Inżynieria Genetyczna ćw. 1

Materiały do ćwiczeń z przedmiotu Genetyka z inżynierią genetyczną D - blok Inżynieria Genetyczna ćw. 1 Instytut Genetyki i Biotechnologii, Wydział Biologii, Uniwersytet Warszawski, rok akad. 2015/2016 Prosimy o nierozpowszechnianie materiałów bez naszej zgody

Analiza funkcjonalna białka Pet127p z S. cerevisiae Instytut Genetyki i Biotechnologii UW, 2016 Pet127p to mitochondrialne białko kodowane jądrowo, odpowiedzialne za dojrzewanie transkryptów mitochondrialnych W danych literaturowych figuruje jako potencjalna egzorybonukleaza, degradująca mitochondrialne RNA w kierunku 5' 3' Brak białka Pet127 (delacja genu PET127) zaburza metabolizm RNA w mitochondriach, co objawia się upośledzeniem procesu oddychania tlenowego w komórkach drożdży w temp. 37 C Oddychanie tlenowe możliwość wzrostu na niefermentowalnym źródle węgla (np. glicerolu) Oddychanie beztlenowe fermentacja w cytoplazmie (np. glukozy) Analiza funkcjonalna poprzez ukierunkowaną mutagenezę i kontrolę fenotypów oddychania (testy wzrostowe na podłożach z fermentowalnym lub nie fermentowalnym źródle węgla)

Schemat mutagenezy Pet127p Instytut Genetyki i Biotechnologii UW, 2016 1. PCR z wykorzystaniem oligonukleotydowych starterów, zawierających zmianę nukleotydu w miejscu wprowadzanej mutacji, na matrycy plazmidowego DNA (wektora bifunkcjonalnego, bakteryjno-drożdżowego, ze sklonowanym genem PET127) 2. Usunięcie metylowanej matrycy - trawienie matrycy enzymem restrykcyjnym Dpn1 po reakcji PCR 3. Transformacja bakterii E. coli 4. Izolacja DNA plazmidowego z wielu klonów 5. Analiza sekwencji poszczególnych plazmidów poszukiwanie pozytywnych klonów 6. Transformacja drożdży plazmidami zawierającymi zmutowane sekwencje genu PET127 7. Analiza fenotypów kroplowe testy wzrostowe na podłożach z glukozą lub glicerolem w temp. 30 C lub 37 C 8. Kontrola genotypów: sekwencjonowanie plazmidów użytych do transformacji (kontrola mutagenezy) i test PCR na obecność wektora i kasety delecyjnej w otrzymanych szczepach (kontrola molekularna mutantów)

Ćwiczenie praktyczne 1 Mutageneza: Podmiana kodonów reszt aminokwasowych w potencjalnej domenie egzorybonukleolitycznej Pet127p Matryca do mutagenezy bifunkcjonalny wektor drożdzowobakteryjny ze sklonowanym genem PET127 (pycplac33::pet127-8,6 kb) Wg zmodyfikowanego protokołu Stratagene QuickChange Site-Directed Mutagenesis, z zastosowaniem polimerazy Phusion

Ćwiczenie praktyczne 1 wykonanie 1. Przygotowanie reakcji PCR. Do 45,0 µl mieszaniny reakcyjnej zawierającej 1x bufor, polimerazę Phusion, dntp oraz matrycę DNA (pycplac33::pet127) dodać po 5,0 µl każdego z 2 starterów do mutagenezy (w stężeniu 100 ng/µl). 2. Reakcję prowadzić w termocyklerze wg programu: 98 C, 30 sek (98 C, 30 sek; 55 C, 1 min; 72 C, 2 min 15 sek) x12, 4 C,. 3. Trawienie matrycy. Po skończeniu reakcji PCR dodać 2,0 µl enzymu restrykcyjnego DpnI. Inkubować w 37 C, 15 min. a następnie wstawić mieszaninę reakcyjną na lód. 4. Transformacja bakterii chemokompetentnych E. coli. Do probówki zawierającej 50 µl chemokomeptentnych komórek E. coli szczepu MH2 dodać 5 µl mieszaniny reakcyjnej. Próby inkubować 10 minut na lodzie, a następnie przenieść na dokładnie 90 sek do temp. 42 C. Natychmiast przenieść próby na lód i inkubować przez 2 min. Po inkubacji dodać 900 µl pożywki SOB i wysiać 100 µl mieszaniny na szalkę LB z dodatkiem 50 µg/ml ampicyliny. Wstawić szalki do cieplarki i inkubować przez noc w 37 C.

Ćwiczenie praktyczne 1 cz. 1 - PCR do mutagenezy Przygotowanie reakcji PCR. Do 45,0 µl mieszaniny reakcyjnej zawierającej 1x bufor, polimerazę Phusion, dntp oraz matrycę DNA (pycplac33::pet127) dodać po 5,0 µl każdego z 2 starterów do mutagenezy (w stężeniu 100 ng/µl) Reakcję przeprowadzić w termocyklerze wg prgramu: 98 C, 30 sek (98 C, 30 sek; 55 C, 1 min; 72 C, 2 min 15 sek) x12, 4 C,.

P C R (ang. Polymerase Chain Reaction) Łańcuchowa reakcja polimerazy - podstawowa technika biologii molekularnej, która umożliwia powielenie określonego fragmentu DNA

Kary Mullis wymyślając w połowie lat 80-tych technikę PCR (łańcuchowej reakcji polimerazy), zrewolucjonizował biologię molekularną.

Liczba powstających produktów: Cykl Liczba cząsteczek produktu Instytut Genetyki i Biotechnologii UW, 2016

Zmiany temperatury podczas reakcji PCR Przyłączanie starterów temperatura zależy od ich długości i sekwencji Denaturacja nici DNA rozłączają się pod wpływem temperatury Wydłużanie polimeraza dobudowuje komplementarną sekwencję

Startery to krótkie odcinki DNA komplementarne do powielanej sekwencji Instytut Genetyki i Biotechnologii UW, 2016

Składniki reakcji PCR Matryca Polimeraza DNA - syntetyzuje nić DNA tylko w jednym kierunku (5 3 ) - do rozpoczęcia syntezy potrzebuje startera Startery Mieszanina dezoksyrybonukleotydów (dntp) Bufor

Zalety: Zalety i wady PCR Instytut Genetyki i Biotechnologii UW, 2016 bardzo wysoka czułość specyficzność krótki czas trwania prostota Wady: bardzo wysoka czułość Dlatego konieczne są odpowiednie kontrole czystości reakcji i jej prawidłowego przebiegu. Jakie??

Kontrole reakcji PCR Instytut Genetyki i Biotechnologii UW, 2016 Kontrola pozytywna (+): próba, o której wiemy, że w danych warunkach reakcji da odpowiedni produkt Kontrola negatywna (-): próba, w której przy zachowaniu właściwej czystości pracy nie powstanie żaden produkt, najczęściej bez matrycy

Jaka jest sekwencja starterów? Poniżej przedstawiono sekwencję 700 nukleotydów mitochondrialnego DNA człowieka. Napisz sekwencję starterów o długości 20 nukleotydów, które umożliwią namnożenie DNA, które odpowiada pogrubionej sekwencji. Sekwencję starterów wpisz zgodnie z regułą 5 3. Jaką długość będzie miał produkt reakcji PCR? GATCACAGGT CTATCACCCT ATTAACCACT CACGGGAGCT CTCCATGCAT TTGGTATTTT CGTCTGGGGG GTGTGCACGC GATAGCATTG CGAGACGCTG GAGCCGGAGC ACCCTATGTC GCAGTATCTG TCTTTGATTC CTGCCTCATC CTATTATTTA TCGCACCTAC GTTCAATATT ACAGGCGAAC ATACTTACTA AAGTGTGTTA ATTAATTAAT GCTTGTAGGA CATAATAATA ACAATTGAAT GTCTGCACAG CCGCTTTCCA CACAGACATC ATAACAAAAA ATTTCCACCA AACCCCCCCC CTCCCCCCGC TTCTGGCCAC AGCACTTAAA CACATCTCTG CCAAACCCCA AAAACAAAGA ACCCTAACAC CAGCCTAACC AGATTTCAAA TTTTATCTTT TGGCGGTATG CACTTTTAAC AGTCACCCCC CAACTAACAC ATTATTTTCC CCTCCCACTC CCATACTACT AATCTCATCA ATACAACCCC CGCCCATCCT ACCCAGCACA CACACACCGC TGCTAACCCC ATACCCCGAA CCAACCAAAC CCCAAAGACA CCCCCCACAG TTTATGTAGC TTACCTCCTC AAAGCAATAC ACTGAAAATG TTTAGACGGG CTCACATCAC CCCATAAACA AATAGGTTTG GTCCTAGCCT TTCTATTAGC TCTTAGTAAG ATTACACATG

Długość produktu reakcji PCR: 302 pz GATCACAGGT CTATCACCCT ATTAACCACT CACGGGAGCT CTCCATGCAT TTGGTATTTT CGTCTGGGGG GTGTGCACGC GATAGCATTG CGAGACGCTG GAGCCGGAGC ACCCTATGTC GCAGTATCTG TCTTTGATTC CTGCCTCATC CTATTATTTA TCGCACCTAC GTTCAATATT ACAGGCGAAC ATACTTACTA AAGTGTGTTA ATTAATTAAT GCTTGTAGGA CATAATAATA ACAATTGAAT GTCTGCACAG CCGCTTTCCA CACAGACATC ATAACAAAAA ATTTCCACCA AACCCCCCCC CTCCCCCCGC TTCTGGCCAC AGCACTTAAA CACATCTCTG CCAAACCCCA AAAACAAAGA ACCCTAACAC CAGCCTAACC AGATTTCAAA TTTTATCTTT TGGCGGTATG CACTTTTAAC AGTCACCCCC CAACTAACAC ATTATTTTCC CCTCCCACTC CCATACTACT AATCTCATCA ATACAACCCC CGCCCATCCT ACCCAGCACA CACACACCGC TGCTAACCCC ATACCCCGAA CCAACCAAAC CCCAAAGACA CCCCCCACAG TTTATGTAGC TTACCTCCTC AAAGCAATAC ACTGAAAATG TTTAGACGGG CTCACATCAC CCCATAAACA AATAGGTTTG GTCCTAGCCT TTCTATTAGC TCTTAGTAAG ATTACACATG

Długość produktu reakcji PCR: 302 pz GATCACAGGT CTATCACCCT ATTAACCACT CACGGGAGCT CTCCATGCAT TTGGTATTTT CGTCTGGGGG GTGTGCACGC GATAGCATTG CGAGACGCTG GAGCCGGAGC ACCCTATGTC GCAGTATCTG TCTTTGATTC CTGCCTCATC CTATTATTTA TCGCACCTAC GTTCAATATT ACAGGCGAAC ATACTTACTA AAGTGTGTTA ATTAATTAAT GCTTGTAGGA CATAATAATA ACAATTGAAT GTCTGCACAG CCGCTTTCCA CACAGACATC ATAACAAAAA ATTTCCACCA AACCCCCCCC CTCCCCCCGC TTCTGGCCAC AGCACTTAAA CACATCTCTG CCAAACCCCA AAAACAAAGA ACCCTAACAC CAGCCTAACC AGATTTCAAA TTTTATCTTT TGGCGGTATG CACTTTTAAC AGTCACCCCC CAACTAACAC ATTATTTTCC CCTCCCACTC CCATACTACT AATCTCATCA ATACAACCCC CGCCCATCCT ACCCAGCACA CACACACCGC TGCTAACCCC ATACCCCGAA CCAACCAAAC CCCAAAGACA CCCCCCACAG TTTATGTAGC TTACCTCCTC AAAGCAATAC ACTGAAAATG TTTAGACGGG CTCACATCAC CCCATAAACA AATAGGTTTG GTCCTAGCCT TTCTATTAGC TCTTAGTAAG ATTACACATG Starter lewy: TGATTCCTGCCTCATCCTAT Starter prawy: GTGACTGTTAAAAGTGCATA

Schemat mutagenezy ukierunkowanej wg protokołu Stratagene QuickChange Site-Directed Mutagenesis Gen na plazmidzie zaznaczono miejsca wprowadzania mutacji Usuwanie wyjściowej, metylowanej matrycy enzymem Dpn1 Denaturacja plazmidu i przyłączenie starterów ze zmutowanymi zasadami Transformacja E. coli. W komórkach bakterii następuje naprawa przerw Polimeraza DNA (bez właściwości usuwania nici) syntetyzuje dziurawe, koliste nici DNA LEGENDA DNA wyjściowego plazmidu Startery do mutagenezy DNA zmutowanych plazmidów

Ćwiczenie praktyczne 1 cz. 2 - trawienie Dpn1 metylowanych matryc w produktach reakcji PCR Trawienie matrycy. Po skończeniu reakcji PCR dodać 2,0 µl enzymu restrykcyjnego DpnI. Inkubować w 37 C, 15 min. a następnie wstawić mieszaninę reakcyjną na lód.

Klonowanie fragmentu PCR na bakteryjnym wektorze plazmidowym 1. Reakcja PCR na matrycy całkowitego DNA drożdżowego 2. Trawienie produktu PCR i wektora (puc19) EcoRI i BamHI 3. Ligacja 4. Transformacja bakterii chemokompetentnych 5. Selekcja pojedynczego klonu (α-komplementacja)

ENZYMY RESTRYKCYJNE 1. W bakteriach pełnią funkcje obrony przed wirusami 2. Enzymy restrykcyjne klasy II tną dwuniciowe DNA w obrębie lub pobliżu określonej sekwencji 3. Rozpoznawane sekwencje są palindromowe, zwykle 4 lub 6 nukleotydowe Po cięciu enzymem restrykcyjnym powstaja fragmenty DNA z "lepkimi" lub "tępymi końcami.

LIGAZA "SKLEJA" DNA Ligazy łączą dwa fragmenty DNA Ligaza tworzy wiązania fosfodiestrowe między grupą 3' OH deoksyrybozy, a grupą fosforanową

LIGACJA WEKTORA ZE WSTAWKĄ Po ligacji plazmidu ze wstawką powstają 3 rodzaje cząsteczek!!!

WEKTORY- PODSTAWOWE NARZĘDZIE W TECHNICE KLONOWANIA 1. Najczęściej stosowanymi wektorami są plazmidy 2. Plazmidowe wektory bakteryjne powstały na bazie plazmidów naturalnie występujących w komórkach bakterii. 3. Dostępne wektory plazmidowe zawierają pewne podstawowe elementy: ORI- miejsce inicjacji replikacji. Specyficzne dla gatunku bakterii, od specyfiki tego miejsca zależy liczba kopii plazmidu w komórce, plazmid może zawierać kilka ori specyficznych dla różnych organizmów. POLILINKER- sztucznie wytworzony odcinek DNA zawierający sekwencje rozpoznawane przez wiele enzymów restrykcyjnych. MARKER I- pozwala odróżnić bakterie posiadające plazmid, od tych które go nie pobrały MARKER II- pozwala odróżnić bakterie które pobrały plazmid ze wstawką, od tych które pobrały "pusty" plazmid

Komórki biorcy do transformacji są odpowiednio przygotowane genetycznie W celu zwiększenia wydajności replikacji obcego DNA, szczepy bakterii wykorzystywanych do klonowań posiadają uszkodzone systemy: restrykcji i modyfikacji rekombinacji homologicznej ( reca - )

Transformacja bakterii chemokompetentnych Instytut Genetyki i Biotechnologii UW, 2016

Klonowanie fragmentu PCR na bakteryjnym wektorze plazmidowym 1. Reakcja PCR na matrycy całkowitego DNA drożdżowego 2. Trawienie produktu PCR i wektora (puc19) EcoRI i BamHI 3. Ligacja 4. Transformacja bakterii (chemokompetentne) 5. Selekcja pojedynczego klonu (α-komplementacja)

DZIĘKI OBECNOŚCI DRUGIEGO MARKERA WYKRYWAMY BAKTERIE NIOSĄCE ZREKOMBINOWANY PLAZMID W przypadku pbr322, bakterie niosące zrekombinowany wektor nie będą rosły na podłożu z tetracykliną W przypadku puc19 do odróżnienia bakterii ze zrekombinowanym wektorem wykorzystujemy aktywność β-galaktozydazy ( biało-niebieskie ) Plazmidy E. coli

SELEKCJA REKOMBINANTÓW Instytut Genetyki i Biotechnologii UW, 2016

Ćwiczenie praktyczne 1 cz. 3 transformacja E. coli Transformacja bakterii chemokompetentnych E. coli. Do probówki zawierającej 50 µl chemokomeptentnych komórek E. coli szczepu MH2 dodać 5 µl mieszaniny reakcyjnej. Próby inkubować 10 minut na lodzie, a następnie przenieść na dokładnie 90 sek do temp. 42 C. Natychmiast przenieść próby na lód i inkubować przez 2 min. Po inkubacji dodać 900 µl pożywki SOB i wysiać 100 µl mieszaniy na szalkę LB z dodatkiem 50 µg/ml ampicyliny. Wstawić szalki do cieplarki i inkubować przez noc w 37 C.

ZADANIE DOMOWE Wektory inne niż plazmidowe: pochodne faga λ kosmidy sztuczne chromosomy bakteryjne (BAC) sztuczne chromosomy drożdżowe (YAC)

(-) (+) ELEKTROFOREZA DNA Instytut Genetyki i Biotechnologii UW, 2016 Agaroza rozpuszczona w buforze tworzy żel. Żel zanurzony w buforze przewodzącym prąd poddajemy działaniu pola elektrycznego. DNA ma ładunek ujemny (-) i migruje w kierunku elektrody dodatniej (+) z szybkością zależną od wielkości i kształtu. Małe liniowe fragmenty poruszają się szybciej niż większe, których ruch jest silniej hamowany przez sito molekularne żelu. Szybkość migracji fragmentów DNA jest odwrotnie proporcjonalna do ich masy cząsteczkowej.

DETEKCJA DNA W ŻELU Proces migracji DNA obserwujemy dzięki dodaniu do próbki odpowiedniego barwnika (np. Oranż G) EtBr DNA obserwujemy w świetle UV, dzięki obecności w żelu bromku etydyny, interkalującego pomiędzy pierścienie aromatyczne w kwasie nukleinowym Bromek etydyny winterkalowany w helisę DNA "świeci" w UV znacznie mocniej niż niewbudowany bromek w tle Bromek etydyny zaburza strukturę DNA, jest silnym mutagenem!!

Analiza restrykcyjna DNA - podstawowa technika biologii molekularnej, która umożliwia analizę sekwencji DNA Enzym restrykcyjny należący do tzw. klasy II to nukleaza rozpoznająca i przecinająca DNA w obrębie ściśle zdefiniowanej sekwencji. Mapa restrykcyjna danego fragmentu DNA to wzajemne ułożenie miejsc (sekwencji), które są rozpoznawane i przecinane przez określony zbiór enzymów restrykcyjnych.

EcoRI jako homodimer

Izoschizomery enzymy restrykcyjne izolowane z różnych bakterii rozpoznające tę samą sekwencję w DNA i wprowadzające identyczny typ cięcia. HaeIII, BsuRI, BshFI, PhoI, BsnI GG CC CC GG Neoschizomery - enzymy restrykcyjne izolowane z różnych bakterii rozpoznające identyczną sekwencję w DNA, ale wprowadzające odmienny typ cięcia. SmaI CCC GGG GGG CCC Acc65I G GTACC CCATG G XmaI C CCGGG GGGCC C KpnI GGTAC C C CATGG

Analiza restrykcyjna Instytut Genetyki i Biotechnologii UW, 2016

Mapa restrykcyjna Instytut Genetyki i Biotechnologii UW, 2016

Zadanie domowe - mapa restrykcyjna Nco I (611) Eco RI (953) Nco I (611) Nco I (1956) Pst I (2312) Nco I (2691) Pst I (3956) Pst I (395 6) 5434 pz pz Eco RI (953) 5434 pz Nco I (195 6) Pst I (2312) Nco I (2691) Jakiej długości powstaną fragmenty DNA po przecięciu powyższych cząsteczek DNA za pomocą enzymu/ów: Enzym Cząsteczka liniowa Cząsteczka kolista EcoRI PstI NcoI EcoRI/PstI

Transformacja drożdży Saccharomyces cerevisiae metodą LiOAc/PEG Transformacja drożdży (szczepy z delecją genu PET127) wyizolowanymi z bakterii plazmidami niosącymi wprowadzoną na ćwiczeniach mutację genu PET127 (pet127-l392a lub pet127-k393a). Roztwór transformacyjny (PEG Mix): ODCZYNNIK OBJĘTOŚĆ (stężenie końcowe) PEG 3350 50% [w/v] 42 μl (~40%) LiOAc 1M 6 μl (~0.1 M) Jednoniciowe nośnikowe DNA ze spermy łososia (carrier ssdna) 10 mg/ml Końcowa objętość 2 μl 50 μl Komórki kompetente zostały przygotowane wcześniej, rozporcjowane i zamrożone w -80 C. Zawieszone są w roztworze zawierającym 1xTE, 0,1 M LiOAc oraz 25% glicerol.

Transformacja drożdży Saccharomyces cerevisiae metodą LiOAc/PEG Transformacja drożdży (szczepy z delecją genu PET127) wyizolowanymi z bakterii plazmidami niosącymi wprowadzoną na ćwiczeniach mutację genu PET127. Wykonanie: 1. Z otrzymanych komórek kompetentnych (200 μl) odpipetować po 50 μl na pojedynczą transformację, krótko zwirować na niewielkich obrotach (2500 rpm przez 30 s. lub short). Supernatant usunąć pipetą nienaruszając pelletu. 2. Do probówki z drożdżami dodać 50 μl roztworu transformacyjnego, a następnie 1 μl DNA plazmidowego (w próbie kontrolnej zamiast DNA należy dodać 1 μl sterylnej wody). Całość zawiesić poprzez pipetowanie. 3. Inkubować w 42 C przez 30 min (w termobloku lub łaźni wodnej). 4. Po inkubacji zebrać komórki przez krótkie i delikatne wirowanie (2500 rpm przez 30 s. lub short), supernatant usunąć, a pellet zawiesić w 100 μl sterylnej wody lub soli fizjologicznej. 5. Całość wysiać na odpowiednią szalkę selekcyjną i inkubować przez 2-3 dni w temperaturze 30 C.

KLONOWANIE DNA 1. trawienie restryktazą wyizolowanego DNA, trawienie wektora. 2. ligacja wektora ze wstawką 3. transformacja bakterii - chemokompetentne - elektrokompetentne 4. selekcja (dzięki obecności na wektorze genów markerowych) 5. Wyszukanie pojedynczego klonu zawierającego zrekombinowany plazmid z interesującym nas fragmentem DNA jeżeli uzyskamy dostateczna liczbę klonów, na tyle dużą, żeby zawarte w nich wstawki reprezentowały cały genom, klony te stanowią BANK GENOMOWEGO DNA

WEKTORY BIFUNKCJONALNE: DWÓCH GOSPODARZY, np.: E. coli S. cerevisiae Drugi marker bakteryjny, np. LacZ Polilinker (MCS) Marker bakteryjny, np. Amp R Marker drożdżowy, zwykle pokarmowy (np. leu2, trp1, his3, ura3) Bakteryjny ori replikacji Drożdżowy ori replikacji, np. 2μ Transformacja bakterii Transformacja drożdży (np. mutantów leu -, trp -, his -, ura - ) Podłoże z antybiotykiem Selekcja transformantów Podłoże selekcyjne, (np. bez leu itp.)

BANK GENÓW DROŻDŻY NA WEKTORZE BIFUNKCJONALNYM YEplac181

RÓŻNE ENZYMY MOGĄ ZOSTAWIAĆ TAKIE SAME KOŃCE: GGATCC CCTAGG NGATCN NCTAGN BamHI Sau3A G GATCC CCTAG G N GATCN NCTAG N

KLONOWANIE DNA 1. trawienie restryktazą wyizolowanego DNA, trawienie wektora. 2. ligacja wektora ze wstawką 3. transformacja bakterii - chemokompetentne - elektrokompetentne 4. selekcja (dzięki obecności na wektorze genów markerowych) 5. Wyszukanie pojedynczego klonu zawierającego zrekombinowany plazmid z interesującym nas fragmentem DNA jeżeli uzyskamy dostateczna liczbę klonów, na tyle dużą, żeby zawarte w nich wstawki reprezentowały cały genom, klony te stanowią BANK GENOMOWEGO DNA

DZIĘKI OBECNOŚCI DRUGIEGO MARKERA WYKRYWAMY BAKTERIE NIOSĄCE ZREKOMBINOWANY PLAZMID W przypadku wektorów pochodnych puc19 (np. YEPLAC) do odróżnienia bakterii ze zrekombinowanym wektorem wykorzystujemy zjawisko α-komplementacji

α- komplementacja Instytut Genetyki i Biotechnologii UW, 2016

Reprezentatywność banku Dane konieczne do oszacowania reprezentatywności banku genomowego: Wielkośc genomu Liczba uzyskanych klonów % transformantów ze zrekombinowanym wektorem Średnia wielkość wstawki Instytut Genetyki i Biotechnologii UW, 2016 Dobry bank genów w E. coli na wektorze plazmidowym zwykle zawiera ponad 50% zrekombinowanych plazmidów, ze średnią wielkością wstawki ok. 10 kb i pokrywa kilkakrotnie genom N = ln(1-p)/ln(1-f) N- liczba klonów. P- prawdopodobieństwo znalezienia fragmentu. f frakcja genomu niesiona przez rekombinanta.

Bank genomowy Instytut Genetyki i Biotechnologii UW, 2016

Bank cdna pre-mrna

Drożdżowy system dwuhybrydowy: badanie interakcji pomiędzy białkami in vivo www.invitrogen.co.jp/gateway/pq10001_01.shtml

System dwuhybrydowy: domenowa budowa czynników transkrypcyjnych

System dwuhybrydowy: konstrukcja białek fuzyjnych

System dwuhybrydowy: transformacja drożdży

System dwuhybrydowy: ekspresja genu reporterowego Instytut Genetyki i Biotechnologii UW, 2016 www.invitrogen.co.jp/gateway/pq10001_01.shtml

Geny reporterowe Instytut Genetyki i Biotechnologii UW, 2016 Badanie regionów promotora odpowiedzialnych za regulację ekspresji genu Badanie zmian ekspresji w wyniku działania czynników zewnętrznych Identyfikacja oddziaływań pomiędzy białkami Określenie lokalizacji badanego białka

Przykładowe geny reporterowe β-galaktozydaza β-glukuronidaza (GUS) acetylotransferaza chloramfenikolu (CAT) fosfataza alkaliczna lucyferazy białko fluoryzujące na zielono (GFP)

Identyfikacja regionów promotora odpowiedzialnych za regulację transkrypcji aktywatory transkrypcji Ekspresja genu reporterowego gen reporterowy 100% promotor gen reporterowy 30% gen reporterowy 70% gen reporterowy 0%

Lokalizacja białka Instytut Genetyki i Biotechnologii UW, 2016 promotor Promotor białko X białko X Bia³ko X ORI GFP GFP amp R amp R analiza mikroskopowa białko X-GFP mitochondria nałożenie obrazu

Drożdżowy system dwuhybrydowy: badanie interakcji pomiędzy białkami in vivo www.invitrogen.co.jp/gateway/pq10001_01.shtml

Kontrola szczepów w mutagenezie PET127 - reakcja PCR Instytut Genetyki i Biotechnologii UW, 2016

Wektor bifunkcjonalny, bakteryjno-drożdżowy ze sklonowanym genem PET127 Wstawka PET127 ~3,1 kb, wklonowana z użyciem BamHI i SacI

Kontrola szczepów w mutagenezie PET127 schemat PCR

Kontrola szczepów w mutagenezie PET127 nastawienie reakcji PCR MultiMix do PCR: Składniki: Bufor do polimerazy 10x (Metabion) 1-sza para starterów (Pet up i Pet down) 10 pm 2-ga para starterów ( Pet Li Pet R) 10 pm dntps (NEB) 10mM Polimeraza Taq (Metabion) 5 U/μL Woda Ilość: 2 μl 0,5 μl (0,25 μl +0,25 μl) 0,5 μl (0,25 μl +0,25 μl) 0,5 μl 0,1 μl 14,4 μl Razem na jedną próbkę: - MultiMix - 18 μl; - matryca (DNA genomowy) - 2 μl; - końcowa objętość próbki - 20 μl. Program Multiplex PCR PET127: 1. Denaturacja wstępna: 98 o C 3:00 min. 2. Denaturacja: 98 o C 0:30 min. 3. Przyłączanie starterów: 55 o C 0:30 min. 4. Elongacja: 72 o C 2:00 min. 5. Elongacja końcowa: 72 o C - 5:00 min. 6. Schładzanie: 10 o C 5 min. Liczba cykli: 30; czas trwania 2 godz. 30 min.

Zadanie domowe - mapa restrykcyjna Nco I (611) Eco RI (953) Nco I (611) Nco I (1956) Pst I (2312) Nco I (2691) Pst I (3956) Pst I (395 6) 5434 pz pz Eco RI (953) 5434 pz Nco I (2691) Nco I (195 6) Pst I (2312) Jakiej długości powstaną fragmenty DNA po przecięciu powyższych cząsteczek DNA za pomocą enzymu/ów: Enzym Cząsteczka liniowa Cząsteczka kolista EcoRI 4482, 952 5434 PstI NcoI EcoRI/PstI 2311, 1644, 1479 3790, 1644 2744, 1345, 735, 610 3354, 1345, 735 1644, 1479, 1359, 952 2431, 1644, 1359

Dysrupcja genów w drożdżach U drożdży występuje bardzo wydajna rekombinacja homologiczna. Zjawisko to polega na wymianie fragmentów nici DNA o podobnej sekwencji. Mechanizm ten stanowi podstawę crossing-over. Rekombinacja homologiczna jest stosowana jako narzędzie przy tworzeniu dysrupcji i delecji genów u drożdży (tworzenie nowych szczepów).

Dysrupcja genu w szczepie haploidalnym

Technika Southern-blot: rozdział i detekcja DNA DNA Hybrydyzacja ze specyficzną, wyznakowaną sondą. DNA

Transfer kapilarny Transfer w polu elektrycznym

Znakowanie sondy (komplementarny kwas nukleinowy)

Kontrola dysrupcji przez hybrydyzację Southerna

Dysrupcja genu w szczepie diploidalnym

Dysrupcje w roślinach Agrobacterium tumefaciens Stanton B. Gelvin, Nature: 433, 583-84

Cel i kaseta dysrupcyjna Instytut Genetyki i Biotechnologii UW, 2016 EcoRI/SalI 3kb; 2kb; 1kb EcoRI 4kb SalI 5kb

Potwierdzamy dysrupcję przez hybrydyzację Southerna Instytut Genetyki i Biotechnologii UW, 2016 1. Jaką sondę zastosować? 2. Jakiej kontroli negatywnej użyć? 3. Jakim enzymem strawić genomowy DNA? 4. Który mutant ma wstawkę tylko w obrębie genu AtXRN2?

Wynik Southerna Instytut Genetyki i Biotechnologii UW, 2016 Autoradiogram hybrydyzacji z sondą do genu oporności na kanamycynę

Hybrydyzacja kolonijna Instytut Genetyki i Biotechnologii UW, 2016

Technika northern-blot: rozdział i detekcja RNA RNA Hybrydyzacja ze specyficzną, wyznakowaną sondą. RNA

Elektroforeza białek: SDS-PAGE SDS nadaje białkom jednolity ładunek ujemny białka migrują w żelu poliakrylamidowym z prędkością zależną od wielkości

Coomassie Brilliant Blue Instytut Genetyki i Biotechnologii UW, 2016

Technika western-blot

SDS-PAGE Western blot

Southern, northern i western Instytut Genetyki i Biotechnologii UW, 2016

Testy kroplowe mutantów w PET127 kontrola fenotypów oddechowych sprawdzenie zdolności transformantów drożdżowych do oddychania tlenowego 30 ⁰ C 37 ⁰ C Δpet127 PET127 (WT) PET127 (D A) PET127 (E A) PET127 (K A) PET127 (L A) GLUKOZA Glicerol niefermentowalne źródło węgla, na którym wydajnie rosną tylko drożdże posiadające zdolność do oddychania tlenowego. GLICEROL Δ +wt Δ +wt

Testy kroplowe mutantów w PET127 kontrola fenotypów oddechowych wykonanie 1. Przygotowanie odpowiednich rozcieńczeń drożdży do testu wzrostowego. 30 µl 30 µl 30 µl 30 µl Hodowla nocna (OD 600 =1,0) 10-1 10-2 10-3 10-4 Seryjne rozcieńczenia 2. Oznaczenie szalek w zależności od temperatury inkubacji (30 i 37 C) i źródła węgla (glukoza i glicerol) = 4 szalki na parę. 3. Nakropić na szalki po 6 µl rozcieńczeń od 10-1 do 10-4 zgodnie ze wzorem. 4. Szalki inkubować w cieplarce w odpowiedniej temperaturze przez 3 dni. 270 µl sterylnej wody (lub soli fizjologicznej) + 30 µl poprzedniego rozcieńczenia Δ +wt 10-1 10-2 10-3 10-4 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Dwa wybrane mutanty białka pet127 (z czterech badanych na ćwiczeniach)

Kontrola szczepów w mutagenezie PET127 rozdział produktów PCR w żelu agarozowym Przygotowanie i nakładanie prób: Do reakcji PCR (20µl) dodać 4µl 6x stężonego buforu obciążającego z barwnikiem Orange G. Do 1-szej kieszonki nałożyć 4µl wzorca masy cząsteczkowej (gotowy, z buforem do nakładania). Na żel nałożyć 12µl mieszaniny. Elektroforezę prowadzić w 1% żelu agarozowym + EtBr, 1x buforze TEA, 70-90V do 1h.

Sekwencjonowanie DNA Instytut Genetyki i Biotechnologii UW, 2016

Sekwencjonowanie DNA: metoda Sangera Instytut Genetyki i Biotechnologii UW, 2016 Dideoksynukleotydy (analogi nukleotydów bez grupy OH w pozycji 3 ) powodują przedwczesną terminację syntezy DNA

Sekwencjonowanie DNA: metoda Sangera Instytut Genetyki i Biotechnologii UW, 2016

Współczesna modyfikacja metody Sangera

Komputerowa analiza sekwencji Wyszukiwanie sekwencji w bazie danych: program BLAST (odczyt sekwencjonowania z wydruku z ćwiczeniem + plik z sekwencją z ćwiczenia komputerowego) Pokaz chromatogramów in silico (w katalogu cw4-2015 kilka przykładowych wyników sekwencjonowań klonów otrzymanych po mutagenezie PET127 do obejrzenia w programie Finch TV) Porównywanie dwóch sekwencji (bl2seq) (plik do blast2seq w katalogu cw4-2015 zawiera przykładowe 2 sekwencje do porównania)

Sekwencjonowanie nowej generacji, wysokoprzepustowe (NGS Next Generation Sequencing) Pirosekwencjonowanie, przez syntezę z kaskadą 4 reakcji enzymatycznych (454; Roche) historycznie pierwsza metoda NGS obecnie platforma zombie Sekwencjonowanie mostkowe, przez syntezę z odwracalną terminacją (Ilumina) obecnie najczęściej stosowana i najbardziej wydajna technologia (do 2 Terra par zasad / 8 dni pracy urządzenia) Sekwencjonowanie typu Ion Torrent, przez syntezę z detekcją protonów na układzie scalonym (Life Tech.) Sekwencjonowanie przez ligację fluorescencyjnie znakowanych krótkich oligonukleotydów (SOLID; Life Tech.) obecnie platforma zombie I wiele innych

Sekwencjonowanie nowej generacji, wysokoprzepustowe podstawowe różnice względem metody Sangera W metodzie Sangera sekwencjonujemy jednocześnie tylko 16-96 różnych matryc, przy czym każda matryca jest mieszanina wielu cząsteczek, które nie powinny ale mogą się różnić! Problem: przy sekwencjonowaniu produktu PCR pochodzącego od homozygoty mamy czysty odczyt. Gdy pochodzi on od heterozygoty w pozycji gdzie występuje różnica między allelami, polegająca na zamianie zasad, odczyt jest wątpliwy a w przypadku delecji lub insercji wręcz nie możliwy dla całej dalszej części cząsteczki. Rozwiązanie: klonowanie produktów PCR i dopiero ich sekwencjonowanie. Metody NGS opierają się o równoległe, masowe sekwencjonowanie od kilku tysięcy do kilkuset milionów różnych matryc tzw. bibliotek. Najpierw sekwencjonowany materiał jest losowo fragmentowany, ligowany z uniwersalnymi adaptorami i odpowiednio rozcieńczany. Każda z finalnych matryc powstaje po amplifikacji klonalnej od pojedynczej cząsteczki poprzez PCR na matrycy 1 cząsteczki a nie mieszaninie różnych wiec jest zawsze homogenna! Każdy wariant allelu ma swoją homogenną reprezentacje!

Sekewncjonowanie w technologii Illumina: mostkowe, przez syntezę z odwracalną terminacją (za Illumina) Instytut Genetyki i Biotechnologii UW, 2016

Metoda Sangera Sekwencjonowanie nowej generacji: wady i zalety względem metody Sangera Proste i szybkie przygotowanie 1 próby. Niski koszt jednokrotnego uruchomienia urządzenia. Długość pojedynczego odczytu do ok. 500-1000 pz. Wysoki koszt odczytu na 1 zasadę. Niska przepustowość, nie możliwe są doświadczenia ilościowe. Metody NGS Instytut Genetyki i Biotechnologii UW, 2016 Trudne, kosztowne i pracochłonne przygotowanie bibliotek, w zasadzie nie opłacalne dla pojedynczych prób. Pojedyncze odczyty bardzo krótkie, w przedziale 100-500 pz. Skomplikowana analiza bioinformatyczna. Więcej błędów sekwencjonowania. Bardzo duża ilość odczytów: do 2 Terra par zasad (dla 4 mld. różnych odczytów), co umożliwia dla 1 urządzenia (Illumina HiSeq 2500) odczyt 10 ludzkich genomów z ok. 100x pokryciem (powtórzeniem) dla jednego kierunku każdej z 2 nici DNA! Duża ilość odczytów pozwala na prowadzenie doświadczeń ilościowych np. transkryptomicznych typu RNA-seq. Wielokrotnie niższy koszt odczytu na 1 zasadę.

Wydajności oraz koszt użycia różnych platform NGS (2014) Instrument Amplification Run time Millions of Reads/run Bases / read Reagent Cost/run Reagent Cost/Gb Reagent Cost/Mread bp/run Gbp/run cost/gb Applied Biosystems 3730 (capillary) sensors Libraries PCR Chips Seq reagents Sum PCR, cloning 2 hrs. 0.000096 650 $144 $2,307,692.31 $1,500,000.00 62,400 0.00006 $2,307,692.3 1 Illumina MiSeq v3 bridgepcr 20 hrs. 22 150 $824 $249.70 $37.45 3,300,000,000 3.300 $249.70 Illumina MiSeq v3 Illumina NextSeq 500 bridgepcr 55 hrs. 22 600 $1,442 $109.24 $65.55 13,200,000,000 13.200 $109.24 BridgePCR 30 hrs. 400 300 $4,000 $33.33 $10.00 120,000,000,000 120.000 $33.33 Illumina HiSeq 2500 - high output v4 Illumina HiSeq X (2 flow cells) BridgePCR 6 days 2000 250 $14,950 $29.90 $7.48 500,000,000,000 500.000 $29.90 BridgePCR 3 days 6000 300 $12,750 $7.08 $2.13 1,800,000,000,000 1,800.000 $7.08 Ion Torrent PGM 314 chip empcr 2.3 hrs. 0.475 200 $349 $3,673.68 $734.74 95,000,000 0.095 $3,673.68 Ion Torrent PGM 314 chip empcr 3.7 hrs. 0.475 400 $474 $2,494.74 $997.89 190,000,000 0.190 $2,494.74 Ion Torrent PGM 318 chip empcr 4.4 hrs. 4.75 200 $749 $788.42 $157.68 950,000,000 0.950 $788.42 Ion Torrent PGM 318 chip Ion Torrent - Proton I empcr 7.3 hrs. 4.75 400 $874 $460.00 $184.00 1,900,000,000 1.900 $460.00 empcr 4 hrs. 70 175 $1,000 $81.63 $14.29 12,250,000,000 12.250 $81.63 Life Technologies SOLiD 5500xl empcr 8 days 1410 110 $10,503 $67.72 $7.45 155,100,000,000 155.100 $67.72 Pacific Biosciences RS II None - SMS 2 hrs. 0.03 3000 $100 $1,111.11 $3,333.33 90,000,000 0.090 $1,111.11 Glenn, TC (2011) Field Guide to Next Generation DNA Sequencers. Molecular Ecology Resources. 2014 Update. http://www.molecularecologist.com/next-gen-fieldguide/

Pokaz NGS LAB W IGiB UW (pok. VII)

Technika northern-blot: rozdział i detekcja RNA RNA Hybrydyzacja ze specyficzną, wyznakowaną sondą. RNA

Indukcja transkrypcji genu kodującego arginazę u A. nidulans

Katabolizm argininy Gen agaa koduje arginazę, rozkładającą argininę do ornityny, a gen otaa koduje transaminazę ornitynową Transkrypcja obu genów jest indukowana argininą Za indukcję odpowiada czynnik transkrypcyjny ARCA arca d 47 mutacja dominująca arca r 3 mutacja recesywna

1. standard masy cząsteczkowej RNA (RNA Lader High Range, MBI Fermentas) warunki hodowli aktywność arginazy 2. wt MM 0,2 3. wt MM + arginina 1,8 4. arca d 47 MM 1,9 5. arca d 47 MM + arginina 2,1 6. arca r 3 MM 0,1 7. arca r 3 MM + arginina 0,1 8. RNA totalne z ludzkich komórek białaczkowych Jurkat 1u aktywności arginazy = aktywność enzymu dająca 1 μmol mocznika na minutę w warunkach standardowych mrna (geny) referencyjne northern-blot jakościowy alternatywny splicing

Technika western-blot

Detekcja białka w western-blot Instytut Genetyki i Biotechnologii UW, 2016

Southern, northern i western Instytut Genetyki i Biotechnologii UW, 2016

Badanie lokalizacji w komórce czynnika transkrypcyjnego AREB u Aspergillus nidulans pokaz mikroskopii fluorescencyjnej AREB czynnik transkrypcyjny z rodziny GATA, rozpoznaje konkretne sekwencje w promotorach wielu genów Pełni rolę negatywnego regulatora transkrypcji (represor) w represji azotowej Lokalizacja wewnątrzkomórkowa zależy od statusu pokarmowego: zwykle jest w jądrze, częściowo w cytoplazmie. W przypadku głodzenia azotowego zwiększa się jeszcze jego obecność w jądrze Obserwacja lokalizacji możliwa jest dzięki fuzji AREB z białkiem T- Sappaphire ( szafirowej fluorescencji ) Kontrolą w doświadczeniu jest histon H1 (białko jądrowe) w fuzji z RFP (białkiem czerwonej fluorescencji )

Schemat integracji do genomu A. nidulans konstruktu kodującego AREB w fuzji białkiem fluorescencyjnym T-Sapphire pyrg A. fu gen z Aspergillus fumigatus, wykorzystywany do rekombinacji homologicznej. Pozwala to uniknąć rekombinacji z dzikim losuc pyrg A. nidulans (niska homologia obu genów) gpd promotor zapewniający wysoką, konstututywną ekspresję konstruktu. ribob A. fu selekcyjny marker pokarmowy, gen z A. fumigatus (też zabezpieczenie przed nieporządaną rekombinacją z genem A. nidulans) Za A. Dzikowska i M. Macios

Obecność AREB w jądrze wzrasta przy głodzeniu azotowym NH4 + NO3 - -N (5 hours) Za A. Dzikowska i M. Macios

Lokalizacja AREB zależy od statusu pokarmowego G glukoza; F- fruktoza; -N głodzenie azotowe; -C głodzenie węglowe G/NH4 G/NO3 F/NH4 F/NO3 -N -C Za A. Dzikowska i M. Macios

Lokalizacja AREB::T-Sappaphire potwierdzona odczynnikiem DAPI (barwiącym specyficznie jądra) DAPI Zanim spenetruje do jądra niespecyficznie barwi inne struktury np. ściany komórkowe AREB::T-Sappaphire Za A. Dzikowska i M. Macios

Kontrola szczepów w mutagenezie PET127 schemat PCR

Kontrola szczepów w mutagenezie PET127 wzorcowy wynik PCR Instytut Genetyki i Biotechnologii UW, 2016

Odczyt testów wzrostowych dla mutantów w PET127 Sprawdzenie fenotypów oddechowych dla mutantów D378A i E346A

Model struktury PET127 z S. cerevisiae Instytut Genetyki i Biotechnologii UW, 2016 Na model PET127 zaznaczono: struktury typu kartka kolorem czerwonym, helisy ciemnoniebieskim, łańcuchy słabo ustrukturyzowane - jasnoniebieskim lub zielonym. Zaznaczono mutowane podstawniki z okolic centrum aktywnego: kolor biały podstawniki E346 i D378, kolor żółty podstawniki L392 i K393. Model atomowy czaszowy: cząsteczka kw. nukleinowego (tu DNA) Model otrzymano w oprogramowaniu I- TASSER (Yang Zhang's Lab) poprzez modelowanie na podstawie sekwencji homologicznych o znanej strukturze i zwizualizowano programem YASSARA (YASARA Biosciences GmbH): http://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/ http://www.yasara.org

Model struktury centrum aktywnego PET127 z S. cerevisiae Na model PET127 zaznaczono: struktury typu kartka kolorem czerwonym, helisy ciemnoniebieskim, łańcuchy słabo ustrukturyzowane - jasnoniebieskim lub zielonym. Zaznaczono mutowane podstawniki z okolic centrum aktywnego: kolor biały podstawniki E346 i D378, kolor żółty podstawniki L392 i K393. MG skoordynowany jon Mg 2+ Model otrzymano w oprogramowaniu I- TASSER (Yang Zhang's Lab) poprzez modelowanie na podstawie sekwencji homologicznych o znanej strukturze i zwizualizowano programem YASSARA (YASARA Biosciences GmbH): http://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/ http://www.yasara.org

Kilka słów o ekspresji heterologicznej

Przykład wektora bifunkcjonalnego do ekspresji białek w komórkach ssaczych Za: OriGene

Plazmid do heterologicznej ekspresji i oczyszczania białek w bakteriach pbad - promotor arabinozowy YFG - your favourite gene polyhistidine tag - znacznik heksahistydynowy (6xHIS) do oczyszczania przez chromatografię powinowactwa

Chromatografia powinowactwa na przykładzie złoża niklowego i heksahistydyny

Konstrukcja zdegenerowanej sondy

SYNTETYCZNY OLIGONUKLEOTYD, PRODUKT PCR LUB RT-PCR w oparciu o znaną sekwencję KLON cdna (np. do przeszukiwania banku genomowego) RNA łatwy do izolacji np. rrna DNA konserwowany ewolucyjnie lub z organizmu spokrewnionego izolacja i fragmentacja DNA DNA BADANY ORGANIZM WEKTOR ligacja transformacja biorcy (Escherichia coli) izolacja RNA i odwrotna transkrypcja cdna RNA (cdna) izolowany z różnych tkanek do hybrydyzacji różnicowej BANK GENOMOWY BANK cdna BIAŁKO łatwe do oczyszczenia, występujące w dużych ilościach Ustalenie N-końcowej sekwencji aminokwasowej białka, projektowanie i synteza zestawu zdegenerowanych sond Immunizacja ssaka (np. królika) SONDA PRZECIWCIAŁA W Y S Z U K I W A N I E K L O N Ó W KOMPLEMENTACJA MUTACJI (na ogół dla banku genowego np. klonowanie genów drożdży wg schematu z ćwiczeń) METODY HYBRYDYZACYJNE (hybrydyzacja kolonijna, łysinkowa albo różnicowa) METODY IMMUNOLOGICZNE (biblioteka na wektorze ekspresyjnym)