przez białko HMGA2 (ang. high-mobility group A protein), które moduluje transkrypcję wielu genów poprzez wpływ na strukturę chromatyny. HMGA2 ulega nasilonej syntezie w NSC, a jego poziom spada wraz z wiekiem [37]. Białko p16 wydaje się pełnić rolę również w starzeniu komórek macierzystych trzustki. Wyłączenie genu INK4a/ARF (p16) prowadzi do wzrostu tempa proliferacji i poprawy funkcjonowania SC trzustki u starszych zwierząt [41]. Rolę czynników z rodziny FoxO (ang. Forkhead box, subgroup O) w starzeniu komórek macierzystych wykazano nie tylko na przykładzie NSC [38], ale też HSC [42]. Renault i wsp. zaproponowali, że FoxO3a kontroluje pulę NSC poprzez utrzymywanie ich w stanie spoczynku, hamowanie przedwczesnego różnicowania oraz regulowanie odpowiedzi na hipoksję [38]. Natomiast, w przypadku HSC brak FoxO3a powoduje spadek zdolności do samoodnowy i podtrzymywania hematopoezy, upo- 164 www.postepybiochemii.pl

śledza zdolność do pozostania w stanie spoczynku i zwiększa wrażliwość na stres związany z podziałami. Wydaje się, że czynniki FoxO mogą wpływać na funkcjonowanie komórek macierzystych poprzez regulację poziomu reaktywnych form tlenu (ROS, ang. reactive oxygene species) [42]. Co ciekawe, w skórze, gdzie wraz z wiekiem dochodzi do akumulacji starych keratynocytów, nie dowiedziono obecności starych komórek macierzystych naskórka, chociaż już komórki progenitorowe wykazywały cechy starzenia [43]. W wyniku starzenia organizmu spada liczba komórek macierzystych m.in. w mózgu i wysepkach trzustkowych. Kluczową rolę w tym procesie wydają się pełnić inhibitory cyklu komórkowego p16 i p19, których podwyższona synteza koreluje z upośledzeniem zdolności do samoodnowy komórek macierzystych oraz spadkiem tempa proliferacji komórek progenitorowych. Zmniejszenie liczby komórek macierzystych prowadzi do zaburzenia homeostazy i zdolności do regeneracji w starzejącym się organizmie. OGRANICZENIE PULI KOMÓREK MACIERZYSTYCH W WYNIKU RÓŻNICOWANIA W odpowiedzi na stres genotoksyczny komórki macierzyste ulegają głównie apoptozie lub starzeniu [36]. Jednak w pewnych tkankach takich jak skóra, reakcją na uszkodzenie DNA jest głównie różnicowanie SC. To z kolei prowadzi do systematycznego ograniczenia ich puli wraz z wiekiem [7]. W mieszkach włosowych ssaków zlokalizowane są przynajmniej trzy typy komórek macierzystych, które odpowiadają za homeostazę skóry u ssaków. Są to naskórkowe komórki macierzyste, które różnicują w keratynocyty, komórki macierzyste mieszków włosowych odpowiedzialne za wzrost włosa oraz komórki macierzyste melanocytów (melanoblasty), które nadają włosom barwę. Mieszki włosowe podlegają stałej odbudowie przechodząc cykl składający się z 3 faz: fazy wzrostu (anagen), fazy regresji (katagen) i fazy spoczynku (telogen). Pigment produkowany jest przez zróżnicowane melanocyty w anagenie. Głównym czynnikiem transkrypcyjnym, który reguluje produkcję barwnika jest MITF (ang. microphthalmia-associated transcription factor). Z kolei MITF podlega kontroli przez hormon stymulujący melanocyty (MSH, ang. α-melanocyte-stimulating hormone) oraz jego receptor (MC1R, ang. melanocortin 1 receptor) [44]. Ubytek melanoblastów w mieszkach włosowych w połączeniu z przybywaniem zróżnicowanych, upigmentowanych melanocytów towarzyszy starzeniu zarówno u myszy jak i u ludzi. Siwienie włosów, jeden z najbardziej widocznych objawów starzenia, związane jest ze spadkiem liczby komórek macierzystych melanocytów [45,46]. Starzenie i/ lub stres genotoksyczny powoduje akumulację uszkodzeń DNA w komórkach macierzystych melanocytów, co prowadzi do utraty przez nie zdolności do samoodnowy [45]. Taka komórka, która posiada uszkodzone DNA, dzieli się symetrycznie na dwie bardziej zróżnicowane upigmentowane komórki potomne. W rezultacie nie dochodzi do stałej odbudowy puli SC i ich liczba systematycznie spada. Chociaż utrata przez komórki macierzyste zdolności do samoodnowy wydaje się nie mieć związku z poziomem syntezy p53, p16, czy p19, upośledzone mechanizmy naprawy DNA powodują, że komórki te różnicują w odpowiedzi na znacznie słabszy stres genotoksyczny [45]. Rzeczywiście, pacjenci z zespołem ataksja teleangiektazja (AT, ang. ataxia-telangiectasia) lub myszy pozbawione genu ATM (ATM, ang. ataxia telangiectasia mutated) wykazują przyspieszone siwienie [45]. Wyniki te sugerują, że utrzymanie integralności genomu i właściwej aktywacji ścieżki odpowiedzi na uszkodzenia DNA (DDR, ang. DNA damage response) ma istotne znaczenie dla zdolności melanoblastów do samoodnowy. Inne prace dowodzą, że ścieżka Wnt odgrywa ważną rolę w biologii komórek macierzystych melanocytów. Aktywacja tego szlaku towarzyszy podziałom SC, a jej inaktywacja stanom spoczynku [47]. Co ważne, stała aktywacja ścieżki Wnt prowadzi do nieprzerwanej proliferacji komórek macierzystych mieszków włosowych, która z kolei powoduje przyspieszone starzenie i w końcu utratę włosów [48]. Aby zachować pulę komórek macierzystych o wysokiej jakości, te, u których doszło do rozleglejszych uszkodzeń DNA są eliminowane z puli na drodze różnicowania. Wiążę się to z systematycznym zubożaniem liczby SC i spadkiem homeostazy organizmu. Kolejnym typem zmian, którym podlegają SC w starzejącym się organizmie jest spadek ich funkcjonalności i utrata specyficzności liniowej komórek progenitorowych. Dotyczy to m.in. komórek macierzystych krwi i mięśni. UTRATA SPECYFICZNOŚCI LINIOWEJ KOMÓREK PROGENITOROWYCH Somatyczne komórki macierzyste mogą być multipotentne, bipotentne lub unipotente w zależności od typu tkanki, w której rezydują [49]. Ta plastyczność komórek macierzystych gwarantuje homeostazę organizmu i zdolność do regeneracji w bardzo szerokim spektrum. Specyficzność liniowa komórek progenitorowych zależy przede wszystkim od czynników epigenetycznych, które wpływają na ekspresję odpowiednich genów [50]. Czynniki środowiskowe indukujące ścieżki sygnałowe takie jak Wnt, Notch oraz Hedgehog mają ogromny wpływ na epigenom komórek macierzystych [7]. Aktywacja ścieżek będąca wynikiem odziaływania starszego mikrośrodowiska/organizmu może prowadzić do nieprawidłowego ukierunkowania różnicujących komórek potomnych jak wykazano w przypadku mięśni szkieletowych, chrząstki oraz układu hematopoetycznego. Akumulacja takich nieprawidłowych komórek potomnych zaburza homeostazę tkanek i prowadzi do upośledzenia funkcjonowania organizmu wraz z wiekiem [7]. Aktywność komórek satelitarnych odpowiada za zdolność mięśni do regeneracji w odpowiedzi na uszkodzenie, czy chorobę [51]. Co ciekawe, komórki satelitarne izolowane z mięśni starych gryzoni znacznie częściej różnicują w kierunku adipocytów i fibroblastów niż w kierunku komórek mięśniowych [52,53]. W rezultacie, czas regeneracji uszkodzonych mięśni u starszych zwierząt ulega wydłużeniu, dochodzi do zwłóknienia, a powstające włókna mięśniowe charakteryzują się mniejszą średnicą [52,54]. Co ciekawe, procesy te można odwrócić podczas tzw. parabiozy heterochronicznej. Parabioza heterochroniczna polega na wytworzeniu wspólnego systemu krążenia poprzez zespolenie naczyniowe między starszym i młodszym osobnikiem. Stwierdzono, że pod wpływem czynników obecnych w su- Postępy Biochemii 60 (2) 2014 165

Rycina 2. Losy komórek macierzystych w starzejącym się organizmie. Uszkodzenia DNA prowadzą do zmian we właściwościach i funkcjonowaniu komórek macierzystych. Prowadzi to do spadku liczby komórek macierzystych, zaburzeń w homeostazie organizmu i zdolności do regeneracji w miarę starzenia organizmu. W zależności od rozległości uszkodzeń DNA komórka macierzysta może ulec apoptozie, różnicowaniu lub starzeniu. Wraz z wiekiem dochodzi również do zaburzeń w funkcjonowaniu tkanek i narządów, co ma związek z utratą specyficzności liniowej komórek progenitorowych. Na przykład komórki satelitarne mięśni zamiast różnicować w komórki mięśniowe różnicują w fibroblasty lub komórki tłuszczowe. Apoptoza, różnicowanie czy starzenie komórek macierzystych to naturalne mechanizmy przeciwnowotworowe, których celem jest eliminacja nieprawidłowych komórek macierzystych. Kiedy te mechanizmy zawodzą, komórki macierzyste ulegają transformacji nowotworowej. rowicy młodych myszy, w starszych zwierzętach warstwa kolagenu w miejscach regenerujących mięśni jest znacznie mniejsza niż przy parowaniu izochronicznym (zespolenie naczyniowe między dwoma starszymi osobnikami). Jednocześnie wzrasta tempo proliferacji progenitorów mięśniowych. Z kolei u młodych myszy, które były narażone na odziaływanie starszego organizmu, efekty są odwrotne [52,54]. Sugeruje to, że zmiany losu komórek progenitorowych mięśni zachodzą raczej w wyniku odziaływania środowiska lokalnego i/lub systemowego, a nie w rezultacie uruchomienia wewnątrzkomórkowego programu. Podstawowym szlakiem istotnym dla funkcjonowania satelitarnych komórek macierzystych jest ścieżka Notch [54]. Zahamowanie tego szlaku prowadzi do upośledzonej regeneracji w starzejących się mięśniach. Z kolei, wymiana czynników podczas parabiozy heterochronicznej przywraca aktywację ścieżki Notch, m.in. w wyniku wzrostu syntezy liganda dla receptora Notch - Delta, a w rezultacie zwiększa aktywność proliferacyjną i zdolności regeneracyjne komórek satelitarnych. Ponadto, we krwi starszych osobników stwierdzono obecność aktywatorów ścieżki Wnt. Co ważne, zablokowanie szlaku Wnt przywraca specyficzność liniową komórek satelitarnych [52]. Podobnie, poziom TGF-β jest wyższy w surowicy starszych osobników, zarówno myszy jak i ludzi [55] i wydaje się, że wspólnie z aktywatorami Wnt moduluje specyficzność liniową komórek satelitarnych. Spadek funkcjonalności układu odpornościowego oraz wyższe ryzyko zachorowania na białaczkę mieloidalną to dwa główne aspekty starzenia układu hematopoetycznego. Podobnie jak w przypadku komórek satelitarnych, HSC doświadczają zmian w kontekście specyficzności liniowej. Wraz z wiekiem dochodzi do zmian w udziale poszczególnych subpopulacji tworzących krew stosunek liczby komórek o charakterze mieloidalnym do liczby komórek o charakterze limfoidalnym zmienia się na korzyść tych pierwszych [56,57]. Analiza ekspresji genów HSC izolowanych ze zwierząt młodych i starych wykazała, że w miarę starzenia dochodzi do wyłączenia genów związanych z różnicowaniem w kierunku limfoidalnym, a wzrostem ekspresji genów odpowiedzialnych za różnicowanie w kierunku linii mieloidalnej. Co więcej, w HSC pobranych od starszych osobników wzrasta poziom ekspresji genów odgrywających rolę w transformacji białaczkowej [57]. Całkiem niedawno pojawiła się alternatywna hipoteza dotycząca starzenia HSC. Challen i wsp. sugerują, że w obrębie HSC występują dwa podtypy. Głównym kryterium, stosowanym w celu ich odróżnienia, to zdolność do usuwania barwnika Hoestch 33342, który używany jest do wyznaczenia populacji bocznej. Podtyp mieloidalny usuwa znacznik z wyższą wydajnością, pozostaje głównie w stanie spoczynku, odpowiada aktywacją na stymulację TGF-β1 oraz charakteryzuje się dłuższym cyklem życiowym. Dla kontrastu podtyp limfoidalny jest aktywny proliferacyjnie i żyje krócej, a stymulacja TGF-β1 prowadzi do jego inaktywacji [8]. Niezależnie od tego, czy starzenie HSC ma podłoże bardziej genetyczne, czy epigenetyczne, czy jest wypadkową zmian obu typów, faktem jest, że liczba komórek o charakterze limfoidalnym spada wraz z wiekiem. Prowadzi to do zaburzeń w funkcjonowaniu układu odpornościowego u starszych osobników takich jak osłabiona odporność, anemia czy nowotwory krwi [58]. Co więcej, starsi pacjenci onkologiczni poddani działaniu leków cytotoksycznych doświadczają bardziej dotkliwych efektów ubocznych związanych z upośledzeniem zdolności regeneracyjnych szpiku kostnego. W końcu, zaawansowany wiek dawcy szpiku kostnego wiąże się z wyższym ryzykiem śmierci biorcy [36]. Zaburzenia w homeostazie organizmu wiążą się z utratą specyficzności liniowej komórek progenitorowych. Komórki satelitarne różnicują w kierunku adipocytów lub fibroblastów, rośnie liczba komórek linii mieloidalnej. Prowadzi to do spadku funkcjonalności tkanek i narządów w miarę starzenia. Bardzo szczególnym przykładem procesu, podczas którego dochodzi do zmiany funkcji komórek jest nowotworzenie. Komórki nowotworowe nie poddając się ścisłej regulacji organizmu, tworzą niezależny twór. Apoptoza, starzenie czy różnicowanie komórek macierzystych to naturalne mechanizmy przeciwnowotworowe. Kiedy zawodzą, komórki ulegają transformacji nowotworowej. Proces ten nie tylko uszczupla pulę prawidłowych komórek macierzystych, ale też dramatycznie obniża długość i jakość życia (Ryc. 2). TRANSFORMACJA NOWOTWOROWA KOMÓREK MACIERZYSTYCH Zaawansowany wiek widnieje na pierwszym miejscu listy czynników korelujących z zachorowalnością na no- 166 www.postepybiochemii.pl

wotwory [59]. Trudności w leczeniu nowotworów wynikają głównie z ich heterogenności. Heterogenność to jedna z głównych cech zarówno nowotworów krwi, jak i guzów litych. Wydaje się, że jest wynikiem nie tylko zmian genetycznych i epigenetycznych, ale także oddziaływania komórek nowotworowych z mikrośrodowiskiem. Ponadto, istotne znaczenie dla heterogenności nowotworu wydaje się mieć obecność hierarchii w populacji. Model stochastyczny rozwoju nowotworu zakłada, że każda komórka w obrębie guza ma taki sam potencjał by zainicjować rozwój choroby. Idąc dalej, według teorii klonalnej ewolucji, każda komórka nowotworowa może potencjalnie przejść szereg zmian genetycznych czy epigenetycznych, które sprawią, że nabędzie oporności na różnego typu stres, np. związany ze wzrostem w warunkach przegęszczenia (niedobór substancji odżywczych i hipoksja), terapiami przeciwnowotworowymi czy procesem przerzutowania (nabycie zdolności do migracji i inwazji, zmiana niszy). W efekcie tych zmian komórka nowotworowa pozyskuje cechy, dzięki którym może się wydajnie dzielić i inicjować chorobę. Dla kontrastu, model hierarchiczny, zwany inaczej modelem opartym o istnienie nowotworowych komórek macierzystych, zakłada, że w obrębie populacji komórek nowotworowych tylko niewielka populacja ma zdolność do odtworzenia całego guza i odpowiada za jego heterogenność. Jest to właśnie populacja nowotworowych komórek macierzystych (CSC, ang. cancer stem cells). Model ten zyskał spore zainteresowanie w ostatnich latach, ponieważ obecność nowotworowych komórek macierzystych, które przez dłuższy czas pozostawałyby w stanie spoczynku, mogłoby tłumaczyć zjawisko wznowy choroby po długich okresach remisji, a także nabywanie oporności na radio- czy chemioterapię [60]. Po raz pierwszy CSC zidentyfikowano w przypadku białaczek, następnie ich istnienie wykazano w wielu typach guzów litych [61]. Identyfikacja CSC jest jednak wciąż sporym wyzwaniem, biorąc pod uwagę heterogenność i niestabilność genetyczną nowotworów. Najnowsze wyniki wskazują na konieczność stosowania do badań świeżo izolowanych komórek nowotworowych w miejsce ustalonych linii [60]. Z kolei praca Quintana i wsp. zwraca uwagę na kwestię mikrośrodowiska w identyfikacji CSC. Doświadczenia prowadzone nad różnymi typami nowotworów wykazały, że bardzo niewielki procent ludzkich komórek nowotworowych (0,1-0,0001%) tworzy guzy, kiedy zostanie wszczepiony do myszy z upośledzonym systemem odporności (NOD/ SCID, ang. non-obese diabetic/severe combined immunodeficiency). Quintana i wsp. pokazali, że aż 25% komórek czerniaka pobranych od 12 różnych pacjentów tworzy guzy, jeśli poda się je do myszy NOD/ SCID IL2Rγ null, u których dodatkowo wyłączono gen kodujący łańcuch gamma receptora interleukiny 2. Prowadzi to do sytuacji, kiedy myszy poza dysfunkcyjnymi limfocytami T i B oraz makrofagami, posiadają także upośledzone komórki dendrytyczne oraz komórki NK. Co więcej, wszczepienie komórek czerniaka w obecności matriżelu znacząco zwiększa odsetek wykrywanych komórek tworzących guz. Zatem okazuje się, że model ksenotransplantacyjny, a szczególnie jego status immunologiczny, a także sposób podania CSC, ma ogromne znaczenie dla oceny ich zdolności do inicjowania choroby [62]. Nowotworowe komórki macierzyste posiadają zdolność do samoodnowy i różnicowania. Są to cechy właściwe również prawidłowym komórkom macierzystym. Może to sugerować, że CSC wywodzą się z prawidłowych komórek macierzystych. Jednym z pośrednich dowodów, które mogłyby o tym świadczyć jest to, że oba typy komórek dzielą ze sobą bardzo wiele ścieżek sygnałowych. Na przykład, komórki macierzyste ostrej ludzkiej białaczki szpikowej wykorzystują Bmi-1, który jest niezbędny również dla funkcjonowania prawidłowych HSC. Z kolei mikrorna-200c, który hamuje syntezę Bmi-1, osłabia zdolność do samoodnowy zarówno prawidłowych jak i nowotworowych komórek macierzystych piersi. Regulator ścieżki Wnt, PLAGL-2 (ang. pleomorphic adenoma gene-like 2), promuje niezróżnicowany stan NSC i glejaka. Natomiast aktywacja receptora jądrowego TLX, który jest homologiem genu tailless u Drosophila melanogaster, hamuje zależny od wieku spadek liczby NSC oraz zwiększa ryzyko zachorowania na glejaka u starszych myszy [7]. W końcu czynnik transkrypcyjny STAT3 (ang. signal transducer and activator of transcription), istotny dla biologii ESC, odgrywa kluczową rolę w podtrzymaniu macierzystości CSC glejaka. Co ważne, wyniki profilowania genetycznego komórek nowotworowych pobranych od pacjentów z białaczkami, wskazują na globalny wzrost ekspresji genów związanych z samoodnową. Dodatkowo dowiedziono, że koreluje to z zaawansowaniem choroby. Dlatego analiza ekspresji genów macierzystości może mieć zastosowanie w diagnostyce, a także w terapii, szczególnie w monitorowaniu postępu lub remisji choroby. Podobne wyniki uzyskano dla nowotworów innych typów, m.in. dla raków jelita grubego [60]. Zarówno HSC, jak i z nich wywodzące się komórki progenitorowe mogą ulegać transformacji nowotworowej. Komórki przewlekłej białaczki szpikowej wykazują obecność białka fuzyjnego BCR-Abl. Rzeczywiście wykazano, że w przewlekłej fazie choroby źródłem komórek białaczkowych są HSC [63]. Co ciekawe, próbki pobrane od pacjentów w fazie przełomu blastycznego dowodzą, że również bardziej zróżnicowane komórki progenitorowe mogą odpowiadać za progresję choroby. W przypadku ostrych białaczek charakter komórek inicjujących nowotwór nie jest do końca poznany. Podobieństwo w panelu antygenów powierzchniowych komórek ludzkiej ostrej białaczki szpikowej (AML, ang. acute myeloid leukaemia) i HSC sugeruje, że stransformowane HSC mogą być przyczyną choroby. Badania z użyciem modelu mysiego, podczas których wprowadzenie mutacji BCR-Abl do HSC, ale już nie do bardziej zróżnicowanych progenitorów, skutkowało rozwojem AML, potwierdzają powyższe wyniki. Z kolei, synteza fuzyjnego białka MLL-GAS7 w HSC i multipotencjalnych progenitorach, ale już nie w unipotencjalnych progenitorach, prowadzi do rozwoju ostrej białaczki limfocytowej. Dla kontrastu, obecność innych białek fuzyjnych tj. MOZ-TIF2, MLL-AF9 oraz MLL- -ENL powoduje transformację białaczkową niezależnie od stadium zróżnicowania komórek. Co ciekawe, poziom ekspresji transgenu wydaje się mieć wpływ na efektywność transformacji. Jedynie wysoki poziom białka fuzyjnego MLL-AF9 jest w stanie doprowadzić do transforma- Postępy Biochemii 60 (2) 2014 167

cji progenitorów z linii granulocytów i makrofagów, podczas gdy niski jest efektywny w przypadku pozostałych linii progenitorów, jak i najbardziej prymitywnych HSC. Podsumowując, HSC są bardziej wrażliwe na transformację nowotworową niż bardziej ukierunkowane progenitory. Transformacja komórek progenitorowych jest jednak możliwa, chociaż wymaga włączenia genów macierzystości i często silniejszej ekspresji onkogenu [61]. Podobnie rzecz ma się w przypadku guzów litych, zarówno komórki macierzyste jak i progenitorowe mogą być komórkami inicjującymi chorobę. Zostało to udowodnione, m.in. w przypadku raka skóry, jelita, prostaty, piersi i mózgu. W znakomitej większości przypadków rozwój raka jelita grubego spowodowany jest mutacjami w genach kodujących białka należące do ścieżki Wnt. Na skutek tego dochodzi do wyłączenia genu APC i/ lub aktywacji β-kateniny, co prowadzi do hiperaktywacji szlaku. Co ciekawe, wydaje się, że w kryptach kosmków jelitowych rezydują dwa podtypy komórek macierzystych, których transformacja może prowadzić do rozwoju raka jelita grubego. Pierwsza z nich ma fenotyp LGR5 +, a także jak podają inne źródła CD133 +, a wyłączenie w nich genu APC powoduje transformację nowotworową. W innej części kosmków jelitowych (+4 i +5 pozycja licząc od podstawy krypty) rezyduje odmienna populacja komórek macierzystych. Podobnie jednak jak populacja LGR5 + ulega ona transformacji w odpowiedzi na mutacje w genach kodujących białka ścieżki Wnt. Transformacja komórek LGR5 + prowadzi też do rozwoju raka żołądka [64]. Szczególnym przypadkiem, który warto wspomnieć w tym miejscu, jest rak prostaty. Wywodzi się ze zróżnicowanych komórek luminalnych. Podczas rozwoju choroby dochodzi do ich ekspansji, natomiast komórki podstawne zanikają. Najnowsze badania sugerują jednak, że także komórki macierzyste warstwy podstawnej i luminalnej mogą ulegać transformacji nowotworowej w wyniku wyłączenia genu PTEN (ang. phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten) lub aktywacji kinazy PI(3)K (ang. Phosphoinositide 3-kinase) [65]. Wydaje się, że CSC mogą powstawać w wyniku transformacji nowotworowej SC, a terapie przeciwnowotworowe bazujące na eliminacji CSC mogą przyczyniać się do zatrzymania choroby. Należy jednak pamiętać, że komórkami inicjującymi chorobę mogą być także komórki progenitorowe lub komórki zróżnicowane. W takich przypadkach transformacja nie jest warunkiem wystarczającym do rozwoju nowotworu. Konieczne może być włączenie genów związanych z macierzystością, wysoki poziom aktywacji onkogenów lub udział dodatkowych szlaków przekazywania sygnału (Ryc. 3). ZMIANY WEWNĄTRZKOMÓRKOWE W STARZEJĄCYCH SIĘ KOMÓRKACH MACIERZYSTYCH ZMIANY NA POZIOMIE GENOMU Rycina 3. Trzy modele opisujące pochodzenie macierzystych komórek nowotworowych. Model hierarchiczny, zwany inaczej modelem opartym o istnienie nowotworowych komórek macierzystych zakłada, że w obrębie populacji komórek nowotworowych tylko niewielka populacja ma zdolność do odtworzenia całego guza i odpowiada za jego heterogenność. Ten rysunek przedstawia trzy hipotezy, które wyjaśniają pochodzenie CSC. A. CSC powstaje w wyniku mutacji w prawidłowej komórce macierzystej. B. CSC powstaje w wyniku mutacji w prawidłowej komórce progenitorowej. C. CSC powstaje w wyniku mutacji w prawidłowej komórce zróżnicowanej. Dodatkowo komórka zróżnicowana musi najpierw ulec odróżnicowaniu, czyli konieczne jest włączenie genów pluripotencji. We wszystkich trzech scenariuszach powstała CSC nabywa zdolność do niekontrolowanego wzrostu. W związku z okresami nasilonej proliferacji, komórki macierzyste narażone są na starzenie replikacyjne, które związane jest ze skracaniem telomerów. Telomery to odcinki DNA o określonej sekwencji występujące na końcach chromosomów, które dzięki oddziaływaniu z określonymi białkami tworzą charakterystyczną strukturę pętli. Główną ich rolą jest ochrona zakończeń chromosomów przed degradacją i zapobieganie fuzji pomiędzy chromosomami. Telomery skracają się z każdym podziałem. U kręgowców telomery składają się z powtórzeń TTAGGG i kompleksu białek zwanych szelterynami (ang. shelterin). Za długość i integralność telomerów odpowiada telomeraza, enzym o właściwościach odwrotnej transkryptazy (TERT, ang. Telomerase Reverse Transcriptase), która na bazie matrycy RNA (TERC, ang. Telomerase RNA Component) syntezuje brakujące fragmenty nici. Aktywność telomerazy utrzymuje się na wysokim poziomie w komórkach macierzystych, a spada w miarę różnicowania i starzenia. Do reaktywacji enzymu dochodzi podczas transformacji nowotworowej [66]. 168 www.postepybiochemii.pl

Skracanie telomerów wraz z wiekiem zaobserwowano w komórkach macierzystych jelita cienkiego, rogówki, jąder oraz mózgu. Skrócenie telomerów w komórkach macierzystych mieszków włosowych u starych myszy koreluje ze spadkiem ich potencjału klonogennego [10]. Co ciekawe, przedziały tkankowe, które charakteryzują się występowaniem najbardziej prymitywnych komórek wykazują też obecność komórek z najdłuższymi telomerami. W miarę przechodzenia do warstw zbudowanych z bardziej zróżnicowanych komórek, długość telomerów w komórkach systematycznie spada. Co istotne, telomery w starych komórkach macierzystych są wciąż dłuższe aniżeli w innych komórkach somatycznych tkanek, w których te komórki rezydują [10,67]. Może to sugerować że SC proliferują wolniej niż ich komórki potomne i/ lub, że wykształciły mechanizmy przeciwdziałające skracaniu telomerów. Badania z wykorzystaniem myszy pozbawionych genu kodującego jednostkę TERC telomerazy, wykazały, że prowadzi to do upośledzenia funkcji komórek macierzystych w pewnych narządach lub do ich zupełnej eliminacji w innych [68]. Naskórkowe komórki macierzyste znajdujące się w mieszkach włosowych tych myszy cechuje nieprawidłowa proliferacja i migracja [69,70]. Z kolei NSC tracą swoją zdolność do samoodnowy i różnicowania, a zwiększone tempo apoptozy dotyczy komórek macierzystych jelit. W efekcie myszy takie charakteryzuje się krótszym czasem życia, upośledzeniem procesu gojenia się ran, czy leukopenią. W końcu dochodzi u nich do częstszego rozwoju nowotworów [69,71]. Co ciekawe, choć aktywność enzymatyczna telomerazy jest konieczna dla zachowania integralności telomerów, białko TERT pozbawione funkcji katalitycznych jest w stanie regulować funkcjonowanie komórek macierzystych niezależnie od stanu telomerów. Nadprodukcja TERT w naskórku myszy powoduje gwałtowne przejście z telogenu do anagenu, w ten sposób stymulując wzrost włosów. Dzieje się to poprzez pobudzenie spoczynkowych komórek macierzystych w mieszkach włosowych [72]. Wyniki tych badań jasno wskazują, że zarówno właściwości enzymatyczne, jak i nieenzymatyczne telomerazy są istotne dla biologii komórek macierzystych oraz utrzymania homeostazy całego organizmu. Co ciekawe, prace innych badaczy dowodzą, że dodatkowe wyłączenie genu p53 w myszach pozbawionych telomerazy przywraca prawidłowe funkcjonowanie komórek macierzystych, choć jednocześnie zwiększa ryzyko nowotworzenia. Z kolei wyłączenie genu p21 wydłuża życie myszy z niefunkcjonalną telomerazą i nie prowadzi do nasilonej transformacji nowotworowej [36]. W miarę starzenia komórki somatyczne gromadzą uszkodzenia genomowe, będące następstwem pojedynczych i podwójnych pęknięć nici DNA, translokacji chromosomowych, skracających się telomerów oraz mutacji punktowych [73]. Celem mechanizmów naprawy DNA jest utrzymanie integralności genomu. Wydaje się, że aktywność i efektywność tych systemów może wpływać na tempo starzenia [74]. Wykazano, że obecność mutacji w genach kodujących białka odpowiedzialne za naprawę DNA, takie jak helikaza WRN (ang. Werner syndrome ATP-dependent), czy kinaza ATM koreluje z wystąpieniem cech przyspieszonego starzenia zarówno badając zespoły segmentowego przyspieszonego starzenia u ludzi, jak i na modelach zwierzęcych [75]. Wraz z wiekiem podwyższony poziom uszkodzeń DNA stwierdzono w naskórkowych komórkach macierzystych oraz HSC [76,77]. Upośledzenie w funkcjonowaniu HSC stwierdzono w komórkach pobranych od zwierząt z wyłączonymi lub zmutowanymi genami związanymi z naprawą DNA takimi jak: FACD1, MSH2, ERCC1 czy RAD50 [36]. Badania z wykorzystaniem myszy z wyłączonymi genami Ku80-, XPD- lub TERC wykazały, że pochodzące z nich komórki macierzyste mają ograniczone zdolności do samoodnowy i proliferacji, a większą podatność na apoptozę i starzenie. Prowadzi to do ograniczenia liczebności ich populacji i upośledzenia homeostazy organizmu w miarę starzenia [78]. Z drugiej strony, w spoczynkowych komórkach macierzystych, które są mniej podatne na starzenie replikacyjne, a bardziej podatne na starzenie chronologiczne, dochodzi do niehomologicznego łączenia końców w celu naprawy pęknięć DNA [79]. Mechanizm ten nie wykorzystuje jako matrycy DNA, stąd jest bardziej podatny na błędy [80]. Co ciekawe, delecje i insercje w obrębie chromosomów mogą być następstwem napraw podwójnych pęknięć DNA i prowadzić do niestabilności genomowej i nieprawidłowości w funkcjonowaniu genów [73]. W związku z tym, paradoksalnie, procesy naprawy DNA mogą powodować akumulację mutacji w spoczynkowych komórkach macierzystych. Ponadto, podczas naprawy DNA dochodzi do redystrybucji białek, których aktywność wpływa na strukturę chromatyny. Może to mieć znaczenie dla globalnej tranksrypcji genów [7]. Jednym z mechanizmów umożliwiających zminimalizowanie ryzyka związanego z akumulacją uszkodzeń DNA jest podział asymetryczny komórek macierzystych. Może w tym miejscu mieć zastosowanie teoria nieśmiertelnej nici zaproponowania w 1975 roku przez Cairns. Podczas podziału asymetrycznego SC dzieli się na dwie komórki potomne, z których jedna zachowuje właściwości komórki macierzystej, natomiast druga przyjmuje cechy komórki bardziej zróżnicowanej. Wg teorii Cairns pierwsza z nich mogłaby dziedziczyć DNA powstałe na bazie starszej matrycy ( nieśmiertelnej ), a druga dostać nić syntetyzowaną na bazie nowszej matrycy [81]. Taka wybiórcza segregacja mogłaby zapobiec akumulacji uszkodzonego DNA i zachowaniu oryginalnej informacji genetycznej w puli najbardziej prymitywnych komórek macierzystych [82]. Co ważne, stwierdzono, że taka selektywna segregacja materiału genetycznego rzeczywiście ma miejsce podczas podziałów asymetrycznych NSC oraz komórek satelitarnych [34,83], aczkolwiek dokładny mechanizm tego procesu nie został jeszcze poznany. ZMIANY EPIGENETYCZNE Zmiany epigenetyczne związane są z modyfikacją struktury chromatyny, co ma kluczowe znaczenie dla jej aktywności transkrypcyjnej. Zmiany te obejmują metylacje DNA i potranslacyjne modyfikacje histonów. W przeciwieństwie do zmian na poziomie genomowym, zmiany epigenetyczne są odwracalne [84]. Czynniki ze- Postępy Biochemii 60 (2) 2014 169

wnętrzne mają ogromny wpływ na epigenom. W kontekście starzenia wykazano np., że dieta niskokaloryczna może wydłużać życie, a stary organizm poddany działaniu czynników obecnych w surowicy młodego podczas parabiozy heterochronicznej ulega odmłodzeniu [54,85]. Badania przeprowadzone na drożdżach sugerują udział deacetylazy histonowej Sir2 w wydłużeniu życia w odpowiedzi na restrykcje kaloryczne [86]. Wyniki te udało się potwierdzić przeprowadzając doświadczenia również na innych organizmach modelowych [87]. Z kolei, badania nicieni Caenorhabditis elegans wskazują na rolę białka z kompleksu metylotransferazy H3K4 w wydłużaniu życia [88]. Co istotne, wykazano że dieta niskokaloryczna opóźnia starzenie HSC i zwiększa ich funkcjonalność w starzejącym się organizmie [89]. Analizując te dane, należy jednak brać pod uwagę możliwość, że modyfikacje epigenetyczne mogą być zjawiskiem wtórnym do uszkodzeń DNA. Na przykład podwójne pęknięcia nici DNA powodują fosforylację histonu H2AX. W wyniku uszkodzeń DNA dochodzi także do acetylacji H3K56 oraz metylacji H3K79 [7]. W związku z tym, obecność zmodyfikowanych histonów może być nie tyle dowodem regulacji epigenetycznych, co świadczyć o tym, że zmiany te zaszły w następstwie rearanżacji genetycznych. Związane z wiekiem zmiany w metylacji DNA i modyfikacji histonów wykazano w różnych tkankach ludzi i gryzoni [90,91]. Generalnie podczas starzenia dochodzi do spadku globalnej metylacji. Wyjątkiem są obszary promotorowe genów bogate w wyspy CpG [91,92]. Pokazano, że występowanie hipermetylacji wysp CpG w obszarach promotorowych genów supresorowych nowotworów koreluje ze spadkiem ich transkrypcji i w efekcie z rozwojem choroby [93]. Z kolei, nieprawidłowości w acetylacji histonu H4K12 mogą prowadzić do spadku zdolności poznawczych mózgu [94]. W procesie starzenia zachodzące zmiany epigenetyczne dotyczą również komórek macierzystych. Zwiększoną metylację DNA zaobserwowano w kryptach kosmków jelitowych (rezerwuar komórek macierzystych) jelita cienkiego i grubego zarówno u starszych myszy, jak i u ludzi. Również i w tych badaniach hipermetylacja dotyczyła głównie obszarów promotorowych genów bogatych w powtórzenia CpG [91,95]. Co ciekawe, poziom metylacji był znacząco wyższy w komórkach jelita grubego niż w komórkach jelita cienkiego, co korelowało z szybszym tempem proliferacji w tej części jelita. Wyniki te sugerują, że natężenie metylacji DNA może być wskaźnikiem wieku replikacyjnego komórek [96]. Związane z wiekiem modyfikacje epigentyczne w obrębie komórek macierzystych mogą być również wyrazem zaburzeń w syntezie enzymów, które modyfikują chromatynę lub ich kofaktorów. Analizy wykonane techniką mikromacierzy wykazały, że w miarę starzenia w mysich HSC spada poziom ekspresji genów kodujących: podjednostki w kompleksie remodelującym chromatynę SWI/SNF (ang. switch/ sucrose nonfermentable), deacetylazy histonowej HDAC1, 5 i 6, oraz metylotransferazy DNA DNMT3b [7]. Co więcej, nieprawidłowa transkrypcja z locus IgK regulowana przez czynnik transkrypcyjny NF-κB (ang. nuclear factor kappa B), ściśle związany z fenotypem zapalnym i sekrecyjnym, prowadzi do zmian epigenetycznych obserwowanych tylko u starszych osobników [97]. Badania innych autorów dowodzą, że w miarę starzenia dochodzi do zmian w obrębie chromosomów i generalnego nasilenia aktywności transkrypcyjnej. Wykazano, że zmiany epigentyczne mogą wyraźnie zwiększyć poziom szumu transkrypcyjnego w komórkach postmitotycznych, takich jak kardiomiocyty czy komórki nerwowe [32]. Analogiczne zjawisko może dotyczyć komórek macierzystych, albo przynajmniej ich frakcji pozostającej przez dłuższy czas w stanie spoczynku. Związane z wiekiem zmiany w białkach odpowiedzialnych za stan chromatyny mogą prowadzić do genomowej niestabilności i nieprawidłowej transkrypcji, i przyczyniać się do spadku homeostazy organizmu [98]. ZMIANY NA POZIOMIE PROTEOMU Utrzymanie homeostazy na poziomie proteomu wymaga systematycznego usuwania źle sfałdowanych lub uszkodzonych białek, które mogą stanowić zagrożenie dla właściwego funkcjonowania komórki [99]. Składnikami systemu kontroli jakości białek są m.in. autofagosomy, chaperony, lizosomy oraz układ proteasomalny [33,99]. Wraz z wiekiem system ten traci jednak na wydajności i skuteczności [99,100]. Gromadzenie uszkodzonych białek i ich agregatów stwierdzono w długożyjących komórkach postmitotycznych takich jak neurony, kardiomiocyty i komórki mięśniowe. Co istotne, konglomeraty nieprawidłowych białek mogą być toksyczne dla komórek [100]. Z kolei, komórki proliferujące wydają się być mniej wrażliwe na tego typu uszkodzenia. Agregaty ulegają rozcieńczeniu w szybko odnawiającej się populacji. Jednocześnie stale dochodzi do syntezy nowych białek, z których większość ma prawidłową budowę i spełnia swe funkcje [101]. Jednym z przykładów tej zależności może być upośledzenie w miarę starzenia funkcjonowania kompleksów porów jądrowych (NPC, ang. nuclear pore complexes). Prowadzi to do wzrostu przepuszczalności błony jądrowej i przemieszczania się białek cytoplazmatycznych do jądra [102]. W komórkach postmitotycznych, takich jak neurony, z powodu inaktywacji transkrypcji nie dochodzi do wymiany utlenionego kompleksu Nup107-160. Nup107-160 jest jednym z elementów odpowiadających za prawidłowe funkcjonowanie NPC. W komórkach proliferujących element ten ulega stałej odnowie [102]. Analogicznie, komórki macierzyste charakteryzujące się długimi okresami spoczynku takie jak komórki satelitarne [103] są bardziej wrażliwe na proteotoksyczność niż komórki macierzyste podlegające częstym podziałom. Podczas pączkowania drożdży, agregaty uszkodzonych białek gromadzą się wybiórczo w komórce matce, zapewniając młodość komórkom potomnym [104,105]. Maszyneria zwana polaryzomem odpowiedzialna za ten asymetryczny podział składa się m.in. z białek Bni1p oraz białka należącego do grupy miozyn Myo2pa [106]. Być może komórki macierzyste używają podobnych mechanizmów podczas podziałów asymetrycznych, aby agregaty białkowe dziedziczone były przez bardziej zróżnicowane, a nie stale odnawiające się komórki potomne. Rzeczywiście, najnowsze prace z wykorzystaniem komórek macierzystych Drosophila melanogaster sugerują, że uszkodzone białka podlegają segregacji podczas podziałów. Jednakże 170 www.postepybiochemii.pl

Rycina 4. W starzejącym się organizmie komórki macierzyste doświadczają zmian na poziomie: genomu, epigenomu i proteomu. Komórki macierzyste podlegają działaniu starzejącego się organizmu. Wiąże się to z zachodzącymi zmianami ogólnoustrojowymi, które wpływają na lokalne mikrośrodowisko/niszę, w której rezydują komórki macierzyste. Dieta niskokaloryczna, hipoksja mogą spowalniać proces starzenia, podczas gdy cytokiny prozapalne będą ten proces przyspieszać. Komórki macierzyste doświadczają także zmian wewnątrzkomórkowych. Jest to następstwem skracania się telomerów, spadku efektywności i wydajności systemów naprawiających uszkodzenia DNA, czy usuwających nieprawidłowe białka, a także zaburzeń w funkcjonowaniu poszczególnych organelli takich jak. mitochondria. W rezultacie w komórkach macierzystych dochodzi do zmian nieodwracalnych (np. mutacje DNA) oraz odwracalnych (np. modyfikacje epigenetyczne, modyfikacje białek). Zmiany te powodują spadek funkcjonalności komórek macierzystych. Ma to bezpośrednie przełożenie na zaburzenia w prawidłowym działaniu całego organizmu i przyczynia się do jego starzenia. w zależności od wieku chronologicznego komórek macierzystych, dziedziczone są albo równocennie (w młodszych) albo przekazywane są bardziej zróżnicowanej komórce potomnej (w starszych). Co ciekawe, autorzy zwracają uwagę, że podział asymetryczny może podlegać regulacji przez czynniki związane z niszą, w jakiej występują komórki macierzyste [107]. Uszkodzenia DNA mogą prowadzić do apoptozy, starzenia, utraty funkcji lub transformacji komórek macierzystych. W miarę starzenia organizmu dochodzi w komórkach macierzystych do akumulacji uszkodzonych makrocząsteczek takich jak DNA i białka. W efekcie spada ich potencjał regeneracyjny i homeostaza organizmu. Modyfikacje o charakterze epigenetycznym są wyrazem wrażliwości komórek macierzystych na zmiany w otaczającym je starzejącym się środowisku i mają ogromny wpływ na ich funkcjonowanie. Aktywność telomerazy, wydajne systemy naprawy uszkodzeń DNA i podział asymetryczny to główne mechanizmy przeciwdziałające starzeniu komórek macierzystych (Ryc. 4). ODWRÓCENIE PROCESU STARZENIA INDUKOWANA PLURIPOTENCJA Odkrycie mechanizmów prowadzących do indukowanej pluripotencji ma swój początek w badaniach prowadzonych w latach 50-tych ubiegłego wieku. Po pierwsze są to prace nad klonowaniem i transferem jądra. Podczas rozwoju organizmu, komórki stopniowo różnicują, tworząc wyspecjalizowane tkanki, które pełnią określone funkcje. Terminalnie zróżnicowane komórki tracą potencjał do samoodnowy. Prace Briggsa i Kinga [108], a także Gurdona [109] wykazały, że przeniesienie jąder z komórek przynajmniej częściowo zróżnicowanych, takich jak te pochodzące z zarodków żabich lub kijanek do oocytów wciąż pozwala na uruchomienie pełnego programu rozwojowego i wytworzenie organizmu. Zatem, zmiany które zachodzą podczas embriogenezy i różnicowania wydają się być odwracalne i mieć charakter raczej zmian epigenetycznych niż genetycznych. Druga istotna kwestia, która przyczyniła się do odkrycia indukowanej pluripotencji, to opracowanie technologii pozwalających na izolację, hodowlę i badanie komórek pluripotentnych. W końcu, prace zespołu prof. Yamanaki wykazały, że aktywacja czynników transkrypcyjnych związanych z macierzystością w komórkach zróżnicowanych może doprowadzić do przywrócenia im cech pluripotencji [110]. Panel 24 wektorów retrowirusowych kodujących czynniki, które zostały pierwotnie użyte do produkcji indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z fibroblastów, ostatecznie udało się zredukować do czterech: Oct-4, Sox2, Klf-4 i c-myc. Powstałe w ten sposób ipsc charakteryzowały się obecnością markerów komórek pluripotentych SSEA-1 i Nanog, tworzyły potworniaki po wszczepieniu do myszy z upośledzoną odpornością i różnicowały w komórki pochodzące ze wszystkich listków zarodkowych po iniekcji do blastocysty [110]. Do tej pory wykorzystując koktajl Yamanaki udało się uzyskać ipsc z komórek pochodzących od gryzoni, małp i ludzi. ipsc otrzymuje się obecnie nie tylko z fibroblastów, ale też z keratynocytów, komórek nerwowych, komórek żołądka i wątroby, melanocytów, a także komórek β trzustki i limfocytów [111]. W ostatnich latach wysiłki badaczy skoncentrowane są na optymalizacji technik uzyskiwania ipsc (nie tylko nadekspresja czynników macierzystości i wykorzystanie wektorów wirusowych jako nośników) i efektywnej identyfikacji komórek, w których uzyskano pełną pluripotencję, a także procedur mających na celu bezpieczne różnicowanie ich do komórek docelowych. Jest to szczególnie ważne w kontekście potencjalnego zastosowania ipsc w zindywidualizowanej medycynie regeneracyjnej, a także w leczeniu chorób związanych z wiekiem. Okazuje się, że starzenie komórkowe może być istotną barierą w procesie reprogramowania. Wydaje się to być związane z aktywacją szlaków p53/ p21 i p16/ Rb i stanowi kolejny mechanizm przeciwnowotworowy. Co ważne, Postępy Biochemii 60 (2) 2014 171

Rycina 5. Reprogramowanie komórek prawidłowych i nowotworowych. A. Komórki zróżnicowane lub komórki stare mogą ulec reprogramowaniu. Nabywają wtedy cech komórek macierzystych. Dzieje się to w wyniku indukcji genów pluripotencji. B. W odpowiedzi na stres komórki nowotworowe ulegają przyspieszonemu starzeniu. Może to być stres oksydacyjny lub stres związany z działaniem terapii przeciwnowotworowej: radio- czy chemioterapii. Starzeniu komórek nowotworowych towarzyszy często poliploidyzacja, czyli replikacja DNA, której nie towarzyszy podział komórki. Starzenie komórek nowotworowych może być procesem odwracalnym. Reprogramowanie starych komórek nowotworowych wiąże się z depoliploidyzacją, autofagią i indukcją genów pluripotencji. Podział starej komórki nowotworowej może mieć charakter amitotyczny (neoza). W rezultacie dochodzi do odnowienia populacji komórek nowotworowych. Stare komórki nowotworowe mogą zatem stanowić spoczynkową populację komórek nowotworowych o właściwościach nowotworowych komórek macierzystych, której celem jest zasilanie populacji stale dzielących się komórek nowotworowych. niektóre czynniki transkrypcyjne stosowane podczas uzyskiwania ipsc również powodują wzrost syntezy markerów starzenia [112]. Wyniki te sugerują, że uzyskiwanie ipsc ze starszych dawców może być kłopotliwe. Jednak praca Lapasset i wsp. dowodzi, że fibroblasty pobrane od 70-, a nawet 100-letnich dawców ulegają reprogramowaniu po transdukcji koktajlem 6 czynników: Oct-4, Sox2, Klf-4, c-myc oraz dodatkowo Lin28 oraz Nanog. Co ciekawe, koktajl Yamanaki jest w tym przypadku niewystarczający. Autorzy pracy najpierw poddali wyizolowane fibroblasty starzeniu replikacyjnemu. Osiągnęli to dokonując kolejnych pasaży. Po transdukcji wektorami lentiwirusowymi kodującymi odpowiednie czynniki dochodzi w pierwszej kolejności do zaniku skupisk SAHF (ang. senescence associated heterochromati foci) w obrębie starych fibroblastów, a następnie do wznowienia proliferacji. W kolejnych dniach komórki zaczynają tworzyć kolonie przypominające skupiska ESC, a jeszcze później dochodzi w nich do wznowienia syntezy endogennych białek Oct-4, Nanog, Sox2 i Rex1, a także TRA-1-60 i SSEA-4. Autorzy wykazali również demetylacje obszarów promotorowych bogatych w wyspy CpG genów Oct-4 i Nanog, a także zdolność powstałych ipsc do różnicowania w komórki pochodzenia ekto-, endo- i mezodermalnego. Co ciekawe, w komórkach tych dochodzi również do reaktywacji telomerazy i wydłużenia telomerów. Z kolei, analiza mikromacierzy wykazała, że wzór ekspresji genów w ipsc wygenerowanych z użyciem sześciu czynników jest bardzo zbliżony do tego właściwego dla hesc. Również w kontekście ROS i metabolizmu mitochondriów autorzy dowiedli, że uzyskane przez nich ipsc przypominają hesc. W końcu, ipsc wyizolowane ze starszych dawców charakteryzowały się prawidłowym kariotypem [113]. Komórki ipsc udało się uzyskać również od dawców będących nosicielami różnych chorób genetycznych lub degeneracyjnych takich jak zespół Downa, choroba Parkinsona, czy cukrzyca typu 1. Stwarza to dodatkowe możliwości badania tych schorzeń [114]. Szczególnym przypadkiem chorób związanych z wiekiem jest nowotworzenie. Komórki nowotworowe mogą ulegać starzeniu w odpowiedzi na stres oksydacyjny, czy terapie przeciwnowotworowe 2. Okazuje się, że starzenie komórek nowotworowych może być odwracalne. Co ciekawe, jak pokazują badania ostatnich lat, proces repro- 2 Tematyka ta została szerzej omówiona w artykule Grażyny Mosieniak i Anny Strzeszewskiej Rola starzenia komórkowego w kancerogenezie i terapii przeciwnowotworowej, zamieszczonym w niniejszym zeszycie Postępów Biochemii. 172 www.postepybiochemii.pl

gramowania starych komórek nowotworowych wiąże się najprawdopodobniej z depoliploidyzacją, autofagią i indukcją genów macierzystości Oct-4 i Nanog [115,116]. Co więcej, prace zespołu prof. Rajaramana sugerują, że stara komórka nowotworowa może przechodzić podział amitotyczny zwany neozą, który prowadzi do powstania kilku-kilkunastu diploidalnych komórek potomnych. Komórki te dzielą się mitotycznie i mogą wykazywać niższą wrażliwość na stres powodowany np. przez chemioterapię niż komórki wyjściowe [117]. Prace te sugerują nie tylko nowe mechanizmy, które być może wyjaśniają przyczyny oporności komórek nowotworowych na terapie, ale także kreślą nowe spojrzenie na cykl życiowy komórki nowotworowej, w którym istotną rolę odgrywają starzenie, reprogramowanie, poliploidyzacja/depoliploidyzacja oraz autofagia. Można zatem zaryzykować hipotezę, że stare komórki nowotworowe stanowią spoczynkową populację komórek nowotworowych o właściwościach nowotworowych komórek macierzystych, której celem jest odnawianie aktywnie namnażającej się populacji. Hipoteza ta wymaga jednak dalszej eksperymentalnej weryfikacji (Ryc. 5). Odkrycie mechanizmów indukowanej pluripotencji stwarza ogromne możliwości w kontekście spersonalizowanej medycyny regeneracyjnej i leczeniu chorób związanych z wiekiem. Szczególnie istotna wydaje się optymalizacja technologii pozwalającej na uzyskiwanie i wykorzystanie ipsc ze starszych dawców. Z drugiej strony, niekontrolowane reprogramowanie niesie ze sobą ryzyko transformacji nowotworowej. Dlatego niezwykle istotne wydaje się szczegółowe poznanie mechanizmów, które regulują ten proces. Obserwacje, że stare komórki nowotworowe także mogą ulegać reprogramowaniu poczyniono w ciągu kilku ostatnich lat. Dalsze badania w tym kierunku pozwolą nie tylko na poznanie nowych aspektów biologii komórek nowotworowych, ale także być może stworzą podstawę do opracowania skuteczniejszych metod diagnostycznych i terapeutycznych chorób nowotworowych. PODSUMOWANIE Wydaje się, że starzenie komórek macierzystych ma wpływ na starzenie organizmu. Wraz z wiekiem dochodzi do spadku liczby i funkcjonalności komórek macierzystych. Przekłada się to na zaburzenie homeostazy i upośledzenie zdolności do odnowy w starzejącym się organizmie. W miarę starzenia komórki macierzyste doświadczają zmian na poziomie genomu, epigenomu oraz proteomu. Poznanie funkcjonalnych skutków tych zmian jest kluczowe dla dalszego poznania biologii tych komórek. Nie ulega również wątpliwości, że lokalne i ogólnoustrojowe zmiany, które zachodzą w starzejącym się organizmie mają wielki wpływ na liczbę i zdolności regeneracyjne komórek macierzystych. Podsumowując, istotne wydaje się poznanie efektów wewnątrzkomórkowych zmian nieodwracalnych (genomowych) i odwracalnych (epigenetycznych) oraz zmian zewnątrzkomórkowych wynikających z wpływu lokalnego i ogólnoustrojowego środowiska na funkcjonowanie komórek macierzystych, a także poznanie wpływu starzejących się komórek macierzystych na funkcjonowanie całego organizmu, w tym na procesy regeneracji i starzenia. Dodatkowo, jeśli rozważamy potencjał komórek macierzystych w kontekście nie tylko homeostazy organizmu, ale także medycyny regeneracyjnej oraz leczenia chorób związanych z wiekiem, dokładne zbadanie interakcji pomiędzy komórkami macierzystymi a środowiskiem wydaje się być kluczowe dla zwiększenia skuteczności terapii. PIŚMIENNICTWO 1. Mikkers H, Frisen J (2005) Deconstructing stemness. EMBO J 24: 2715-2719 2. Li L, Clevers H (2010) Coexistence of quiescent and active adult stem cells in mammals. Science 327: 542-545 3. Mitalipov S, Wolf D (2009) Totipotency, pluripotency and nuclear reprogramming. Adv Biochem Eng Biotechnol 114: 185-199 4. Masui S, Nakatake Y, Toyooka Y, Shimosato D, Yagi R, Takahashi K, Okochi H, Okuda A, Matoba R, Sharov AA, Ko MS, Niwa H (2007) Pluripotency governed by Sox2 via regulation of Oct3/4 expression in mouse embryonic stem cells. Nat Cell Biol 9: 625-635 5. Pazhanisamy SK (2009) Stem cells, DNA damage, ageing and cancer. Hematol Oncol Stem Cell Ther 2: 375-384 6. Sikora MA, Olszewski WL (2004) Stem cells biology and therapeutic application. Postepy Hig Med Dosw (Online) 58: 202-208 7. Liu L, Rando TA (2011) Manifestations and mechanisms of stem cell aging. J Cell Biol 193: 257-266 8. Challen GA, Boles NC, Chambers SM, Goodell MA (2010) Distinct hematopoietic stem cell subtypes are differentially regulated by TGF-beta1. Cell Stem Cell 6: 265-278 9. Fuchs E, Tumbar T, Guasch G (2004) Socializing with the neighbors: stem cells and their niche. Cell 116: 769-778 10. Flores I, Canela A, Vera E, Tejera A, Cotsarelis G, Blasco MA (2008) The longest telomeres: a general signature of adult stem cell compartments. Genes Dev 22: 654-667 11. Ginis I, Luo Y, Miura T, Thies S, Brandenberger R, Gerecht-Nir S, Amit M, Hoke A, Carpenter MK, Itskovitz-Eldor J, Rao MS (2004) Differences between human and mouse embryonic stem cells. Dev Biol 269: 360-380 12. Swerts K, De Moerloose B, Dhooge C, Laureys G, Benoit Y, Philippe J (2006) Prognostic significance of multidrug resistance-related proteins in childhood acute lymphoblastic leukaemia. Eur J Cancer 42: 295-309 13. Zhou S, Schuetz JD, Bunting KD, Colapietro AM, Sampath J, Morris JJ, Lagutina I, Grosveld GC, Osawa M, Nakauchi H, Sorrentino BP (2001) The ABC transporter Bcrp1/ABCG2 is expressed in a wide variety of stem cells and is a molecular determinant of the side-population phenotype. Nat Med 7: 1028-1034 14. O Connor MD, Kardel MD, Eaves CJ (2011) Functional assays for human embryonic stem cell pluripotency. Methods Mol Biol 690: 67-80 15. Evans MJ, Kaufman MH (1981) Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature 292: 154-156 16. Martin GR (1975) Teratocarcinomas as a model system for the study of embryogenesis and neoplasia. Cell 5: 229-243 17. Thomson JA, Itskovitz-Eldor J, Shapiro SS, Waknitz MA, Swiergiel JJ, Marshall VS, Jones JM (1998) Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science 282: 1145-1147 18. Shamblott MJ, Axelman J, Wang S, Bugg EM, Littlefield JW, Donovan PJ, Blumenthal PD, Huggins GR, Gearhart JD (1998) Derivation of pluripotent stem cells from cultured human primordial germ cells. Proc Natl Acad Sci USA 95: 13726-13731 19. Chung Y, Klimanskaya I, Becker S, Li T, Maserati M, Lu SJ, Zdravkovic T, Ilic D, Genbacev O, Fisher S, Krtolica A, Lanza R (2008) Human embryonic stem cell lines generated without embryo destruction. Cell Stem Cell 2: 113-117 20. Kucia M, Reca R, Campbell FR, Zuba-Surma E, Majka M, Ratajczak J, Ratajczak MZ (2006) A population of very small embryonic-like Postępy Biochemii 60 (2) 2014 173

(VSEL) CXCR4(+)SSEA-1(+)Oct-4+ stem cells identified in adult bone marrow. Leukemia 20: 857-869 21. Halasa M, Baskiewicz-Masiuk M, Dabkowska E, Machalinski B (2008) An efficient two-step method to purify very small embryonic-like (VSEL) stem cells from umbilical cord blood (UCB). Folia Histochem Cytobiol 46: 239-243 22. Miyanishi M, Mori Y, Seita J, Chen JY, Karten S, Chan CK, Nakauchi H, Weissman IL (2013) Do pluripotent stem cells exist in adult mice as very small embryonic stem cells? Stem Cell Reports 1: 198-208 23. Szade K, Bukowska-Strakova K, Nowak WN, Szade A, Kachamakova-Trojanowska N, Zukowska M, Jozkowicz A, Dulak J (2013) Murine bone marrow Lin(-)Sca(-)1(+)CD45(-) very small embryonic-like (VSEL) cells are heterogeneous population lacking Oct-4A expression. PLoS One 8: e63329 24. Alvarez-Gonzalez C, Duggleby R, Vagaska B, Querol S, Gomez SG, Ferretti P, Madrigal A (2013) Cord blood Lin(-)CD45(-) embryonic-like stem cells are a heterogeneous population that lack self-renewal capacity. PLoS One 8: e67968 25. Danova-Alt R, Heider A, Egger D, Cross M, Alt R (2012) Very small embryonic-like stem cells purified from umbilical cord blood lack stem cell characteristics. PLoS One 7: e34899 26. Kassmer SH, Jin H, Zhang PX, Bruscia EM, Heydari K, Lee JH, Kim CF, Krause DS (2013) Very small embryonic-like stem cells from the Murine bone marrow differentiate into epithelial cells of the lung. Stem Cells 31: 2759-2766 27. Havens AM, Shiozawa Y, Jung Y, Sun H, Wang J, McGee S, Mishra A, Taichman LS, Danciu T, Jiang Y, Yavanian G, Leary E, Krebsbach PH, Rodgerson D, Taichman RS (2013) Human very small embryonic-like cells generate skeletal structures, in vivo. Stem Cells Dev 22: 622-630 28. Jones DL, Rando TA (2011) Emerging models and paradigms for stem cell ageing. Nat Cell Biol 13: 506-512 29. van der Flier LG, Clevers H (2009) Stem cells, self-renewal, and differentiation in the intestinal epithelium. Annu Rev Physiol 71: 241-260 30. Hayflick L (1965) The limited in vitro lifetime of human diploid cell strains. Exp Cell Res 37: 614-636 31. Kamminga LM, van Os R, Ausema A, Noach EJ, Weersing E, Dontje B, Vellenga E, de Haan G (2005) Impaired hematopoietic stem cell functioning after serial transplantation and during normal aging. Stem Cells 23: 82-92 32. Busuttil R, Bahar R, Vijg J (2007) Genome dynamics and transcriptional deregulation in aging. Neuroscience 145: 1341-1347 33. Rajawat YS, Hilioti Z, Bossis I (2009) Aging: central role for autophagy and the lysosomal degradative system. Ageing Res Rev 8: 199-213 34. Conboy MJ, Karasov AO, Rando TA (2007) High incidence of non-random template strand segregation and asymmetric fate determination in dividing stem cells and their progeny. PLoS Biol 5: e102 35. Liu L, Cheung TH, Charville GW, Hurgo BM, Leavitt T, Shih J, Brunet A, Rando TA (2013) Chromatin modifications as determinants of muscle stem cell quiescence and chronological aging. Cell Rep 4: 189-204 36. Sharpless NE, DePinho RA (2007) How stem cells age and why this makes us grow old. Nat Rev Mol Cell Biol 8: 703-713 37. Nishino J, Kim I, Chada K, Morrison SJ (2008) Hmga2 promotes neural stem cell self-renewal in young but not old mice by reducing p16ink4a and p19arf expression. Cell 135: 227-239 38. Renault VM, Rafalski VA, Morgan AA, Salih DA, Brett JO, Webb AE, Villeda SA, Thekkat PU, Guillerey C, Denko NC, Palmer TD, Butte AJ, Brunet A (2009) FoxO3 regulates neural stem cell homeostasis. Cell Stem Cell 5: 527-539 39. Sun LY, Evans MS, Hsieh J, Panici J, Bartke A (2005) Increased neurogenesis in dentate gyrus of long-lived Ames dwarf mice. Endocrinology 146: 1138-1144 40. Molofsky AV, Slutsky SG, Joseph NM, He S, Pardal R, Krishnamurthy J, Sharpless NE, Morrison SJ (2006) Increasing p16ink4a expression decreases forebrain progenitors and neurogenesis during ageing. Nature 443: 448-452 41. Janzen V, Forkert R, Fleming HE, Saito Y, Waring MT, Dombkowski DM, Cheng T, DePinho RA, Sharpless NE, Scadden DT (2006) Stemcell ageing modified by the cyclin-dependent kinase inhibitor p16in- K4a. Nature 443: 421-426 42. Miyamoto K, Araki KY, Naka K, Arai F, Takubo K, Yamazaki S, Matsuoka S, Miyamoto T, Ito K, Ohmura M, Chen C, Hosokawa K, Nakauchi H, Nakayama K, Nakayama KI, Harada M, Motoyama N, Suda T, Hirao A (2007) Foxo3a is essential for maintenance of the hematopoietic stem cell pool. Cell Stem Cell 1: 101-112 43. Liang L, Chinnathambi S, Stern M, Tomanek-Chalkley A, Manuel TD, Bickenbach JR (2004) As epidermal stem cells age they do not substantially change their characteristics. J Investig Dermatol Symp Proc 9: 229-237 44. Blanpain C, Fuchs E (2009) Epidermal homeostasis: a balancing act of stem cells in the skin. Nat Rev Mol Cell Biol 10: 207-217 45. Inomata K, Aoto T, Binh NT, Okamoto N, Tanimura S, Wakayama T, Iseki S, Hara E, Masunaga T, Shimizu H, Nishimura EK (2009) Genotoxic stress abrogates renewal of melanocyte stem cells by triggering their differentiation. Cell 137: 1088-1099 46. Nishimura EK, Granter SR, Fisher DE (2005) Mechanisms of hair graying: incomplete melanocyte stem cell maintenance in the niche. Science 307: 720-724 47. Fuchs E, Merrill BJ, Jamora C, DasGupta R (2001) At the roots of a never-ending cycle. Dev Cell 1: 13-25 48. Liu H, Fergusson MM, Castilho RM, Liu J, Cao L, Chen J, Malide D, Rovira, II, Schimel D, Kuo CJ, Gutkind JS, Hwang PM, Finkel T (2007) Augmented Wnt signaling in a mammalian model of accelerated aging. Science 317: 803-806 49. Weissman IL (2000) Stem cells: units of development, units of regeneration, and units in evolution. Cell 100: 157-168 50. Hemberger M, Dean W, Reik W (2009) Epigenetic dynamics of stem cells and cell lineage commitment: digging Waddington s canal. Nat Rev Mol Cell Biol 10: 526-537 51. Le Grand F, Rudnicki MA (2007) Skeletal muscle satellite cells and adult myogenesis. Curr Opin Cell Biol 19: 628-633 52. Brack AS, Rando TA (2007) Intrinsic changes and extrinsic influences of myogenic stem cell function during aging. Stem Cell Rev 3: 226-237 53. Taylor-Jones JM, McGehee RE, Rando TA, Lecka-Czernik B, Lipschitz DA, Peterson CA (2002) Activation of an adipogenic program in adult myoblasts with age. Mech Ageing Dev 123: 649-661 54. Conboy IM, Conboy MJ, Wagers AJ, Girma ER, Weissman IL, Rando TA (2005) Rejuvenation of aged progenitor cells by exposure to a young systemic environment. Nature 433: 760-764 55. Carlson ME, Conboy MJ, Hsu M, Barchas L, Jeong J, Agrawal A, Mikels AJ, Agrawal S, Schaffer DV, Conboy IM (2009) Relative roles of TGF-beta1 and Wnt in the systemic regulation and aging of satellite cell responses. Aging Cell 8: 676-689 56. Sudo K, Ema H, Morita Y, Nakauchi H (2000) Age-associated characteristics of murine hematopoietic stem cells. J Exp Med 192: 1273-1280 57. Rossi DJ, Bryder D, Zahn JM, Ahlenius H, Sonu R, Wagers AJ, Weissman IL (2005) Cell intrinsic alterations underlie hematopoietic stem cell aging. Proc Natl Acad Sci USA 102: 9194-9199 58. Grubeck-Loebenstein B, Della Bella S, Iorio AM, Michel JP, Pawelec G, Solana R (2009) Immunosenescence and vaccine failure in the elderly. Aging Clin Exp Res 21: 201-209 59. Danaei G, Rimm EB, Oza S, Kulkarni SC, Murray CJ, Ezzati M (2010) The promise of prevention: the effects of four preventable risk factors on national life expectancy and life expectancy disparities by race and county in the United States. PLoS Med 7: e1000248 60. Visvader JE, Lindeman GJ (2012) Cancer stem cells: current status and evolving complexities. Cell Stem Cell 10: 717-728 61. Visvader JE (2011) Cells of origin in cancer. Nature 469: 314-322 62. Quintana E, Shackleton M, Sabel MS, Fullen DR, Johnson TM, Morrison SJ (2008) Efficient tumour formation by single human melanoma cells. Nature 456: 593-598 63. Fialkow PJ, Denman AM, Jacobson RJ, Lowenthal MN (1978) Chronic myelocytic leukemia. Origin of some lymphocytes from leukemic stem cells. J Clin Invest 62: 815-823 174 www.postepybiochemii.pl

64. Barker N, Ridgway RA, van Es JH, van de Wetering M, Begthel H, van den Born M, Danenberg E, Clarke AR, Sansom OJ, Clevers H (2009) Crypt stem cells as the cells-of-origin of intestinal cancer. Nature 457: 608-611 65. Goldstein AS, Huang J, Guo C, Garraway IP, Witte ON (2010) Identification of a cell of origin for human prostate cancer. Science 329: 568-571 66. Chan SW, Blackburn EH (2002) New ways not to make ends meet: telomerase, DNA damage proteins and heterochromatin. Oncogene 21: 553-563 67. Wang C, Jurk D, Maddick M, Nelson G, Martin-Ruiz C, von Zglinicki T (2009) DNA damage response and cellular senescence in tissues of aging mice. Aging Cell 8: 311-323 68. Lee HW, Blasco MA, Gottlieb GJ, Horner JW, 2nd, Greider CW, DePinho RA (1998) Essential role of mouse telomerase in highly proliferative organs. Nature 392: 569-574 69. Rudolph KL, Chang S, Lee HW, Blasco M, Gottlieb GJ, Greider C, De- Pinho RA (1999) Longevity, stress response, and cancer in aging telomerase-deficient mice. Cell 96: 701-712 70. Flores I, Cayuela ML, Blasco MA (2005) Effects of telomerase and telomere length on epidermal stem cell behavior. Science 309: 1253-1256 71. Ferron S, Mira H, Franco S, Cano-Jaimez M, Bellmunt E, Ramirez C, Farinas I, Blasco MA (2004) Telomere shortening and chromosomal instability abrogates proliferation of adult but not embryonic neural stem cells. Development 131: 4059-4070 72. Sarin KY, Cheung P, Gilison D, Lee E, Tennen RI, Wang E, Artandi MK, Oro AE, Artandi SE (2005) Conditional telomerase induction causes proliferation of hair follicle stem cells. Nature 436: 1048-1052 73. Akbari M, Krokan HE (2008) Cytotoxicity and mutagenicity of endogenous DNA base lesions as potential cause of human aging. Mech Ageing Dev 129: 353-365 74. Hart RW, Setlow RB (1974) Correlation between deoxyribonucleic acid excision-repair and life-span in a number of mammalian species. Proc Natl Acad Sci USA 71: 2169-2173 75. Kudlow BA, Kennedy BK, Monnat RJ, Jr. (2007) Werner and Hutchinson-Gilford progeria syndromes: mechanistic basis of human progeroid diseases. Nat Rev Mol Cell Biol 8: 394-404 76. Rossi DJ, Bryder D, Seita J, Nussenzweig A, Hoeijmakers J, Weissman IL (2007) Deficiencies in DNA damage repair limit the function of haematopoietic stem cells with age. Nature 447: 725-729 77. Sotiropoulou PA, Candi A, Mascre G, De Clercq S, Youssef KK, Lapouge G, Dahl E, Semeraro C, Denecker G, Marine JC, Blanpain C (2010) Bcl-2 and accelerated DNA repair mediates resistance of hair follicle bulge stem cells to DNA-damage-induced cell death. Nat Cell Biol 12: 572-582 78. Ruzankina Y, Pinzon-Guzman C, Asare A, Ong T, Pontano L, Cotsarelis G, Zediak VP, Velez M, Bhandoola A, Brown EJ (2007) Deletion of the developmentally essential gene ATR in adult mice leads to age-related phenotypes and stem cell loss. Cell Stem Cell 1: 113-126 79. Mohrin M, Bourke E, Alexander D, Warr MR, Barry-Holson K, Le Beau MM, Morrison CG, Passegue E (2010) Hematopoietic stem cell quiescence promotes error-prone DNA repair and mutagenesis. Cell Stem Cell 7: 174-185 80. Weinstock DM, Richardson CA, Elliott B, Jasin M (2006) Modeling oncogenic translocations: distinct roles for double-strand break repair pathways in translocation formation in mammalian cells. DNA Repair (Amst) 5: 1065-1074 81. Cairns J (1975) Mutation selection and the natural history of cancer. Nature 255: 197-200 82. Rando TA (2006) Stem cells, ageing and the quest for immortality. Nature 441: 1080-1086 83. Karpowicz P, Morshead C, Kam A, Jervis E, Ramunas J, Cheng V, van der Kooy D (2005) Support for the immortal strand hypothesis: neural stem cells partition DNA asymmetrically in vitro. J Cell Biol 170: 721-732 84. Goldberg AD, Allis CD, Bernstein E (2007) Epigenetics: a landscape takes shape. Cell 128: 635-638 85. Dorshkind K, Montecino-Rodriguez E, Signer RA (2009) The ageing immune system: is it ever too old to become young again? Nat Rev Immunol 9: 57-62 86. Lin SJ, Defossez PA, Guarente L (2000) Requirement of NAD and SIR2 for life-span extension by calorie restriction in Saccharomyces cerevisiae. Science 289: 2126-2128 87. Longo VD, Kennedy BK (2006) Sirtuins in aging and age-related disease. Cell 126: 257-268 88. Greer EL, Maures TJ, Hauswirth AG, Green EM, Leeman DS, Maro GS, Han S, Banko MR, Gozani O, Brunet A (2010) Members of the H3K4 trimethylation complex regulate lifespan in a germline-dependent manner in C. elegans. Nature 466: 383-387 89. Chen J, Astle CM, Harrison DE (2003) Hematopoietic senescence is postponed and hematopoietic stem cell function is enhanced by dietary restriction. Exp Hematol 31: 1097-1103 90. Christensen BC, Houseman EA, Marsit CJ, Zheng S, Wrensch MR, Wiemels JL, Nelson HH, Karagas MR, Padbury JF, Bueno R, Sugarbaker DJ, Yeh RF, Wiencke JK, Kelsey KT (2009) Aging and environmental exposures alter tissue-specific DNA methylation dependent upon CpG island context. PLoS Genet 5: e1000602 91. Maegawa S, Hinkal G, Kim HS, Shen L, Zhang L, Zhang J, Zhang N, Liang S, Donehower LA, Issa JP (2010) Widespread and tissue specific age-related DNA methylation changes in mice. Genome Res 20: 332-340 92. Zhang Z, Deng C, Lu Q, Richardson B (2002) Age-dependent DNA methylation changes in the ITGAL (CD11a) promoter. Mech Ageing Dev 123: 1257-1268 93. Jones PA, Baylin SB (2007) The epigenomics of cancer. Cell 128: 683-692 94. Peleg S, Sananbenesi F, Zovoilis A, Burkhardt S, Bahari-Javan S, Agis-Balboa RC, Cota P, Wittnam JL, Gogol-Doering A, Opitz L, Salinas-Riester G, Dettenhofer M, Kang H, Farinelli L, Chen W, Fischer A (2010) Altered histone acetylation is associated with age-dependent memory impairment in mice. Science 328: 753-756 95. Yatabe Y, Tavare S, Shibata D (2001) Investigating stem cells in human colon by using methylation patterns. Proc Natl Acad Sci USA 98: 10839-10844 96. Kim JY, Siegmund KD, Tavare S, Shibata D (2005) Age-related human small intestine methylation: evidence for stem cell niches. BMC Med 3: 10 97. Chambers SM, Shaw CA, Gatza C, Fisk CJ, Donehower LA, Goodell MA (2007) Aging hematopoietic stem cells decline in function and exhibit epigenetic dysregulation. PLoS Biol 5: e201 98. Maslov AY, Vijg J (2009) Genome instability, cancer and aging. Biochim Biophys Acta 1790: 963-969 99. Koga H, Kaushik S, Cuervo AM (2011) Protein homeostasis and aging: The importance of exquisite quality control. Ageing Res Rev 10: 205-215 100. Rodriguez KA, Gaczynska M, Osmulski PA (2010) Molecular mechanisms of proteasome plasticity in aging. Mech Ageing Dev 131: 144-155 101. Kirkwood TB (2005) Understanding the odd science of aging. Cell 120: 437-447 102. D Angelo MA, Raices M, Panowski SH, Hetzer MW (2009) Age-dependent deterioration of nuclear pore complexes causes a loss of nuclear integrity in postmitotic cells. Cell 136: 284-295 103. Morgan JE, Partridge TA (2003) Muscle satellite cells. Int J Biochem Cell Biol 35: 1151-1156 104. Erjavec N, Cvijovic M, Klipp E, Nystrom T (2008) Selective benefits of damage partitioning in unicellular systems and its effects on aging. Proc Natl Acad Sci USA 105: 18764-18769 105. Kaeberlein M (2010) Lessons on longevity from budding yeast. Nature 464: 513-519 106. Liu B, Larsson L, Caballero A, Hao X, Oling D, Grantham J, Nystrom T (2010) The polarisome is required for segregation and retrograde transport of protein aggregates. Cell 140: 257-267 Postępy Biochemii 60 (2) 2014 175

107. Bufalino MR, DeVeale B, van der Kooy D (2013) The asymmetric segregation of damaged proteins is stem cell-type dependent. J Cell Biol 201: 523-530 108. Briggs R, King TJ (1952) Transplantation of living nuclei from blastula cells into enucleated Frogs eggs. Proc Natl Acad Sci USA 38: 455-463 109. Gurdon JB (1962) The developmental capacity of nuclei taken from intestinal epithelium cells of feeding tadpoles. J Embryol Exp Morphol 10: 622-640 110. Takahashi K, Yamanaka S (2006) Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell 126: 663-676 111. Stadtfeld M, Hochedlinger K (2010) Induced pluripotency: history, mechanisms, and applications. Genes Dev 24: 2239-2263 112. Banito A, Rashid ST, Acosta JC, Li S, Pereira CF, Geti I, Pinho S, Silva JC, Azuara V, Walsh M, Vallier L, Gil J (2009) Senescence impairs successful reprogramming to pluripotent stem cells. Genes Dev 23: 2134-2139 113. Lapasset L, Milhavet O, Prieur A, Besnard E, Babled A, Ait-Hamou N, Leschik J, Pellestor F, Ramirez JM, De Vos J, Lehmann S, Lemaitre JM (2011) Rejuvenating senescent and centenarian human cells by reprogramming through the pluripotent state. Genes Dev 25: 2248-2253 114. Park IH, Arora N, Huo H, Maherali N, Ahfeldt T, Shimamura A, Lensch MW, Cowan C, Hochedlinger K, Daley GQ (2008) Disease-specific induced pluripotent stem cells. Cell 134: 877-886 115. Erenpreisa J, Cragg MS (2013) Three steps to the immortality of cancer cells: senescence, polyploidy and self-renewal. Cancer Cell Int 13: 92 116. Mosieniak G, Sikora E (2010) Polyploidy: the link between senescence and cancer. Curr Pharm Des 16: 734-740 117. Rajaraman R, Rajaraman MM, Rajaraman SR, Guernsey DL (2005) Neosis a paradigm of self-renewal in cancer. Cell Biol Int 29: 1084-1097 Stem cells and senescence Halina Waś, Joanna Czarnecka Laboratory of Molecular Bases of Aging, Nencki Institute of Experimental Biology, 3 Pasteura St., 02-093 Warsaw, Poland e-mail: h.was@nencki.gov.pl Key words: stem cell, senescence, cancer stem cell, cell reprogramming ABSTRACT Stem cells are undifferentiated cells that can differentiate into specialized cells, that build the whole body. These rare cells are required for homeostasis and tissue replacement throughout the human lifespan, and appear to be characterized by a few specific physiological and biochemical properties, particularly the capacity for self-renewal. Recent studies suggest that stem cells may undergo senescence, what plays a crucial role in organismal aging. Importantly, both senescence and apoptosis are anti-cancer mechanisms that counteract neoplastic transformation of stem cells. On the other hand, mechanisms that suppress the development of cancer may also induce an unwanted consequence: a decline in the number and functional alterations of stem cells with advancing age. These functional changes reflect harmful effects of age on the genome, epigenome, and proteome of stem cells. Some of which arise cell independently and others which are imposed by an age-related change in the local milieu or systemic environment. Remarkably, some of the changes, particularly epigenomic and proteomic ones, are potentially reversible, and both environmental (e.g. caloric restrictions, hypoxia) and genetic interventions can lead to inducible pluripotency. Here, we discuss recent discoveries in the field of senescence of stem cells. These findings have profound implications, not only for our understanding of stem cells biology and organismal aging, but also for stem cell-based regenerative medicine and stem cell-based therapy of age-related diseases. 176 www.postepybiochemii.pl