Lublin, RECENZJA

Transkrypt

1 Katedra i Zakład Farmakognozji z Pracownią Roślin Leczniczych UNIWERSYTET MEDYCZNY W LUBLINIE ul. Chodźki 1, LUBLIN tel./fax kskalicka@pharmacognosy.org Lublin, RECENZJA rozprawy na stopień doktora nauk weterynaryjnych mgr. Natalii Kasicy-Jarosz zatytułowanej Badanie funkcji polipeptydu aktywującego przysadkową cyklazę adenylanową (PACAP)- 38 w przebiegu uszkodzenia komórek rzęsatych przez czynniki prozapalne oraz stres oksydacyjny z użyciem danio pręgowanego (Danio rerio) jako organizmu modelowego" wykonanej pod kierunkiem prof. dr hab. Jerzego Kaleczyca (promotor), oraz dra Piotra Podlasza (promotor pomocniczy) w Katedrze Anatomii Zwierząt, Wydział Medycyny Weterynaryjnej, Uniwersytet Warmińsko-Mazurskiego w Olsztynie. W skład recenzowanej pracy doktorskiej wchodzą dwie publikacje z listy A czasopism punktowanych MNiSW o łącznym współczynniku IF równym 5,748. Są to prace: 1) N. Kasica, P. Podlasz, M. Sundvik, A. Tamas, D. Reglodi, J. Kaleczyc, Protective Effects of Pituitary Adenylate Cyclase-Activating Polypeptide (PACAP) Against Oxidative Stress in Zebrafish Hair Cells, Neurotoxicity Research, 2016, 1-15 (Punkty MNISW: 25, impact factor: 2,942) 2) N. Kasica-Jarosz, P. Podlasz, J. Kaleczyc, Pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (PACAP-38) plays an inhibitory role against inflammation induced by chemical damage to zebrafish hair cells, PLOS ONE, 2018, (Punkty MNISW: 35, impact factor: 2,806). Zasadniczym celem recenzowanej rozprawy doktorskiej było wykazanie protekcyjnych właściwości polipeptydu aktywującego przysadkową cyklazę adenylanową (PACAP-38) wobec komórek rzęsatych poddanych szkodliwemu działaniu stresu oksydacyjnego i czynników prozapalnych. Autorka podjęła się próby zbadania czy PACAP-38 posiada właściwości antyapoptotyczne oraz przeciwzapalne. Zdolność słyszenia dźwięków zawdzięczamy komórkom rzęsatym w uchu wewnętrznym. Są one bardzo delikatne i podatne na uszkodzenie pod wpływem wielu czynników, jak uraz, choroba, różne leki oraz czynniki związane ze starzeniem się. Niestety, u ludzi i reszty ssaków 1

2 komórki rzęsate nie odnawiają się, dlatego ich uszkodzenie prowadzi do pogorszenia lub utraty słuchu. Komórki rzęsate są wyspecjalizowanymi mechanoreceptorami znajdującymi się zarówno w narządzie słuchu jak i narządzie równowagi, odpowiedzialnymi za przekształcanie bodźców mechanicznych w impulsy nerwowe. Nie są zdolne do regeneracji, w związku z czym ich uszkodzenie skutkuje trwałym i nieodwracalnym upośledzeniem zmysłu słuchu i/bądź zmysłu równowagi. Przestawione prace poprzedzone są krótkim, 35 stronicowym syntetycznym opisem badań. Autorka przedstawiła cel pracy, krótko opisała koncepcję i plan badań, stosowane materiały i metody wykorzystane w realizowaniu zaplanowanego celu, opisała otrzymane wyniki dyskutując je z dostępną literaturą. Całość poprzedzona jest streszczeniem w języku polskim i angielskim. Uważam, iż dobrym uzupełnieniem byłby jeszcze dołączony wykaz skrótów. Na pięciu stronach Wstępu Autorka charakteryzuje stres oksydacyjny i jego szkodliwe działanie na narząd słuchu. Dalej znajduje się opis komórek rzęsatych, przy którym Doktorantka podkreśla podobieństwo budowy i funkcji pomiędzy ssakami a rybami, gdyż to właśnie model rybi danio pręgowanego wykorzystany został w jej badaniach jako model in vivo. Dalej następuje krótki opis polipeptydu aktywującego przysadkową cyklazę adenylanową (PACAP-38), która to substancja wybrana została jako potencjalnie wykazująca ochronne działanie wobec wolnorodnikowych uszkodzeń ucha wewnętrznego. Dotychczasowe badania in vitro, oraz w mniejszym stopniu in vivo, na różnych typach komórek dowodzą, iż związek ten posiada właściwości antyapoptotyczne oraz przeciwzapalne, mechanizm działania nie jest jednak znany. Wstęp wprowadza czytelnika do celu pracy i metodyki. Cel pracy, jej koncepcja oraz plan badań przedstawione są na kolejnych sześciu stronach. Badania mające na celu wykazanie antyapoptotycznych i przeciwzapalnych właściwości PACAP-38 przeprowadzone zostały na pięciodniowych dniowych larwach danio pręgowanego osobnikach dzikich oraz transgenicznych, o wyznakowanych neutrofilach i komórkach rzęsatych. Autorka opisuje stosowane grupy badawcze oraz warunki prowadzonych eksperymentów. W celu określenia właściwości antyapoptycznych uszkodzenia komórek rzęsatych linii nabocznej wywołane zostały poprzez ekspozycję larw na działanie roztworu H2O2. Następnie wykazano obecność kaspazy-3, markera apoptozy, oraz p-38 MAPK kinazy aktywowanej stresem, w komórkach rzęsatych u osobników z grupy kontrolnej oraz grup eksperymentalnych. Wykonano testy behawioralne, na podstawie których określono parametry ruchu larw jak średnia prędkość, maksymalna prędkość, procent czasu, w którym zwierzęta są aktywne oraz czas spoczynku. Jako, że komórki rzęsate wchodzą w skład linii nabocznej, która jest narządem mającym duży wpływ na zachowanie ryb, sprawdzono tym samym, czy ich ochrona przez PACAP-38 ma przełożenie na zachowanie oraz funkcjonowanie zwierząt. Te badania wykonano na typie dzikim. 2

3 Celem określenia właściwości przeciwzapalnych nekrozę komórek rzęsatych linii nabocznej wywołano poprzez ekspozycję larw na roztwór CuSO4. Określono liczbę neutrofili zlokalizowanych w obrębie komórek rzęsatych, zarówno w grupie kontrolnej oraz grupach badawczych. Oceniono też nekrozę komórek rzęsatych. W tym celu wykorzystano linie transgeniczne. Ponadto techniką Real-Time PCR dokonano analizy ekspresji genów markerów stresu i stanu zapalnego w grupach kontrolnej i badawczych. Jako gen referencyjny użyto gen β-aktyny. W doświadczeniu wykorzystano osobniki typu dzikiego Tuebingen. Ustalono także, które receptory są specyficzne dla neutrofili oraz wykazano ich względny poziom ekspresji. W części Materiał i metody Doktorantka charakteryzuje wykorzystane w badaniach zwierzęta oraz sposób ich hodowli i namnażania. Opisuje też stosowanie techniki jak immunohistochemia, mikroskopia konfokalna, izolacja RNA i odwrotna transkrypcja, Real- Time PCR, sortowanie komórek metodą FACS czy testy behawioralne. Ta część uzupełniona jest także o dwie tabele przedstawiające wykaz przeciwciał stosowanych w badaniach oraz sekwencje starterów użytych w badaniach. Uzyskane wyniki opisane są na dwóch stronach a kolejne dwie zawierają wnioski końcowe. Autorka wykazała iż godzinna ekspozycja larw na 1.5 mm roztwór H2O2 spowodowała prawie 30-krotny wzrost liczby kaspazo-3-pozytywnych komórek rzęsatych w porównaniu do grupy kontrolnej, natomiast inkubacja wraz z PACAP-38 skutkowała 2- krotnym spadkiem kaspazo-3-immunoreaktywnych komórek rzęsatych. Badany związek nie wpłynął z kolei istotnie na poziom kinazy p-38 MAPK. W badaniach behawioralnych zaobserwowano poprawę badanych parametrów do wartości odnotowanych w grupie, gdzie komórki rzęsate linii nabocznej uszkodzone zostały przez roztwór H2O nm PACAP-38 nie wykazał działania ochronnego przed wystąpieniem nekrozy indukowanej CuSO4, o połowę zmniejszyła się jednak liczba neutrofili wokół nekrotycznych komórek rzęsatych. PACAP-38 wykazał wpływ na regulację ekspresji wybranych markerów stanu zapalnego w neutrofilach, przybliżając podwyższony poziom IL-1β, IL-6, IL-8 i ATF3 do wartości kontrolnych. Stwierdzono, że wszystkie geny ulegają ekspresji w neutrofilach. Badania własne Doktorantka zaplanowała dobrze i systematycznie zrealizowała, a uzyskane wyniki omówione są w sposób prawidłowy. Piśmiennictwo jest dobrane odpowiednio i liczy 34 pozycje, w przeważającej części pochodzące z ostatnich lat. Jest to głównie literatura fachowa, anglojęzyczna, publikowana w znanych, liczących się czasopismach. Jej wykorzystanie w pracy, zarówno we wstępie, jak i w dyskusji, świadczy o umiejętności korzystania z zasobów piśmiennictwa naukowego oraz o dobrym tematycznym rozeznaniu. Literatura numerowana jest zgodnie z kolejnością pojawiania się w tekście. Zauważyć muszę, iż brak jest konsekwencji w jej prezentowaniu. Autorka zamiennie podaje całe tytuły czasopism lub ich skróty. Różny jest też sposób podawania stron cytowanych publikacji np. pozycja 8 - strony podano w formacie: Bardzo 3

4 często jednak numery stron podawano według formatu typowego dla niektórych czasopism, gdzie cytuje się tylko ostatnie dwie strony zmieniające się np. pozycja 11 (435 44). Do pracy dołączone są oświadczenia współautorów, z których jednoznacznie wynika, iż udział Doktorantki w powstawaniu prac jest wiodący. Współautorzy podkreślają, iż prace powstały w oparciu o Jej własne hipotezy badawcze, opracowała koncepcje badań, analizowała uzyskane dane i wyciągnęła odpowiednie wnioski. Po przeczytaniu pracy nasuwa mi się kilka spostrzeżeń. - W Streszczeniu autorka pisze: Ponieważ dane zawarte w dostępnej literaturze sugerowały, że PACAP-38 może posiadać odpowiednie właściwości protekcyjne, stąd też niniejsza rozprawa dotyczy stosownych badań które przeprowadzono w odniesieniu do tej substancji. Bardziej poprawnym określeniem moim zdaniem byłoby stwierdzenie, iż rozprawa dotyczy badań funkcji PACAP-38 w przebiegu uszkodzenia komórek rzęsatych przez czynniki prozapalne oraz stres oksydacyjny z użyciem danio pręgowanego (Danio rerio) jako organizmu modelowego jak sformułowano w tytule. - Na stronie 22 Autorka pisze: Ocena behawioru wykazała, że koinkubacja larw z 100 nm PACAP-38 spowodowała istotną statystycznie poprawę wyżej wymienionych parametrów. Wyżej nie wymieniono żadnych parametrów. Wspomniane są one znacznie wcześniej. - Brak jest moim zdaniem podkreślenia nowatorskości pracy. Autorka powinna wyraźnie zaznaczyć jakie badania wykonano po raz pierwszy, jakie wyniki uzyskano po raz pierwszy. Czytelnik ma taka wiedzę po przeczytaniu dołączonych prac, ale byłoby dobrze podkreślić to w dołączonym krótkim opracowaniu. - Brakuje mi szerszych informacji dotyczących znaczenia komórek rzęsatych i dlaczego tak ważne jest poszukiwanie związków wykazujących działanie ochronne. Skoro one są tematem pracy dobrze byłoby scharakteryzować je dokładniej i omówić rolę jaka pełnią. - Dobrze byłoby dołączyć także szersze informacje dotyczącego roli i zastosowania peptydu będącego tematem badań w lecznictwie. Niestety, przy redagowaniu pracy Autor popełnił kilka błędów edytorskich, co oczywiście jest nieuniknione i w żaden sposób nie wpływa na jej wartość, ale z obowiązku recenzenta przytaczam je poniżej: s. 27, pozycja literaturowa 4 dwa razy podano rok opublikowania 2014 s. 27, pozycja literaturowa 7 użyto skrótu stron pp. Unikałabym sloganu - behawior zwierząt strona 25 punk 2 lepiej byłoby napisać zachowania behawioralne 4

5 Pragnę podkreślić, iż wartość merytoryczna niniejszej rozprawy doktorskiej jest wysoka. Pani mgr Natalia Kasica-Jarosz skutecznie opanowała umiejętność planowania, a następnie sukcesywnej realizacji badań naukowych. Wykazała dobre zrozumienie zagadnień teoretycznych z zakresu tematu, znajomość zastosowanych metod badawczych oraz potrafi podsumować i krytycznie omówić wyniki własne w odniesieniu do publikacji innych autorów. Podjęcie przez Doktorantkę niniejszego tematu badawczego uważam za uzasadnione i niezwykle ważne z punktu widzenia metodologicznego i aplikacyjnego, chociaż możliwa aplikacyjność powinna być moim zdaniem szerzej wyjaśniona w tekście opracowania. Podsumowując stwierdzam, że cele pracy zostały zrealizowane, a osiągnięte wyniki stanowią istotny wkład w rozwój dziedziny. O dużej wartości wykonanych badań świadczy opublikowanie wyników w postaci dobrej jakości artykułów w renomowanych czasopismach o wysokim współczynniku oddziaływania, o czym wspomniałam na wstępie recenzji. Wnioski końcowe Przedstawiona mi do oceny rozprawa doktorska spełnia wymogi formalne i merytoryczne stawiane w ustawie o stopniach naukowych i tytule naukowym oraz o stopniach i tytule w zakresie sztuki (z dn. 14 marca 2003 r. z późniejszymi zmianami). Na tej podstawie wnioskuję do Wysokiej Rady Wydziału Medycyny Weterynaryjnej, Uniwersytetu Warmińsko-Mazurskiego w Olsztynie o przyjęcie niniejszej rozprawy i dopuszczenie mgr Natalii Kasicy-Jarosz do dalszych etapów przewodu doktorskiego. Jednocześnie ze względu na zaangażowanie w pracę badawczą Doktorantki oraz wysoką wartość uzyskanych wyników pragnę rekomendować rozprawę doktorską mgr Natalii Kasicy - Jarosz do wyróżnienia. dr hab. n farm. Krystyna Skalicka-Woźniak 5