Koszmar piwowara, czyli zakażenia w piwie
Plan wykładu Parę słów wstępu Objawy zakażenia Charakterystyka zakażających drobnoustrojów: -dzikie drożdże -bakterie Gram ujemne -bakterie Gram dodatnie -killer yeast -inne możliwe zakażenia Biofilm Metody rozpoznawania zakażenia, izolacji i identyfikacji Jak i kiedy dochodzi do zakażenia Wpływ charakterystyki piwa na możliwość zakażenia Minimalizowanie ryzyka Celowe zakażenie piwa sour is new hoppy
O co chodzi z zakażeniami w piwie? Za PWN: zakażenie, infekcja, med. wtargnięcie do ustroju i rozwój w nim zakaźnego czynnika chorobotwórczego Zakażenia zmieniają właściwości sensoryczne piwa, zazwyczaj w niepożądany sposób W ekstremalnych przypadkach mogą być niebezpieczne dla zdrowia konsumenta
Piwo nie jest przyjaznym środowiskiem Niskie ph (około 4,5) Niska zawartość tlenu (warunki beztlenowe) Zawartość alkoholu Chmiel Mała zawartość składników odżywczych Co innego brzeczka
Zakażenia piw domowych Zjawisko znacznie bardziej powszechne, niż się sądzi! Stopnie zakażenia: 1. Piwo do wylania, obrzydliwe, niepijalne 2. Piwo pijalne, ale coś w nim nie do końca pasuje 3. Piwo w porządku, osoba po dogłębym szkoleniu sensorycznym wykrywa wadę wynikającą z zakażenia 4. Piwo smakuje lepiej niż nie zakażone
Zachowanie drobnoustrojów w piwie E. Żyrek(2008) Zagrożenia mikrobiologiczne przy aseptycznym rozlewie piwa
Objawy zakażeń Zmętnienie Smak i zapach octu Zgniłe jaja Kwaśność Wysoki poziom diacetylu Gushing Końska derka/skóra/wełna
Dzikie drożdże Brettanomyces B. anomalus B. bruxellensis B. claussenii B. custersianus B. lambicus B. naardenensis B. nanuss Bakteria Opis Efekty zakażenia Preferowane warunki wzrostu podobne jak u drożdży piwnych, potrafią fermentować dekstryny Gushing, aromaty ananasa, jabłka, gruszki, końskiej derki stajni, dymu, apteczne, fekalne. Tworzą błonę na powierzchni http://withfriendship.com/images/e/21277/ http://investigadores.uncoma.edu.ar/
http://www.homebrewtalk.com
http://www.homebrewtalk.com
http://www.homebrewtalk.com
Dzikie drożdże Bakteria Opis Efekty zakażenia Saccharomyces S. cerevisiae var. diastaticus i inne S. bayanus S. pastorianus Preferowane warunki wzrostu podobne jak u drożdży piwnych, potrafią fermentować dekstryny Przegazowanie piwa, aromaty apteczne, goździkowe. Candida, Torulaspora, Pichia, Kluyveromyces Tlenowce, nie potrafią przeprowadzać fermentacji Zmętnienie, produkcja błony na powierzchni, kwas octowy Rhodotorula, Cryptococcus Często wykrywane, ale w normalnych warunkach nie są w stanie zepsuć piwa Zmętnienie
Bakterie Obligatoryjne/fakultatywne tlenowce/beztlenowce http://www.e-biotechnologia.pl/
Bakterie Gram ujemne Bakteria Opis Efekty zakażenia Bakterie octowe: Acetobacter A. aceti A. liquefacies A. pastorianus A. hansenii Gluconobacter oxydans Obligatoryjne tlenowce Komórki w postaci pałeczek, występujących w parach bądź łańcuchach. Optymalne warunki wzrostu: 25-30 C, ph 5,4-6,3, wysoka tolerancja na alkohol (G. oxydans nawet do 13%) Zmętnienie i śliskie błony na powierzchni piwa. Utlenianie etanolu, produkcja kwasu octowego i octanów smak i zapach octu. www.jimsbeerkit.co.uk www.homebrewtalk.com
Bakterie Gram ujemne Zymomonas mobilis Bakteria Opis Efekty zakażenia Krótkie pałeczki występujące pojedynczo, w parach lub łańcuchach. Fakultatywne beztlenowce, fermentujące glukozę i fruktozę (ale nie maltozę). Optymalna temperatura wzrostu: 25-30 C, tolerancja alkoholu do 13% Produkcja siarkowodoru i aldehydu octowego, powodują tzw. smak zgniłego jabłka. Wytwarzają także etanol, kwas octowy, kwas mlekowy, acetoinę (masło) Obesumbacterium proteus, dawniej Hafnia protea Krótkie pałeczki. Rośnie razem z drożdżami, często obecny w gęstwie. Infekuje wyłącznie brzeczkę, wrażliwe na alkohol, odporne na chmiel. Powoduje niskie odfermentowanie i wysokie ph w piwie. Produkuje DMS, diacetyl i alkohole wyższe. Produkuje także N-nitrosaminy (czynnik kancerogenny)
Bakterie Gram ujemne Citrobacter freundii Bakteria Opis Efekty zakażenia Cienkie pałeczki występujące pojedynczo lub w parach, fakultatywnie beztlenowe, fermentują glukozę. Wrażliwe na alkohol, odporne na chmiel. Przyspieszona fermentacja w początkowych stadiach, produkcja kwasów organicznych i DMS. Enterobacter (Rahnella) R. aquatilis E. agglomerans Klebsiella terrigena Klebisella oxytoca Krótkie pałeczki, fermentują glukozę z produkcją kwasów i gazów. Niska tolerancja na alkohol, odporne na chmiel. Cienkie pałeczki występujące pojedynczo, lub w krótkich łańcuchach. Fakultatywne beztlenowce, fermentują glukozę. Wrażliwe na alkohol, odporne na chmiel. Podobne do Obesumbacterium, zakaża gęstwy drożdżowe. Produkuje wysokie ilości diacetylu. Przetwarzają kwas ferulikowy na 4-winylo gwajakol
Bakterie Gram ujemne Bakteria Opis Efekty zakażenia Pectinatus cerevisiiphilus Megasphaera cerevisiae Bardzo cienkie zakręcone pałeczki występujące pojedynczo lub w parach. Obligatoryjne beztlenowce, odporne na chmiel. Ziarniaki występujące pojedynczo lub w krótkich łańcuchach, obligatoryjne beztlenowce. Wrażliwe na alkohol (powyżej 4%), odporne na chmiel. Produkuje siarkowodór i inne związki siarki. Zapach i smak zgnilizny, produkcja związków siarki, kwasu masłowego.
Bakterie Gram dodatnie Lactobacillus L. brevis L. casei L. plantarum L. fermentum L. buchneri L. delbrückii Pediococcus P. damnosus P. inopinatus Bakteria Opis Efekty zakażenia Cienkie pałeczki. Fakultatywne beztlenowe. Niektóre odporne na związki chmielu. Ziarniaki występujące pojedynczo, w parach, tetradach i jako krótkie łańcuchy. Faktulatywne beztlenowce, wiele szczepów odpornych na związku chmielu i alkohol. Zmętnienie w piwie, niektóre gatunki produkują polisacharydy, co daje efekt lepkiej zawiesiny. Produkują kwas mlekowy, a także kwas octowy, etanol i dwutlenek węgla, potrafią zakwasić brzeczkę Infekują fermentującą brzeczkę i piwo, produkują lepką zawiesinę powodują zmętnienia, kwasowość i wysokie stężenia diacetylu, powstrzymują wzrost drożdży.
Lactobacillus
Lactobacillus
Bakterie Gram dodatnie Bacillus B. coagulans Micrococcus M. kristinae Bakteria Opis Efekty zakażenia Duże pałeczki. Tlenowce/fakultatywne beztlenowce. Termofilne, endospory umożliwiają im przetrwanie gotowania, wrażliwe na związki chmielu i nie rosną w środowisku o ph niższym niż 5. Zazwyczaj obligatoryjne tlenowce, lub fakultatywne beztlenowce. Wrażliwe na związki chmielu i niskie ph. Potrafią rosnąć w brzeczce w temperaturach zacierania (55-70 C), produkując kwas mlekowy. Często spotykane w browarach, ale nie powodują zakażeń piwa.
Killer yeast Drożdże Saccharomyces cerevisiae mogą wytwarzać toksyny zabijające komórki tego samego gatunku należące do innego szczepu. Istnieją drożdże K (killer), S (sensitive) i N (neutral). Drożdże piwowarskie należą najczęściej do grupy S Do 90% drożdży może zgniąć podczas fermentacji H.J.J. van Vuuren (1986) Killer Yeast cause of stuck fermentations in a wine cellar
H.J.J. van Vuuren (1986) Killer Yeast cause of stuck fermentations in a wine cellar
Inne możliwe zakażenia Organizm Opis Efekty zakażenia Pleśnie Alternaria, Aspergillus, Cladosporium, Fusarium, Rhizopus Tlenowce, infekują słody i produkty zbożone Posmaki melasy, palone, winne, starości ; zmiany barwy, zwiększony poziom azotu, zmętnienie, gushing Toksyny mogą być niebezpieczne dla zdrowia ludzi i drożdży jeden z możliwych powodów niedofermentowania piwa http://www.ag.ndsu.edu/
Primary gushing Wywoływane między innymi przez metabolity grzybów Fusarium, Aspergillus i Penicillum Infekcja jęczmienia na polu, lub słodu podczas przechowywania Pięć zainfekowanych ziaren na 100g słodu wystarcza do wywołania tego zjawiska Próba kontrolna Słód z Fusarium Słód z Aspergillus Słód zakażony Fusarium średnia strata piwa [g] 0 64 22 55 http://www.crc.dk/flab/fusarium.htm
Secondary gushing Czyli po prostu przegazowanie Powody nie związane z zakażeniem: za niskie odfermentowanie, za dużo cukru do refermentacji Zakażenie np. dzikimi drożdżami Brettanomyces
Biofilm Trójwymiarowa kolonia bakterii zawartych w macierzy zewnątrzkomórkowych polimerów (egzopolisacharydów) wykazujących zdolność adhezji do wilgotnych powierzchni stałych oraz do siebie nawzajem http://textbookofbacteriology.net/biofilm_formation.gif
Biofilm w browarze Występują w nim głównie Pseudomonas, Escherichia, Lactobacillus, Acetobacter i Saccharomyces 1-2mm wysokości, 6mm średnicy. Śluzowate, barwy od kremowej poprzez czerwoną do czarnej http://www.microbehunter.com
Bakterie z biolifmu w browarze L. Shabani, A. Devolli (2010) Microbial spoilage in beer processing by biofilms
Grzyby z biolifmu w browarze L. Shabani, A. Devolli (2010) Microbial spoilage in beer processing by biofilms
Test wyizolowanych drobnoustrojów - brak wzrostu +/T+ wzrost i zmętnienie A+ wzrost, zmętnienie i zakwaszenie L. Shabani, A. Devolli (2010) Microbial spoilage in beer processing by biofilms
Metody rozpoznawania zakażenia, izolacji i identyfikacji Ocena wizualna (zmętnienie, kożuch) Ocena zapachowa Ocena smakowa Obserwacja pod mikroskopem Posiew na pożywce agarowej Posiew na pożywce płynnej
www.homebrewtalk.com
www.homebrewtalk.com
Obserwacje pod mikroskopem Potrzebny jest mikroskop Powiększenie 40x nadaje się do obserwacji drożdży Do bakterii potrzeba powiększenia 100x i użycia olejku imersyjnego Można określić czystość (szczególnie przydatne przy gęstwach), wyróżnić bakterie pałeczkowate i ziarniaki
Selektywne podłoża Podłoża o odpowiednim składzie, umożliwiające wykrycie konkretnych drobnoustrojów HLP - Hsu's Lactobacillus/Pediococcus Medium SDA/LMDA - Lee's Multi-Differential Agar/Schwarz Differential Agar LWYM - Lin's Wild Yeast Medium
Selektywne pożywki są drogie 500g za prawie 500 złotych, 20 płytek za 80-300 złotych Alternatywa pożywka z brzeczki/piwa E. Żyrek(2008) Zagrożenia mikrobiologiczne przy aseptycznym rozlewie piwa
Posiew Potrzebujemy: środek do dezynfekcji w spraju, palnik, płytki z pożywką, próbkę którą chcemy zbadać, ciepłe miejsce do inkubacji,ezę, głaszczkę (lub coś w zastępstwie) http://pl.wikipedia.org http://www.homebrewing.pl
Podłoża płynne Najprościej jest stosować dwa rodzaje pożywki płynnej: brzeczka i piwo Probówki typu Falcon 15/50ml. Tanie (ok. 20pln/50sztuk), sterylne, przydają się do produkcji skosów itp. http://www.homebrewersassociation.org
Test na obecność katalazy Posiadając czyste kultury bakterii/drożdży możemy przeprowadzić test na obecność katalazy za pomocą wody utlenionej. Pośród interesujących nas drobnoustrojów Lactobacillus i Pediococcus dają wynik ujemny, reszta dodatni http://nhscience.lonestar.edu/biol/wellmeyer/media/catalaseresults2.jpg http://stopmyclock.com/wp-content/uploads/2011/10/catalase-test.gif
Barwienie bakterii metodą Grama trudne do wykonania w warunkach domowych Alternatywa test z użyciem 3% r-r KOH. 91,4% bakterii G+ i 88% bakterii G- można prawidłowo oznaczyć za pomocą tego testu http://jjkaos.tistory.com/tag/koh%20test
Postulaty Kocha Postulat 1 Drobnoustrój musi być obecny we wszystkich piwach mających daną chorobę i powinien mieć związek ze zmianami chorobowymi. Postulat 2 Drobnoustrój musi być wyizolowany w czystej kulturze od chorego piwa. Postulat 3 Drobnoustrój, wyosobniony z chorego piwa, po wprowadzeniu do piwa lub brzeczki musi wywołać tę samą chorobę. Postulat 4 Drobnoustrój należy ponownie wyosobnić w czystej kulturze z eksperymentalnie zakażonego piwa lub brzeczki w celu spełnienia trzeciego postulatu.
Jak i kiedy dochodzi do zakażenia
Zakażające drobnoustroje są obecne: Na słodzie Na sprzęcie używanym do produkcji piwa, głównie na plastiku W gęstwach Mogą być w wodzie kranowej W powietrzu
Powietrze w browarze Bakterie beztlenowe Drożdże Jesień średnia Zakres (cfu/m 3 ) Wiosna średnia Zakres (cfu/m 3 ) Jesień średnia Zakres (cfu/m 3 ) Wiosna średnia Zakres (cfu/m 3 ) Powietrze wchodzące 50 10-280 50 10-410 20 10-150 30 10-230 Rozlewnia 560 10-3900 240 10-1500 110 10-780 90 10-1300 Powietrze wychodzące 210 10-1100 90 10-380 40 10-310 20 10-100 Haikira A., Henriksson E. (1992) Detection of airborne microorganisms as a means of hygiene control in the brewery filling area
Wpływ charakterystyki piwa na możliwość zakażenia Cechy piwa zmniejszające ryzyko: Wysoka zawartość alkoholu Wysokie odfermentowanie Fermentacja w niskich temperaturach (dolna fermentacja) Ciemna barwa piwa
Wpływ charakterystyki piwa na możliwość zakażenia Cechy piwa zwiększające ryzyko: Niska zawartość alkoholu Niedofermentowanie Duża zawartość dekstryn Obecność skrobii, laktozy Wysoka temperatura fermentacji
Chmiel Antybakteryjne działanie chmiel zawdzięcza obecności α- i β- kwasów Chmiel wpływa na bakterie G+, nie G-! Szczepy Lactobacillus brevis i Pediococcus damnosus potrafią być odporne na chmiel http://www.homebrewparty.com/ http://entheology.com
Minimalizowanie ryzyka Śrutowanie w innym pomieszczeniu niż to, w którym pracujemy z brzeczką Płytki z brzeczką 10Blg, niechmieloną. Od lewego górnego rogu zgodnie z ruchem wskazówek zegara: Powietrze w łazience Powietrze w kuchni Próbka słodu Powietrze z pokoju, w którym odbywało się śrutowanie
Minimalizowanie ryzyka Praca w pomieszczeniach bez kiszonek, owoców Praca w pomieszczeniach czystych, chłodnych i suchych Nie odkurzać/wietrzyć tuż przed pracą z brzeczką Porządne mycie i dezynfekcja WSZYSTKIEGO!
Celowe zakażenie piwa sour is new hoppy nowa moda, głównie pośród amerykańskich mikrobrowarów Celowe zakażanie piwa dzikimi drożdżami i/lub bakteriami http://www.ratebeer.com/ http://en.wikipedia.org/ http://www.smaki-piwa.pl/
Jak ukwasić piwo? Piwo bazowe najlepiej o wysokim FG, niskim aromacie chmielowym (i tak zaniknie) i nie agresywnie chmielone/palone/przyprawione Dobrze mieć osobne fermentory/plastiki do kwaszonych piw Dzikie mikroby można kupić/upolować/wyciągnąć z kwaśnego piwa http://cdn.discusscooking.com
Zdobywanie mikrobów Wyeast 5112 Brettanomyces bruxellensis, 5335 Lactobacillus, 5526, Brettanomyces lambicus, 5733 Pediococcus White Labs WLP630 Berliner Weisse Blend, WLP645 Brettanomyces claussenii, WLP650 Brettanomyces bruxellensis, WLP653 Brettanomyces lambicus, WLP655 Belgian Sour Mix 1, WLP670 American Farmhouse Blend, WLP675 Malolactic Bacteria, WLP677 Lactobacillus Bacteria
Zdobywanie mikrobów W postaci osadu z butelek z zakwaszanym piwem Wyłapywanie z powietrza, najlepiej na wiosnę i jesienią. http://www.themadfermentationist.com
Mikroby do kwaszenia Brettanomyces wnoszą aromaty (zależnie od szczepu): ananasa, jabłka, gruszki, końskiej derki stajni, dymu, apteczne, fekalne Pediococcus - główny producent kwasu mlekowego w zakwaszanych piwach, potrzebują nawet kilka miesięcy do działania. Używać w połączeniu z Brettanomyces Lactobacillus stosowane właściwie wyłącznie w Berliner Weisse Acetobacter niewielkie znaczenie, częściej są zagrożeniem dla piwa
Berliner Weisse www.homebrewtalk.com
Brettanomyces - gatunki Brettanomyces po grecku oznacza brytyjskie grzyby Brettanomyces claussenii najmniej intensywne, pochodzą z angielskiego piwa z początku XX wieku. Wnoszą owocowe, ananasowe aromaty Brettanomyces bruxellensis średnio intensywny gatunek, używany w Belgii Brettanomyces lambicus najbardziej intensywny charakter, produkuje typowe nuty dla lambików.
Fermentacja Najlepsze efekty przy jednoczesnym zadawaniu drożdży piwowarskich i reszty mikrobów Minimum 6 miesięcy dla uzyskania pożądanych efektów http://www.themadfermentationist.com
http://www.themadfermentationist.com
Jeśli już trafi się kwasiżur Zamiast wylewać w kanał można przelać do szklanego balonu, zostawić na rok-dwa i może wyjdzie całkiem smaczne sour ale :)
Dziękuję za uwagę! http://andragy.files.wordpress.com