WPŁYW DIWERCYNY I OGRZEWANIA ŚRODOWISKA NA WZROST BAKTERII Z RODZAJU LISTERIA

Biotechnologia (-), - WPŁYW DIWERCYNY I OGRZEWANIA ŚRODOWISKA NA WZROST BAKTERII Z RODZAJU LISTERIA Anna Sip, Włodzimierz Grajek Streszczenie. Celem pracy było określenie wpływu diwercyny na przeŝywalność bakterii L. monocytogenes oraz ustalenie, w jaki sposób proces pasteryzacji wpływa na aktywność biologiczną tej bakteriocyny. W ramach badań określono wraŝliwość róŝnych szczepów Listeria na działanie diwercyny oraz ustalono, jakie czynniki wpływają na skuteczność jej antylisteryjnego działania. Stwierdzono, Ŝe aktywność diwercyny względem poszczególnych szczepów Listeria jest zróŝnicowana. Wykazano, Ŝe diwercyna jest najbardziej aktywna względem L. monocytogenes w warunkach chłodniczych. Ustalono równieŝ, Ŝe komórki L. monocytogenes poddane stresowi termicznemu są bardziej wraŝliwe na działanie diwercyny. Słowa kluczowe: diwercyna, bakteriocyny, Listeria monocytogenes, bioutrwalanie WSTĘP Wiele bakteriocyn wytwarzanych przez bakterie fermentacji mlekowej (LAB) wykazuje antagonistyczną aktywność w stosunku do patogennych bakterii z rodzaju Listeria [Muriana ]. Bakterie te są często źródłem zakaŝenia produktów mlecznych, mięsnych, rybnych oraz owocowo-warzywnych przechowywanych w opakowaniach próŝniowych [Harvey i Gilmour, Rudol i Scherer, Hasan i in., Jorgesen i Huss, Lin i in. ]. Zwykle dobrze namnaŝają się w warunkach chłodniczych, a przy tym są odporne na działanie wielu czynników fizykochemicznych. Tolerują wysokie stęŝenia NaCl (do %), niskie ph, a takŝe wytrzymują zamraŝanie i długotrwałe wysuszenie [Lovett ]. W ostatnich latach przeprowadzono wiele badań mających na celu opracowanie efektywnej metody inaktywacji patogennych bakterii Listeria monocytogenes. Badania te jak dotąd nie przyniosły jednak spodziewanych rezultatów. W związku z tym, Ŝe liczne bakteriocyny syntezowane przez LAB są zdolne do bakteriobójczego działania na bakterie Listeria sp., istnieje moŝliwość wykorzystania ich aktywności do ograniczania rozwoju tych niepoŝądanych bakterii. Dobrze przebadaną bakteriocyną wykazującą bardzo silną bakteriobójczą aktywność w stosunku do Listeria sp., jest diwercyna. Bakteriocyna ta wytwarzana jest przez bakterie fermentacji mlekowej Carnobacterium divergens, naturalnie występujące w rybach

A. Sip, Wł. Grajek łososiowatych, mleku, serach miękkich z porosem pleśni, mięsie wołowym, wieprzowym oraz jagnięcym [Pilet i in., Joborn i in., Milliere i in., Hitchener i in., Show i Harding ]. Diwercyna jest termostabilnym białkiem o masie cząsteczkowej, kda, całkowicie bezpiecznym dla organizmu człowieka [Pilett i in. ]. Właściwości diwercyny czynią ją atrakcyjnym czynnikiem poprawiającym bezpieczeństwo mikrobiologiczne artykułów Ŝywnościowych naraŝonych na zakaŝenia bakteriami naleŝącymi do rodzaju Listeria. Celem badań opisanych w niniejszej pracy było określenie wraŝliwości róŝnych szczepów Listeria sp. występujących w Ŝywności na działanie diwercyny oraz zbadanie moŝliwości zwiększenia skuteczności działania tej bakteriocyny poprzez zastosowanie jej w połączeniu z pasteryzacją. MATERIAŁY I METODY Mikroorganizmy Jako mikroorganizmy wskaźnikowe do oznaczania aktywności diwercyny stosowano bakterie Listeria monocytogenes Scott A,,,, A i oraz Listeria innocua F. Baterie te hodowano w bulionie TS (Trypcase Soy broth, biomerieux) z dodatkiem,% ekstraktu droŝdŝowego w warunkach względnie beztlenowych w temperaturze C. W badaniach mających na celu oznaczenie zakresu antybakteryjnej aktywności diwercyny stosowano ponadto bakterie Carnobacterium piscicola V, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus sake, Lactobacillus plantarum, Leuconostoc mesenteroides, Lactooccus lactis subsp. cremoris, Pediococcus acidilactici, Pediococcus pentosaceus, Enterococcus faecalis, Streprococcus thermophilus, Bacillus cereus, Clostridium tyrobutyricum, Salmonella typhimurium, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Pseudomonas fluorescens pochodzące z Kolekcji Kultur Katedry Biotechnologii i Mikrobiologii śywności Akademii Rolniczej w Poznaniu. Wymienione bakterie hodowano w bulionie wzbogaconym (BTL, Łódź) w temperaturach optymalnych dla ich wzrostu. Wszystkie szczepy bakteryjne przechowywano w postaci zawiesiny z dodatkiem % v/v glicerolu w temperaturze C. Diwercyna Diwercyna została otrzymana według technologii opracowanej przez autorów [Sip i Grajek i ]. W badaniach stosowano jej wodne roztwory o aktywności AU cm oznaczonej względem bakterii C. piscicola. Roztwory te przechowywano w temperaturze C i rozmraŝano w temperaturze pokojowej. Wpływ diwercyny na wzrost bakterii L. monocytogenes -godzinne kultury bakterii L. monocytogenes posiewano na poŝywkę TS (Trypcase Soy broth, biomerieux) o ph,. Początkowe stęŝenie komórek L. monocytogenes w poŝywce wynosiło jtk cm. Do poŝywki przed inokulacją wprowadzano, i AU cm diwercyny. Hodowle bakterii L. monocytogenes prowadzono w temperaturach,, oraz C przez h. Podczas nich oznaczano liczebność populacji bakterii L. monocytogenes. Kontrole stanowiły hodowle bakterii L. monocytogenes na poŝywce pozbawionej diwercyny. Acta Sci. Pol.

Wpływ diwercyny... Wpływ ogrzewania na aktywność diwercyny -godzinne płynne kultury bakterii wskaźnikowych ogrzewano minut w temp. C. Po ogrzewaniu bakterie przenoszono do świeŝej poŝywki TS z dodatkiem AU cm diwercyny. PoŜywkę zaszczepiano taką ilością zawiesiny bakteryjnej, aby uzyskać początkowe stęŝenie komórek jtk cm. Inkubację prowadzono przez h w temperaturach i C. Podczas inkubacji oznaczano liczebność populacji bakterii i porównywano ją z liczebnością bakterii hodowanych w środowisku pozbawionym diwercyny (kontrola) oraz liczebnością bakterii nie poddanych ogrzewaniu, które hodowano w poŝywce zawierającej AU cm diwercyny. Oznaczanie liczby Ŝywych komórek Liczebność Ŝywych komórek bakterii L. monocytogenes oznaczano klasyczną zalewową metodą płytkową na poŝywce Listeria Selective Agar (Oxford formation, Oxoid). Wyniki pomiarów podawano w jtk w przeliczeniu na cm poŝywki. Oznaczanie aktywności diwercyny Aktywność preparatów diwercyny w stosunku do poszczególnych bakterii oznaczano metodą krytycznych rozcieńczeń i wyraŝano w umownych jednostkach AU cm definiowanych jako odwrotność najniŝszego rozcieńczenia bakteriocyny, przy którym nie następowało zahamowanie ich wzrostu [Pilet i in. ]. WYNIKI I DYSKUSJA WraŜliwość róŝnych szczepów Listeria sp. na działanie diwercyny Przeprowadzone badania, których wyniki przedstawiono w tabeli wykazały, Ŝe wraŝliwość róŝnych szczepów bakterii z rodzaju Listeria występujących w Ŝywności na działanie diwercyny jest zróŝnicowana. Diwercyna jest najbardziej aktywna względem najsilniej patogennych bakterii Listeria monocytogenes Scott A ( AU cm ). Dwukrotnie niŝszą aktywność wykazuje ona w stosunku do bakterii Listeria monocytogenes, Listeria monocytogenes, Listeria monocytogenes, Listeria monocytogenes A oraz Listeria innocua F. Najsłabiej działa ona natomiast na bakterie Listeria monocytogenes. Oznacza to tym samym, Ŝe bakterie te są najbardziej odporne na działanie diwercyny. W związku z tym w kolejnych badaniach bakterie Listeria monocytogenes wykorzystywano jako drobnoustrój wskaźnikowy. Tabela. Aktywność standardowego roztworu diwercyny w stosunku do bakterii z rodzaju Listeria Table. Activity of standard divercin solution against Listeria sp. Aktywność diwercyny Bakterie Bacteria Divercin activity [AU cm ] Listeria monocytogenes Scott A Listeria monocytogenes Listeria monocytogenes Listeria monocytogenes Listeria monocytogenes Listeria monocytogenes A Listeria innocua F Biotechnologia (-)

A. Sip, Wł. Grajek Wpływ diwercyny na przeŝywalność bakterii Listeria monocytogenes Przeprowadzone badania wykazały, Ŝe silny wpływ na intensywność wzrostu Listeria sp. oraz na ich wraŝliwość na działanie diwercyny wywierała temperatura. Stwierdzono, Ŝe badane bakterie rozwijały się najlepiej w temperaturze C. W miarę obni- Ŝania temperatury inkubacji malała szybkość ich wzrostu. Diwercyna, niezaleŝnie od stęŝenia w jakim była stosowana, działała najlepiej w warunkach chłodniczych, natomiast najsłabiej w temperaturze C (rys. ). W związku z tym moŝna przypuszczać, Ŝe jej większa aktywność w niskiej temperaturze jest wynikiem synergistycznego działania temperatury. Ustalono równieŝ, Ŝe skuteczność antylisteryjnego działania diwercyny zaleŝy od jej stęŝenia w środowisku. W całym badanym przedziale temperatury wraz ze wzrostem stęŝenia bakteriocyny od do AU cm zwiększała się skuteczność jej działania. Dalsze zwiększanie stęŝenia diwercyny nie wywierało wpływu na jej aktywności względem bakterii Listeria sp. Przeprowadzone badania wykazały, Ŝe w temperaturze C AU cm diwercyny juŝ po h powodowało całkowitą inaktywację komórek L. monocytogenes (wykres, C). W temperaturze C szybkość działania AU cm diwercyny była mniejsza (inaktywacja Listeria po h). W najwyŝszej badanej temperaturze omawiany dodatek diwercyny wpływał najsłabiej na wzrost L. monocytogenes. Początkowo (do h inkubacji) działał bakteriobójczo, a następnie tracił zdolność do oddziaływania na bakterie Listeria. W konsekwencji tego ich liczebność zaczynała zwiększać się i w h hodowli osiągała poziom porównywalny z hodowlą kontrolą (rys., C). Wpływ AU cm diwercyny na wzrost bakterii Listeria był wyraźnie mniejszy. W warunkach chłodniczych diwercyna zastosowana w takim stęŝeniu najpierw redukowała liczebność Listeria o ok. cykle log a następnie do h powstrzymywała ich rozwój. W temperaturze i C AU cm diwercyny takŝe początkowo obniŝało liczbę komórek L. monocytogenes, jednak po h dawka ta przestawała działać. W rezultacie tego liczba bakterii gwałtownie zwiększała się i po h osiągała poziom zbliŝony do występującego w próbie kontrolnej. Dodatkowe badania wykazały, Ŝe większe od opisanych stęŝenia diwercyny działały na bakterie L. monocytogenes tak samo jak AU cm (dane nie prezentowane). Podsumowując przeprowadzone badania stwierdzono, Ŝe diwercyna wykazuje największą bakteriobójczą aktywność względem bakterii L. monocytogenes w temperaturze C, gdy jest stosowana w stęŝeniu co najmniej AU cm. Wpływ ogrzewania środowiska na zakres aktywności diwercyny oraz efektywność jej działania Celem badań opisanych poniŝej było określenie wpływu ogrzewania środowiska na antybakteryjne działanie diwercyny. Przeprowadzone badania wykazały, Ŝe diwercyna działa bakteriobójczo na bakterie Listeria monocytogenes, Listeria innocua, Enterococcus faecalis oraz na niektóre szczepy bakterii Carnobacterium piscicola, Carnobacterium divergens i Clostridium tyrobutiricum. Nie była natomiast aktywna w stosunku do bakterii fermentacji mlekowej z rodzajów Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc i Pediocccus oraz bakterii Gram-ujemnych. Obróbka termiczna wyraźnie rozszerzyła zakres aktywności diwercyny. Wykazano, Ŝe po min ogrzewania w temperaturze C bakterie Staphylococcus aureus, Clostridium perfringens oraz Bacillus cereus, początkowo niewraŝliwe na działania diwercyny, tracą odporność na jej właściwości (tab. ). Acta Sci. Pol.

Wpływ diwercyny... C C C czas inkubacji [h] kontrola AU/ml AU/ml AU/ml Rys.. Wpływ stęŝenia diwercyny i temperatury inkubacji na wzrost L. monocytogenes Fig.. Effect of divercin concentration and time of incubation on L. monocytogenes growth Biotechnologia (-)

A. Sip, Wł. Grajek Tabela. Wpływ ogrzewania środowiska na zakres aktywności diwercyny Table. Effect of heating on the spectrum of divercin activity Szczepy wskaźnikowe Indicator strains Carnobacterium divergens V Carnobacterium piscicola V Lactobacillus curvatus Lactobacillus sake Lactobacillus plantarum Leuconostoc mesenteroides Lactooccus lactis subsp. cremoris Pediococcus acidilactici Pediococcus pentosaceus Enterococcus faecalis Lactoococcus thermophilus Listeria innocua F Listeria monocytogenes Listeria monocytogenes Listeria monocytogenes Listeria monocytogenes Listeria monocytogenes A Bacillus cereus Clostridium tyrobutyricum ATCC Clostridium perfringens Staphylococcus aureus Pseudomonas fluorescens Salmonella typhimurium Escherichia coli Przed obróbką termiczną Before terminal treatment Po obróbce termicznej After terminal treatment MoŜliwość rozszerzenia zakresu aktywności bakteriocyn poprzez poddanie środowiska, w którym są obecne drobnoustroje obróbce termicznej dostrzegli takŝe inni badacze. Delves-Broughton i in. [] wykazali, Ŝe w pasteryzowanej masie jajecznej nizyna posiada szersze spektrum aktywności. W produkcie tym silnie redukuje ona liczebność bakterii z rodzaju Pseudomonas, w normalnych warunkach niewraŝliwych na jej działanie. W przypadku diwercyny obróbka termiczna zwiększyła jedynie zakres jej aktywności w stosunku do bakterii Gram-dodatnich. Bakterie Gram-ujemne po obróbce termicznej były nadal niewraŝliwe na aktywność tego związku. Przeprowadzone badania wykazały ponadto, Ŝe ogrzewanie zwiększa skuteczność działania diwercyny na bakterie z rodzaju Listeria. Wykazano, Ŝe w temperaturze C diwercyna powstrzymuje rozwój bakterii nie poddanych wstępnemu ogrzewaniu, natomiast na bakterie poddane stresowi termicznemu działa ona bakteriobójczo i po h inkubacji całkowicie je niszczy (rys., C). W temperaturze C diwercyna względem bakterii, których zawiesiny poddano pasteryzacji, wykazuje analogiczną aktywność jak w temperaturze C (rys. ). Analizując wyniki badań zamieszczone na rysunku stwierdzono równieŝ, Ŝe AU cm diwercyny w temperaturze C działa na bakterie w próbach poddanych obróbce termicznej z taką samą efektywnością jak AU cm diwercyny na bakterie nieogrzewane. Oznacza to, Ŝe po ogrzewaniu prób moŝliwe jest zniszczenie L. monocytogenes za pomocą mniejszych dawek diwercyny oraz jednoczesne ograniczenie rozwoju bakterii w naturalnych warunkach niewraŝliwych na działanie diwercyny. Acta Sci. Pol.

Wpływ diwercyny... Na podstawie przedstawionych danych stwierdzono, Ŝe -minutowe ogrzewanie środowiska w temperaturze C zwiększa skuteczność działania diwercyny względem bakterii Listeria oraz rozszerza zakres jej aktywności. Celowe zatem wydaje się wprowadzanie diwercyny do produktów Ŝywnościowych poddanych wstępnemu ogrzewaniu. C C czas inkubacji [h] kontrola AU/ml ogrzewanie wstępneau/ml Rys.. Wpływ ogrzewania środowiska na aktywność diwercyny względem bakterii Listeria monocytogenes Fig.. Effect of heating on divercin activity against Listeria monocytogenes Biotechnologia (-)

A. Sip, Wł. Grajek WNIOSKI Przeprowadzone badania wykazały, Ŝe wraŝliwości róŝnych szczepów Listeria sp. występujących w Ŝywności na działanie diwercyny jest zróŝnicowana. Diwercyna jest najbardziej aktywna względem najsilniej patogennych bakterii Listeria monocytogenes Scott A, natomiast najsłabiej działa ona na bakterie Listeria monocytogenes. Wykazano, Ŝe efektywność działania diwercyny zaleŝy od jej stęŝenia oraz temperatury inkubacji. Stwierdzono, Ŝe w warunkach chłodniczych diwercyna zastosowana w stęŝeniu AU cm działa najskuteczniej na bakterie Listeria monocytogenes. Po godzinach inkubacji powoduje całkowitą inaktywację ich komórek. Wraz ze wzrostem temperatury maleje skuteczność działania bakteriocyny. Ustalono równieŝ, Ŝe skuteczność działania diwercyny moŝna zwiększyć poprzez stosowanie jej w połączeniu z pasteryzacją. Wykazano, Ŝe zabieg ten zwiększa wraŝliwość Listeria sp. na działanie diwercyny oraz rozszerza zakres jej aktywności. Zalecać zatem moŝna poddawanie produktów Ŝywnościowych zakaŝonych bakteriami z rodzaju Listeria -minutowemu ogrzewaniu w temperaturze C bezpośrednio przed wprowadzeniem do nich diwercyny. PIŚMIENNICTWO Delves-Broughton J., Williams G. C., Wilkinson S.,. The use of bacteriocin, nisin as a preservatives in pasteurized liquid whole egg. Lett. Appl. Microbiol.,. Joborn A, Olsson J. C., Westerdahl A., Conway P. L., Kjellegerg S.,. Colonization in the fish intestinal tract and production of inhibitory substances in intestional mucus and faecal extracts by Carnobacterium sp. strain K. J. Fish Diseases,. Jorgensen L. V., Huss H. H.,. Prevalence and growth of Listeria monocytogenes in naturally contaminated seafood. Int. J. Food Microbiol.,. Harvey J., Glimour A.,. Characterization of recurrent and sporadic Listeria monocytogenes isolates from raw milk and nondairy foods by pulsed-field gel electrophoresis, monocin typing, plasmid profiling, and cadmium and antibiotic resistance determination. Appl. Environ. Microbiol.,. Hassan Z., Purwati E., Radu S., Rahim R. A., Rusul G.,. Prevalence of Listeria sp. and Listeria monocytogenes in meat and fermented fish in Malaysia. Sautheast. Asian J. Trop. Med.,. Hitchener B. J., Egan A. F., Rogers P. J.,. Characteristics of lactic acid bacteria isolated from vacuum-packaged beef. J. Appl. Microbiol.,. Lin Ch.-M., Fernando S. Y., Wie Ch.,. Occurrence of Listeria monocytogenes, Salmonella sp., Escherichia coli and E. coli O:H in vegetables salads. Food Control,. Lovett J.,. Listeria monocytogenes. In: Foodborne bacterial pathogens (ed. Doyle M. P.). Marcel Dekker, Inc.,. Milliere J. B., Michel M., Mathieu F., Lefebvore G.,. Presence of Carnobacterium spp. in French surface mould-ripened soft cheese. J. Appl. Bacteriol.,. Pilet M. F., Dusset X., Barre R., Novel G., Desmazaeud M., Piard J. Ch.,. Evidence for two bacteriocins produced by Carnobacterium piscicola and Carnobacterium divergens isolated from fish and active against Listeria monocytogenes. J. Food Protect.,. Rudol M., Scherer S.,. High incidence of Listeria monocytogenes in European red smear cheese. Int. J. Food Microbiol.,. Acta Sci. Pol.

Wpływ diwercyny... Sip A., Grajek W.,. Biosynteza diwercyny przez kulturę bakterii Carnobacterium divergens o wysokiej koncentracji komórek. I Krajowy Kongres Biotechnologii. Wrocław września, str.. Sip A., Grajek W.,. Technologia produkcji diwercyny. Szkoła Letnia. Bakterie fermentacji mlekowej klasyfikacja, metabolizm, genetyka, wykorzystanie, Kazimierz Dolny maja czerwca. Show B. G., Harding C. D.,. A numerical taxonomic study of lactic acid bacteria from vacuum-packaged beef, pork, lamb and bacon. J. Appl. Bacteriol.,. EFFECT OF DIVERCIN AND THERMAL TREATMENT ON THE LISTERIA SP. GROWTH Abstract. The aim of this study was established the sensibility of different Listeria strains on divercin activity. Efficacy of divercin in combination with thermal treatment against Listeria monocytogenes was also examined. The results of this study showed the strongest divercin activity against Listeria monocytogenes at temperature of C. The heating had also favourable effect on divercin activity. This process increased Listeria cells sensibility on divercin and broadened its spectrum of activity. It was proved that using divercin in combination with limited thermal treatment may be better method for food protection against Listeria and another foodborne pathogens contaminations. Key words: divercin, bacteriocins, Listeria monocytogenes, biopreservation Anna Sip, Włodzimierz Grajek, Katedra Biotechnologii i Mikrobiologii śywności, Akademia Rolnicza im A. Cieszkowskiego w Poznaniu, ul. Wojska Polskiego, - Poznań; aniasip@owl.au.poznan.pl Dr Anna Sip jest stypendystką FNP / Biotechnologia (-)