Instytut Fizjologii i Żywienia Zwierząt im. Jana Kielanowskiego PAN

Instytut Fizjologii i Żywienia Zwierząt im. Jana Kielanowskiego PAN Rola interleukiny -1β w mechanizmie hamowania sekrecji GnRH i LH u owcy w czasie ostrego i przedłużonego stanu zapalnego. Badania in vitro i in vivo. AUTOREFERAT Dr inż. Andrzej Herman Laboratorium Biologii Molekularnej

I. Dane osobowe. Imię i nazwisko. Posiadane stopnie naukowe z podaniem nazwy, miejsca i roku ich uzyskania. Imię i Nazwisko: Andrzej Przemysław Herman Posiadane stopnie naukowe: Magister inżynier biotechnologii, specjalność procesy biotechnologiczne 13 lipca 2004 - Wydział Chemiczny, Politechnika Wrocławska; Pracę magisterską pt. Flokulacja biomodyfikowanych zawiesin mineralnych wykonywano pod kierunkiem prof. dr hab. Zygmunta Sadowskiego w Zakładzie Inżynierii Chemicznej. Doktor nauk rolniczych w zakresie zootechniki 23 czerwca 2009 Instytut Fizjologii i Żywienia Zwierząt im. Jana Kielanowskiego PAN; Pracę doktorską pt. Wpływ stresu immunologicznego i interleukiny-1β na układ podwzgórzowo-przysadkowogonadotropowy anestralnych owiec wykonywano pod kierunkiem dr hab. Doroty Tomaszewskiej-Zaremby prof. nadzw. w Zakładzie Neuroendokrynologii. Informacja o dotychczasowym zatrudnieniu w jednostkach naukowych od 03.2012 do chwili obecnej - kierownik Laboratorium Biologii Molekularnej Instytutu Fizjologii i Żywienia Zwierząt im. Jana Kielanowskiego PAN od 04.2011 do 02.2012 - p.o. kierownika Laboratorium Biologii Molekularnej Instytutu Fizjologii i Żywienia Zwierząt im. Jana Kielanowskiego PAN od 03.2010 do chwili obecnej - adiunkt w Zakładzie Neuroendokrynologii, a następnie w Laboratorium Biologii Molekularnej Instytutu Fizjologii i Żywienia Zwierząt im. Jana Kielanowskiego PAN od 06.2009 do 03.2010 - asystent w Zakładzie Neuroendokrynologii Instytutu Fizjologii i Żywienia Zwierząt im. Jana Kielanowskiego PAN od 10.2006 do 05.2009 doktorant, specjalista w Zakładzie Neuroendokrynologii Instytutu Fizjologii i Żywienia Zwierząt im. Jana Kielanowskiego PAN 2

II. Wskazanie osiągnięcia wynikającego z art. 16 ust. 2 ustawy z dnia 14 marca 2003 r. o stopniach naukowych i tytule naukowym oraz o stopniach i tytule w zakresie sztuki (Dz. U. nr 65, poz. 595 ze zm.): a) Tytuł osiągnięcia naukowego: Rola interleukiny -1β w mechanizmie hamowania sekrecji GnRH i LH u owcy w czasie ostrego i przedłużonego stanu zapalnego. Badania in vitro i in vivo. b) Wykaz publikacji wchodzących w skład osiągnięcia naukowego (autorzy, tytuł publikacji, nazwa wydawnictwa, rok wydania, punktacja punktacja MNiSW według komunikatu obowiązującego w roku wydania pracy i wskaźnik Impact Factor) [1] Herman AP, Misztal T, Romanowicz K, Tomaszewska-Zaremba D: Central injection of exogenous IL-1β in the control activities of hypothalamic pituitary gonadal axis in anestrous ewes. Reproduction in Domestic Animals. 2012; 47: 44-52. 30 pkt (MNiSW 2012); IF (2012) = 1,392 Mój udział w wyżej wymienionej pracy dotyczył sformułowania koncepcji badań, zaplanowania i organizacji doświadczeń na zwierzętach, wykonania analiz Real-Time PCR, oznaczenia wydajności translacji, wykonania testu ELISA, opracowania zebranych danych doświadczalnych oraz ich analizy statystycznej, a także przygotwania publikacji do druku. Ogółem swój udział określam na 70%. [2] Herman AP, Krawczyńska A, Bochenek J, Dobek E, Herman A, Tomaszewska-Zaremba D: LPS induced inflammation potentiates the IL-1β-mediated reduction of LH secretion from the anterior pituitary explants. Clinical & Developmental Immunology. 2013; 2013:926937. 25 pkt (MNiSW 2013); IF (2013) = 2,934 Mój udział w wyżej wymienionej pracy dotyczył sformułowania koncepcji badań, zaplanowania i organizacji doświadczeń na zwierzętach, wykonania analiz Real-Time PCR, opracowania zebranych danych doświadczalnych oraz oraz ich analizy statystycznej, a także przygotwania publikacji do druku. Ogółem swój udział określam na 65%. [3] Herman AP, Krawczyńska A, Bochenek J, Haziak K, Antushevitch H, Herman A, Tomaszewska Zaremba D: Inhibition of acetylcholinesterase activity by rivastigmine 3

decreases LPS-induced interleukin-1β expression in the hypothalamus of ewes. Domestic Animal Endocrinology. 2013; 44: 109-114. 30 pkt (MNiSW 2013); IF (2013) = 1,783 Mój udział w wyżej wymienionej pracy dotyczył sformułowania koncepcji badań, zaplanowania i organizacji doświadczeń na zwierzętach, wykonania analiz Real-Time PCR, oznaczenia stężenia IL-1β, opracowania zebranych danych doświadczalnych oraz oraz ich analizy statystycznej, a także przygotwania publikacji do druku. Ogółem swój udział określam na 65%. [4] Herman AP, Krawczyńska A, Bochenek J, Haziak K, Romanowicz K, Misztal T, Antushevich H, Herman A, Tomaszewska Zaremba D: The effect of rivastigmine on the LPS-induced suppression of GnRH/LH secretion during the follicular phase of the estrous cycle in ewes. Animal Reproduction Science. 2013; 138: 203-212. 30 pkt (MNiSW 2013); IF (2013) = 1,581 Mój udział w wyżej wymienionej pracy dotyczył sformułowania koncepcji badań, zaplanowania i organizacji doświadczeń na zwierzętach, wykonania analiz Real-Time PCR, opracowania zebranych danych doświadczalnych oraz ich analizy statystycznej, a także przygotwania publikacji do druku. Ogółem swój udział określam na 65%. [5] Herman AP, Kopycińska K, Krawczyńska K, Romanowicz K, Tomaszewska-Zaremba D.: The effect of repeated endotoxin injections on gonadotropin secretion in ewes. Journal of Animal and Feed Sciences. 2014; 23: 217-221. 20 pkt (MNiSW 2014); IF (2014) = 0,591* Mój udział w wyżej wymienionej pracy dotyczył sformułowania koncepcji badań, zaplanowania i organizacji doświadczeń na zwierzętach, opracowania zebranych danych doświadczalnych, a także przygotwania publikacji do druku. Ogółem swój udział określam na 65%. [6] Herman AP, Krawczyńska A, Bochenek J, Antushevich H, Herman A, Tomaszewska- Zaremba D: Peripheral injection of SB203580 inhibits the inflammatory-dependent synthesis of proinflammatory cytokines in the hypothalamus. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2014; 475152. 30 pkt (MNiSW 2014); IF (2014) = 2,706* Mój udział w wyżej wymienionej pracy dotyczył sformułowania koncepcji badań, zaplanowania i organizacji doświadczeń na zwierzętach, wykonania analiz Real-Time 4

PCR, oznaczenia stężenia IL-1β, opracowania zebranych danych doświadczalnych, a także przygotwania publikacji do druku. Ogółem swój udział określam na 65%. [7] Herman AP, Krawczyńska A, Bochenek J, Antushevich H, Herman A, Tomaszewska Zaremba D: The involvement of prolactin in meloxicam-dependent inflammatory response of gonadotropic axis to prolonged LPS treatment in anestrous ewes. Reproduction, Fertility and Development. opublikowane on-line: 2014; DOI: 10.1071/RD13435. 25 pkt (MNiSW 2014); IF (2014) = 2,577* Mój udział w wyżej wymienionej pracy dotyczył sformułowania koncepcji badań, zaplanowania i organizacji doświadczeń na zwierzętach, wykonania analiz Real-Time PCR, oznaczenia stężenia GnRH, opracowania zebranych danych doświadczalnych, a także przygotwania publikacji do druku. Ogółem swój udział określam na 70%. *dla prac opublikowanych w 2014 roku przyjęto wartości Impact Factor z roku 2013 Sumaryczny Impact Factor monotematycznego cyklu publikacji: 13,564 Sumaryczna liczba punktów MNiSW dla monotematycznego cyklu wybranych publikacji: 190 pkt c) Oświadczenia współautorów o udziale własnym w przygotowaniu prac stanowiących szczególne osiągnięcia naukowe w załączniku 6. d) Omówienie celu naukowego ww. prac i osiągniętych wyników wraz z omówieniem ich ewentualnego wykorzystania. Jedną z przyczyn zaburzenia procesów rozrodu zarówno u ludzi jak i u zwierząt może być stan zapalny wywołany infekcją bakteryjną lub wirusową [Nepomnaschy i wsp., 2007]. Wskazuje to na współzależność układów immunologicznego i neuroendokrynnego, chociaż dokładny mechanizm poprzez który aktywacja układu immunologicznego prowadzi do zaburzenia procesu rozrodu nie został jeszcze w pełni poznany. Wydaje się, że wzajemne oddziaływanie pomiędzy tymi układami może zachodzić na wszystkich piętrach układu zwanego osią podwzgórze przysadka gonady (HPG). Szczególnie ważną rolę w komunikacji pomiędzy tymi układami odgrywa podwzgórze, które jest częścią mózgu odpowiedzialną za utrzymanie homeostazy organizmu, odpowiada bowiem za integrację i przetwarzanie sygnałów z układu nerwowego, endokrynnego i immunologicznego. Struktura ta pełni kluczową rolę w kontroli rozrodu poprzez toniczne uwalnianie neurohormonu 5

gonadoliberyny (GnRH) do podwzgórzowo-przysadkowego układu wrotnego, regulując syntezę i uwalnianie gonadotropin: hormonu luteinizującego (LH) i folikulotropowego (FSH) z przedniego płata przysadki [Gore, 2002]. U owcy zdecydowana większość populacji neuronów syntetyzujących GnRH ma perikariony ulokowane w okolicy przedwzrokowej (POA). Z kolei większość zakończeń neuronów GnRH znajduje się w wyniosłości pośrodkowej (ME) [Caldani i wsp., 1988]. W badaniach in vivo wykazano, że stres immunologiczny wywołany podaniem endotoksyny bakteryjnej lipopolisacharydu (LPS) hamuje toniczną sekrecję LH u wielu gatunków zwierząt także u owcy [Daniel i wsp., 2003; Herman i wsp., 2010 (B)]. Dostępne w literaturze światowej dane i wyniki wcześniejszych badań własnych sugerują, że zaburzenie sekrecji LH jest przede wszystkim następstwem hamującego oddziaływania stresu immunologicznego na biosyntezę GnRH w podwzgórzu, a także zmniejszenia jego uwalniania do podwzgórzowo przysadkowego układu wrotnego [Battaglia i wsp., 1997; Daniel i wsp., 2003; Herman i Tomaszewska, 2010]. Zmiany w sekrecji LH mogą także wynikać z oddziaływania stresu immunologicznego bezpośrednio na komórki gonadotropowe, stwierdzono bowiem, że obwodowe podanie LPS obniża poziom ekspresji genu i białka receptora GnRH (GnRHR) w komórkach przedniego płata przysadki, zmniejszając tym samym wrażliwość tego gruczołu na stymulację GnRH [Williams i wsp., 2001; Herman i wsp., 2010 (B)]. Chociaż w hamowanie osi HPG w stanie zapalnym mogą być włączone mediatory aktywowanej osi podwzgórze-przysadka-nadnercza, to ich rola w hamowaniu sekrecji GnRH/LH nie wydaje się być kluczowa [Rivest i Rivier, 1995]. Dane te potwierdzają także wyniki badań przeprowadzonych na owcach, w których stwierdzono, że farmakologiczne zablokowanie syntezy kortyzolu nie zmniejsza hamowania sekrecji GnRH/LH w czasie stresu immunologicznego, wywołanego podaniem endotoksyny [Debus i wsp., 2002]. Dlatego przypuszcza się, że oddziaływanie pomiędzy układem immunologicznym a neuroendokrynnym w głównej mierze zachodzi za pośrednictwem mediatorów zapalnych, takich jak interleukina (IL) -1β, IL-6 i czynnik martwicy guza (TNFα). Podczas ogólnoustrojowego zapalenia, ich głównym źródłem w organizmie są aktywowane komórki układu immunologicznego, przede wszystkim monocyty i makrofagi, chociaż w mniejszych ilościach cytokiny te są także syntetyzowane przez limfocyty T i B, neutrofile i komórki NK [Dinarello, 2000]. Cytokiny prozapalne biorą udział w centralnej regulacji procesów związanych bezpośrednio i pośrednio z odpowiedzią immunologiczną i zapalną. Na kluczową 6

rolę IL-1β, IL-6 i TNF w transmisji sygnałów z układu immunologicznego do neuroendokrynnego wskazuje także fakt, że aktywacja układu immunologicznego znacząco podwyższa poziom tych cytokin w płynie mózgowo-rdzeniowym [Watanobe i Hayakawa, 2003; Lampa i wsp., 2012]. Część cytokin prozapalnych działających w obszarze ośrodkowego układu nerwowego (OUN) jest pochodzenia obwodowego i do parenchymy mózgu przenika na drodze aktywnego transportu [Banks i wsp., 1995]. Cytokiny prozapalne mogą także pojawiać się w płynie rdzeniowym w wyniku aktywności sekrecyjnej komórek splotu naczyniówkowego [Zeni i wsp., 2007]. Sądzi się jednak, że głównym źródłem cytokin prozapalnych obecnych w obszarze mózgu, szczególnie w późniejszej fazie reakcji zapalnej, jest ich lokalna synteza w komórkach OUN [Acarin i wsp., 2000]. Chociaż ostry stan zapalny prowadzi do istotnego zwiększenia stężenia zarówno IL-1β, IL-6 jak i TNFα w płyniemózgowo rdzeniowym, to wyniki badań przeprowadzonych na kastrowanych samicach szczura sugerują, że jedynie IL-1β i TNFα uczestniczą w hamowaniu uwalniania LH [Watanobe i Hayakawa, 2003]. Z kolei w doświadczeniu, w którym szczurom podano IL-1β, IL-6 i TNFα bezpośrednio do III komory mózgu wykazano, że spośród tych cytokin to IL-1β zdecydowanie najsilniej hamuje uwalnianie LH [Rivier i Vale, 1990]. Należy podkreślić, że w przeprowadzonych wczesniej badaniach własnych wykazano, że u owcy w czasie ostrego stanu zapalnego znaczące ilości IL-1β były syntetyzowane bezpośrednio w obszarach podwzgórza związanych z aktywnością GnRH-ergiczną [Herman i wsp., 2010 (A)]. Wykazano w nich również znaczącą ekspresję genów kodujących receptory IL-1β w tych strukturach [Herman i wsp., 2010 (A)], co sugeruje, że oddziałująca centralnie IL-1β może bezpośrednio wpływać na aktywność komórek ulokowanych w tych obszarach mózgu. W badaniach przeprowadzonych przez Igaz i wsp. (2006) na linii komórkowej immortalizowanych neuronów GnRH - Gnv-4, stwierdzono ekspresję receptorów IL-1 (IL-1R) na błonach tych komórek, co wskazuje na możliwość bezpośredniego wpływu IL-1β na aktywność sekrecyjną tych neuronów. Hamujące działanie IL-1β na uwalnianie LH może nie tylko wynikać z jej wpływu na sekrecję GnRH w podwzgórzu, ale nie można wykluczyć, że obwodowa IL-1β oddziałuje bezpośrednio na wydzielanie LH także na poziomie przysadki mózgowej, gdyż receptory tej cytokiny są rozpowszechnione w komórkach gruczołowego płata przysadki [Vitkovic i wsp., 2000]. Należy podkreślić, że większość badań dotyczących wpływu stanu zapalnego na proces rozrodu, jak i roli cytokin prozapalnych w oddziaływaniach zachodzących pomiędzy układami 7

immunologicznym i neuroendokrynnym, było prowadzona na gryzoniach. Może mieć to istotne znaczenie dla uzyskanych danych, zwierzęta te charakteryzują się bowiem niską wrażliwością na działanie endotoksyny bakteryjnej, powszechnie stosowanej do indukowania reakcji zapalnej. Podawane szczurom dożylne dawki endotoksyny [Refojo i wsp., 1998; Buttini i wsp., 1997] w celu wywołania stanu zapalnego są wielokrotnie większe niż stosowane u owcy [Daniel i wsp., 2003; Herman i wsp., 2010 (B)] i naczelnych [Xiao i wsp., 2000]. Dlatego, obecnie coraz więcej prac wskazuje na ograniczoną przydatność małych gryzoni jako zwierząt modelowych w doświadczeniach z zakresu immunologii [Mestas i Hughes, 2004; Seok i wsp., 2013]. Problem ten został także dostrzeżony przez amerykańską Agencję Żywności i Leków, która zdecydowała, że wszystkie nowe leki, mające być stosowane w leczeniu objawów ogólnoustrojowego zapalenia, przed rozpoczęciem prób klinicznych muszą zostać przebadane przynajmniej na jednym uznanym modelu zwierzęcym niezaliczanym do gryzoni [Azevedo, 2012]. Ze względu na aspekt etyczny i ograniczoną dostępność zwierząt naczelnych doświadczenia przeprowadzone na tych zwierzętach są stosunkowo rzadkie, natomiast coraz więcej prac z zakresu immunologii prowadzi się na zwierzętach gospodarskich między innymi na owcach [Azevedo, 2012]. Przedstawione poniżej badania własne zostały w całości przeprowadzone na owcy, która jest powszechnie akceptowanym modelem w badaniach nad oddziaływaniami zachodzącymi pomiędzy układem immunologicznym a neuroendokrynnym [Battaglia i wsp., 1997; Williams i wsp., 2001; Daniel i wsp., 2003; Herman i Tomaszewska, 2010; Herman i wsp., 2010 (B)]. Celem prezentowanych badań było poznanie roli interleukiny -1β w mechanizmie hamowania sekrecji GnRH i LH u owcy w czasie ostrego i przedłużonego stanu zapalnego. Badania te miały udzielić odpowiedzi na następujące pytania: W jaki sposób podana do III komory mózgu IL-1β wpływa na sekrecję GnRH/LH u anestralnych owiec? Czy IL-1β wpływa także na sekrecję LH z przysadki w warunkach in vitro oraz czy działanie tej cytokiny może zależeć od statusu immunologicznego zwierzęcia? Czy farmakologiczna aktywacja cholinergicznego mechanizmu przeciwzapalnego w trakcie ostrego stanu zapalnego zmniejsza syntezę IL-1β w podwzgórzu i przez to osłabia hamujący wpływ zapalenia na sekrecję GnRH/LH? Czy ostry i przedłużony stan zapalny w ten sam sposób wpływają na sekrecję hormonów gonadotropowych? 8

Czy zahamowanie aktywności kinazy p38 MAPK może wpływać na syntezę cytokin prozapalnych w podwzgórzu w trakcie przedłużonego stanu zapalnego i czy wpłynie to na hamowanie sekrecji GnRH/LH? Czy zahamowanie syntezy prostaglandyn w OUN przez COX-2 selektywny inhibitor zmniejszy hamujący wpływ przedłużonego stanu zapalnego na sekrecję GnRH/LH? W celu poznania jaką rolę w regulacji sekrecji GnRH/LH u owcy odgrywa centralna IL-1β przeprowadzono doświadczenie pierwsze, w którym owcom w okresie anestralnym wykonano centralne iniekcje IL-1β oraz przeprowadzono kolekcje płynu mózgowordzeniowego z III komory mózgu (publikacja 1). Przeprowadzone badania wykazały, że oddziałująca na poziomie podwzgórza IL-1β hamuje zarówno syntezę GnRH, jak i uwalnianie tego podwzgórzowego neuropeptydu. Zmniejszenie sekrecji GnRH może wynikać bezpośrednio z supresji transkrypcji genu GnRH w POA. Chociaż istotne zmniejszenie liczby matrycy mrna kodującej GnRH w ME, w której ulokowane są jedynie zakończenia neuronów GnRH-ergicznych, sugeruje, że IL-1β może hamować aksonalny transport GnRH mrna z perikarionów do zakończeń nerwowych i/lub stymulować degradację transkryptu, akumulowanego w zakończeniach neuronów. Znaczący wpływ na obniżenie sekrecji GnRH może mieć wykazana w tych badaniach zdolność IL-1β do zmniejszenia liczby matrycy GnRH mrna związanej z rybosomami, co skutkuje zmniejszeniem intensywności translacji gonadoliberyny. Indukowane przez IL-1β zmniejszenie sekrecji GnRH w podwzgórzu wydaje się bezpośrednio wpływać na zmniejszenie poziomu ekspresji genów kodujących LH i FSH oraz GnRHR w przysadce. Wyniki przeprowadzonych badań sugerują, że oddziałująca centralnie IL-1β może być przynajmniej częściowo odpowiedzialna za hamowanie sekrecji GnRH/LH u owcy w czasie stanu zapalnego. Ponieważ, o czym wspomniano wcześniej, receptory IL-1β są obecne na komórkach przysadki, wskazało to na możliwość bezpośredniego wpływu tej cytokiny na sekrecję LH. Dlatego przeprowadzono eksperyment ex vivo na przysadkach pobranych od owiec w fazie pęcherzykowej cyklu rujowego, które stymulowano tą cytokiną (publikacja 2). Należy także podkreślić, że doświadczenie przeprowadzono zarówno na przysadkach pobranych od zwierząt w stanie fizjologicznym jak i w stanie ostrego stanu zapalnego wywołanego podaniem LPS. Opierając się na dostępnych doniesieniach dotyczących wpływu stanu zapalnego na ekspresję receptora GnRHR w przysadce założono, że eksplanty te mogą wykazywać zmniejszoną wrażliwość na stymulację GnRH. Wyniki przeprowadzonych badań 9

dowiodły, że prozapalna IL-1β wpływa na uwalnianie LH nie tylko przez hamowanie sekrecji GnRH w podwzgórzu, ale zmniejsza także sekrecję tej gonadotropiny oddziałując także bezpośrednio na poziomie przysadki mózgowej. Odmienne wyniki uzyskano w badaniach in vitro przeprowadzonych na hodowlach pierwotnych komórek przysadki owiec. Stwierdzono w nich, że zarówno IL-1β jak i IL-1α stymulują uwalnianie LH [Braden i wsp. 1998]. Również w badaniach przeprowadzonych na komórkach przysadki szczura wykazano, że IL-1β w sposób zależny od dawki stymuluje sekrecję LH, ale hamuje uwalnianie FSH [Murata i Ying, 1991]. Te różnice w odpowiedzi przysadki na działanie IL-1β na sekrecję LH w warunkach in vitro mogą wynikać z odmiennego modelu doświadczalnego. Prezentowane doświadczenie przeprowadzono na eksplantach przysadki. W tym modelu komórki w znacznym stopniu zachowują strukturę gruczołu oraz większość międzykomórkowych połączeń, co z kolei umożliwia występowanie różnorodnych międzykomórkowych interakcji, które nie występują w tradycyjnej hodowli pierwotnej. Stąd nie można wykluczyć, że hamujący wpływ IL-1β na sekrecję LH nie musi wynikać z bezpośredniego oddziaływania tej cytokiny na komórki gonadotropowe, ale może być także następstwem oddziaływania tej cytokiny na komórki przysadki sąsiadujące z gonadotropami. Komórki te pod wpływem IL-1β mogą uwalniać czynniki takie jak prolaktyna czy IL-6, które działając parakrynnie zaburzają sekrecję LH z gonadotropów. Chociaż IL-1β istotnie zmniejszała ekspresję genu receptora GnRHR w przysadkach, to w naszym doświadczeniu ex vivo nie wykazano zależności pomiędzy zmniejszoną ekspresją genu GnRHR w przysadkach a uwalnianiem LH z eksplantów. Może to sugerować, że pomimo zmian w transkrypcji genu GnRHR zarówno przysadki pobrane od owiec kontrolnych jak i traktowanych LPS wykazały zbliżoną wrażliwość na stymulację GnRH. Na podstawie przeprowadzonych badań wykazano również, że eksplanty przysadki pobranych od zwierząt w stanie ostrego stresu immunologicznego poddane nawet kilkugodzinnej inkubacji ex vivo charakteryzują się podwyższoną ekspresją genu receptora IL- 1R1. Zwiększona ekspresja receptora IL-1R1 wydaje się tłumaczyć, większą wrażliwość tkanek pobranych od zwierząt traktowanych endotoksyną na działanie IL-1β. Jednocześnie wyniki te wskazują, że status immunologiczny zwierzęcia może w sposób istotny i długotrwały wpływać na reaktywność przysadki, nawet przez wiele godzin po zaniknięciu sygnału zapalnego. Na podstawie wyżej przedstawionych wyników wskazujących na istotne znaczenie prozapalnej IL-1β w hamowaniu sekrecji GnRH/LH zarówno na poziomie przysadki jak i 10

podwzgórza, sformułowano hipotezę zakładającą, że obniżenie syntezy tej cytokiny w trakcie ostrego stanu zapalnego może zmniejszyć to hamowanie. Jednym z endogennych mechanizmów regulujących przebieg odpowiedzi immunologicznej i syntezę cytokin prozapalnych w trakcie zapalenia jest cholinergiczny mechanizm przeciwzapalny. W warunkach fizjologicznych mechanizm ten jest aktywowany w wyniku stymulacji nerwu błędnego, co prowadzi do wzmożonego uwalniania acetylocholiny (ACh). Mechanizm ten może być także aktywowany farmakologicznie przez podanie inhibitora acetylocholinesterazy (AChE), enzymu odpowiedzialnego za degradację ACh. W badaniach in vitro stwierdzono, że ACh oddziałując najprawdopodobniej przez receptor nikotynowy CHRNA7 zmniejsza indukowane podaniem LPS uwalnianie cytokin prozapalnych, m.in. IL-1β, IL-6 i TNF [Borovikowa i wsp., 2000]. Zdolność cholinergicznego mechanizmu przeciwzapalnego do hamowania syntezy prozapalnej IL-1β została także pozytywnie zweryfikowana w badaniach przeprowadzonych na myszach [Pollak i wsp., 2005]. W pierwszym etapie badań, sprawdzono, czy inhibitor AChE rywastygmina zahamuje syntezę IL-1β w podwzgórzu owcy (publikacja 3). W tym celu przeprowadzono doświadczenie na dorosłych owcy w fazie pęcherzykowej cyklu rujowego. Zwierzęta podzielono na trzy grupy doświadczalne. Owcom z grup I i II podano podskórnie sól fizjologiczną, a zwierzętom z grupy III podano w ten sam sposób rywastygmninę. Po 30 min owcom z grup II i III podano dożylnie LPS, a grupie I sól fizjologiczną. Na podstawie otrzymanych wyników stwierdzono, że aktywacja cholinergicznego mechanizmu przeciwzapalnego u owcy przy pomocy rywastygminy hamuje stymulowaną podaniem LPS syntezę IL-1β w strukturach podwzgórza związanych z aktywnością GnRH-ergiczną. To działanie rywastygminy może przynajmniej częściowo wynikać ze zmniejszenia aktywności AChE w podwzgórzu i lokalnej akumulacji ACh, która oddziałując najprawdopodobniej przez receptor nikotynowy CHRNA7 może działać immunosupresyjnie i blokować syntezę centralnej IL-1β. Fakt, że w grupie traktowanej LPS i rywastygminą nie stwierdzono zwiększenia ekspresji genu IL-1R1 może wynikać ze zmniejszania stężenia liganda tego receptora w obszarze podwzgórza. Zahamowanie stymulowanej LPS syntezy prozapalnej IL-1β w podwzgórzu nie musi wynikać jedynie z oddziaływania ACh na poziomie podwzgórza. Aktywacja cholinergicznego mechanizmu przeciwzapalnego po podaniu rywastygminy mogła doprowadzić do zmniejszenia syntezy cytokin prozapalnych przez marofagi obecne we krwi obwodowej [Borovikowa i wsp., 2000]. Wyniki badań przeprowadzonych na myszach sugerują, że aby 11

sygnał zapalny o toczącym się w tkankach obwodowych zapaleniu dotarł do mózgu, niezbędne jest osiągnięcie pewnego minimalnego poziomu stężenia cytokin prozapalnych we krwi. Dopiero po jego osiągnięciu informacja zapalna jest przekazywana do OUN [Pollak i wsp., 2005]. Można zatem przyjąć, że częściowo stwierdzone w przeprowadzonym doświadczeniu obniżenie syntezy IL-β i ekspresji genu jej receptora w podwzgórzu może wynikać z hamującego oddziaływania rywastygminy na syntezę obwodowej IL-1β. W oparciu o wyniki przytoczonych powyżej prac, wskazujących, że IL-1β może odgrywać istotną rolę w supresji sekrecji GnRH w trakcie stanu zapalnego przeprowadzono analogiczne doświadczenie, w którym zbadano wpływ aktywacji cholinergicznego mechanizmu przeciwzapalnego w czasie ostrego stanu zapalnego na sekrecję GnRH/LH u tych owiec w fazie pęcherzykowej cyklu rujowego (publikacja 4). Wykazano, że zablokowanie aktywności AChE zmniejsza hamujący wpływ stanu zapalnego na sekrecję GnRH/LH, co pośrednio sugeruje, że cytokiny prozapalne, a w szczególności IL-1β, mogą być istotnym elementem mechanizmu, poprzez który stan zapalny oddziałuje na proces rozrodu na poziomie podwzgórza i przysadki mózgowej. Przy czym nie można wykluczyć, że istotne znaczenie dla normalizacji sekrecji GnRH/LH u zwierząt, którym podano rywastygminę miało również zmniejszenie odpowiedzi stresowej. U tych zwierząt stwierdzono bowiem istotne obniżenie poziomu markerów stresu tj. kortyzolu i prolaktyny. Należy również podkreślić, że w badaniach tych podanie rywastygminy nie tylko uwolniło sekrecję GnRH od hamującego oddziaływania stresu immunologicznego, ale nawet stymulowało wydzielanie tego hormonu w porównaniu ze zwierzętami kontrolnymi. Może to być związane ze wzrostem stężenia ACh i jej bezpośrednim oddziaływaniem na neurony GnRH w podwzgórzu, gdyż wielokrotnie w badaniach in vitro wykazano stymulujący wpływ ACh na sekrecję GnRH. Przytoczone powyżej wyniki doświadczeń wykazały istotną rolę IL-1β w hamowaniu sekrecji GnRH/LH u owcy w tracie ostrego stanu zapalnego. Wydaje się jednak, że szczególne znaczenie dla zaburzenia procesów rozrodczych może mieć zapalenie o charakterze przewlekłym, aczkolwiek zagadnienie to nie zostało jeszcze zbadane u owcy. Celem określenia, w jaki sposób przedłużony stan zapalny wywołany wielokrotną iniekcją endotoksyny wpłynie na uwalnianie gonadotropin przeprowadzono badania na dojrzałych płciowo owcach w okresie anestralnym (publikacja 5). Przez sześć dni owcom, przez założony do żyły szyjnej zewnętrznej kateter, podawano raz na dobę endotoksynę bakteryjną. Każdego dnia, od zwierząt pobierano dwie próbki krwi: na 1 godz. przed i 3 godz. 12

po podaniu LPS. Wykazano, że organizm owcy poddany kilkudniowemu traktowaniu LPS traci zdolność do względnie szybkiego przywracania prawidłowej sekrecji LH. Stwierdzone zaburzenie sekrecji LH może częściowo wynikać ze stresu wywoływanego przez każdą kolejną iniekcję endotoksyny. Jednak fakt, że najsilniejsze hamowanie uwalniania LH było stwierdzono w ostatnich dniach doświadczenia, kiedy stymulacja uwalniania kortyzolu była znacząco niższa niż w pierwszych dwóch dniach eksperymentu sugeruje, że stres wywołany podaniem endotoksyny nie odgrywa kluczowej roli w hamowaniu uwalniania LH w przypadku przedłużonego podania endotoksyny, a jest ono raczej wynikiem aktywacji układu immunologicznego i działania mediatorów zapalnych. Wykazano również, że przedłużone podanie LPS stymuluje uwalnianie FSH, czego nie stwierdza się po pojedynczej iniekcji LPS [Herman i wsp., 2010 (B)]. Sugeruje to, częściową odmienność mechanizmów, przez które ostry i przewlekły stan zapalny oddziałują na sekrecję gonadotopin u owcy. W nawiązaniu do powyższych wyników, które wykazały, że przewlekłe zapalenie hamuje uwalnianie LH u owcy, postanowiono zbadać, czy zahamowanie syntezy cytokin prozapalnych w obszarze podwzgórza uwolni sekrecję GnRH/LH od wpływu przedłużonego stanu zapalnego. W tym celu podjęto działania mające na celu zablokowanie aktywności kinazy białkowej p38 aktywowanej przez mitogeny (p38 MAPK). W przeprowadzonych doświadczeniach, głównie na modelu in vitro stwierdzono, że kinaza p38 MAPK bierze udział w kontroli syntezy cytokin prozapalnych, zarówno na etapie transkrypcji ich genów jak i na poziomie posttranskrypcyjnym [Young i wsp., 1993; Baldassare i wsp., 1999]. Jednym z najsilniej działających odwracalnych inhibitorów p38 MAPK jest pirydynylo imidazol - SB203580, który nie wpływa na sam proces aktywacji kinazy p38 MAPK, ale blokuje aktywność katalityczną tego enzymu [Kumar i wsp., 1999]. W oparciu o powyższe przesłanki, postanowiono zbadać czy podanie SB203580 zmniejszy syntezę cytokin prozapalnych w podwzgórzu owcy w przedłużonym stanie zapalnym (publikacja 6). Zwierzęta zostały losowo przydzielone do jednej z czterech grup doświadczalnych. Przez sześć dni, przez założony do żyły szyjnej zewnętrznej kateter owcom z grup I i II podawano raz na dobę sól fizjologiczną, a z grup III i IV LPS. Siódmego dnia doświadczenia, na 30 min przed iniekcją LPS/NaCl zwierzętom z grup II i IV podano dożylnie SB203480. Wykazano, że podobnie jak w przypadku pojedynczej iniekcji LPS [Herman i wsp., 2010 (A)], także długotrwałe podawanie LPS stymuluje produkcję cytokin prozapalnych między innymi IL-1β w podwzgórzu. Może to sugerować, że cytokiny te są zaangażowane w wywoływanie zmian towarzyszących 13

przedłużonemu zapaleniu na poziomie OUN. Wykazano także, że farmakologiczne zablokowanie aktywności kinazy p38-mapk przez obwodowe podanie SB203580 redukuje indukowaną podaniem LPS syntezę tych cytokin prozapalnych w podwzgórzu. Wskazuje to na duży potencjał SB203580 w hamowaniu reakcji zapalnej także na poziomie OUN. Podobnie jak w przypadku zastosowania rywastygminy, obniżenie syntezy cytokin prozapalnych po podaniu SB203580 nie musi wynikać bezpośrednio z oddziaływania tego inhibitora na poziomie OUN. Jak dowiedziono, już obniżenie stężenia cytokin prozapalnych na obwodzie poniżej pewnego krytycznego poziomu, może zahamować transmisję sygnału zapalnego do parenchymy mózgu i zahamować syntezę centralnych cytokin zapalnych [Pollak i wsp., 2005]. Ponieważ otrzymane wyniki sugerowały, że zablokowanie aktywności kinazy p38 MAPK może zmniejszyć hamujące oddziaływanie przesłużonego stanu zapalnego na sekrecję GnRH/LH, dlatego w ramach prowadzonych badań nad oddziaływaniem SB203580 na syntezę cytokin prozapalnych w podwzgórzu, zbadano także wpływ podania tego inhibitora na sekrecję GnRH/LH u owiec. Stwierdzono jednak, że pojedyncze podanie SB203580, przynajmniej w czasie trwania doświadczenia, nie zmniejszyło hamującego oddziaływania przewlekłego stanu zapalnego na sekrecję GnRH/LH, co sugeruje, że samo zahamowanie produkcji cytokin prozapalnych w OUN, przynajmniej w krótkim okresie, nie jest wystarczające do zniesienia supresyjnego wpływu przewlekłego stanu zapalnego na proces rozrodu u owcy. Przytoczone powyżej wyniki skłoniły mnie do poszukiwania innych potencjalnych ścieżek, poprzez które przedłużony stan zapalny może hamować sekrecję GnRH/LH u owcy. Chociaż, jak wspomniano powyżej obecność receptorów IL-1β zarówno w podwzgórzu, jak i w przysadce umożliwia tej cytokinie bezpośredni wpływ na sekrecję GnRH/LH, to w proces ten mogą być także zaangażowane inne mediatory, których synteza jest regulowana przez tą cytokinę. Jednymi z takich pośredników wydają się być prostaglandyny. Na udział tych mediatorów w regulacji sekrecji GnRH wskazuje znacząca ekspresja receptorów prostaglandyn na powierzchni neuronów GnRH-ergicznych [Rage i wsp., 1997]. Tezę o istotnej roli prostaglandyn w centralnej regulacji procesów rozrodu wspiera także fakt, że obszarem podwzgórza wykazującym najwyższą ekspresję receptorów prostaglandyn, spośród wszystkich struktur mózgu, jest POA [Matsumura i wsp., 1992]. Ponadto badania przeprowadzone na samcach szczura wykazały, że farmakologiczne zahamowanie syntezy 14

prostaglandyn przez podanie indometacyny znosi hamujący wpływ centralnej IL-1β na sekrecję GnRH/LH [Rivest i Rivier, 1993]. Sugeruje to, że prostaglandyny mogą odgrywać ważną rolę w pośrednim oddziaływaniu tej cytokiny na proces rozrodu na poziomie OUN. Prostaglandyny mogą także oddziaływać na sekrecję gonadotropin bezpośrednio na poziomie przysadki, gdyż w badaniach in vitro stwierdzono, że regulują one ekspresję genu kodującego podjednostkę β LH, a także obniżają ekspresję receptora GnRH w komórkach gonadotropowych [Naor i wsp., 2007]. Celem zbadania znaczenia prostaglandyn w hamowaniu sekrecji GnRH/LH u owcy w przedłużonym stanie zapalnym przeprowadzono kolejne doświadczenie (publikacja 7). Owce w okresie anestralnym przydzielono losowo do czterech grup doświadczalnych. Przez sześć dni, przez założony do żyły szyjnej zewnętrznej kateter podawano raz na dobę owcom z grup I i II sól fizjologiczną, a z grup III i IV LPS. Siódmego dnia doświadczenia, na 30 min przed iniekcją LPS/NaCl owcom z grup II i IV podano dożylnie COX-2 selektywny inhibitor syntezy prostaglandyn - meloksykam. Wykazano, że zahamowanie sekrecji GnRH/LH występujące w trakcie przewlekłego stanu zapalnego u owcy może zostać zniesione przez podanie inhibitora COX-2, ale efekt ten obserwowano tylko u osobników, u których poziom prolaktyny był zbliżony do kontrolnego. To działanie meloksykamu wydaje się wynikać z obniżenia przez ten inhibitor syntezy prostaglandyn w obszarze podwzgórza. Opublikowane do tej pory badania nad rolą prostaglandyn w hamowaniu sekrecji GnRH/LH u owcy w czasie stanu zapalnego nie były jednoznaczne. Harris i wsp. (2000) wykazali, że zablokowanie syntezy prostaglandyn uwalnia sekrecję GnRH/LH od supresyjnego oddziaływania ostrego stresu immunologicznego. Prace innego zespołu podważały natomiast znaczenie prostaglandyn w hamowaniu sekrecji LH u owcy w stanie zapalnym. Breen i wsp. (2004) wykazali, że zablokowanie syntezy prostaglandyn nie uwalnia wyrzutu LH spod hamującego oddziaływania stresu immunologicznego wywołanego pojedynczym podaniem endotoksyny bakteryjnej. Uzyskane przez nas wyniki mogą częściowo tłumaczyć tę sprzeczność. Stwierdzono bowiem, że efektywność inhibitorów prostaglandyn w hamowaniu wpływu stresu immunologicznego na sekrecję GnRH/LH wydaje się zależeć od fazy reakcji zapalnej, w której są one stosowane. Wysoki poziom prolaktyny jest zazwyczaj charakterystyczny dla ostrej reakcji zapalnej [Herman i wsp., 2010 (B); Bondanelli i wsp., 2008], natomiast w czasie przewlekłego zapalenia nie obserwuje się zwiększonego poziomu tego hormonu [Bondanelli i wsp., 2008; Scotland i wsp., 2011]. Otrzymane przez nas wyniki wskazują, że zahamowanie aktywności 15

COX-2 szybko i efektywnie przywraca sekrecję GnRH/LH do poziomu kontrolnego u owiec w stanie przewlekłego, ale nie ostrego stanu zapalnego. PODSUMOWANIE WYNIKÓW BADAŃ STANOWIĄCYCH PODSTAWĘ HABILITACJI Podsumowując, przeprowadzone badania wykazały, że prozapalna IL-1β hamuje proces rozrodu u owcy zaburzając zarówno syntezę jak i uwalnianie GnRH w podwzgórzu, oraz hamuje sekrecję LH bezpośrednio na poziomie przysadki mózgowej. Aktywacja mechanizmów ukierunkowanych na hamowanie syntezy cytokin prozapalnych, w tym IL-1β, może zmniejszać negatywne oddziaływanie stanu zapalnego na sekrecję GnRH/LH, ale efektywność tego działania jest uzależniona od fazy reakcji zapalnej. Hamowanie syntezy centralnej IL-1β znosi hamujący wpływ ostrego stanu zapalnego na aktywność układu podwzgórzowo-przysadkowo-gonadotropowego. Jednak w przypadku zwierząt, u których zapalenie ma charakter przewlekły farmakologiczne blokowanie syntezy cytokin prozapalnych, przynajmniej w krótkim czasie, nie wpływa na obserwowaną supresję sekrecji GnRH/LH, natomiast zahamowanie syntezy prostaglandyn, biorących udział w pośrednim mechanizmie oddziaływania IL-1β na sekrecję GnRH/LH, szybko i skutecznie znosi hamujący wpływ przedłużonego stanu zapalnego na aktywność sekrecyjną układu podwzgórzowoprzysadkowo-gonadotropowego. PIŚMIENNICTWO Acarin L, González B, Castellano B: Neuronal, astroglial and microglial cytokine expression after an excitotoxic lesion in the immature rat brain. Eur J Neurosci. 2000; 12: 3505-3520. Azevedo L: Sepsis - An Ongoing and Significant Challenge, Publisher: InTech. 2012. Baldassare JJ, Bi Y, Bellone CJ: The role of p38 mitogen-activated protein kinase in IL-1 beta transcription. J Immunol. 1999; 162: 5367-5373. Banks WA, Kastin AJ, Broadwell RD: Passage of cytokines across the blood-brain barier. Neuroimmunomodulation. 1995; 2: 241-248. Battaglia DF, Bowen JM, Krasa HB, Thrun LA, Viguié C, Karsch FJ: Endotoxin inhibits the reproductive neuroendocrine axis while stimulating adrenal steroids: A simultaneous view from hypophyseal portal and peripheral blood. Endocrinology. 1997; 138: 4273-4281. Bondanelli M, Zatelli MC, Ambrosio MR, Uberti EC: Systemic illness. Pituitary. 2008; 11: 187-207. Borovikova LV, Ivanova S, Zhang M, Yang H, Botchkina GI, Watkins LR, Wang H, Abumrad N, Eaton JW, Tracey KJ: Vagus nerve stimulation attenuates the systemic inflammatory response to endotoxin. Nature. 2000; 405: 458-462. 16

Braden TD, Fry C, Sartin JL: Effects of interleukins on secretion of luteinizing hormone from ovine pituitary cells. Amer J Vet Res. 1998; 59: 1488-1493. Breen KM, Billings HJ, Debus N, Karsch FJ: Endotoxin inhibits the surge secretion of gonadotropin-releasing hormone via prostaglandin-independent pathway. Endocrinology. 2004; 145: 221-227. Buttini M, Mir A, Appel K, Wiederhold KH, Limonta S, Gebicke-Haerter PJ, Boddeke HW: Lipopolysaccharide induces expression of tumour necrosis factor alpha in rat brain: inhibition by methylprednisolone and by rolipram. Brit J Pharmacol. 1997; 122: 1483-1489. Caldani M, Batailler M, Thiéry JC, Dubois MP: LHRH-immunoreactive structures in the sheep brain. Histochemistry. 1988; 89: 129-139. Daniel JA, Abrams MS, de Souza L, Wagner CG, Whitlock BK, Sartin JL: Endotoxin inhibition of luteinizing hormone in sheep. Domest Anim Endocrinol. 2003; 25: 13-19. Debus N, Breen KM, Barrell GK, Billings HJ, Brown M, Young EA, Karsch FJ: Does cortisol mediate endotoxininduced inhibition of pulsatile luteinizing hormone and gonadotropin-releasing hormone secretion? Endocrinology. 2002; 143: 3748-3758. Dinarello CA: Proinflammatory cytokines. Chest. 2000; 118: 503-508. Gore AC: GnRH, The Master Molecule of Reproduction. Springer, 1 st edition. 2002. Harris TG, Battaglia DF, Brown ME, Brown MB, Carlson NE, Viguié C, Williams CY, Karsch FJ: Prostaglandins mediate the endotoxin-induced suppression of pulsatile gonadotropin-releasing hormone and luteinizing hormone secretion in the ewe. Endocrinology. 2000; 141: 1050-1058. Herman AP, Misztal T, Herman A, Tomaszewska-Zaremba D: Expression of Interleukin (IL)-1β and IL-1 Receptors Genes in the Hypothalamus of Anoestrous Ewes after Lipopolysaccharide Treatment. Reprod Domest Anim. 2010 (A); 45: e426-433. Herman AP, Romanowicz K, Tomaszewska-Zaremba: Effect of LPS on reproductive system at the level of the pituitary of anestrous ewes. Reprod Domest Anim. 2010 (B); 45: e351-359. Herman AP, Tomaszewska-Zaremba D: Effect of endotoxin on the expression of GnRH and GnRHR genes in the hypothalamus and anterior pituitary gland of anestrous ewes. Anim Reprod Sci. 2010; 120: 105-111. Igaz P, Salvi R, Rey JP, Glauser M, Pralong FP, Gaillard RC: Effects of cytokines on gonadotropin-releasing hormone (GnRH) gene expression in primary hypothalamic neurons and in GnRH neurons immortalized conditionally. Endocrinology. 2006; 147: 1037-1043. Kumar S, Jiang MS, Adams JL, Lee JC: Pyridinylimidazole compound SB 203580 inhibits the activity but not the activation of p38 mitogen-activated protein kinase. Biochem Biophys Res Commun. 1999; 263: 825-831. Lampa J, Westman M, Kadetoff D, Agréus AN, Le Maître E, Gillis-Haegerstrand C, Andersson M, Khademi M, Corr M, Christianson CA, Delaney A, Yaksh TL, Kosek E, Svensson CI: Peripheral inflammatory disease associated with centrally activated IL-1 system in humans and mice. Proc Nat Acad Sci USA. 2012; 109: 12728-12733. Matsumura K, Watanabe Y, Imai-Matsumura K, Connolly M, Koyama Y, Onoe H, Watanabe Y: Mapping of prostaglandin E2 binding sites in rat brain using quantitative autoradiography. Brain Res. 1992; 581: 292-298. 17

Mestas J, Hughes CC: Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. J Immunol. 2004; 172: 2731-2738. Murata T, Ying SY: Effects of interleukin-1 on secretion of follicle-stimulating hormone (FSH) and luteinizing hormone (LH) by cultured rat anterior pituitary cells. Life Sci. 1991; 49: 447-453. Naor Z, Jabbour HN, Naidich M, Pawson AJ, Morgan K, Battersby S, Millar MR, Brown P, Millar RP: Reciprocal cross talk between gonadotropin-releasing hormone (GnRH) and prostaglandin receptors regulates GnRH receptor expressionand differential gonadotropin secretion. Mol Endocrinol. 2007; 21: 524-537. Nepomnaschy PA, Sheiner E, Mastorakos G, Arck PC: Stress, Immune Function, and Women's Reproduction. Ann N Y Acad Sci. 2007; 1113: 350-364. Pollak Y, Gilboa A, Ben-Menachem O, Ben-Hur T, Soreq H, Yirmiya R: Acetylcholinesterase inhibitors reduce brain and blood interleukin-1beta production. Ann Neurol. 2005; 57: 741-745. Rage F, Lee BJ, Ma YJ, Ojeda SR: Estradiol enhances prostaglandin E2 receptor gene expression in luteinizing hormone-releasing hormone (LHRH) neurons and facilitates the LHRH response to PGE2 by activating a glia-toneuron signaling pathway. J Neurosci. 1997; 17: 9145-9156. Refojo D, Arias P, Moguilevsky JA, Felder C: Effect of bacterial endotoxin on in vivo pulstile gonadotropin secretion in adult male rats. Neuroendocrinology. 1998; 67: 275-281. Rivest S, Rivier C: Centrally injected interleukin-1b inhibits hypothalamic LHRH secretion and circulating LH levels via prostaglandins in rats. J Neuroendocrinol. 1993; 5: 445-550. Rivier C, Vale W: Cytokines act within the brain to inhibit luteinizing hormone secretion and ovulation in the rat. Endocrinology. 1990; 127: 849-856. Rivest S, Rivier C: The role of corticotropin-releasing factor and interleukin-1 in the regulation of neurons controlling reproductive functions. Endocrine Rev. 1995; 16: 177-199. Scotland PE, Patil M, Belugin S, Henry MA, Goffin V, Hargreaves KM, Akopian AN: Endogenous prolactin generated during peripheral inflammation contributes to thermal hyperalgesia. Eur J Neurosci. 2011; 34: 745-754. Seok J, Warren HS, Cuenca AG, Mindrinos MN, Baker HV, Xu W, Richards DR, McDonald-Smith GP, Gao H, Hennessy L et al.: Genomic responses in mouse models poorly mimic human inflammatory diseases. Proc Natl Acad Sci USA. 2013; 110: 3507-3512. Vitkovic L, Bockaert J, Jacque C: "Inflammatory" cytokines: neuromodulators in normal brain? J Neurochem. 2000; 74: 457-471. Watanobe H, Hayakawa Y: Hypothalamic interleukin-1β and tumor necrosis factor-α, but not interleukin-6, mediate the endotoxin-induced suppression of the reproductive axis in rats. Endocrinology. 2003; 144: 4868-4875. Williams CY, Harris TG, Battaglia DF, Viguié C, Karsch FJ: Endotoxin inhibits pituitary responsiveness to gonadotropin-releasing hormone. Endocrinology. 2001; 142: 1915-1922. Xiao E, Xia-Zhang L, Ferin M: Inhibitory effects of endotoxin on LH secretion in the ovariectomized monkey are prevented by naloxone but not by an interleukin-1 receptor antagonist. Neuroimmunomodulation. 2000; 7: 6-15. 18

Young P, McDonnell P, Dunnington D, Hand A, Laydon J, Lee J: Pyridinyl imidazoles inhibit IL-1 and TNF production at the protein level. Agents Actions. 1993; 39: C67-C69. Zeni P, Doepker E, Topphoff UF, Huewel S, Tenenbaum T, Galla HJ: MMPs contribute to TNF-α-induced alteration of the blood-cerebrospinal fluid barrier in vitro. Amer J Physiol Cell Physiol. 2007; 293: C855- C864. III. Omówienie pozostałych osiągnięć naukowo-badawczych po uzyskaniu stopnia doktora 1. Spis innych (niewchodzących w skład osiągnięcia wymienionego w pkt II) opublikowanych po doktoracie prac naukowych 1.1 Publikacje naukowe w czasopismach znajdujących się w bazie Journal Citation Reports (JRC) [1] Herman AP and Tomaszewska-Zaremba D: Effect of endotoxin on the expression of GnRH and GnRHR genes in the hypothalamus and anterior pituitary gland of anestrous ewes. Animal Reproduction Science. 2010; 120: 105 111. [2] Górski K, Romanowicz K, Herman A a, Molik E, Gajewska A, Tomaszewska-Zaremba D, Misztal T: The possible involvement of salsolinol and hypothalamic prolactin in the central regulatory processes in ewes during lactation. Reproduction in Domestic Animals. 2010; 45 (5): e54 e60. a w tej publikacji podano tylko inicjał mojego pierwszego imienia [3] Herman AP, Misztal T, Herman A, Tomaszewska-Zaremba D: Expression of Interleukin (IL)-1β and IL-1 receptors genes in the hypothalamus of anoestrous ewes after lipopolysaccharide treatment. Reproduction in Domestic Animals. 2010; 45: e426 e433. [4] Herman AP, Romanowicz K, Tomaszewska-Zaremba D: Effect of LPS on reproductive system at the level of the pituitary of anestrous ewes. Reproduction in Domestic Animals. 2010; 45: e351 e359. [5] Hasiec M, Herman AP, Molik E, Dobek E, Romanowicz K, Fülöp F, Misztal T: The stimulatory effect of salsolinol on prolactin gene expression within the anterior pituitary of lactating sheep: In vivo and in vitro study. Small Ruminant Research. 2012; 102: 202 207. 19

[6] Herman A, Herman AP: Caffeine s mechanisms of action and its cosmetic use. Skin Pharmacology and Physiology. 2013; 26: 8 14. [7] Herman A, Herman AP, Domagalska BW, Młynarczyk A: Essential oils and herbal extracts as antimicrobial agents in cosmetic emulsion. Indian Journal of Microbiology. 2013; 53: 232 237. [8] Tomaszewska-Zaremba D, Herman AP, Misztal T: Does central IL-1β affect GnRH secretion in the hypothalamus of anoestrous ewes via different regulatory pathways? Journal of Animal and Feed Sciences. 2013; 22: 5 12. [9] Haziak K, Herman AP, Tomaszewska-Zaremba D: Effect of LPS on the LH release and gene expression of LH-β, GnRH-R and TLR4 in the anterior pituitary of follicular phase ewes in vitro study. Journal of Animal and Feed Sciences. 2013, 22: 97 105. [10] Herman AP, Herman A, Haziak K, Tomaszewska-Zaremba D: Immune stress up regulates TLR4 and Tollip gene expression in the hypothalamus of ewe. Journal of Animal and Feed Sciences. 2013; 22: 13 18. [11] Herman A, Bochenek J, Herman AP: Effect of cinnamon and lavender oils on FtsZ gene expression in the Staphylococcus aureus ATCC 29213. Applied Biochemistry and Microbiology. 2013, 49: 481 484. [12] Antushevich H, Pawlina B, Kapica M, Krawczynska A, Herman AP, Kuwahara A, Kato I, Zabielski R: Influence of fundectomy and intraperitoneal or intragastric administration of apelin on apoptosis, mitosis, and DNA repair enzyme OGG 1,2 expression in adult rats GI tract and pancreas. Journal of Physiology and Pharmacology. 2013, 64: 423 428. [13] Haziak K, Herman AP, Tomaszewska-Zaremba D: Effects of central injection of anti- LPS antibody and blockade of TLR4 on GnRH/LH secretion during immunological stress in anestrous ewes. Mediators of Inflammation. 2014:867170, 10 pages. [14] Krawczyńska A, Olczak E, Rembiszewska A, Herman AP, Gromadzka-Ostrowska J: Time-dependent supplementation of vitamin E influences leptin expression in the aortic layers of rats fed atherogenic diet. Journal of Physiology and Pharmacology. 2014; 65: 33 39. [15] Antushevich H, Krawczynska A, Herman AP, Zabielski R: Effect of apelin on mitosis, apoptosis and DNA repair enzyme OGG 1/2 expression in intestinal cell lines IEC-6 and Caco-2. Folia Histochemica et Cytobiologica. 2014; 52: 51 59. 20

[16] Herman A, Herman AP: Nanoparticles as antimicrobial agents: their toxicity and mechanisms of action. Journal of Nanoscience and Nanotechnology. 2014; 14: 946 957. [17] Gajewska A, Herman AP, Wolińska-Witort E, Kochman K, Zwierzchowski L: In vivo oestrogenic modulation of Egr1 and Pitx1 gene expression in female rat pituitary gland. Journal of Molecular Endocrinology. 2014; 53: 355 366. [18] Skipor J, Szczepkowska A, Kowalewska M, Herman AP, Lisiewski P: Profile of Toll-like receptor mrna expression in the choroid plexus in adult ewes. Acta Veterinaria Hungarica. 2014; 5: 1-10. [19] Herman A, Herman AP: Essential oils and their constituents as skin penetration enhancer for transdermal drug delivery: a review. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 2014; DOI 10.1111/jphp.12334. [20] Herman AP, Herman A, Skipor J, Krawczyńska A, Bochenek J, Tomaszewska-Zaremba D: Caffeine stimulates in vitro pituitary LH secretion in lipopolysaccharide-treated ewes. Reproductive Biology. 2014; DOI:10.1016/j.repbio.2014.12.001 1.2 Monografie, publikacje naukowe w czasopismach międzynarodowych lub krajowych innych niż znajdujące się w bazach lub na liście, o których mowa w pkt II A: [21] Słupecka M, Woliński J, Herman AP, Ochniewicz P, Kornacka MK: Biological role of obestatin in physiology and pathophysiology. Developmental Period Medicine. 2012; 16: 47 52. 2. Krótka charakterystyka opublikowanych prac naukowych niewchodzących w skład osiągnięcia wymienionego w pkt II Od początku pracy naukowej w Instytucie byłem zaangażowany w badania prowadzone w Zakładzie Neuroendokrynologii, z którym współpracuję także obecnie, jako kierownik Laboratorium Biologii Molekularnej. Prowadzone we współpracy z Zakładem Neuroendokrynologii badania dotyczyły wpływu ogólnoustrojowego stanu zapalnego na proces rozrodu owcy na poziomie podwzgórza (publikacja 1) i przysadki mózgowej (publikacja 4). W ramach prowadzonych badań stwierdzono także lokalną syntezę prozapalnej IL-1β w strukturach podwzgórza związanych z aktywnością GnRH-ergiczną w czasie stanu zapalnego wywołanego obwodowym podaniem endotoksyny bakteryjnej (publikacja 3). Prowadzono również prace mające na celu lepsze poznanie dróg, poprzez 21

które centralna IL-1β zaburza sekrecję GnRH (publikacja 8). Wykazano także, że stres immunologiczny stymuluje ekspresję genów kodujących receptor TLR4 jak i białka Tollip, będącego jednym z najważniejszych białek regulujących transdukcję sygnału tego receptora w podwzgórzu (publikacja 10). Skłoniło nas to do rozpoczęcia prac, których celem było wyjaśnienie czy ligand tych receptorów LPS może być również bezpośrednio zaangażowany w modulację sekrecji GnRH na poziomie podwzgórza. Stwierdzono, że blokowanie receptora TLR4 w podwzgórzu zmniejsza hamujący wpływ ostrego stanu zapalnego na ekspresję genów GnRH i LHβ, aczkolwiek zmiany te nie odwracają supresji uwalniania LH u anestralnych owiec (publikacja 13). Uzyskane wyniki sugerują, że częściowo zaburzenie sekrecji GnRH/LH występujące w czasie ostrego stanu zapalnego wywołanego pojedynczą iniekcją LPS może wynikać z bezpośredniego oddziaływania endotoksyny przenikającej z krwi obwodowej w rejon podwzgórza. Warto zaznaczyć, że LPS może także bezpośrednio oddziaływać na sekrecję LH na poziomie przysadki, gdyż w badaniach przeprowadzonych ex vivo wykazano istotny wpływ endotoksyny zarówno na syntezę jak i uwalnianie tego hormonu (publikacja 9). W przeprowadzonych również na modelu ex vivo badaniach stwierdzono, że status immunologiczny zwierzęcia może istotnie wpływać na odpowiedź przysadki na działanie czynników nie immunologicznych, takich jak kofeina. Wykazano, że ta metyloksantyna silniej stymuluje sekrecję LH w eksplantach przysadek pochodzących od zwierząt, u których wywołano przedłużony stan zapalny niż w tkankach pochodzących od zwierząt w stanie fizjologicznym (publikacja 20). Ponadto, w ramach współpracy naukowej z zespołem Zakładu Lokalnych Regulacji Fizjologicznych Instytutu Rozrodu Zwierząt i Badań Żywności PAN w Olsztynie uczestniczę w badaniach, których celem było poznanie roli splotu naczyniówkowego w transmisji sygnałów pomiędzy układem immunologicznym a neuroendokrynnym. W ramach prowadzonych prac wykazano istotną ekspresję receptorów z rodziny TLR w splocie naczyniówkowym owcy, co wskazuje na znaczący potencjał splotu naczyniówkowego w wykrywaniu obecności wielu różnorodnych wzorców związanych z patogenami zarówno pochodzenia bakteryjnego jak i wirusowego (publikacja 18). Ponadto, wraz z zespołem z Zakładu Endokrynologii Instytutu Fizjologii i Żywienia Zwierząt uczestniczyłem w badaniach nad rolą, jaką w procesie laktacji u owcy odgrywa oddziałująca centralnie pochodna dopaminy salsolinol (publikacja 2 i 5). Chociaż, znacząca część moich badań z zakresu neuroendokrynologii jest prowadzona na owcach, biorę także udział w pracach 22